Ten protokół dostarcza obszernego przewodnika po sekcji i analizie do wykorzystania głębokich punktów orientacyjnych oka, immunohistochemii s-opsyn, Retistruct i niestandardowego kodu do dokładnej i niezawodnej orientacji izolowanej siatkówki myszy w przestrzeni anatomicznej.
Artykuł metodologiczny
To, gdzie tniesz, ma znaczenie: przewodnik po sekcji i analizie orientacji przestrzennej siatkówki myszy na podstawie punktów orientacyjnych oczu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Dokładne i niezawodne identyfikowanie orientacji przestrzennej izolowanej siatkówki myszy jest ważne dla wielu badań w neuronauce wizualnej, w tym analizy gradientów gęstości i wielkości typów komórek siatkówki, dostrajania kierunku selektywnych komórek zwojowych oraz badania topograficznych wzorców degeneracji w niektórych chorobach siatkówki. Istnieje jednak wiele różnych metod rozwarstwiania oka opisanych w literaturze, które są używane do identyfikacji i oznaczania orientacji siatkówki w siatkówce myszy. Chociaż metoda orientacji stosowana w takich badaniach jest często pomijana, nieraportowanie, w jaki sposób określa się orientację siatkówki, może powodować rozbieżności w literaturze i zamieszanie podczas próby porównania danych między badaniami. Powierzchowne punkty orientacyjne oka, takie jak oparzenia rogówki, są powszechnie stosowane, ale ostatnio wykazano, że są mniej wiarygodne niż głębsze punkty orientacyjne, takie jak mięśnie proste, szczelina naczyniówki lub gradient s-opsyny. W tym miejscu przedstawiamy obszerny przewodnik dotyczący korzystania z głębokich punktów orientacyjnych oka w celu dokładnego przeanalizowania i udokumentowania orientacji przestrzennej izolowanej siatkówki myszy. Porównaliśmy również skuteczność dwóch przeciwciał s-opsyny i dołączyliśmy protokół immunohistochemii s-opsyny. Ponieważ orientacja siatkówki zgodnie z gradientem s-opsyny wymaga rekonstrukcji siatkówki za pomocą oprogramowania Retistruct i rotacji za pomocą niestandardowego kodu, przedstawiliśmy ważne kroki wymagane do korzystania z obu tych programów. Ogólnie rzecz biorąc, celem tego protokołu jest dostarczenie niezawodnego i powtarzalnego zestawu metod dokładnej orientacji siatkówki, który można dostosować do większości protokołów eksperymentalnych. Nadrzędnym celem tej pracy jest standaryzacja metod orientacji siatkówki na potrzeby przyszłych badań.
Wprowadzenie
Ważnym i czasami pomijanym aspektem neuronauki siatkówki jest prawidłowa orientacja i analiza izolowanej siatkówki całomocnej, czy to orientacji siatkówki w komorze rejestrującej elektrofizjologię, czy na szkiełku histologicznym. Jest to szczególnie ważne w przypadku badań z udziałem siatkówki myszy, która jest obecnie najpowszechniej wykorzystywanym modelem do badań układu wzrokowego ssaków. Ostatnie odkrycia ujawniają, że siatkówka myszy nie jest jednorodna przestrzennie, ale ma gradienty gęstości i wielkości funkcjonalnie odrębnych typów komórek siatkówki, takich jak komórki zwojowe melanopsyny, przejściowe komórki zwojowe OFF-alfa i stożkowe opsyny1,2,3,4,5. W związku z tym metoda zastosowana do określenia orientacji siatkówki może mieć wpływ na wyniki eksperymentalne dotyczące typu komórki lub rozkładu opsyny2,3,6, dostrajanie kierunku selektywnych komórek zwojowych7,8,9 oraz topograficzne wzorce zwyrodnienia siatkówki10,11,12,13,14. W rzeczywistości nieinformowanie o tym, w jaki sposób zgłaszana jest orientacja siatkówki, może powodować rozbieżności w literaturze i zamieszanie podczas próby porównania danych między badaniami. Dlatego tak ważne jest, aby naukowcy przedstawili metodę identyfikacji orientacji siatkówki, aby można było dokładnie zinterpretować wyniki takich badań.
Orientacja siatkówki jest zwykle identyfikowana na podstawie oceny rogówki grzbietowej, brzusznej, nosowej lub skroniowej przed enukleacją oka1,3,12,15,16,17,18,19 lub wycinając lub barwiąc głębokie anatomiczne punkty orientacyjne oka, takie jak mięśnie zewnątrzgałkowe6,7, szczelina naczyniówki20,21, lub gradient s-opsin2,3. Mięśnie proste można wykorzystać do identyfikacji siatkówki grzbietowej, brzusznej, nosowej i skroniowej poprzez wykonanie głębokiego cięcia łagodzącego, które przecina na pół przyczep odpowiednio mięśnia prostego górnego, prostego dolnego, prostego przyśrodkowego lub bocznego mięśnia prostego. Jednak w większości eksperymentów użycie jednego mięśnia prostego jest wystarczające do orientacji siatkówki22. Szczelina naczyniówki, która jest pozostałością po rozwoju oka, może być postrzegana jako słaba pozioma linia z tyłu oka. Każdy koniec tej linii kończy się na biegunie nosowym lub skroniowym globu23. Wreszcie, ekspresja s-opsyny jest asymetrycznie rozprowadzana do brzusznej siatkówki u myszy, a przeciwciała s-opsyny mogą być użyte do odsłonięcia siatkówki brzusznej w eksperymentach immunohistochemicznych1.
