Artykuł metodologiczny

Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek pełnego wegetatywnego cyklu komórkowego wolno rosnącej bakterii społecznej Myxococcus xanthus

DOI:

10.3791/57860

⸱

20 czerwca 2018

 , 
1Department of Ecophysiology, Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki bakteryjne są przestrzennie wysoce zorganizowane. Aby śledzić tę organizację w czasie w wolno rosnących komórkach Myxococcus xanthus, opracowano zestaw do fluorescencyjnego obrazowania żywych komórek z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną przez kilka pokoleń. Za pomocą tej metody można było określić czasoprzestrzenną dynamikę białek ważnych dla segregacji chromosomów i podziału komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek bakteryjnych jest kluczową metodą w analizie przestrzennej i czasowej dynamiki białek i chromosomów leżących u podstaw wydarzeń centralnego cyklu komórkowego. Jednak obrazowanie tych cząsteczek w wolno rosnących bakteriach stanowi wyzwanie ze względu na fotowybielanie fluoroforów i fototoksyczność podczas akwizycji obrazu. W tym miejscu opisujemy prosty protokół pozwalający obejść te ograniczenia w przypadku Myxococcus xanthus (którego czas generacji wynosi 4 - 6 godzin). W tym celu komórki M. xanthus są hodowane na grubej, zawierającej składniki odżywcze podkładce agarowej w wilgotnym środowisku o kontrolowanej temperaturze. W tych warunkach określamy czas podwojenia poszczególnych komórek, śledząc wzrost pojedynczych komórek. Co więcej, kluczowe procesy komórkowe, takie jak segregacja chromosomów i podział komórek, można obrazować za pomocą fluorescencyjnego obrazowania żywych komórek komórek zawierających odpowiednie znakowane fluorescencyjnie białka markerowe, takie jak ParB-YFP, FtsZ-GFP i mCherry-PomX w wielu cyklach komórkowych. Następnie pozyskane obrazy są przetwarzane w celu wygenerowania montaży i/lub filmów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki bakteryjne są przestrzennie wysoce zorganizowane, a wiele białek lokalizuje się asymetrycznie w przedziałach komórkowych1,2,3,4. Ta lokalizacja jest często bardzo dynamiczna i zmienia się w czasie w odpowiedzi na sygnały cyklu komórkowego lub sygnały zewnętrzne. Podobnie, chromosom bakteryjny jest przestrzennie wysoce zorganizowany, a poszczególne loci są umieszczane w określonych lokalizacjach subkomórkowych przed i w trakcie procesu segregacji5. Ta dynamiczna organizacja przestrzenna jest ważna dla wzrostu, podziału, regulacji cyklu komórkowego, różnicowania, ruchliwości, transdukcji sygnału, a także organizacji i segregacji chromosomów; W związku z tym wpływa zasadniczo na wszystkie aspekty funkcjonowania bakterii.

Czasoprzestrzenna dynamika tych procesów komórkowych jest analizowana w różnych gatunkach bakterii, przy czym Escherichia coli, Bacillus subtilis, Vibrio cholerae i Caulobacter crescentus służą jako ważne organizmy modelowe. Jednak te cztery gatunki obejmują tylko niewielkie spektrum ogromnej różnorodności bakteryjnej i, co może nie być zaskakujące, biorąc pod uwagę duży dystans filogenetyczny między tymi gatunkami, organizacja komórkowa i mechanizmy polaryzacji są różne u tych bakterii. Rodzi to potrzebę zbadania dodatkowych gatunków bakterii, aby móc ostatecznie wyodrębnić ogólne zasady leżące u podstaw czasoprzestrzennej dynamiki komórek bakteryjnych.

Gram-ujemny delta-proteobacterium M. xanthus jest organizmem modelowym w badaniu zachowań społecznych i współpracy u bakterii6. M. xanthus jest ścisłą tlenowcem i w obecności składników odżywczych tworzy kolonie, w których komórki rozprzestrzeniają się na zewnątrz w wysoce skoordynowany, rojowy sposób i żerują na innych mikroorganizmach7. W odpowiedzi na głód składników odżywczych komórki inicjują program rozwojowy, który powoduje powstanie owocników, które składają się z tysięcy komórek, a wewnątrz których ruchliwe komórki w kształcie pręcików różnicują się w sferyczne diploidalne zarodniki8. Oba rodzaje zachowań, tj. rój i tworzenie owocników, są wykonywane tylko przez komórki, które są umieszczone na twardej powierzchni. Co więcej, w obu warunkach odżywczych komórki angażują się w procesy, które obejmują bezpośrednie kontakty komórka-komórka, w tym wymianę lipoprotein błony zewnętrznej, które mogą stymulować ruchliwość lub funkcjonować jako toksyny w biorcy9,10, wymiana LPS11, stymulacja ruchliwości przez egzopolisacharydy na sąsiednich komórkach12oraz sygnalizacja międzykomórkowa za pomocą białka sygnalizacyjnego zakotwiczonego powierzchniowo w komórce13,14.

Ostatnio M. xanthus stał się również organizmem modelowym do badania mechanizmów leżących u podstaw ruchliwości i jej regulacji15, podział komórek16,17,18, oraz organizacja chromosomów19,20,21. Krytyczne etapy cyklu komórkowego M. xanthus zostały szczegółowo przeanalizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu obrazów snap-shot lub krótkich nagrań poklatkowych na szczepach zawierających odpowiednie białka znakowane fluorescencyjnie16,17,18,19,20. Idealnie byłoby, gdyby wiele komórek było obserwowanych z rozdzielczością pojedynczej komórki za pomocą fluorescencyjnego obrazowania żywych komórek przez co najmniej jeden pełny cykl komórkowy, aby uzyskać wiarygodne dane ilościowe dotyczące parametrów cyklu komórkowego. Jest to jednak wyzwanie w przypadku M. xanthus ze względu na jego stosunkowo długi czas wytwarzania wynoszący 4 - 6 godzin w standardowych warunkach laboratoryjnych oraz ze względu na fotowybielanie fluoroforów i fototoksyczność podczas akwizycji obrazu.

Tutaj opisujemy protokół obserwacji komórek M. xanthus z rozdzielczością pojedynczej komórki poprzez fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek przez co najmniej 24 godziny i obejmujące kilka cykli komórkowych. Co ważne, podczas całego protokołu komórki są utrzymywane na podkładce agarowej i w bliskim kontakcie, co pozwala na czynności zależne od kontaktu, niezbędne dla społecznego stylu życia M. xanthus. Protokół pozwala również użytkownikom monitorować kształt, rozmiar, podziały i sondy fluorescencyjne w wysokiej rozdzielczości czasowej i z rozdzielczością pojedynczej komórki, a tym samym umożliwia ilościowe określanie zmienności między komórkami i korelacji zdarzeń cyklu komórkowego.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie i wzrost szczepów M. xanthus

Uwaga: Zobacz Tabelę 1 i Tabelę 2.

