To, gdzie tniesz, ma znaczenie: przewodnik po sekcji i analizie orientacji przestrzennej siatkówki myszy na podstawie punktów orientacyjnych oczu

Ważnym i czasami pomijanym aspektem neuronauki siatkówki jest prawidłowa orientacja i analiza izolowanej siatkówki całomocnej, czy to orientacji siatkówki w komorze rejestrującej elektrofizjologię, czy na szkiełku histologicznym. Jest to szczególnie ważne w przypadku badań z udziałem siatkówki myszy, która jest obecnie najpowszechniej wykorzystywanym modelem do badań układu wzrokowego ssaków. Ostatnie odkrycia ujawniają, że siatkówka myszy nie jest jednorodna przestrzennie, ale ma gradienty gęstości i wielkości funkcjonalnie odrębnych typów komórek siatkówki, takich jak komórki zwojowe melanopsyny, przejściowe komórki zwojowe OFF-alfa i stożkowe opsyny^1,2,3,4,5. W związku z tym metoda zastosowana do określenia orientacji siatkówki może mieć wpływ na wyniki eksperymentalne dotyczące typu komórki lub rozkładu opsyny^2,3,6, dostrajanie kierunku selektywnych komórek zwojowych^7,8,9 oraz topograficzne wzorce zwyrodnienia siatkówki^{10,11,12,13,14}. W rzeczywistości nieinformowanie o tym, w jaki sposób zgłaszana jest orientacja siatkówki, może powodować rozbieżności w literaturze i zamieszanie podczas próby porównania danych między badaniami. Dlatego tak ważne jest, aby naukowcy przedstawili metodę identyfikacji orientacji siatkówki, aby można było dokładnie zinterpretować wyniki takich badań.

Orientacja siatkówki jest zwykle identyfikowana na podstawie oceny rogówki grzbietowej, brzusznej, nosowej lub skroniowej przed enukleacją oka^1,3^{,12,15,16,17,18,19} lub wycinając lub barwiąc głębokie anatomiczne punkty orientacyjne oka, takie jak mięśnie zewnątrzgałkowe^6,7, szczelina naczyniówki^20,21, lub gradient s-opsin^2,3. Mięśnie proste można wykorzystać do identyfikacji siatkówki grzbietowej, brzusznej, nosowej i skroniowej poprzez wykonanie głębokiego cięcia łagodzącego, które przecina na pół przyczep odpowiednio mięśnia prostego górnego, prostego dolnego, prostego przyśrodkowego lub bocznego mięśnia prostego. Jednak w większości eksperymentów użycie jednego mięśnia prostego jest wystarczające do orientacji siatkówki²². Szczelina naczyniówki, która jest pozostałością po rozwoju oka, może być postrzegana jako słaba pozioma linia z tyłu oka. Każdy koniec tej linii kończy się na biegunie nosowym lub skroniowym globu²³. Wreszcie, ekspresja s-opsyny jest asymetrycznie rozprowadzana do brzusznej siatkówki u myszy, a przeciwciała s-opsyny mogą być użyte do odsłonięcia siatkówki brzusznej w eksperymentach immunohistochemicznych¹.

Ostatnia praca Stabio, et al.²² wykazał, że powierzchowne punkty orientacyjne oka, takie jak oparzenia rogówki, są mniej wiarygodną metodą orientowania siatkówki w przestrzeni anatomicznej, najprawdopodobniej z powodu błędu ludzkiego i zmienności w powodowaniu oparzenia rogówki podczas używania skroniowej i przyśrodkowej kanty jako punktów odniesienia. W przeciwieństwie do tego, wykazano, że głębokie punkty orientacyjne, takie jak mięsień prosty górny, szczelina naczyniówki i gradient s-opsyny, są bardziej wiarygodnymi i dokładnymi punktami orientacyjnymi do orientacji siatkówki²². Jednak identyfikacja tych anatomicznych punktów orientacyjnych wymaga unikalnych etapów sekcji, które nie są szczegółowo opisane w literaturze. Dlatego celem tego protokołu jest zapewnienie kompleksowego samouczka na temat tego, jak używać mięśnia prostego górnego, szczeliny naczyniówki i gradientu s-opsyny do dokładnej identyfikacji orientacji przestrzennej siatkówki myszy. Ponadto dołączyliśmy porównanie skuteczności dwóch przeciwciał s-opsyny, a także protokół immunohistochemii s-opsyny.

Dodatkowym wyzwaniem dla badań opierających się na precyzyjnej orientacji siatkówki są duże nacięcia odciążające wymagane do spłaszczenia całych siatkówk na komorze rejestracyjnej, czaszy lub szkiełku. Może to stanowić wyzwanie dla analizy tego, co naturalnie jest strukturą trójwymiarową, gdy jest obrazowane jako płaska struktura dwuwymiarowa. Program o nazwie Retistruct²⁴ może być użyty do przywrócenia płaskiej, całościowej siatkówki do jej trójwymiarowej struktury, zanim zebrane z niej dane zostaną przeanalizowane. W związku z tym sekcja tego protokołu jest poświęcona podkreśleniu kroków, które są niezbędne do użycia oprogramowania Retistruct do rekonstrukcji siatkówek myszy barwionych immunologicznie s-opsyną. Dołączyliśmy również sekcję protokołu do korzystania z naszego niestandardowego skryptu MATLAB, który został opracowany do dokładnego obracania i orientowania siatkówek myszy zabarwionych s-opsyną.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu w Akron.