Ostatnia praca Stabio, et al.22 wykazał, że powierzchowne punkty orientacyjne oka, takie jak oparzenia rogówki, są mniej wiarygodną metodą orientowania siatkówki w przestrzeni anatomicznej, najprawdopodobniej z powodu błędu ludzkiego i zmienności w powodowaniu oparzenia rogówki podczas używania skroniowej i przyśrodkowej kanty jako punktów odniesienia. W przeciwieństwie do tego, wykazano, że głębokie punkty orientacyjne, takie jak mięsień prosty górny, szczelina naczyniówki i gradient s-opsyny, są bardziej wiarygodnymi i dokładnymi punktami orientacyjnymi do orientacji siatkówki22. Jednak identyfikacja tych anatomicznych punktów orientacyjnych wymaga unikalnych etapów sekcji, które nie są szczegółowo opisane w literaturze. Dlatego celem tego protokołu jest zapewnienie kompleksowego samouczka na temat tego, jak używać mięśnia prostego górnego, szczeliny naczyniówki i gradientu s-opsyny do dokładnej identyfikacji orientacji przestrzennej siatkówki myszy. Ponadto dołączyliśmy porównanie skuteczności dwóch przeciwciał s-opsyny, a także protokół immunohistochemii s-opsyny.
Dodatkowym wyzwaniem dla badań opierających się na precyzyjnej orientacji siatkówki są duże nacięcia odciążające wymagane do spłaszczenia całych siatkówk na komorze rejestracyjnej, czaszy lub szkiełku. Może to stanowić wyzwanie dla analizy tego, co naturalnie jest strukturą trójwymiarową, gdy jest obrazowane jako płaska struktura dwuwymiarowa. Program o nazwie Retistruct24 może być użyty do przywrócenia płaskiej, całościowej siatkówki do jej trójwymiarowej struktury, zanim zebrane z niej dane zostaną przeanalizowane. W związku z tym sekcja tego protokołu jest poświęcona podkreśleniu kroków, które są niezbędne do użycia oprogramowania Retistruct do rekonstrukcji siatkówek myszy barwionych immunologicznie s-opsyną. Dołączyliśmy również sekcję protokołu do korzystania z naszego niestandardowego skryptu MATLAB, który został opracowany do dokładnego obracania i orientowania siatkówek myszy zabarwionych s-opsyną.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu w Akron.
1. Używanie punktu orientacyjnego mięśnia prostego górnego do identyfikacji orientacji siatkówki
UWAGA: Mięsień prosty górny jest punktem orientacyjnym dla siatkówki grzbietowej (Tabela 1). Jeśli eksperyment nie wymaga znakowania siatkówki grzbietowej, pomiń krok 1 i przejdź do kroku 2.
- Postępuj zgodnie z zatwierdzonym przez siebie protokołem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt w sprawie eutanazji myszy.
- Aby określić ogólną orientację kuli ziemskiej, natychmiast po eutanazji wykonaj ślad wypalenia na grzbietowej rogówce bezpośrednio między kantą nosową a skroniową w pobliżu granicy rogówki-twardówki (Ryc. 1A). Zrób ślad oparzenia, podgrzewając pisak kauteryzacyjny przez dziesięć sekund, a następnie dotykając końcówką pisaka do grzbietowej rogówki przez mniej niż sekundę.
UWAGA: Zbyt długie przytrzymanie pisaka kauterycznego przy rogówce spowoduje przebicie gałki ziemskiej.
UWAGA: Podczas gdy niektóre pisaki kauteryczne emitują światło, pisak kauteryczny wymieniony w Tabeli materiałów nie emituje światła po podgrzaniu, co czyni go bezpieczną opcją do eksperymentów dostosowanych do ciemności. - Do enukleacji użyj zakrzywionych kleszczy, aby delikatnie wypchnąć oko z oczodołu i chwycić gałkę od spodu. Nie przecinaj nerwu wzrokowego w celu usunięcia gałki ocznej; Zamiast tego powoli wyjmij kulę ziemską z gniazda, jednocześnie delikatnie przesuwając ją od lewej do prawej, aż kula zostanie zwolniona z gniazda.
UWAGA: Ten ruch pozwoli mięśniom prostym pozostać przyczepionymi do gałki ziemskiej, gdy gałka ziemska zostanie ostatecznie całkowicie usunięta z panewki. Nerw wzrokowy również często pozostaje przyczepiony do gałki ocznej. - Przenieść kulę ziemską z dołączonymi mięśniami prostymi na szalkę Petriego zawierającą podłoże preparacyjne. Upewnij się, że śledzisz, które oko jest lewym okiem, a które prawym.
UWAGA: Sekcja powinna używać odpowiedniego podłoża preparacyjnego, które jest zgodne z ich protokołem eksperymentalnym. - W zakresie sekcji zlokalizuj wizualnie oparzenie grzbietowej rogówki i zidentyfikuj górny mięsień prosty z którym jest ono związane (Rysunek 1A).
- Za pomocą nożyczek preparacyjnych lub igły 20 G (0,9 mm x 25 mm) (patrz Tabela materiałów) nakłuć rogówkę w miejscu oparzenia. Wykonaj głębokie nacięcie łagodzące w kuli w kierunku nerwu wzrokowego, aby przeciąć mięsień górny. Wyizolowaną i zrekonstruowaną siatkówkę z tym cięciem pokazano na rycinach 1B i 1C.
- Rozpocznij izolowanie siatkówki, używając dwóch zestawów kleszczy (patrz Tabela materiałów), aby delikatnie rozerwać otwór wykonany za pomocą nakłucia w kroku 1.6, aż część siatkówki zostanie odsłonięta.
UWAGA: Ważne jest, aby robić to delikatnie, ponieważ zbyt mocne rozdarcie może spowodować dalsze rozdarcie rany. - Użyj kleszczy, aby oddzielić siatkówkę od twardówki, aż twardówka zostanie całkowicie usunięta. Usuń tęczówkę, soczewkę, ciało szkliste i wszelkie pozostałe struktury za pomocą kleszczy, aż siatkówka zostanie całkowicie odizolowana.
UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany. Jeśli tkanka ma zostać unieruchomiona do immunohistochemii s-opsyny, przejdź do kroku 3.5.
2. Używanie punktu orientacyjnego szczeliny naczyniówki do identyfikacji orientacji siatkówki
UWAGA: Szczelina naczyniówki znajduje się na twardówce z tyłu oka i biegnie od bieguna skroniowego do bieguna nosowego (Ryc. 2B i 2C; Tabela 1).
- Postępuj zgodnie z zatwierdzonym protokołem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt w sprawie eutanazji myszy.
- Aby określić ogólną orientację kuli ziemskiej, natychmiast po eutanazji wykonaj ślad wypalenia na grzbietowej rogówce bezpośrednio między kantą nosową a skroniową w pobliżu granicy rogówka-twardówka (Ryc. 2A). Zrób ślad oparzenia, podgrzewając pisak kauteryzacyjny przez dziesięć sekund, a następnie dotykając końcówką pisaka do grzbietowej rogówki przez mniej niż sekundę.
UWAGA: Zbyt długie przytrzymanie długopisu kauterycznego przy rogówce spowoduje przebicie gałki ziemskiej. - Wyłuszczyć oko i przenieść gałkę ziemską na szalkę Petriego zawierającą pożywkę separacyjną. Upewnij się, że śledzisz, które oko jest lewym okiem, a które prawym.
UWAGA: Sekcja powinna używać odpowiedniego podłoża preparacyjnego, które jest zgodne z ich protokołem eksperymentalnym. - Wizualnie zlokalizuj i zidentyfikuj szczelinę naczyniówki z tyłu oka (Ryc. 2B, 2C).
UWAGA: Szczelina naczyniówki jest również widoczna wewnątrz muszli ocznej w świetle podczerwonym20. - Ustaw kulę ziemską na szalce Petriego tak, aby oparzenie grzbietowe znajdowało się na górnym biegunie, tak jak by to było, gdyby oko nadal znajdowało się u myszy.
UWAGA: Obecność oparzenia grzbietowego pozwala na identyfikację nosowej i skroniowej strony gałki ziemskiej, o ile udokumentowano, czy jest to prawe, czy lewe oko: Jeśli jest to prawe oko, szczelina naczyniówki nosa będzie znajdować się po prawej stronie oparzenia, a skroniowa szczelina naczyniówki będzie po lewej stronie oparzenia. Jeśli jest to lewe oko, skroniowa szczelina naczyniówki będzie znajdować się po prawej stronie oparzenia, a szczelina naczyniówki nosa będzie po lewej stronie oparzenia.
Za pomocą nożyczek preparacyjnych lub igły o gramaturze 20 G (0,9 x 25 mm) (patrz Tabela Materiałów) wykonaj jedno nakłucie w kuli ziemskiej, w której znajduje się oparzenie grzbietowe. - Wykonaj płytkie cięcie łagodzące w kierunku nerwu wzrokowego, w którym znajduje się oparzenie grzbietowej rogówki. Cięcie to będzie prostopadłe do szczeliny naczyniówki, co pozwoli na identyfikację siatkówki grzbietowej po izolacji (Rysunek 2D).
- Wykonaj następujące dwa głębokie cięcia odciążające w kierunku nerwu wzrokowego: jedno poprzez wyłożenie ostrzy nożyczek preparacyjnych linią skroniowej szczeliny naczyniówki z tyłu oka, a drugie poprzez wyrównanie ostrzy nożyczek rozwarstwiających z linią szczeliny naczyniówki nosowej z tyłu oka. Cięcia te są pokazane na izolowanej i zrekonstruowanej siatkówce w Rysunek 2D i 2E.
UWAGA: Alternatywnie można wykonać głębokie cięcie w skroniowej szczelinie naczyniówki, a płytkie cięcie można wykonać w szczelinie naczyniówki nosowej, dzięki czemu nie ma potrzeby cięcia grzbietowego oparzenia rogówki. Pozwala to na dokładną orientację siatkówki przy mniejszej liczbie nacięć odciążających. - Rozpocznij izolację siatkówki za pomocą dwóch zestawów kleszczyków (patrz Tabela materiałów), aby delikatnie rozerwać otwór wykonany za pomocą nakłucia w krokach 2.7 i 2.8, aż część siatkówki zostanie odsłonięta.
UWAGA: Ważne jest, aby robić to delikatnie, ponieważ zbyt mocne rozdarcie może spowodować dalsze rozdarcie skaleczeń łagodzących. - Użyj kleszczy, aby oddzielić siatkówkę od twardówki, aż twardówka zostanie całkowicie usunięta. Usuń tęczówkę, soczewkę, ciało szkliste i wszelkie pozostałe struktury za pomocą kleszczy, aż siatkówka zostanie całkowicie odizolowana.
UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany. Jeśli tkanka ma zostać unieruchomiona do immunohistochemii s-opsyny, przejdź do kroku 3.5.
3. Oznaczanie gradientu S-opsin w siatkówce myszy
UWAGA: Ekspresja fotopigmentu s-opsyna jest asymetrycznie rozłożona na brzuszną siatkówkę1, co czyni go doskonałym markerem dla brzusznej połowy siatkówki. Ta metoda jest przydatna tylko w przypadku tkanek utrwalonych i wybarwionych immunologicznie (Tabela 1). Poniższe kroki można zastosować do siatkówki, która została wycięta przy użyciu dowolnej z wyżej wymienionych metod.
- Postępuj zgodnie z zatwierdzonym protokołem Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt w sprawie eutanazji myszy.