  1. Przygotuj 1% bulion casitone (CTT) pożywkę wzrostową 1% (w/v) trawienie trzustkowe kazeiny (np. Bacto casitone), 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM KH2PO4 pH 7,6, 8 mM MgSO422, uzupełnione kanamycyną (50 μg/ml) lub oksytetracykliną (10 μg/ml). Dodaj gentamycynę (10 μg/ml) do wszystkich pożywek, aby zmniejszyć ryzyko zanieczyszczenia innymi bakteriami, ponieważ komórki M. xanthus są na nią naturalnie odporne.
  2. Zaszczepić 5 ml 1% CTT zawierającego odpowiedni antybiotyk (antybiotyki) pojedynczą świeżo wyhodowaną kolonią typu dzikiego (WT) DK1622 23, SA4420 (ΔmglA)24, SA4797 (ΔmglA, ΔpomX/PpomZ mCherry-pomX)16, SA8241 (ΔmglA, ftsZ+/PnatftsZ-gfp), lub SA4749 (ΔmglA, parB+/ PnatparB-yfp) rano dnia 1.
    1. Zawiesić pojedynczą kolonię M. xanthus w 500 μl 1% CTT uzupełnionego antybiotykami w sterylnej probówce i przenieść całą zawiesinę do 50 ml kolby Erlenmeyera zawierającej 5 ml 1% CTT.
      UWAGA: Użyć kolby Erlenmeyera o 10-krotnie większej objętości niż kultura, aby zagwarantować wystarczające napowietrzenie i optymalny wzrost.
  3. Hodować komórki przez osiem pokoleń (około 40 - 48 godzin z czasem generacji 4 - 6 godzin) w temperaturze 32 °C, wytrząsając z prędkością 220 obr./min, w ciemności. Utrzymuj komórki w fazie wzrostu wykładniczego (OD550 <1.2) i zapobiegaj ich osiągnięciu fazy stacjonarnej. W razie potrzeby rozcieńczyć komórki w świeżej pożywce 1% CTT zawierającej odpowiedni antybiotyk (antybiotyki) do OD550 0,1 - 0,2,
    UWAGA: Optymalna wartość OD550 dla mikroskopii jednokomórkowej wynosi 0,5 - 0,7. Przy tym OD550 na obrazie znajduje się wystarczająca liczba komórek, aby umożliwić kwantyfikację, a także analizę statystyczną parametrów komórkowych.

2. Przygotowanie próbek mikroskopowych

Uwaga: Komórki, które mają być oglądane pod mikroskopem, są umieszczane na szkiełku nakrywkowym mikroskopu, a następnie przykrywane podkładką agarozową zawierającą składniki odżywcze. Szkiełko nakrywkowe jest przyklejone do plastikowej lub metalowej ramy, aby zapewnić mechaniczne podparcie. Przygotowując się do badania mikroskopowego, należy wcześniej przygotować dużą podkładkę z 1% agarozy/TPM/0,2% CTT, jak opisano w krokach 2.1 - 2.3. Prosimy również o zapoznanie się z tabelą materiałów, aby zapoznać się z konkretnymi użytymi tutaj produktami.

  1. Przygotować 500 ml buforu TPM (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM KH2PO4 pH 7,6, 8 mMMgSO4) i sterylizować w autoklawie lub filtrze za pomocą filtra butelkowego.
    UWAGA: Sterylny bufor może być przechowywany przez kilka miesięcy w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotować 1% roztwór do mikroskopii agarozowej zawierający 0,2% CTT (zmieszać 1 g agarozy z 80 ml buforu TPM i 20 ml 1% pożywki CTT). Podgrzej w kuchence mikrofalowej, aż agaroza się stopi.
    UWAGA: 0,2% CTT jest wystarczające, aby umożliwić komórkom wzrost i zapobiec głodowi. Wyższe stężenia CTT w podłożu mikroskopowym spowodują wysoką fluorescencję tła.
  3. Napełnij szalkę Petriego stopioną agarozą do grubości 0,5 cm (w przypadku kwadratowej szalki Petriego o wymiarach 11,5 cm x 11,5 cm wymagane jest około 60 ml stopionej agarozy) i pozwól jej ostygnąć do temperatury pokojowej.
    UWAGA: Podkładka agarozowa może być przechowywana w temperaturze 4 °C w wilgotnym środowisku do 2 dni.
    1. Przed użyciem podgrzej wkładkę 1% agarozy/TPM/0,2% CTT w temperaturze 32 °C przez co najmniej 15 minut.
      UWAGA: Aby przygotować komórki do mikroskopii, wykonaj kroki 2.4 - 2.8.
  4. Umieść sterylne szklane szkiełko nakrywkowe (60 mm x 22 mm, grubość: 0,7 mm) na plastikowej lub metalowej ramie z otworem pośrodku (Rysunek 1A); ta ramka służy jako mechaniczne podparcie dla cienkiego szkiełka nakrywkowego i pomaga zmniejszyć dryft podczas mikroskopii. Przymocuj szkiełko nakrywkowe do ramy za pomocą taśmy.
    1. Aby przygotować ramkę, wytnij ramkę o wymiarach 75 mm × 25 mm z metalowej płytki o grubości 1 mm, a następnie wytnij otwór o odpowiedniej wielkości (20 mm × 30 mm w tym eksperymencie) pośrodku.
  5. Dodać 10 - 20 μl wykładniczo rosnących komórek M. xanthus na szkiełko nakrywkowe.
  6. Dodaj fluorescencyjne mikrosfery 0,5 μm jako markery odniesienia do komórek, aby uprościć śledzenie komórek lub białek w nagraniach poklatkowych.
    1. Rozcieńczyć mikrosfery w stosunku 1:100 w buforze TPM i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do kilku miesięcy. Przed użyciem dokładnie wstrząsnąć i dodać do komórek 5 - 10 μl rozcieńczonych mikrosfer.
      UWAGA: Tutaj użyto mikrosfer, które są fluorescencyjne we wszystkich popularnych niebieskich, zielonych, żółtych i czerwonych kanałach fluorescencyjnych.
  7. Wytnij małą podkładkę o rozmiarze zbliżonym do szkiełka nakrywkowego dużej, wstępnie podgrzanej podkładki 1% agarozy/TPM/0,2% CTT i umieść ją na wierzchu komórek (Rysunek 1B). Umieść szkiełko nakrywkowe na podkładce agarozowej 1% agarozy/TPM/0,2% CTT, aby zapobiec parowaniu i utrzymać komórki w wilgotnym środowisku.
    UWAGA: Samo szkiełko nakrywkowe zapobiegnie znacznemu parowaniu przez co najmniej 2 godziny. W przypadku dłuższych nagrań poklatkowych, podkładkę 1% agarozy/TPM/0,2% CTT i szkiełko nakrywkowe należy uszczelnić folią parafinową, aby zapobiec parowaniu.
  8. Inkubować próbkę mikroskopową w temperaturze 32 °C przez 15-20 minut, aby komórki mogły przyczepić się do dna podkładki agarozowej. Następnie rozpocznij nagrania z mikroskopii poklatkowej.