1. Używanie punktu orientacyjnego mięśnia prostego górnego do identyfikacji orientacji siatkówki

UWAGA: Mięsień prosty górny jest punktem orientacyjnym dla siatkówki grzbietowej (Tabela 1). Jeśli eksperyment nie wymaga znakowania siatkówki grzbietowej, pomiń krok 1 i przejdź do kroku 2.

1. Postępuj zgodnie z zatwierdzonym przez siebie protokołem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt w sprawie eutanazji myszy.
2. Aby określić ogólną orientację kuli ziemskiej, natychmiast po eutanazji wykonaj ślad wypalenia na grzbietowej rogówce bezpośrednio między kantą nosową a skroniową w pobliżu granicy rogówki-twardówki (Ryc. 1A). Zrób ślad oparzenia, podgrzewając pisak kauteryzacyjny przez dziesięć sekund, a następnie dotykając końcówką pisaka do grzbietowej rogówki przez mniej niż sekundę.
   UWAGA: Zbyt długie przytrzymanie pisaka kauterycznego przy rogówce spowoduje przebicie gałki ziemskiej.
   UWAGA: Podczas gdy niektóre pisaki kauteryczne emitują światło, pisak kauteryczny wymieniony w Tabeli materiałów nie emituje światła po podgrzaniu, co czyni go bezpieczną opcją do eksperymentów dostosowanych do ciemności.
3. Do enukleacji użyj zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie wypchnąć oko z oczodołu i chwycić gałkę od spodu. Nie przecinaj nerwu wzrokowego w celu usunięcia gałki ocznej; Zamiast tego powoli wyjmij kulę ziemską z gniazda, jednocześnie delikatnie przesuwając ją od lewej do prawej, aż kula zostanie zwolniona z gniazda.
   UWAGA: Ten ruch pozwoli mięśniom prostym pozostać przyczepionymi do gałki ziemskiej, gdy gałka ziemska zostanie ostatecznie całkowicie usunięta z panewki. Nerw wzrokowy również często pozostaje przyczepiony do gałki ocznej.
4. Przenieść kulę ziemską z dołączonymi mięśniami prostymi na szalkę Petriego zawierającą podłoże preparacyjne. Upewnij się, że śledzisz, które oko jest lewym okiem, a które prawym.
   UWAGA: Sekcja powinna używać odpowiedniego podłoża preparacyjnego, które jest zgodne z ich protokołem eksperymentalnym.
5. W zakresie sekcji zlokalizuj wizualnie oparzenie grzbietowej rogówki i zidentyfikuj górny mięsień prosty z którym jest ono związane (Rysunek 1A).
6. Za pomocą nożyczek preparacyjnych lub igły 20 G (0,9 mm x 25 mm) (patrz Tabela materiałów) nakłuć rogówkę w miejscu oparzenia. Wykonaj głębokie nacięcie łagodzące w kuli w kierunku nerwu wzrokowego, aby przeciąć mięsień górny. Wyizolowaną i zrekonstruowaną siatkówkę z tym cięciem pokazano na rycinach 1B i 1C.
7. Rozpocznij izolowanie siatkówki, używając dwóch zestawów kleszczy (patrz Tabela materiałów), aby delikatnie rozerwać otwór wykonany za pomocą nakłucia w kroku 1.6, aż część siatkówki zostanie odsłonięta.
   UWAGA: Ważne jest, aby robić to delikatnie, ponieważ zbyt mocne rozdarcie może spowodować dalsze rozdarcie rany.
8. Użyj kleszczy, aby oddzielić siatkówkę od twardówki, aż twardówka zostanie całkowicie usunięta. Usuń tęczówkę, soczewkę, ciało szkliste i wszelkie pozostałe struktury za pomocą kleszczy, aż siatkówka zostanie całkowicie odizolowana.
   UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany. Jeśli tkanka ma zostać unieruchomiona do immunohistochemii s-opsyny, przejdź do kroku 3.5.

2. Używanie punktu orientacyjnego szczeliny naczyniówki do identyfikacji orientacji siatkówki

UWAGA: Szczelina naczyniówki znajduje się na twardówce z tyłu oka i biegnie od bieguna skroniowego do bieguna nosowego (Ryc. 2B i 2C; Tabela 1).