- Bezpośrednio po eutanazji należy wyłuszczyć oko i umieścić gałkę ziemską na szalce Petriego z pożywką separacyjną. Upewnij się, że śledzisz, które oko jest lewym okiem, a które prawym okiem, aby określić orientację siatkówki po wypreparowaniu siatkówki.
UWAGA: Sekcja powinna używać odpowiedniego podłoża preparacyjnego, które jest zgodne z ich protokołem eksperymentalnym. - Rozpocznij izolację siatkówki, używając dwóch zestawów kleszczy (tabela materiałów), aby delikatnie wyrwać otwór w rogówce, aż część siatkówki zostanie odsłonięta.
UWAGA: Ważne jest, aby robić to delikatnie, ponieważ zbyt mocne rozdarcie może spowodować rozdarcie siatkówki. - Użyj kleszczy, aby oddzielić siatkówkę od twardówki, aż twardówka zostanie całkowicie usunięta. Usuń tęczówkę, soczewkę, ciało szkliste i wszelkie pozostałe struktury za pomocą kleszczy, aż siatkówka zostanie całkowicie odizolowana.
UWAGA: W tym miejscu protokół może zostać wstrzymany. Jeśli używasz siatkówki do eksperymentu ex vivo, przeprowadź eksperyment przed wykonaniem poniższych kroków. - Za pomocą nożyczek preparacyjnych wykonaj cztery odciążające nacięcia w siatkówce, tak aby leżała płasko. Zamontuj zwój siatkówki stroną z komórką do góry na membranie nitrocelulozowej (tabela materiałów), delikatnie dociskając każdy róg siatkówki do membrany za pomocą kleszczy.
UWAGA: Lokalizacja nacięć odciążających może być dowolna w przypadku korzystania z gradientu s-opsyny do orientacji siatkówki. - Za pomocą kleszczy przenieś zamontowaną siatkówkę do pierwszego dołka w 24-dołkowej płytce (tabela materiałów) wypełnionej 1 ml 4% paraformaldehydu (tabela materiałów) w celu utrwalenia. Umieść 24-dołkową płytkę na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej (tabela materiałów) i utrwal siatkówkę dokładnie na 40 minut.
UWAGA: Wszystkie poniższe etapy mycia i inkubacji należy wykonać za pomocą 24-dołkowej płytki na wytrząsarce orbitalnej. - Myj siatkówkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej, przenosząc ją do drugiej studzienki wypełnionej 1 ml 0,1 M PBS. Powtórz ten krok dwukrotnie, sekwencyjnie przenosząc siatkówkę do trzeciej i czwartej studzienki wypełnionej 0,1 M PBS.
- Przenieść zamontowaną siatkówkę do piątego dołka zawierającego 1 ml roztworu blokującego (1,7% Triton X-100 i 5,2% normalnej surowicy osła w 0,1 M PBS; patrz tabela materiałów) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
- Dodać królicze przeciwciało pierwszorzędowe anty-s-opsyny (patrz tabela materiałów) do roztworu blokującego w stężeniu 1:500 i inkubować przez trzy dni w temperaturze 4 °C.
- Przepłukać nadmiar przeciwciała pierwszorzędowego z siatkówki sześć razy, umieszczając je kolejno w sześciu studzienkach wypełnionych 1 ml 0,1 M PBS przez 10 minut każdy w temperaturze pokojowej.
- Umieść siatkówkę w studzienku ze świeżym roztworem blokującym (1,7% Triton X-100 i 5,2% normalnej surowicy osła w 0,1 M PBS) i dodaj przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowi Alexa-594 (patrz tabela materiałów). Inkubować siatkówkę z przeciwciałem drugorzędowym przez noc w temperaturze 4 °C.
- Przepłukać nadmiar przeciwciał drugorzędowych z siatkówki sześć razy, umieszczając je kolejno w sześciu studzienkach wypełnionych 1 ml świeżego 0,1 M PBS przez 10 minut każdy w temperaturze pokojowej.
- Za pomocą kleszczy przenieś zamontowaną siatkówkę na szalkę Petriego zawierającą 0,1 M PBS. Uwolnij siatkówkę z błony nitrocelulozowej, delikatnie wkładając końcówki kleszczyków między siatkówkę a błonę, aż siatkówka przestanie być przyczepiona.
- Zamontuj siatkówkę na szklanym szkiełku mikroskopowym, delikatnie szturchając ją kleszkami, aż siatkówka przyklei się do szkła i wyjmij szkiełko z szalki Petriego.
- Przykryj siatkówkę na szkiełku za pomocą Aquamount i przykryj ją szkiełkiem nakrywkowym #1.5. Umieść szkiełko w tacce na szkiełka (patrz Tabela materiałów) i pozostaw je na godzinę w temperaturze pokojowej.
- Włóż szkiełko z powrotem do lodówki i przechowuj w tacce na suwaki (patrz Tabela materiałów) w temperaturze 4 °C, gdy nie jest używane. Po przykryciu szkiełka na 24 godziny użyj lakieru do paznokci, aby uszczelnić boki szkiełka, aby zapobiec wysuszeniu.
UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
4. Używanie zrekonstruowanych siatek barwionych immunologicznie S-opsyną do identyfikacji orientacji siatkówki
- Zwizualizuj gradient s-opsyny za pomocą mikroskopu konfokalnego lub mikroskopu epifluorescencyjnego z mocowaniem kamery (patrz Tabela materiałów) i zobrazuj siatkówkę tak, aby cała siatkówka była widoczna na jednym obrazie (rysunki 1B, 2D, 3A i 3D). Można to zrobić, obrazując siatkówkę w sekcjach przy małym powiększeniu, a następnie zszywając obrazy ze sobą.
- Nazwij siatkówki, aby można je było zidentyfikować. Na przykład pierwszą siatkówkę, która ma być zrekonstruowana, nazwij "Siatkówka1".