3. Konfiguracja mikroskopu i akwizycja poklatkowa

Uwaga: Opisany tutaj protokół został opracowany dla odwróconego mikroskopu szerokokątnego z autofokusem, obiektywu 100X/1.30 NA oil PH3, zmotoryzowanego stolika X, Y, kamery sCMOS, źródła światła, filtrów dla białek zielono-fluorescencyjnych, czerwonych lub żółto-fluorescencyjnych oraz komory inkubacyjnej o kontrolowanej temperaturze. Komora ta chroni komórki przed światłem i utrzymuje stałą temperaturę.

  1. Przed rozpoczęciem mikroskopii podgrzać komorę inkubacyjną i mikroskop do temperatury 32 °C przez ~1 - 2 godziny.
    UWAGA: W zależności od konfiguracji mikroskopu nagrzewanie może potrwać dłużej. Wstępne podgrzewanie jest niezbędne do zmniejszenia dryftu i stabilizuje system sterowania autofokusem.
  2. Włącz mikroskop i uruchom oprogramowanie sterujące mikroskopem. Wybierz odpowiedni obiektyw oraz odpowiednie lustra i filtry, aby uzyskać obrazy kontrastu fazowego, a także obrazy białek zielono-fluorescencyjnych, czerwonych lub żółtych fluorescencyjnych.
    UWAGA: Mikroskop jest zwykle dostarczany z preferowanym oprogramowaniem do sterowania mikroskopem i akwizycji obrazu. W tym przypadku wykorzystano dostępne na rynku oprogramowanie (patrz tabela materiałów) do sterowania mikroskopem i akwizycji obrazu.
  3. Dodać kroplę wysokiej jakości olejku immersyjnego na soczewkę obiektywu i na dno próbki wstępnie inkubowanej w temperaturze 32 °C. Umieścić obiektyw w najniższym możliwym położeniu Z, aby uniknąć uszkodzenia soczewki obiektywu, gdy próbka jest umieszczana na stoliku mikroskopu. Umieść metalową ramkę z próbką na stoliku mikroskopu i "stroną z otworem" w kierunku obiektywu. Bezpiecznie zamocuj próbkę w uchwycie stolika.
  4. Skoncentruj się na komórkach, przesuwając stolik w kierunku Z bliżej celu. Przesuwaj stolik wolniej, gdy olej spadnie na dolną stronę próbki, a soczewka obiektywu zetknie się. Przesuwaj stół montażowy w kierunku X/Y, aż w obszarze widzenia będzie widocznych wiele pojedynczych komórek, gdy komórki znajdują się w płaszczyźnie ogniskowej. Upewnij się, że w obszarze view znajduje się co najmniej jedna mikrosfera fluorescencyjna, aby później wyrównać uzyskane obrazy.
    UWAGA: W optymalnych warunkach powinna zostać osiągnięta gęstość komórek 15 - 30 komórek na region widzenia (2,048 x 2,048 piksela lub 133,1 x 133,1 μm).
  5. Otwórz kreatora Akwizycji wielowymiarowej w oprogramowaniu sterującym mikroskopem, aby skonfigurować eksperyment poklatkowy, który umożliwia mikroskopowi rejestrowanie obrazów na wielu długościach fal i pozycjach stolika, jeśli jest to wymagane.
    1. W zakładce Main aktywuj Timelapse i Multiple Wavelengths. Dodatkowe zakładki pojawią się po lewej stronie okna.
    2. Kliknij kartę Zapisywanie i wybierz Katalog, aby wybrać pusty folder na dysku twardym komputera, aby zapisać pozyskane obrazy. Aktywuj nazwę podstawową przyrostu, jeśli plik istnieje, aby upewnić się, że kolejne zestawy danych nie zastępują wcześniejszych. Następnie nadaj eksperymentowi nazwę z datą i nazwą szczepu lub tytułem eksperymentu.
    3. Kliknij zakładkę Timelapse, aby dostosować parametry time-lapse. Ustaw Czas trwania na 24 godziny i ustaw Interwał czasu na 20 minut. Liczba punktów czasowych zmieni się automatycznie.
      UWAGA: Optymalny przedział czasowy zależy od eksperymentu i funkcji komórkowej, która ma być analizowana. Częste pozyskiwanie obrazu może powodować fotowybielanie. W związku z tym należy empirycznie znaleźć kompromis między rozdzielczością czasową a fotowybielaniem. Przy czasie podwajania wynoszącym 4 - 6 godzin można łatwo uzyskać obrazy w odstępach 5 minut (lub nawet w mniejszych odstępach czasu, jeśli jest to pożądane) w celu mikroskopii z kontrastem fazowym. Jeśli pożądana jest mikroskopia fluorescencyjna w czasie 24 godzin, obrazy powinny być rejestrowane w odstępie około 15 - 30 minut.
    4. Kliknij zakładkę Długości fal. Wybierz liczbę długości fal, które mają być uzyskiwane dla każdego obrazu w każdym punkcie czasowym, zmieniając liczbę.
      UWAGA: Dla każdej długości fali pojawi się nowa zakładka po lewej stronie kreatora "Akwizycja wielowymiarowa", a długości fal zostaną uzyskane w kolejności od góry do dołu. Dla każdej długości fali ustawienia akwizycji można modyfikować osobno.
    5. Kliknij pierwszą kartę długości fali od góry. Wybierz opcję Kontrast fazowy z listy rozwijanej Iluminacja. Wybierz 100 ms dla opcji Ekspozycja i wybierz opcję Every Time Point (Każdy punkt czasowy) z listy rozwijanej Acquire (Pobierz). Wyłącz opcję Automatyczne naświetlanie, wybierając opcję Nigdy z listy rozwijanej.
    6. Powtórz krok 3.5.5 dla każdej długości fali, która ma być uzyskana w każdym punkcie czasowym. Dla opisanej tutaj konfiguracji eksperymentalnej i białek znakowanych fluorescencyjnie należy użyć następujących parametrów dla ekspozycji: 250 ms dla białek fuzyjnych mCherry, 200 ms dla białek fuzyjnych YFP i 1,000 ms dla białek fuzyjnych GFP.
      UWAGA: Optymalne ustawienia oświetlenia dla każdego szczepu i białka fluorescencyjnego należy określić z wyprzedzeniem, zmieniając intensywność lampy i czas akwizycji obrazu dla każdej długości fali. Zbyt długi czas akwizycji obrazu zwiększy efekt fototoksyczny i ostatecznie doprowadzi do zatrzymania wzrostu i śmierci komórki. W związku z tym należy osiągnąć kompromis między jakością obrazu a żywotnością komórek.
    7. Pobieraj obrazy z wielu pozycji etapu, aby zwiększyć liczbę komórek zarejestrowanych w tym samym eksperymencie.
      1. Aby uzyskać obrazy z wielu pozycji stołu montażowego, aktywuj opcję Wiele pozycji stołu montażowego na karcie Główna. Następnie kliknij kartę Scena i kliknij przycisk Na żywo, aby spojrzeć na pole widzenia.
      2. Przesuwaj stolik w kierunku X/Y, aż obszar zainteresowania (ROI) znajdzie się w polu view. Zapisz współrzędne X i Y, klikając "+" w zakładce Etap. Ponownie przesuń stolik w kierunku X/Y, aż zostanie znaleziony nowy zwrot z inwestycji, a następnie ponownie zapisz współrzędne, klikając przycisk "+". Kontynuuj, aż zostanie zapisana żądana liczba regionów.
        UWAGA: W przypadku akwizycji obrazu fluorescencyjnego upewnij się, że obszary zainteresowania (ROI) nie znajdują się zbyt blisko siebie, aby zminimalizować fototoksyczność.
  6. Sprawdź jeszcze raz, czy komórki są ostre, klikając różne zapisane pozycje X i Y, a następnie uruchom sprzętowy autofokus, klikając AFC hold, aby utrzymać zapisaną pozycję Z na stałym poziomie w trakcie eksperymentu.
  7. Rozpocznij nagrania poklatkowe w oprogramowaniu sterującym mikroskopem, klikając przycisk Acquire (Akwizycja) w kreatorze Multi-Dimensional Acquisition (Akwizycja wielowymiarowa).
    UWAGA: Dla każdej uzyskanej długości fali pojawi się jedno okno i pojawi się dodatkowe okno, które pokazuje liczbę uzyskanych punktów czasowych i czas do następnej akwizycji obrazu.
  8. Sprawdź, czy komórki są nadal ostre po pierwszych kilku punktach czasowych w nagraniach poklatkowych, aby zmaksymalizować jakość obrazów i w razie potrzeby ponownie ustawić ostrość.