1. Postępuj zgodnie z zatwierdzonym protokołem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt w sprawie eutanazji myszy.
2. Aby określić ogólną orientację kuli ziemskiej, natychmiast po eutanazji wykonaj ślad wypalenia na grzbietowej rogówce bezpośrednio między kantą nosową a skroniową w pobliżu granicy rogówka-twardówka (Ryc. 2A). Zrób ślad oparzenia, podgrzewając pisak kauteryzacyjny przez dziesięć sekund, a następnie dotykając końcówką pisaka do grzbietowej rogówki przez mniej niż sekundę.
   UWAGA: Zbyt długie przytrzymanie długopisu kauterycznego przy rogówce spowoduje przebicie gałki ziemskiej.
3. Wyłuszczyć oko i przenieść gałkę ziemską na szalkę Petriego zawierającą pożywkę separacyjną. Upewnij się, że śledzisz, które oko jest lewym okiem, a które prawym.
   UWAGA: Sekcja powinna używać odpowiedniego podłoża preparacyjnego, które jest zgodne z ich protokołem eksperymentalnym.
4. Wizualnie zlokalizuj i zidentyfikuj szczelinę naczyniówki z tyłu oka (Ryc. 2B, 2C).
   UWAGA: Szczelina naczyniówki jest również widoczna wewnątrz muszli ocznej w świetle podczerwonym²⁰.
5. Ustaw kulę ziemską na szalce Petriego tak, aby oparzenie grzbietowe znajdowało się na górnym biegunie, tak jak by to było, gdyby oko nadal znajdowało się u myszy.
   UWAGA: Obecność oparzenia grzbietowego pozwala na identyfikację nosowej i skroniowej strony gałki ziemskiej, o ile udokumentowano, czy jest to prawe, czy lewe oko: Jeśli jest to prawe oko, szczelina naczyniówki nosa będzie znajdować się po prawej stronie oparzenia, a skroniowa szczelina naczyniówki będzie po lewej stronie oparzenia. Jeśli jest to lewe oko, skroniowa szczelina naczyniówki będzie znajdować się po prawej stronie oparzenia, a szczelina naczyniówki nosa będzie po lewej stronie oparzenia.
   Za pomocą nożyczek preparacyjnych lub igły o gramaturze 20 G (0,9 x 25 mm) (patrz Tabela Materiałów) wykonaj jedno nakłucie w kuli ziemskiej, w której znajduje się oparzenie grzbietowe.
6. Wykonaj płytkie cięcie łagodzące w kierunku nerwu wzrokowego, w którym znajduje się oparzenie grzbietowej rogówki. Cięcie to będzie prostopadłe do szczeliny naczyniówki, co pozwoli na identyfikację siatkówki grzbietowej po izolacji (Rysunek 2D).
7. Wykonaj następujące dwa głębokie cięcia odciążające w kierunku nerwu wzrokowego: jedno poprzez wyłożenie ostrzy nożyczek preparacyjnych linią skroniowej szczeliny naczyniówki z tyłu oka, a drugie poprzez wyrównanie ostrzy nożyczek rozwarstwiających z linią szczeliny naczyniówki nosowej z tyłu oka. Cięcia te są pokazane na izolowanej i zrekonstruowanej siatkówce w Rysunek 2D i 2E.
   UWAGA: Alternatywnie można wykonać głębokie cięcie w skroniowej szczelinie naczyniówki, a płytkie cięcie można wykonać w szczelinie naczyniówki nosowej, dzięki czemu nie ma potrzeby cięcia grzbietowego oparzenia rogówki. Pozwala to na dokładną orientację siatkówki przy mniejszej liczbie nacięć odciążających.
8. Rozpocznij izolację siatkówki za pomocą dwóch zestawów kleszczyków (patrz Tabela materiałów), aby delikatnie rozerwać otwór wykonany za pomocą nakłucia w krokach 2.7 i 2.8, aż część siatkówki zostanie odsłonięta.
   UWAGA: Ważne jest, aby robić to delikatnie, ponieważ zbyt mocne rozdarcie może spowodować dalsze rozdarcie skaleczeń łagodzących.
9. Użyj kleszczy, aby oddzielić siatkówkę od twardówki, aż twardówka zostanie całkowicie usunięta. Usuń tęczówkę, soczewkę, ciało szkliste i wszelkie pozostałe struktury za pomocą kleszczy, aż siatkówka zostanie całkowicie odizolowana.
   UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany. Jeśli tkanka ma zostać unieruchomiona do immunohistochemii s-opsyny, przejdź do kroku 3.5.

3. Oznaczanie gradientu S-opsin w siatkówce myszy

UWAGA: Ekspresja fotopigmentu s-opsyna jest asymetrycznie rozłożona na brzuszną siatkówkę¹, co czyni go doskonałym markerem dla brzusznej połowy siatkówki. Ta metoda jest przydatna tylko w przypadku tkanek utrwalonych i wybarwionych immunologicznie (Tabela 1). Poniższe kroki można zastosować do siatkówki, która została wycięta przy użyciu dowolnej z wyżej wymienionych metod.