- Pobierz i zainstaluj ImageJ pod adresem https://imagej.nih.gov/ij/download.html.
- Utwórz osobny folder dla każdej siatkówki, która wymaga rekonstrukcji, ale pozostaw foldery puste. Na przykład utwórz folder o nazwie "Retina1". Wszystkie pliki potrzebne do zrekonstruowania tej siatkówki zostaną umieszczone w tym folderze w kolejnych krokach.
UWAGA: Jedynymi plikami, które powinny zawierać te foldery, są pliki, które mają być analizowane przez Retistruct. Wszelkie pliki inne niż te opisane poniżej spowodują, że siatkówka nie będzie mogła zostać otwarta przez oprogramowanie Retistruct. - Otwórz obraz siatkówki w ImageJ, wybierając Plik → Otwórz, a następnie wybierając "Siatkówka1".
- Nie wprowadzając żadnych zmian w obrazie, zapisz go jako "image.png" w folderze o nazwie "Retina 1", wybierając opcję Plik → Zapisz jako → PNG.
UWAGA: Plik musi mieć nazwę "image.png", aby oprogramowanie Retistruct rozpoznało go jako siatkówkę do rekonstrukcji. - Użyj narzędzia Linia segmentowa, aby obrysować krawędzie siatkówki. Klikając dwa sąsiednie punkty na granicy siatkówki, narzędzie do segmentacji linii zasadniczo "połączy kropki" między dwoma sąsiednimi punktami, tworząc kontur. Powtarzaj tę czynność, aż cała siatkówka zostanie obrysowana. Zapisz kontur siatkówki jako "outline.roi" w folderze o nazwie "Retina1", wybierając Analyze → Tools → ROI manager → Add[t] → More → Save.
UWAGA: Krawędź siatkówki można zidentyfikować w miejscu, w którym barwienie s-opsyny przechodzi w tło. - Użyj narzędzia Linia segmentowana zgodnie z instrukcjami w kroku 4.7, aby obrysować granicę tarczy nerwu wzrokowego. Zapisz kontur tarczy optycznej jako "od.roi" w folderze zatytułowanym "Retina1", wybierając Analizuj narzędzia → → Menedżer zwrotu z inwestycji → Dodaj[t] → Więcej → Zapisz.
UWAGA: Tarcza nerwu wzrokowego jest identyfikowana jako mały otwór w środku siatkówki i będzie się różnić w zależności od jakości sekcji.
UWAGA: Wszystkie pliki potrzebne do rekonstrukcji Retistruct ("image.png", "outline.roi" i "od.roi") powinny być teraz zapisane w folderze "Retina1". - Aby pobrać, zainstalować i otworzyć program Retistruct, postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w podręczniku użytkownika Retistruct, który znajduje się w sekcji Materiały uzupełniające firmy Sterratt i wsp.24
- Po wyświetleniu okna Retistruct kliknij ikonę "Otwórz" w lewym górnym rogu okna i wybierz folder katalogu "Retina1".
- Pojawi się okno obrazu wskazujące, że nie istnieje podziałka liniowa. Kliknij "Zamknij", a w polu pojawi się obraz siatkówki. Zwizualizuj kontur siatkówki, klikając przycisk "Właściwości" w prawym górnym rogu okna i zmień kolor konturu na widoczny kolor (Rysunek 5A).
- WAŻNE: Określ, czy siatkówka pochodzi z prawego, czy z lewego oka w panelu po lewej stronie (Rysunek 5A).
- Kliknij przycisk "Dodaj rozdarcie" po lewej stronie i określ, gdzie w siatkówce znajduje się rozdarcie lub nacięcie, klikając trzy wierzchołki rozdarcia (Rysunek 5A). Spowoduje to utworzenie linii łączących trzy wierzchołki cięcia. Powtórz dla wszystkich nacięć w siatkówce.
- Określ siatkówkę grzbietową, klikając dowolny punkt konturu siatkówki. W tym miejscu na konspekcie pojawi się wielka litera "D" (Rysunek 5B).
UWAGA: Siatkówka grzbietowa będzie ciemniejszą połową siatkówki, przeciwną do gradientu s-opsyny. Jednak oznaczanie siatkówki grzbietowej w Retistruct nie jest wiarygodną metodą identyfikacji grzbietowej połowy siatkówki, więc oznaczenie "grzbietowej" może być na tym etapie dowolne. - Zrekonstruuj siatkówkę, klikając przycisk "Rekonstruuj siatkówkę" w lewym górnym rogu ekranu (Rysunek 5B). Pojawi się wykres biegunowy zrekonstruowanej siatkówki z nacięciami widocznymi w tym samym kolorze co kontur (Rysunek 5C).
- Kliknij przycisk "Zapisz" po prawej stronie ekranu, aby zrekonstruowana siatkówka i wszystkie powiązane z nią dane zostały zapisane w katalogu folderów "Retina1" (Rysunek 5D).
- Zapisz zrekonstruowaną siatkówkę, klikając przycisk "PDF" w panelu po prawej stronie (Rysunek 5D). Pojawi się pole z prośbą o specyfikację rozmiaru. Domyślny rozmiar jest akceptowalny dla poniższych kroków. Ta czynność spowoduje zapisanie zrekonstruowanej siatkówki jako "image.polar.pdf" w katalogu folderów "Retina1".
- Otwórz "image.polar.pdf" w programie do malowania (lub innym programie do obróbki obrazu) i użyj narzędzia "Wiadro z farbą" (lub podobnego), aby zmienić tło zrekonstruowanej siatkówki na czarne. Zapisz zrekonstruowaną siatkówkę jako plik .tif, taki jak "Retina1_reconstructed.tif" w katalogu folderu "Retina1".
UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. - Pobierz kod MATLAB do obracania siatkówki o nazwie "Retina_Rotator.m" (patrz Materiały dodatkowe). Umieść plik kodu we własnym folderze, w którym nie ma żadnych innych plików.
- Otwórz program MATLAB w wersji 2007b lub nowszej. Kliknij dwukrotnie plik kodu, aby otworzyć go w programie MATLAB. W oknie poleceń wpisz "Retina_Rotator", a następnie naciśnij Enter. Pojawi się okno wyszukiwania.
UWAGA: Kod jest specyficzny dla plików .tif. Jeśli plik do obrócenia nie jest w odpowiednim formacie, kod nie obróci prawidłowo siatkówki. Zobacz kroki 4.17 i 4.18. do zapisania zrekonstruowanej siatkówki w odpowiednim formacie. - Otwórz plik, który chcesz obrócić. Na przykład wybierz "Retina1_reconstructed.tif". Kod następnie przeanalizuje zrekonstruowaną siatkówkę i automatycznie zapisze obróconą siatkówkę jako "Retina1_reconstructed_rotated.tif" w folderze, w którym znajduje się oryginalny plik.
- Po zakończeniu analizy siatkówki przez kod pojawi się również okno pokazujące obrazy siatkówki przed i po obróceniu w celu porównania (rysunki 3B i 3C; Rysunki 3E i 3F).
UWAGA: Ten kod obraca zrekonstruowaną siatkówkę tak, aby brzuszna (najjaśniejsza) połowa znajdowała się na dole, a grzbietowa (najciemniejsza) na górze, dokładnie orientując w ten sposób siatkówkę zgodnie z gradientem s-opsin1. Jeśli udokumentowano, czy siatkówka pochodzi z prawego, czy z lewego oka, lokalizacja biegunów nosowych i skroniowych może być również ekstrapolowana z tej metody orientacji (Ryc. 3).
Wyniki
Pojedyncze nacięcie odciążające, które przecina mięsień prosty górny, pozwala na dokładną i niezawodną identyfikację grzbietowej części siatkówki (Rycina 1). Szczelina naczyniówki umożliwia dokładną i niezawodną identyfikację nosowej i skroniowej części siatkówki dzięki głębokim nacięciom odciążającym wzdłuż skroniowej i nosowej szczeliny naczyniówki (Rycina 2). W tym przykładzie wykonano również nacięcie odciążające w grzbietowej części siatkówki w celu zidentyfikowania osi grzbietowo-brzusznej siatkówki (Rycina 2D, strzałka pionowa). Kroki tych procesów zostały przedstawione w celu umożliwienia ich powtórzenia przez przyszłych badaczy wykonujących preparaty. Połączenie immunohistochemii s-opsyny (Rycina 3A oraz 3D), rekonstrukcji za pomocą oprogramowania Retistruct (3B, 3E) oraz precyzyjnej rotacji przy użyciu niestandardowego kodu MATLAB (3C, 3F) pozwala na identyfikację brzusznej i grzbietowej połowy siatkówki, a także biegunów nosowego i skroniowego, jeśli wiadomo, czy siatkówka pochodzi z prawego, czy z lewego oka (Rycina 3). Porównaliśmy również dwa powszechnie stosowane przeciwciała pierwszorzędowe przeciwko s-opsynie pod kątem skuteczności w znakowaniu czopków s-opsynowych (Rycina 4A-D): zarówno kozie przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko s-opsynie, jak i królicze przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko s-opsynie skutecznie znakują czopki s-opsynowe (Rycina 4E) u tej samej myszy.
Nacięcia odciążające zidentyfikowano na zrekonstruowanych siatkówkach barwionych immunohistochemicznie na s-opsynę, a ich lokalizację porównano z orientacją wyznaczoną przez gradient s-opsyny. Przy użyciu autorskiego kodu MATLAB (patrz Materiały uzupełniające), siatkówki zostały precyzyjnie obrócone tak, aby najwyższe stężenie barwienia s-opsyny znajdowało się brzusznie, co pozwoliło wyznaczyć prawdziwą stronę grzbietową na 90° (dla mięśnia prostego górnego), prawdziwą stronę nosową na 0° (dla nosowej szczeliny naczyniówkowej) oraz prawdziwą stronę skroniową na 180° (dla skroniowej szczeliny naczyniówkowej). Wartość kąta każdego poszczególnego nacięcia odciążającego określono za pomocą narzędzia do pomiaru kątów w programie ImageJ po obrocie siatkówek zgodnie z gradientem s-opsyny. Obliczono średni kąt dla każdego rodzaju nacięcia odciążającego, a następnie naniesiono średnią wartość dla każdego typu nacięcia na wykres polarny (Rycina 6). Średnio nacięcia mięśnia prostego górnego wyznaczyły biegun grzbietowy na 96,3 ± 4,3° (n = 11) (Rycina 6). Nosowa szczelina naczyniówkowa wyznaczyła biegun nosowy na 6,7 ± 5,8°, a skroniowa szczelina naczyniówkowa wyznaczyła biegun skroniowy na 172,0 ± 4,4° (n = 9; Rycina 6).