4. Generowanie filmów poklatkowych i wyrównanie obrazu

Uwaga: Dostępnych jest kilka komercyjnych i darmowych pakietów oprogramowania do akwizycji i analizy obrazów. Korzystamy z dostępnego na rynku oprogramowania (patrz tabela materiałów) z wieloma preinstalowanymi wtyczkami i dodatkowymi narzędziami.

  1. Zapisz poszczególne obrazy z nagrań poklatkowych na komputerze z zainstalowanym oprogramowaniem do analizy/przetwarzania obrazu.
  2. Uruchom oprogramowanie i otwórz obrazy jako stos, klikając Przejrzyj dane wielowymiarowe | Wybierz punkt menu Plik podstawowy | Wybierz pozycję Katalog. Otwórz folder z danymi wielowymiarowymi. Sprawdź zestaw danych i kliknij przycisk Widok; Zestaw danych będzie wyświetlany jako pojedyncze obrazy od pierwszego punktu czasu do końca. Aktywuj długość fali (w celu utworzenia stosu), zaznacz wszystkie obrazy, które powinny znaleźć się w stosie i kliknij Załaduj obraz(y). Powtórz ten krok dla wszystkich długości fal i zapisz ukończone stosy.
  3. (Opcjonalnie) Otwórz wszystkie obrazy wymagane do filmu za pomocą punktu menu Plik | otwarty.
    UWAGA: Zaleca się otwieranie obrazów za pomocą jednej uzyskanej długości fali na raz, aby nie spowalniać komputera, jeśli moc obliczeniowa jest ograniczona. Jeśli pewne części nagrań poklatkowych, np. początek, koniec lub kilka punktów czasowych zostaną pominięte, można to dostosować w ukończonym filmie.
  4. Aktywuj stos obrazów, który musi zostać skorygowany pod kątem dryfu. Otwórz narzędzie do wyrównywania za pomocą aplikacji | Automatyczne wyrównywanie.... Zaznacz opcję Stos jako źródło obrazów i pierwszą płaszczyznę/punkt czasowy jako płaszczyznę odniesienia. Zaznacz stos za pomocą przycisku Stos źródłowy i kliknij przycisk Zastosuj.
    UWAGA: Automatyczne wyrównanie zajmie trochę czasu i mocy obliczeniowej, ale jest dobrym sposobem na skorygowanie dużych stosów pod kątem dryfu konfiguracji mikroskopu. To automatyczne wyrównanie działa dobrze, jeśli uwzględnione są mikrosfery, ale może również działać bez nich.
  5. Zapisz wyrównany stos.
  6. Użyj ROIs.
    UWAGA: Fluorescencyjna mikroskopia poklatkowa z łatwością tworzy duże zestawy plików danych, które zajmują dużo mocy obliczeniowej i spowalniają dalsze przetwarzanie tych filmów. Dlatego zdecydowanie zalecamy zidentyfikowanie ROI i odizolowanie komórek do pracy z mniejszymi plikami.
    1. Wybierz narzędzie Region prostokątny. Utwórz ROI wokół interesujących komórek, ręcznie rysując ROI na obrazie kontrastu fazowego. Upewnij się, że interesujące komórki są widoczne i ostre przez cały czas trwania filmu poklatkowego.
    2. Otwórz film poklatkowy drugiej długości fali tego samego zestawu danych. Aby przenieść ROI z obrazów kontrastu fazowego na obrazy fluorescencyjne drugiej długości fali, użyj narzędzia Transferuj regiony za pomocą opcji Regiony | Regiony transferowe. Wybierz zestaw danych kontrastu fazowego jako obraz źródłowy, a drugi zestaw danych długości fali jako obraz docelowy. Wybierz Wszystkie regiony i naciśnij OK.
    3. Powtórz krok 4.6.2 dla każdej długości fali uzyskanej dla tego samego zestawu danych.
    4. Wybierz ROI i zduplikuj go jako stos za pomocą punktu menu Edytuj | Duplikat | Stos... lub naciśnij Shift + Ctrl + D. Następnie zapisz zduplikowany stos za pomocą punktu menu Plik | Zapisz w tym samym folderze, w którym znajdują się oryginalne dane.
    5. Powtórz krok 4.6.4 dla każdego zwrotu z inwestycji dla każdej długości fali uzyskanej dla tego samego zestawu danych
  7. Aby wygenerować film w formatach MOV lub AVI, otwórz funkcję Make Movie za pomocą Stack | Zrób film. Wybierz nagrania poklatkowe za pomocą przycisku Stos źródłowy. Wybierz format wyjściowy, liczbę klatek na sekundę, liczbę klatek i kliknij przycisk Zapisz.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M. xanthus to wolno rosnąca bakteria, która porusza się po powierzchniach stałych. Aby przetestować naszą konfigurację eksperymentalną, przeprowadziliśmy eksperyment poklatkowy z ruchliwymi ogniwami DK1622 WT. Obrazy kontrastu fazowego były rejestrowane w odstępach 5 minut przez 24 godziny (Rysunek 2A, B). Większość komórek wyrównała się w grupy. Zgodnie z oczekiwaniami komórki wykazywały ruchliwość i poruszały się głównie w grupach. Ponadto zaobserwowaliśmy, że komórki czasami zmieniały kierunek ruchu. Wyniki te sugerują, że komórki WT w badanych warunkach zachowują się normalnie pod względem ruchliwości komórek. Jednak nawet gdy komórki są rejestrowane co 5 minut, identyfikacja poszczególnych komórek jest trudna. Co więcej, ponieważ komórki są ruchliwe, wiele komórek ucieka lub wchodzi w pole widzenia, co utrudnia śledzenie komórek przez dłuższy czas.