1. Postępuj zgodnie z zatwierdzonym protokołem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt w sprawie eutanazji myszy.
2. Bezpośrednio po eutanazji należy wyłuszczyć oko i umieścić gałkę ziemską na szalce Petriego z pożywką separacyjną. Upewnij się, że śledzisz, które oko jest lewym okiem, a które prawym okiem, aby określić orientację siatkówki po wypreparowaniu siatkówki.
   UWAGA: Sekcja powinna używać odpowiedniego podłoża preparacyjnego, które jest zgodne z ich protokołem eksperymentalnym.
3. Rozpocznij izolację siatkówki, używając dwóch zestawów kleszczy (tabela materiałów), aby delikatnie wyrwać otwór w rogówce, aż część siatkówki zostanie odsłonięta.
   UWAGA: Ważne jest, aby robić to delikatnie, ponieważ zbyt mocne rozdarcie może spowodować rozdarcie siatkówki.
4. Użyj kleszczy, aby oddzielić siatkówkę od twardówki, aż twardówka zostanie całkowicie usunięta. Usuń tęczówkę, soczewkę, ciało szkliste i wszelkie pozostałe struktury za pomocą kleszczy, aż siatkówka zostanie całkowicie odizolowana.
   UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany. Jeśli używasz siatkówki do eksperymentu ex vivo, przeprowadź eksperyment przed wykonaniem poniższych kroków.
5. Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj cztery odciążające nacięcia w siatkówce, tak aby leżała płasko. Zamontuj zwój siatkówki stroną z komórką do góry na membranie nitrocelulozowej (tabela materiałów), delikatnie dociskając każdy róg siatkówki do membrany za pomocą kleszczy.
   UWAGA: Lokalizacja nacięć odciążających może być dowolna w przypadku korzystania z gradientu s-opsyny do orientacji siatkówki.
6. Za pomocą kleszczy przenieś zamontowaną siatkówkę do pierwszego dołka w 24-dołkowej płytce (tabela materiałów) wypełnionej 1 ml 4% paraformaldehydu (tabela materiałów) w celu utrwalenia. Umieść 24-dołkową płytkę na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej (tabela materiałów) i utrwal siatkówkę dokładnie na 40 minut.
   UWAGA: Wszystkie poniższe etapy mycia i inkubacji należy wykonać za pomocą 24-dołkowej płytki na wytrząsarce orbitalnej.
7. Myj siatkówkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej, przenosząc ją do drugiej studzienki wypełnionej 1 ml 0,1 M PBS. Powtórz ten krok dwukrotnie, sekwencyjnie przenosząc siatkówkę do trzeciej i czwartej studzienki wypełnionej 0,1 M PBS.
8. Przenieść zamontowaną siatkówkę do piątego dołka zawierającego 1 ml roztworu blokującego (1,7% Triton X-100 i 5,2% normalnej surowicy osła w 0,1 M PBS; patrz tabela materiałów) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
9. Dodać królicze przeciwciało pierwszorzędowe anty-s-opsyny (patrz tabela materiałów) do roztworu blokującego w stężeniu 1:500 i inkubować przez trzy dni w temperaturze 4 °C.
10. Przepłukać nadmiar przeciwciała pierwszorzędowego z siatkówki sześć razy, umieszczając je kolejno w sześciu studzienkach wypełnionych 1 ml 0,1 M PBS przez 10 minut każdy w temperaturze pokojowej.
11. Umieść siatkówkę w studzienku ze świeżym roztworem blokującym (1,7% Triton X-100 i 5,2% normalnej surowicy osła w 0,1 M PBS) i dodaj przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowi Alexa-594 (patrz tabela materiałów). Inkubować siatkówkę z przeciwciałem drugorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C.
12. Przepłukać nadmiar przeciwciał drugorzędowych z siatkówki sześć razy, umieszczając je kolejno w sześciu studzienkach wypełnionych 1 ml świeżego 0,1 M PBS przez 10 minut każdy w temperaturze pokojowej.
13. Za pomocą kleszczy przenieś zamontowaną siatkówkę na szalkę Petriego zawierającą 0,1 M PBS. Uwolnij siatkówkę z błony nitrocelulozowej, delikatnie wkładając końcówki kleszczyków między siatkówkę a błonę, aż siatkówka przestanie być przyczepiona.
14. Zamontuj siatkówkę na szklanym szkiełku mikroskopowym, delikatnie szturchając ją kleszkami, aż siatkówka przyklei się do szkła i wyjmij szkiełko z szalki Petriego.
15. Przykryj siatkówkę na szkiełku za pomocą Aquamount i przykryj ją szkiełkiem nakrywkowym #1.5. Umieść szkiełko w tacce na szkiełka (patrz Tabela materiałów) i pozostaw je na godzinę w temperaturze pokojowej.
16. Włóż szkiełko z powrotem do lodówki i przechowuj w tacce na suwaki (patrz Tabela materiałów) w temperaturze 4 °C, gdy nie jest używane. Po przykryciu szkiełka na 24 godziny użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić boki szkiełka, aby zapobiec wysuszeniu.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