Aby śledzić te same komórki M. xanthus przez kilka rund cyklu komórkowego za pomocą obrazowania żywych komórek, poszczególne szczepy mogą zostać usunięte dla genu mglA, który jest niezbędny dla ruchliwości25. Zapobiega to przemieszczaniu się komórek poza pole widzenia podczas protokołu obrazowania. Delecje w ramce są generowane zgodnie z opisem Shi i wsp. 26

Zgodnie z oczekiwaniami, w obrazowaniu żywych komórek z kontrastem fazowym z nieruchliwymi komórkami ΔmglA (Rysunek 3), komórki nie wykazywały aktywnego ruchu. Byliśmy w stanie śledzić wzrost i podział poszczególnych komórek podczas tworzenia mikrokolonii. Na podstawie nagrań poklatkowych, w których obrazy były rejestrowane w odstępach 5 minut przez 24 godziny, możliwe było ilościowe określenie czasu podziału (czasu między dwoma zdarzeniami podziału komórki) z rozdzielczością pojedynczej komórki. Komórki mutanta ΔmglA miały czas między podziałami wynoszący 235 ± 50 minut (n = 97 komórek). Przy około 4 godzinach czas podziału jest podobny do czasu podwojenia mierzonego w kulturach zawiesinowych dla komórek WT. Dostarcza to dowodów na to, że komórki M. xanthus rosną optymalnie w tych warunkach eksperymentalnych.

Aby zbadać, czy nasza konfiguracja pozwala komórkom normalnie rosnąć podczas śledzenia białek znakowanych YFP przez długi czas, przeprowadziliśmy fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe z komórkami M. xanthus, które wyrażają białko oznaczone YFP. W tym celu podążaliśmy za ParB-YFP jako markerem pochodzenia replikacji (ori). ParB jest składnikiem systemu ParABS w M. xanthus i wiąże się z miejscami parS proksymalnie do orni; W związku z tym można śledzić duplikację pochodzenia i segregację chromosomów19,20,21. Dzięki akwizycji obrazu (kontrast fazowy i fluorescencja, czas akwizycji 200 ms w kanale YFP) co 20 minut, komórki rosły, dzieliły się i wykazywały wzrost nawet po 24 godzinach (Rysunek 4A). Na początku nagrań ParB-YFP utworzył dwa klastry w regionach subpolarnych w większości komórek (Rysunek 4A). Na krótko przed lub po podziale komórki, subpolarny klaster ParB-YFP na starym biegunie komórkowym uległ powieleniu. Jedna z dwóch gromad pozostała na starym biegunie komórki, podczas gdy druga kopia przeniosła się na nowy biegun komórki, osiągając swoją ostateczną pozycję subpolarną po około 40 - 60 minutach (Rysunek 4A, B). Obserwacje te są zgodne z wcześniejszymi danymi wygenerowanymi na podstawie krótkich nagrań poklatkowych przy użyciu cienkich padów agarowych19. Wnioskujemy, że ta eksperymentalna konfiguracja pozwala fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej śledzić segregację chromosomów w ciągu kilku cykli komórkowych w wolno rosnących komórkach M. xanthus, bez zakłócania wzrostu komórek lub maszynerii segregacji chromosomów.

W podobnym eksperymencie staraliśmy się śledzić markery podziału komórek za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej. Podobnie jak prawie wszystkie inne bakterie, M. xanthus wymaga FtsZ, bakteryjnej tubuliny podobnej do tubuliny GTPazy do podziału komórek16,17,18. FtsZ tworzy strukturę przypominającą pierścień w komórce środkowej, tak zwany pierścień Z, który pomaga rekrutować wszystkie inne białka wymagane do podziału komórki27,28. U M. xanthus tworzenie pierścienia Z i jego pozycjonowanie w komórce środkowej jest stymulowane przez trzy białka PomXYZ16,17. Te trzy białka tworzą kompleks związany z chromosomami, który przenosi się przez nukleoid z miejsca podziału komórki w komórce "matki" do środka nukleoidu w dwóch komórkach potomnych. Środek nukleoidu zbiega się ze środkiem komórki, przed segregacją chromosomów, a tutaj kompleks PomXYZ rekrutuje FtsZ i stymuluje tworzenie pierścienia Z.

Tutaj najpierw obserwowaliśmy nieruchome komórki wyrażające ftsZ-gfp. Ponieważ FtsZ-GFP ogólnie wykazuje słabszy sygnał fluorescencji niż ParB-YFP, zwiększyliśmy czas ekspozycji 5-krotnie do 1 s w kanale GFP. Zgodnie z oczekiwaniami, silną akumulację FtsZ-GFP zaobserwowano tylko w środkowej komórce i ta lokalizacja dyktowała pozycję zwężenia podziału komórki (Figura 5A). FtsZ-GFP głównie tworzył klaster w środkowej komórce w dłuższej komórce. Było również oczywiste, że ta gromada z czasem zyskiwała na intensywności. Po podziale komórki zaobserwowaliśmy, że FtsZ-GFP ponownie gromadzi się w komórce środkowej w dwóch komórkach potomnych około 2 godziny później (Rysunek 5B). Jest to zgodne z odkryciem, że około 50% komórek w populacji wykazuje lokalizację FtsZ w środkowej komórce na podstawie analizy snap-shot16,17.

W drugim eksperymencie przez 24 godziny obserwowaliśmy nieruchliwe komórki ΔmglA, które wykazują ekspresję mCherry-pomX. Jako część systemu PomXYZ, PomX pomaga kierować tworzeniem i pozycjonowaniem pierścienia Z, stymulując w ten sposób podział komórek w midcell16. Sygnał fluorescencyjny mCherry-PomX jest silny i pozwala na czas ekspozycji w kanale fluorescencji wynoszący 250 ms. Co ważne, wszystkie komórki urosły i wykazywały zdarzenie podziału komórek w trakcie eksperymentu, tworząc mikrokolonie po 24 godzinach (Rysunek 6A). Jak wcześniej informowaliśmy16, prawie wszystkie komórki zawierały klaster mCherry-PomX. Większość z nich zlokalizowana jest w komórce środkowej i skupia się z dala od komórki środkowej, która przemieszcza się do komórki środkowej w trakcie trwania eksperymentu. Podczas podziałów komórkowych klastry mCherry-PomX zostały podzielone, przy czym każda komórka potomna otrzymała klaster. W przeciwieństwie do FtsZ-GFP, mCherry-PomX lokalizował się w środkowej komórce 80 - 90% cyklu komórkowego i osiągnął tę pozycję wkrótce po podziale komórki (Figura 6B).