4. Używanie zrekonstruowanych siatek barwionych immunologicznie S-opsyną do identyfikacji orientacji siatkówki

1. Zwizualizuj gradient s-opsyny za pomocą mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu epifluorescencyjnego z mocowaniem kamery (patrz Tabela materiałów) i zobrazuj siatkówkę tak, aby cała siatkówka była widoczna na jednym obrazie (rysunki 1B, 2D, 3A i 3D). Można to zrobić, obrazując siatkówkę w sekcjach przy małym powiększeniu, a następnie zszywając obrazy ze sobą.
2. Nazwij siatkówki, aby można je było zidentyfikować. Na przykład pierwszą siatkówkę, która ma być zrekonstruowana, nazwij "Siatkówka1".
3. Pobierz i zainstaluj ImageJ pod adresem https://imagej.nih.gov/ij/download.html.
4. Utwórz osobny folder dla każdej siatkówki, która wymaga rekonstrukcji, ale pozostaw foldery puste. Na przykład utwórz folder o nazwie "Retina1". Wszystkie pliki potrzebne do zrekonstruowania tej siatkówki zostaną umieszczone w tym folderze w kolejnych krokach.
   UWAGA: Jedynymi plikami, które powinny zawierać te foldery, są pliki, które mają być analizowane przez Retistruct. Wszelkie pliki inne niż te opisane poniżej spowodują, że siatkówka nie będzie mogła zostać otwarta przez oprogramowanie Retistruct.
5. Otwórz obraz siatkówki w ImageJ, wybierając Plik → Otwórz, a następnie wybierając "Siatkówka1".
6. Nie wprowadzając żadnych zmian w obrazie, zapisz go jako "image.png" w folderze o nazwie "Retina 1", wybierając opcję Plik → Zapisz jako → PNG.
   UWAGA: Plik musi mieć nazwę "image.png", aby oprogramowanie Retistruct rozpoznało go jako siatkówkę do rekonstrukcji.
7. Użyj narzędzia Linia segmentowa, aby obrysować krawędzie siatkówki. Klikając dwa sąsiednie punkty na granicy siatkówki, narzędzie do segmentacji linii zasadniczo "połączy kropki" między dwoma sąsiednimi punktami, tworząc kontur. Powtarzaj tę czynność, aż cała siatkówka zostanie obrysowana. Zapisz kontur siatkówki jako "outline.roi" w folderze o nazwie "Retina1", wybierając Analyze → Tools → ROI manager → Add[t] → More → Save.
   UWAGA: Krawędź siatkówki można zidentyfikować w miejscu, w którym barwienie s-opsyny przechodzi w tło.
8. Użyj narzędzia Linia segmentowana zgodnie z instrukcjami w kroku 4.7, aby obrysować granicę tarczy nerwu wzrokowego. Zapisz kontur tarczy optycznej jako "od.roi" w folderze zatytułowanym "Retina1", wybierając Analizuj narzędzia → → Menedżer zwrotu z inwestycji → Dodaj[t] → Więcej → Zapisz.
   UWAGA: Tarcza nerwu wzrokowego jest identyfikowana jako mały otwór w środku siatkówki i będzie się różnić w zależności od jakości sekcji.
   UWAGA: Wszystkie pliki potrzebne do rekonstrukcji Retistruct ("image.png", "outline.roi" i "od.roi") powinny być teraz zapisane w folderze "Retina1".
9. Aby pobrać, zainstalować i otworzyć program Retistruct, postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w podręczniku użytkownika Retistruct, który znajduje się w sekcji Materiały uzupełniające firmy Sterratt i wsp.²⁴
10. Po wyświetleniu okna Retistruct kliknij ikonę "Otwórz" w lewym górnym rogu okna i wybierz folder katalogu "Retina1".
11. Pojawi się okno obrazu wskazujące, że nie istnieje podziałka liniowa. Kliknij "Zamknij", a w polu pojawi się obraz siatkówki. Zwizualizuj kontur siatkówki, klikając przycisk "Właściwości" w prawym górnym rogu okna i zmień kolor konturu na widoczny kolor (Rysunek 5A).
12. WAŻNE: Określ, czy siatkówka pochodzi z prawego, czy z lewego oka w panelu po lewej stronie (Rysunek 5A).
13. Kliknij przycisk "Dodaj rozdarcie" po lewej stronie i określ, gdzie w siatkówce znajduje się rozdarcie lub nacięcie, klikając trzy wierzchołki rozdarcia (Rysunek 5A). Spowoduje to utworzenie linii łączących trzy wierzchołki cięcia. Powtórz dla wszystkich nacięć w siatkówce.
14. Określ siatkówkę grzbietową, klikając dowolny punkt konturu siatkówki. W tym miejscu na konspekcie pojawi się wielka litera "D" (Rysunek 5B).
    UWAGA: Siatkówka grzbietowa będzie ciemniejszą połową siatkówki, przeciwną do gradientu s-opsyny. Jednak oznaczanie siatkówki grzbietowej w Retistruct nie jest wiarygodną metodą identyfikacji grzbietowej połowy siatkówki, więc oznaczenie "grzbietowej" może być na tym etapie dowolne.
15. Zrekonstruuj siatkówkę, klikając przycisk "Rekonstruuj siatkówkę" w lewym górnym rogu ekranu (Rysunek 5B). Pojawi się wykres biegunowy zrekonstruowanej siatkówki z nacięciami widocznymi w tym samym kolorze co kontur (Rysunek 5C).
16. Kliknij przycisk "Zapisz" po prawej stronie ekranu, aby zrekonstruowana siatkówka i wszystkie powiązane z nią dane zostały zapisane w katalogu folderów "Retina1" (Rysunek 5D).
17. Zapisz zrekonstruowaną siatkówkę, klikając przycisk "PDF" w panelu po prawej stronie (Rysunek 5D). Pojawi się pole z prośbą o specyfikację rozmiaru. Domyślny rozmiar jest akceptowalny dla poniższych kroków. Ta czynność spowoduje zapisanie zrekonstruowanej siatkówki jako "image.polar.pdf" w katalogu folderów "Retina1".
18. Otwórz "image.polar.pdf" w programie do malowania (lub innym programie do obróbki obrazu) i użyj narzędzia "Wiadro z farbą" (lub podobnego), aby zmienić tło zrekonstruowanej siatkówki na czarne. Zapisz zrekonstruowaną siatkówkę jako plik .tif, taki jak "Retina1_reconstructed.tif" w katalogu folderu "Retina1".
    UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
19. Pobierz kod MATLAB do obracania siatkówki o nazwie "Retina_Rotator.m" (patrz Materiały dodatkowe). Umieść plik kodu we własnym folderze, w którym nie ma żadnych innych plików.
20. Otwórz program MATLAB w wersji 2007b lub nowszej. Kliknij dwukrotnie plik kodu, aby otworzyć go w programie MATLAB. W oknie poleceń wpisz "Retina_Rotator", a następnie naciśnij Enter. Pojawi się okno wyszukiwania.
    UWAGA: Kod jest specyficzny dla plików .tif. Jeśli plik do obrócenia nie jest w odpowiednim formacie, kod nie obróci prawidłowo siatkówki. Zobacz kroki 4.17 i 4.18. do zapisania zrekonstruowanej siatkówki w odpowiednim formacie.
21. Otwórz plik, który chcesz obrócić. Na przykład wybierz "Retina1_reconstructed.tif". Kod następnie przeanalizuje zrekonstruowaną siatkówkę i automatycznie zapisze obróconą siatkówkę jako "Retina1_reconstructed_rotated.tif" w folderze, w którym znajduje się oryginalny plik.
22. Po zakończeniu analizy siatkówki przez kod pojawi się również okno pokazujące obrazy siatkówki przed i po obróceniu w celu porównania (rysunki 3B i 3C; Rysunki 3E i 3F).
    UWAGA: Ten kod obraca zrekonstruowaną siatkówkę tak, aby brzuszna (najjaśniejsza) połowa znajdowała się na dole, a grzbietowa (najciemniejsza) na górze, dokładnie orientując w ten sposób siatkówkę zgodnie z gradientem s-opsin¹. Jeśli udokumentowano, czy siatkówka pochodzi z prawego, czy z lewego oka, lokalizacja biegunów nosowych i skroniowych może być również ekstrapolowana z tej metody orientacji (Ryc. 3).