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat zestawu eksperymentalnego użytego w tym badaniu. (A) Metalowa lub plastikowa rama służy jako podpora dla próbki. Szkiełko nakrywkowe jest przymocowane do metalowej ramy za pomocą taśmy w celu zmniejszenia ruchu próbki. (B) Widok z boku na układ próbki doświadczalnej. Komórki są montowane na szkiełku nakrywkowym pokazanym w (A). Podkładka agarozowa, która dostarcza składniki odżywcze i wilgoć do komórek, jest umieszczana na wierzchu komórek. Płatek agarozowy jest pokryty dodatkowym szkiełkiem nakrywkowym w celu zmniejszenia parowania. Aby uzyskać wysokiej jakości obrazy, używany jest obiektyw z 100-krotnym kontrastem fazowym zanurzeniowym w oleju. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Mikroskopia poklatkowa z kontrastem fazowym komórek WT M. xanthus. Komórki obserwowano przez 24 godziny, a obrazy uzyskiwano co 5 minut. (A) Pokazywane są reprezentatywne obrazy tego samego pola widzenia co 5 minut. Kolorowe strzałki wskazują kierunkowość ruchu poszczególnych komórek. Ten sam kolor oznacza tę samą komórkę w czasie. Liczby wskazują czas w minutach. Pasek skali: 5 μm. (B) Obrazy tego samego pola widzenia są wyświetlane po każdej godzinie. Zauważ, że pokazane jest to samo pole widzenia, ale ponieważ komórki się poruszają, komórki stale wchodzą i opuszczają pole widzenia. Liczby wskazują czas w godzinach. Podziałka skali: 5 μm. PH: kontrast fazowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Mikroskopia poklatkowa z kontrastem fazowym nieruchliwych komórek M. xanthus. Komórki ΔmglA obserwowano przez 24 godziny. Obrazy były rejestrowane co 5 minut, a reprezentatywne obrazy są wyświetlane po każdej godzinie. Zaznaczone przewężenia podziału komórek są oznaczone pomarańczowymi strzałkami. Liczby wskazują czas w godzinach. PH: kontrast fazowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Fluorescencyjna mikroskopia poklatkowa ParB-YFP w nieruchliwych komórkach M. xanthus. Komórki mutanta ΔmglA wykazującego ekspresję parB-yfp w obecności natywnego parB (SA4749; ΔmglA; parB+/PnatparB-yfp) obserwowano przez 24 godziny za pomocą kontrastu fazowego i mikroskopii fluorescencyjnej. (A) Obrazy były rejestrowane co 20 minut, a reprezentatywne obrazy co godzinę do 10 godzin, wraz z tymi samymi komórkami po 24 godzinach. Obrazy są wyświetlane w kontraście fazowym (PH) oraz jako nakładka kontrastu fazowego i sygnału YFP. Wybrane podziały komórek są oznaczone pomarańczowymi strzałkami. Białe i zielone strzałki wskazują zdarzenia duplikacji klastra ParB-YFP, a zielone strzałki oznaczają gromadę translokacyjną. Liczby wskazują czas w godzinach. Pasek skali: 5 μm. (B) Obrazy zostały uzyskane jak w (A), ale są wyświetlane w wyższej rozdzielczości czasowej. Liczby wskazują czas w minutach. Strzałki są jak w (A). Podziałka skali: 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Fluorescencyjna mikroskopia poklatkowa FtsZ-GFP w nieruchliwych komórkach M. xanthus. Komórki mutanta ΔmglA wykazującego ekspresję ftsZ-gfp w obecności natywnego ftsZ (SA8241; ΔmglA; ftsZ+/PnatftsZ-gfp) obserwowano przez 24 godziny za pomocą kontrastu fazowego i mikroskopii fluorescencyjnej. (A) Obrazy były rejestrowane co 20 minut, a reprezentatywne obrazy co godzinę do 10 godzin, wraz z tymi samymi komórkami po 24 godzinach. Obrazy są wyświetlane w kontraście fazowym (PH) oraz jako nakładka kontrastu fazowego i sygnału GFP. Wybrane podziały komórek są oznaczone pomarańczowymi strzałkami. Białe strzałki wskazują klastry FtsZ-GFP w komórce środkowej. Liczby wskazują czas w godzinach. Pasek skali: 5 μm. (B) Obrazy zostały uzyskane jak w (A), ale są wyświetlane w wyższej rozdzielczości czasowej. Liczby wskazują czas w minutach. Zielone i białe strzałki oznaczają klastry FtsZ-GFP odpowiednio w lewej i prawej komórce. Pomarańczowe strzałki wskazują podziały komórek. Podziałka skali: 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Fluorescencyjna mikroskopia poklatkowa mCherry-PomX w nieruchliwych komórkach M. xanthus. Nieruchliwe komórki ΔpomX gromadzące mCherry-PomX (SA4797; ΔmglA; ΔpomX/PpomZ mCherry-pomX) obserwowano przez 24 godziny za pomocą kontrastu fazowego i mikroskopii fluorescencyjnej co 20 minut. (A) Reprezentatywne obrazy co godzinę do 10 godzin są pokazane, razem z tymi samymi komórkami po 24 godzinach. Obrazy są wyświetlane w kontraście fazowym (PH) oraz jako nakładka kontrastu fazowego i sygnału mCherry. Wybrane podziały komórek są oznaczone pomarańczowymi strzałkami. Białe i zielone strzałki wskazują klastry mCherry-PomX odpowiednio przed i po zdarzeniach podziału. Liczby wskazują czas w godzinach. Podziałka skali: 5 μm. (B) Obrazy zostały uzyskane jak w (A) i są wyświetlane w wyższej rozdzielczości czasowej. Strzałki są jak w (A). Podziałka skali: 5 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Szczep bakteryjny Istotny genotyp1 odniesienie DK1622 powiedział: Dzika czcionka 23 Zobacz materiał SA4420 ΔmglA 24 Zobacz materiał SA4749 ΔmglA; parB+/attB::PnatparB-yfp (pAH7) W ramach tego badania Zobacz materiał SA4797 ΔmglA; ΔpomX/ attB::PpomZ mCherry-pomX (pAH53) 16 Zobacz materiał SA8241 ΔmglA; ftsZ+/ mxan18-19::PnatftsZ-gfp (pDS150) W ramach tego badania Plazmidy w nawiasach zawierają wskazane fuzje genów i były interbramowane we wskazanych miejscach genomu.
Plazmidy zintegrowane w miejscu attB lub regionie międzygenowym mxan18-19 ulegały ekspresji od
ich natywny promotor (Pnat) lub natywny promotor pomZ (PpomZ).

Tabela 1: Lista szczepów bakteryjnych użytych w tym badaniu.

plazmidy Istotne cechy odniesienie pAH7 powiedział: Pnat parB-yfp; Mx8 attP; TetR Rozdział 19 Zobacz materiał pAH53 PpomZ mCherry-pomX; Mx8 attP ; KmR 16 pDS150 1 Pnat ftsZ-gfp ; mxan18-19 ; TetR W ramach tego badania pMR3691 powiedział: Plazmid do indukowanej wanilią ekspresji genów Rozdział 18 Zobacz materiał pKA51 Pnat ftsZ-gfp ; Mx8 attP; TetR 17 1 pDS150: pDS150 jest pochodną pKA51, w której miejsce Mx8 attP zostało zastąpione regionem międzygenowym mxan18-19.
W tym celu region międzygenowy mxan18-19 amplifikowano z pMR3691 za pomocą starterów Mxan18-19 fwd BsdRI
(GCGATCATTGCGCCCCAGACGATAACAGGC) oraz Mxan18-19 rev BlpI
(GCGGCTGAGCCCGCGCCCGAACCGCAACCGCAACC) i sklonowane do pKA51.