Pojedyncze cięcie odciążające, które dokładnie i niezawodnie przecina mięsień prosty górny, identyfikuje siatkówkę grzbietową (Rysunek 1). Szczelina naczyniówki dokładnie i niezawodnie identyfikuje siatkówkę nosową i skroniową z głębokimi nacięciami odciążającymi wzdłuż skroniowej i nosowej szczeliny naczyniówki (Ryc. 2). W tym przykładzie wykonano również nacięcie odciążające w siatkówce grzbietowej w celu zidentyfikowania osi grzbietowo-brzusznej siatkówki (Rysunek 2D, strzałka pionowa). Etapy tych procesów są pokazane w celu replikacji przez przyszłe sekcjonały. Połączenie immunohistochemii s-opsyny (ryc. 3A i 3D), rekonstrukcji za pomocą oprogramowania Retistruct (3B, 3E) i dokładnej rotacji za pomocą niestandardowego kodu MATLAB (3C, 3F) pozwala na identyfikację brzusznej i grzbietowej połowy siatkówki, a także biegunów nosowych i skroniowych, jeśli wiadomo, czy siatkówka pochodzi z prawego, czy lewego oka (Rycina 3). Porównaliśmy również dwa powszechnie stosowane przeciwciała pierwotne s-opsyny pod kątem skuteczności w znakowaniu czopków s-opsyny (Figura 4A-D): Zarówno kozie przeciwciało pierwotne anty-s-opsyny, jak i królicze przeciwciało pierwotne anty-s-opsyny skutecznie znakują czopki s-opsyny (Figura 4E) u tej samej myszy.

Na zrekonstruowanych siatkówkach barwionych immunologicznie s-opsynami zidentyfikowano nacięcia łagodzące, a ich lokalizacje porównano z orientacją określoną przez gradient s-opsyny. Korzystając z naszego niestandardowego kodu MATLAB (patrz Materiały dodatkowe), siatkówki zostały dokładnie obrócone tak, aby najwyższe stężenie barwienia s-opsyny znajdowało się brzusznie, umieszczając w ten sposób prawdziwą grzbietową pod kątem 90° (dla odbytnicy górnej), prawdziwą nosową pod kątem 0° (dla szczeliny naczyniówki nosowej) i prawdziwą skroniową pod kątem 180° (dla skroniowej szczeliny naczyniówki). Wartość każdego indywidualnego kąta cięcia odciążającego została określona za pomocą narzędzia kąta w ImageJ po obróceniu siatkówki zgodnie z gradientem s-opsin. Obliczono średni kąt dla każdego typu cięcia odciążającego, a następnie naniesiono średnią wartość każdego typu cięcia odciążającego na wykresie biegunowym (Rysunek 6). Średnio, górne nacięcia mięśnia prostego zidentyfikowały biegun grzbietowy pod kątem 96,3 ± 4,3° (n = 11) (Ryc. 6). Szczelina naczyniówki nosowej zidentyfikowała biegun nosowy pod kątem 6,7 ± 5,8°, a skroniowa szczelina naczyniówki zidentyfikowała biegun skroniowy pod kątem 172,0 ± 4,4° (n = 9; Rysunek 6).

Rycina 1: Użycie mięśnia prostego górnego do dokładnej identyfikacji siatkówki grzbietowej prawego oka. (A) Przykład oparzenia grzbietowego rogówki przy granicy rogówkowo-twardówkowej wykonanego pisakiem z końcówką kauteryczną (biała strzałka). Mięsień prosty górny jest również widoczny w tym widoku (biała strzałka). (B) Przykład całej zamontowanej siatkówki z odciążającym nacięciem wykonanym w siatkówce grzbietowej poprzez przecięcie na pół mięśnia prostego górnego. Strzałka przedstawia głębokie cięcie odciążające wykonane w siatkówce grzbietowej poprzez przecięcie na pół mięśnia prostego górnego. Siatkówka jest barwiona pierwszorzędowym przeciwciałem anty-s-opsyną kozła (patrz tabela materiałów) i przeciwciałem drugorzędowym anty-koza osła Alexa 594 (patrz tabela materiałów; wzbudzenie: 590 nm; emisja: 620 nm) (cyjan). Siatkówkę zobrazowano mikroskopem epifluorescencyjnym z filtrem Texas Red (595 nm). (C) Siatkówka zrekonstruowana w Retistruct i obrócona za pomocą niestandardowego kodu MATLAB (patrz Materiały Uzupełniające) z widocznym cięciem odciążającym mięsień prosty górny (biała strzałka). D: grzbietowy, V: brzuszny, T: skroniowy, N: nosowy. Podziałka = 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Wykorzystanie szczeliny naczyniówki do dokładnej identyfikacji biegunów nosowych i skroniowych siatkówki prawego oka. (A) Przykład oparzenia grzbietowej rogówki w pobliżu granicy rogówkowo-twardówkowej wykonanego pisakiem z końcówką kauteryczną. (B) Szczelina naczyniówki widoczna w tylnej części oka na twardówce (biała strzałka). Na tym zdjęciu widoczne jest również oparzenie grzbietowej części rogówki, znajdujące się około 90° od skroniowej szczeliny naczyniówki. (C) Szczelina naczyniówki widoczna z tyłu oka na twardówce, biegnąca od nerwu wzrokowego do granicy rogówkowo-twardówkowej. (D) Siatkówka zabarwiona kozią anty-s-opsyną (patrz Spis materiałów) i wtórnym przeciwciałem anty-kozich osła Alexa 594 (patrz Tabela materiałów; wzbudzenie: 590 nm; emisja: 620 nm) (cyjan) z nacięciami szczeliny naczyniówkowej (strzałki poziome) i nacięciem odciążającym grzbiet (strzałka pionowa). Siatkówkę zobrazowano mikroskopem epifluorescencyjnym z filtrem Texas Red (595 nm). (E) Siatkówka zrekonstruowana w Retistruct i obrócona za pomocą niestandardowego kodu MATLAB (patrz Materiały Uzupełniające) z widocznym nacięciem odciążającym grzbiet oraz widocznymi cięciami szczeliny naczyniówki nosowej i skroniowej (białe strzałki). D: grzbietowy, V: brzuszny, T: skroniowy, N: nosowy. Podziałka = 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 3: Wykorzystanie gradientu s-opsyny do identyfikacji wszystkich czterech biegunów siatkówki. (A) Przykład siatkówki wyciętej z prawego oka, która została wybarwiona immunologicznie w celu znakowania s-opsyny i zobrazowana za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z filtrem Texas Red (595 nm). Nacięcia w tej siatkówce są dowolne, ponieważ orientacja topograficzna jest określana przez gradient s-opsyny. (B) Wyniki rekonstrukcji siatkówki w A za pomocą Retistruct. Zwróć uwagę, że gradient s-opsin nie jest prawidłowo wyrównany, ponieważ siatkówka nie została przepuszczona przez niestandardowy kod MATLAB (patrz Materiały uzupełniające). (C) Wyniki obracania siatkówki w A za pomocą niestandardowego kodu. Siatkówka została obrócona tak, że największe stężenie barwienia s-opsyny znajduje się na dole i jest identyfikowane jako brzuszna siatkówka. Ponieważ siatkówka znajduje się w prawym oku, biegun skroniowy znajduje się 90° w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara od bieguna grzbietowego, a biegun nosowy znajduje się 90° zgodnie z ruchem wskazówek zegara od bieguna grzbietowego. (D) Przykład siatkówki wyciętej z lewego oka, która została wybarwiona immunologicznie w celu oznaczenia s-opsyny i zobrazowana za pomocą filtra Texas Red (595 nm). Nacięcia w tej siatkówce są dowolne, ponieważ orientacja topograficzna jest określana przez gradient s-opsyny. (E) Wyniki cyfrowej rekonstrukcji siatkówki w D za pomocą Retistruct. Zwróć uwagę, że gradient s-opsin nie jest prawidłowo wyrównany, ponieważ siatkówka nie została obrócona przez kod niestandardowy. (F) Wyniki obracania siatkówki w D za pomocą niestandardowego kodu. Siatkówka została obrócona tak, że największe stężenie barwienia s-opsyny znajduje się na dole i