Tabela 2: Lista plazmidów użytych w tym badaniu.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescencyjne obrazowanie żywych komórek stało się potężnym narzędziem do badania czasoprzestrzennej dynamiki komórek bakteryjnych. Poklatkowa mikroskopia fluorescencyjna ruchliwych i wolno rosnących bakterii, takich jak M. xanthus, była jednak wyzwaniem i była wykonywana tylko przez krótki czas. W tym miejscu przedstawiamy łatwą w użyciu i solidną metodę obrazowania żywych komórek M. xanthus za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda pozwala użytkownikowi śledzić komórki i znakowane fluorescencyjnie białka przez kilka rund cyklu komórkowego z rozdzielczością pojedynczej komórki.

Istnieje kilka warunków wstępnych, które wpływają na powodzenie obrazowania żywych komórek wolno rosnących komórek M. xanthus , w tym: 1) solidna powierzchnia do przyczepiania komórek; 2) dostępność składników odżywczych i tlenu; 3) stała wilgotność i temperatura; oraz 4) optymalizacja warunków eksperymentalnych, takich jak czas ekspozycji i częstotliwość pozyskiwania obrazu.

W naszym eksperymentalnym zestawie używamy grubych płatków agarozowych uzupełnionych składnikami odżywczymi. Używanie grubych płatków agarozowych w przeciwieństwie do urządzeń mikroprzepływowych do śledzenia pojedynczych komórek ma pewne podstawowe zalety, ale także pewne wady. Po pierwsze, podkładka agarozowa nie tylko zapewnia powierzchnię do przyczepiania się i ruchu komórek M. xanthus, ale także wystarczającą ilość składników odżywczych do wzrostu przez co najmniej 24 godziny. Po drugie, analizy snap shot powszechnie stosowane do badania wewnątrzkomórkowej lokalizacji białek znakowanych fluorescencyjnie przeprowadzono wcześniej na tym samym typie płatków agarozowych 16,17,29. W związku z tym dane z analiz typu snap shot mogą być bezpośrednio porównywane z danymi uzyskanymi za pomocą opisanej tutaj metody. Po trzecie, płatki agarozowe można łatwo modyfikować i uzupełniać antybiotykami lub innymi suplementami, takimi jakCuSO4 i wanilinian, które są powszechnie stosowane do indukcji ekspresji genów18,30. Wreszcie, ponieważ komórki mogą tworzyć mikrokolonie w trakcie eksperymentu, ta konfiguracja pozwala również na badanie wpływu bezpośrednich interakcji komórka-komórka na konkretny analizowany parametr. Ten aspekt jest szczególnie ważny w przypadku M. xanthus, ponieważ bakteria ta wykazuje kilka interakcji zależnych od kontaktu. Główną wadą tej metody jest to, że warunki eksperymentu są ustawione na czas trwania eksperymentu. Z kolei urządzenia mikroprzepływowe na ogół pozwalają na zmianę warunków doświadczalnych w trakcie eksperymentu poprzez dodanie na przykład antybiotyków31.

Dostępne są darmowe pakiety oprogramowania (np. MicrobeJ, Oufti) do automatycznej analizy wzrostu pojedynczych komórek i lokalizacji białek w poszczególnych komórkach. Jednak oprogramowanie to doskonale nadaje się tylko do analizy pojedynczych komórek lub małych grup komórek. W związku z tym wyzwaniem pozostaje automatyczna analiza danych generowanych dla opisywanych tu nagrań 24 h.

Podsumowując, opisaliśmy łatwy w użyciu i powtarzalny protokół do wykonywania obrazowania żywych komórek z wolno rosnącymi bakteriami M. xanthus . Pokazujemy, że proste płatki agarozowe uzupełnione składnikami odżywczymi są wystarczające do podtrzymania wzrostu przez co najmniej 24 godziny i pozwalają na obserwację i analizę lokalizacji i wzrostu białek z rozdzielczością pojedynczej komórki przez kilka pokoleń.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Niemiecką Radę ds. Badań Naukowych (DFG) w ramach Transregio 174 "Czasoprzestrzenna dynamika komórek bakteryjnych" oraz Towarzystwo Maxa Plancka.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMI6000B z AFCLeica microsystems11888945Automatyczny odwrócony mikroskop fluorescencyjny szerokokątny z adaptacyjną kontrolą ostrości
Uniwersalna rama montażowa11532338 Leica microsystemsUchwyt stolika dla różnych rozmiarów próbek 
Olej HCX PL FLUOTAR 100x/1.30 PH3Leica microsystems11506197Obiektyw z kontrastem fazowym
Kamera Orca Flash 4.0Hamamatsu115329524,0 megapikselowa kamera sCMOS do akwizycji zdjęć
Zestaw filtrów TXR ET, kLeica microsystems11504170Zestaw filtrów fluorescencyjnych, Ex: 560/40 Em: 645/75
Zestaw filtrów L5 ET, kLeica microsystems11504166Zestaw filtrów fluorescencyjnych, Ex: 480/40 Em: 527/30
Zestaw filtrów YFP ET, kLeica microsystems11504165, Ex: 500/20 Em: 535/30
ProScan III WcześniejszyH117N1, V31XYZEF, PS3J100Sterownik automatyki mikroskopu z interaktywnym centrum sterowania
Źródło światła EL 6000Leica microsystems11504115Zewnętrzne fluorescencyjne źródło światła
Inkubator BLX BlackPecon11532830komora inkubacyjna otaczająca mikroskop
Tempcontrol 37-2 cyfrowe11521719mikrosystemów LeicaAutomatyczna kontrola temperatury w komorze inkubacyjnej
Siarczan gentmycynyCarl Roth0233.4Gentamycyna
Oksytetracylina dihydratSigma Aldrich201-212-8Oxytetracyklina
Siarczan kanamycynyCarl RothT832.3Kanamycin
Filtropur BT25 0,2 filtr butelkowySarstedt831,822,101Filtr butelkowy do sterylizacji
Deckglä serVWR630-1592Szkiełko nakrywkowe szklane (60 x 22 mm, grubość: 0,7 mm)
Seakem LE agarozaLonza50004Agaroza do szkiełek mikroskopowych
Leica Metamorph AFLeica microsystems11640901Oprogramowanie sterujące mikroskopem i oprogramowanie do analizy obrazu
Tetraspeck Microsperes, 0,5 i mikro; m ThermoFisherT7281Mikrosfery fluorescencyjne
szalka PetriegoGreiner Bio-one688102120 mm x 120 mm x 17 mm kwadratowa szalka Petriego do płatków agarozy
BD Bacto CasitoneBecton Dickinson225930Casitone
Parafilm MVWR291-1213Parafilm
Tris(hydroksymetylo)-aminometanCarl RothAE15.2Tris
Siarczan magnezu siedmiowodnyCarl RothP027.2Siarczan magnezu
Diwodorofosforan potasu p.d.Carl Roth3904.1Diwodorofosforan potasu
< mocny>1% Pożywka CTT: < / silna> 1 % (w/v) BD Bacto&; casitone, 10 mM Tris-HCl ph 8,0, 1 mM bufor fosforanu potasu pH 7,6, 8 mM MgSO4Pożywka uprawowa dla M.xanthus
TPM bufor: 10 mM Tris-HCl ph 8,0, 1 mM bufor fosforanu potasu pH 7,6, 8 mM MgSO4Bufor do przygotowania szkiełek mikroskopowych dla M.xanthus
Zestaw filtrów fluorescencyjnych