jest identyfikowane jako brzuszna siatkówka. Ponieważ siatkówka znajduje się w lewym oku, biegun nosowy znajduje się 90° w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara od bieguna grzbietowego, a biegun skroniowy znajduje się 90° w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara od bieguna grzbietowego. D: grzbietowy, V: brzuszny, T: skroniowy, N: nosowy. Podziałka = 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Porównanie dwóch pierwszorzędowych przeciwciał s-opsyny w znakowaniu czopków s-opsyny. (A) Siatkówka przebarwiona pierwotnym przeciwciałem anty-s-opsyny kozy (patrz tabela materiałów). (B) Druga siatkówka tej samej myszy zabarwiona pierwszorzędowym przeciwciałem króliczej anty-s-opsyny (patrz tabela materiałów). (C) Reprezentatywny obszar (0,1 x 0,1 mm2) z siatkówki barwionej pierwotnym przeciwciałem anty-s-opsyny kozy. Obraz wykonany mikroskopem epifluorescencyjnym w powiększeniu 40x. (D) Reprezentatywny obszar (0,1 x 0,1 mm2) z siatkówki barwionej króliczą anty-s-opsyną (patrz tabela materiałów), alternatywa dla przeciwciał pierwotnych. Zdjęcie wykonano pod mikroskopem epifluorescencyjnym w powiększeniu 40x. (E) Oba przeciwciała znakują tę samą liczbę zewnętrznych segmentów stożka s, ponieważ nie ma znaczącej różnicy w liczbie immunododatnich czopków s, które są barwione przez anty-s-opsynę kozy i anty-s-opsynę królika w którymkolwiek z badanych eksmośrodów siatkówki (n = 2; ANOVA z testem Bonferroniego post hoc; p >0,05). Podziałka liniowa = 1 mm (A-B); 25 μm (C-D). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Ilustrowany przewodnik dotyczący korzystania z oprogramowania Retistruct do rekonstrukcji siatkówki wybarwionej immunologicznie s-opsyną. (A) Siatkówka otwarta w Retistruct z widocznym konturem i dodanym "Tear". Punkty "Łzy" są oznaczone nałożonymi na siebie białymi strzałkami. Wszystkie nacięcia w tej siatkówce są arbitralne, ponieważ żaden konkretny punkt orientacyjny nie został użyty do zaznaczenia orientacji siatkówki podczas sekcji. Ważne przyciski są zaznaczone na czerwono. (B) Siatkówka z dodanymi wszystkimi "łzami" i siatkówką grzbietową oznaczoną literą "D" na brzegu siatkówki. Zauważ, że przycisk "Rekonstruuj siatkówkę" jest teraz widoczny. Ważne przyciski są zaznaczone na czerwono. (C) Proces rekonstrukcji siatkówki. Po prawej stronie pojawi się wykres biegunowy zrekonstruowanej siatkówki, pokazujący odciążające nacięcia w kolorze cyjanu (niebieskie strzałki nałożone w celu wyjaśnienia miejsc cięcia). (D) Końcowy wynik przepuszczenia siatkówki przez Retistruct. Oryginalna cała siatkówka pozostaje po lewej stronie, a zrekonstruowana siatkówka pojawia się po prawej. Cięcia odciążające są widoczne w kolorze turkusowym (białe strzałki nałożone w celu wyjaśnienia miejsc cięcia). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 6: Mięsień prosty górny i szczelina naczyniówki mogą być wykorzystane do dokładnej orientacji siatkówki myszy. Biegunowy wykres kątów uzyskanych z nacięć odciążających mięśnie proste górne lub cięć szczeliny naczyniówkowej w siatkówkach, które zostały zrekonstruowane za pomocą Retistruct. Na zrekonstruowanych siatkówkach wybarwionych immunologicznie s-opsyną zidentyfikowano skaleczenia łagodzące i porównano ich lokalizację z lokalizacją gradientu s-opsyny. Korzystając z niestandardowego kodu MATLAB do dokładnego obracania siatkówki tak, aby najwyższe stężenie barwienia s-opsyny było zlokalizowane brzusznie, dla każdej siatkówki określono prawdziwą grzbietową (90° dla mięśnia prostego górnego), prawdziwą nosową (0° dla szczeliny naczyniówki nosa) i prawdziwą skroniową (180° dla skroniowej szczeliny naczyniówkowej). Wartość każdego indywidualnego kąta cięcia odciążającego została określona w ImageJ, a średni kąt został obliczony dla każdego typu cięcia odciążającego. Nacięcia mięśnia prostego górnego pozwoliły zidentyfikować biegun grzbietowy pod kątem 96,3 ± 4,3° (n = 11). Szczelina naczyniówki nosowej zidentyfikowała biegun nosowy pod kątem 6,7 ± 5,8°, a szczelina skroniowa naczyniówki zidentyfikowała biegun skroniowy pod kątem 172,0 ± 4,5° (n = 9). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Głębokie punkty orientacyjne, biegun siatkówki, który identyfikują, oraz czy mogą być używane do aplikacji żywej lub stałej tkanki.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.