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shapiro, L., McAdams, H. H., Losick, R. Why and how bacteria localize proteins. Science. 326 (5957), 1225-1228 (2009).
  2. Treuner-Lange, A., Søgaard-Andersen, L. Regulation of cell polarity in bacteria. J Cell Biol. 206 (1), 7-17 (2014).
  3. Laloux, G., Jacobs-Wagner, C. Spatiotemporal control of PopZ localization through cell cycle-coupled multimerization. J Cell Biol. 201, 827-841 (2013).
  4. Rudner, D. Z., Losick, R. Protein subcellular localization in bacteria. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2 (4), 000307(2010).
  5. Badrinarayanan, A., Le, T. B. K., Laub, M. T. Bacterial chromosome organization and segregation. Annu Rev Cell Dev Biol. 31 (1), 171-199 (2015).
  6. Munoz-Dorado, J., Marcos-Torres, F. J., Garcia-Bravo, E., Moraleda-Munoz, A., Perez, J. Myxobacteria: Moving, Killing, Feeding, and Surviving Together. Front Microbiol. 7, 781(2016).
  7. Berleman, J. E., Kirby, J. R. Deciphering the hunting strategy of a bacterial wolfpack. FEMS Microbiol Rev. 33 (5), 942-957 (2009).
  8. Konovalova, A., Petters, T., Søgaard-Andersen, L. Extracellular biology of Myxococcus xanthus. FEMS Microbiol. Rev. 34, 89-106 (2010).
  9. Nudleman, E., Wall, D., Kaiser, D. Cell-to-cell transfer of bacterial outer membrane lipoproteins. Science. 309, 125-127 (2005).
  10. Vassallo, C. N., et al. Infectious polymorphic toxins delivered by outer membrane exchange discriminate kin in myxobacteria. eLife. 6, 29397(2017).
  11. Vassallo, C., et al. Cell rejuvenation and social behaviors promoted by LPS exchange in myxobacteria. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (22), 2939-2946 (2015).
  12. Li, Y., et al. Extracellular polysaccharides mediate pilus retraction during social motility of Myxococcus xanthus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5443-5448 (2003).
  13. Kim, S. K., Kaiser, D. Cell alignment required in differentiation of Myxococcus xanthus. Science. 249, 926-928 (1990).
  14. Lobedanz, S., Søgaard-Andersen, L. Identification of the C-signal, a contact dependent morphogen coordinating multiple developmental responses in Myxococcus xanthus. Genes Dev. 17, 2151-2161 (2003).
  15. Schumacher, D., Søgaard-Andersen, L. Regulation of cell polarity in motility and cell division in Myxococcus xanthus. Annu Rev Microbiol. 71 (1), 61-78 (2017).
  16. Schumacher, D., et al. The PomXYZ proteins self-organize on the bacterial nucleoid to stimulate cell division. Dev Cell. 41 (3), 299-314 (2017).
  17. Treuner-Lange, A., et al. PomZ, a ParA-like protein, regulates Z-ring formation and cell division in Myxococcus xanthus. Mol Microbiol. 87 (2), 235-253 (2013).
  18. Iniesta, A. A., Garcia-Heras, F., Abellon-Ruiz, J., Gallego-Garcia, A., Elias-Arnanz, M. Two systems for conditional gene expression in Myxococcus xanthus inducible by isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside or vanillate. J Bacteriol. 194 (21), 5875-5885 (2012).
  19. Harms, A., Treuner-Lange, A., Schumacher, D., Søgaard-Andersen, L. Tracking of chromosome and replisome dynamics in Myxococcus xanthus. reveals a novel chromosome arrangement. PLoS Genet. 9 (9), 1003802(2013).
  20. Iniesta, A. A. ParABS system in chromosome partitioning in the bacterium Myxococcus xanthus. PLoS One. 9 (1), 86897(2014).
  21. Lin, L., Osorio Valeriano, M., Harms, A., Søgaard-Andersen, L., Thanbichler, M. Bactofilin-mediated organization of the ParABS chromosome segregation system in Myxococcus xanthus. Nat Commun. 8 (1), 1817(2017).
  22. Hodgkin, J., Kaiser, D. Cell-to-cell stimulation of movement in nonmotile mutants of Myxococcus. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (7), 2938-2942 (1977).
  23. Kaiser, D. Social gliding is correlated with the presence of pili in Myxococcus xanthus. Proc Natl Acad Sci USA. 76 (11), 5952-5956 (1979).
  24. Miertzschke, M., et al. Structural analysis of the Ras-like G protein MglA and its cognate GAP MglB and implications for bacterial polarity. EMBO J. 30 (20), 4185-4197 (2011).
  25. Hodgkin, J., Kaiser, D. Genetics of gliding motility in Myxococcus xanthus. (Myxobacterales): Two gene systems control movement. Mol Gen Genet. 171, 177-191 (1979).
  26. Shi, X., et al. Bioinformatics and experimental analysis of proteins of two-component systems in Myxococcus xanthus. J Bacteriol. 190 (2), 613-624 (2008).
  27. Bi, E. F., Lutkenhaus, J. FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli. Nature. 354 (6349), 161-164 (1991).
  28. Lutkenhaus, J., Pichoff, S., Du, S. Bacterial cytokinesis: From Z ring to divisome. Cytoskeleton. 69 (10), 778-790 (2012).
  29. McLoon, A. L., et al. MglC, a Paralog of Myxococcus xanthus GTPase-Activating Protein MglB, Plays a Divergent Role in Motility Regulation. J Bacteriol. 198 (3), 510-520 (2015).
  30. Gomez-Santos, N., et al. Comprehensive set of integrative plasmid vectors for copper-inducible gene expression in Myxococcus xanthus. Appl Environ Microbiol. 78 (8), 2515-2521 (2012).
  31. Treuner-Lange, A., et al. The small G-protein MglA connects to the MreB actin cytoskeleton at bacterial focal adhesions. J Cell Biol. 210 (2), 243-256 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cykl kom rkowy bakteriimikroskopia poklatkowasegregacja chromosom wpodzia kom rkowyobrazowanie w kontra cie fazowymledzenie bia ek fluorescencyjnychprzygotowanie podk adek agarozowychkonfiguracja mikroskopu

Powiązane artykuły