Rycina 1: Wykorzystanie mięśnia prostego górnego do dokładnej identyfikacji siatkówki grzbietowej prawego oka. (A) Przykład grzbietowego wypalenia rogówki w pobliżu granicy rogówkowo-twardówkowej wykonanego za pomocą pisaka z końcówką kauteryzacyjną (biała strzałka). W tym widoku widoczny jest również mięsień prosty górny (biała strzałka). (B) Przykład całej zamontowanej siatkówki z nacięciem odciążającym wykonanym w siatkówce grzbietowej poprzez przecięcie mięśnia prostego górnego. Strzałka wskazuje głębokie nacięcie odciążające wykonane w siatkówce grzbietowej poprzez przecięcie mięśnia prostego górnego. Siatkówka została zabarwiona przeciwciałem pierwszorzędowym kozim anty-s-opsin (patrz Tabela materiałów) oraz przeciwciałem wtórnym oslim anty-kozim Alexa 594 (patrz Tabela materiałów; wzbudzenie: 590 nm; emisja: 620 nm) (cyjan). Obraz siatkówki wykonano za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z filtrem Texas Red (595 nm). (C) Siatkówka zrekonstruowana w programie Retistruct i obrócona za pomocą niestandardowego kodu MATLAB (patrz Materiały uzupełniające) z widocznym nacięciem odciążającym mięśnia prostego górnego (biała strzałka). D: grzbietowo (dorsal), V: brzusznie (ventral), T: skroniowo (temporal), N: nosowo (nasal). Paski skali = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Wykorzystanie szczeliny naczyniówki do dokładnej identyfikacji bieguna nosowego i skroniowego siatkówki prawego oka. (A) Przykład grzbietowego wypalenia rogówki w pobliżu granicy rogówkowo-twardówkowej wykonanego za pomocą pisaka kauteryzacyjnego. (B) Szczelina naczyniówki widoczna na twardówce z tyłu oka (biała strzałka). W tym widoku widoczne jest również grzbietowe wypalenie rogówki, znajdujące się około 90° od skroniowej szczeliny naczyniówki. (C) Szczelina naczyniówki widoczna na twardówce z tyłu oka, biegnąca od nerwu wzrokowego do granicy rogówkowo-twardówkowej. (D) Siatkówka barwiona przeciwciałem kozim anty-s-opsin (patrz Tabela materiałów) oraz przeciwciałem wtórnym oslim anty-kozie Alexa 594 (patrz Tabela materiałów; wzbudzenie: 590 nm; emisja: 620 nm) (cyjan) z nacięciami szczeliny naczyniówki (strzałki poziome) i grzbietowym nacięciem odciążającym (strzałka pionowa). Obrazowanie siatkówki wykonano za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z filtrem Texas Red (595 nm). (E) Siatkówka zrekonstruowana w programie Retistruct i obrócona za pomocą niestandardowego kodu MATLAB (patrz Materiały uzupełniające), z widocznym grzbietowym nacięciem odciążającym oraz nacięciami nosowej i skroniowej szczeliny naczyniówki (białe strzałki). D: grzbietowy, V: brzuszny, T: skroniowy, N: nosowy. Paski skali = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 3: Wykorzystanie gradientu s-opsyny do identyfikacji wszystkich czterech biegunów siatkówki. (A) Przykład siatkówki wypreparowanej z prawego oka, która została poddana immunobarwieniu w celu znakowania s-opsyny i zobrazowana za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego z filtrem Texas Red (595 nm). Cięcia w tej siatkówce są przypadkowe, ponieważ orientacja topograficzna jest określana przez gradient s-opsyny. (B) Wyniki rekonstrukcji siatkówki z panelu A przy użyciu programu Retistruct. Zauważmy, że gradient s-opsyny nie jest prawidłowo wyrównany, ponieważ siatkówka nie została przetworzona za pomocą niestandardowego kodu MATLAB (patrz Materiały uzupełniające). (C) Wyniki obrotu siatkówki z panelu A za pomocą niestandardowego kodu. Siatkówka została obrócona tak, aby najwyższe stężenie barwienia s-opsyny znajdowało się na dole i zostało zidentyfikowane jako część brzuszna siatkówki. Ponieważ siatkówka pochodzi z prawego oka, biegun skroniowy znajduje się 90° przeciwnie do ruchu wskazówek zegara od bieguna grzbietowego, a biegun nosowy znajduje się 90° zgodnie z ruchem wskazówek zegara od bieguna grzbietowego. (D) Przykład siatkówki wypreparowanej z lewego oka, która została poddana immunobarwieniu w celu znakowania s-opsyny i zobrazowana za pomocą filtra Texas Red (595 nm). Cięcia w tej siatkówce są przypadkowe, ponieważ orientacja topograficzna jest określana przez gradient s-opsyny. (E) Wyniki cyfrowej rekonstrukcji siatkówki z panelu D przy użyciu programu Retistruct. Zauważmy, że gradient s-opsyny nie jest prawidłowo wyrównany, ponieważ siatkówka nie została obrócona za pomocą niestandardowego kodu. (F) Wyniki obrotu siatkówki z panelu D za pomocą niestandardowego kodu. Siatkówka została obrócona tak, aby najwyższe stężenie barwienia s-opsyny znajdowało się na dole i zostało zidentyfikowane jako część brzuszna siatkówki. Ponieważ siatkówka pochodzi z lewego oka, biegun nosowy znajduje się 90° przeciwnie do ruchu wskazówek zegara od bieguna grzbietowego, a biegun skroniowy znajduje się 90° zgodnie z ruchem wskazówek zegara od bieguna grzbietowego. D: grzbietowy, V: brzuszny, T: skroniowy, N: nosowy. Paski skali = 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 4: Porównanie dwóch pierwszorzędowych przeciwciał przeciwko s-opsyninie w znakowaniu czopków s-opsyninowych. (A) Siatkówka barwiona kozim pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko s-opsyninie (patrz Tabela materiałów). (B) Druga siatkówka tej samej myszy barwiona króliczym pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko s-opsyninie (patrz Tabela materiałów). (C) Reprezentatywny obszar (0,1 x 0,1 mm2) z siatkówki barwionej kozim pierwszorzędowym przeciwciałem przeciwko s-opsyninie. Obraz wykonany za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego przy powiększeniu 40X. (D) Reprezentatywny obszar (0,1 x 0,1 mm2) z siatkówki barwionej króliczym przeciwciałem przeciwko s-opsyninie (patrz Tabela materiałów), alternatywnym przeciwciałem pierwszorzędowym. Obraz wykonany za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego przy powiększeniu 40X. (E) Oba przeciwciała znakują taką samą liczbę segmentów zewnętrznych czopków s, ponieważ nie stwierdzono istotnej różnicy w liczbie immunopozytywnych czopków s barwionych przez kozie przeciwciało przeciwko s-opsyninie i królicze przeciwciało przeciwko s-opsyninie przy żadnej z badanych ekscentryczności siatkówki (n = 2; ANOVA z testem post hoc Bonferroniego; p >0,05). Paski skali = 1 mm (A-B); 25 µm (C-D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 5: Przewodnik wizualny po użytkowaniu oprogramowania Retistruct w celu rekonstrukcji siatkówek poddanych immunobarwieniu na s-opsynę. (A) Siatka otwarta w programie Retistruct z widocznym obrysem i dodanym „rozdarciem” (Tear). Punkty „rozdarcia” są wskazane nałożonymi białymi strzałkami. Wszystkie nacięcia w tej siatce są przypadkowe, ponieważ podczas sekcji nie wykorzystano żadnego konkretnego punktu orientacyjnego do oznaczenia orientacji siatkówki. Ważne przyciski są obramowane na czerwono. (B) Siatka ze wszystkimi dodanymi „rozdarciami” i zidentyfikowaną częścią grzbietową siatkówki, oznaczoną literą „D” na krawędzi. Zauważ, że przycisk „Reconstruct Retina” jest teraz widoczny. Ważne przyciski są obramowane na czerwono. (C) Proces rekonstrukcji siatkówki. Po prawej stronie pojawi się wykres biegunowy zrekonstruowanej siatkówki, pokazujący nacięcia odciążające w kolorze cyjanowym (nałożone niebieskie strzałki wyjaśniają lokalizację nacięć). (D) Końcowy wynik przetwarzania siatkówki w programie Retistruct. Oryginalna siatkówka w preparacie całego organu (wholemount) pozostaje po lewej stronie, a zrekonstruowana siatkówka pojawia się po prawej. Nacięcia odciążające są widoczne w kolorze cyjanowym (nałożone białe strzałki wyjaśniają lokalizację nacięć). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Rycina 6: Mięsień prosty górny oraz szczelina naczyniówkowa mogą być wykorzystane do precyzyjnej orientacji siatkówki myszy. Wykres polarny kątów uzyskanych z nacięć odciążających mięśnia prostego górnego lub nacięć szczeliny naczyniówkowej w siatkówkach zrekonstruowanych za pomocą programu Retistruct. Nacięcia odciążające zidentyfikowano na zrekonstruowanych siatkówkach z immunobarwieniem s-opsyny, a ich położenie porównano z położeniem gradientu s-opsyny. Wykorzystując specjalistyczny kod MATLAB do precyzyjnego obrotu siatkówek tak, aby najwyższe stężenie barwienia s-opsyny znajdowało się brzusznie, dla każdej siatkówki określono rzeczywistą stronę grzbietową (90° dla mięśnia prostego górnego), rzeczywistą stronę nosową (0° dla nosowej szczeliny naczyniówkowej) oraz rzeczywistą stronę skroniową (180° dla skroniowej szczeliny naczyniówkowej). Wartość kąta każdego pojedynczego nacięcia odciążającego określono w programie ImageJ, a następnie obliczono średni kąt dla każdego rodzaju nacięcia odciążającego. Nacięcia mięśnia prostego górnego wskazały biegun grzbietowy przy 96,3 ± 4,3° (n = 11). Nosowa szczelina naczyniówkowa wskazała biegun nosowy przy 6,7 ± 5,8°, a skroniowa szczelina naczyniówkowa wskazała biegun skroniowy przy 172,0 ± 4,5° (n = 9). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Głęboki Punkt Orientacyjny | Lokalizacja oparzenia rogówki | Zidentyfikowano biegun siatkówki | Zastosowanie eksperymentalne |
| Mięsień prosty górny | Grzbietowy | Grzbietowy | Żywe lub utrwalone |
| Szczelina naczyniówkowa nosowa | Grzbietowy | Nosowy | Żywe lub utrwalone |
| Przednia szczelina naczyniówkowa kąta skroniowego | Grzbietowy | Czasowy | Żywe lub utrwalone |
| gradient S-opsyny | Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. | Grzbietowy, brzuszny, nosowy, skroniowy | Utrwalony |
Tabela 1: Głębokie punkty orientacyjne, identyfikowany przez nie biegun siatkówki oraz informacja, czy mogą być one stosowane w tkance żywej lub utrwalonej.
Dyskusja
Nie ma kompleksowego, ustandaryzowanego protokołu do określania i oznaczania orientacji izolowanej siatkówki myszy w przestrzeni anatomicznej. Szczegółowo opisany tutaj protokół próbuje wypełnić tę pustkę poprzez standaryzację i uszczegółowienie, w jaki sposób używać głębokich anatomicznych punktów orientacyjnych jako punktów odniesienia do wiarygodnej identyfikacji orientacji siatkówki. Wykazano, że głębokie anatomiczne punkty orientacyjne w tym protokole zapewniają dokładniejszą i bardziej wiarygodną metodę orientacji siatkówki myszy niż powierzchowne punkty orientacyjne, takie jak oparzenia rogówki22. Tak więc badania, które opierały się na oparzeniach rogówki w celu orientacji siatkówki, mogły mieć większe błędy w orientacji niż badania, które opierały się na punktach orientacyjnych, takich jak mięśnie proste i szczelina naczyniówki. Ta rozbieżność podkreśla potrzebę i znaczenie tego ustandaryzowanego protokołu w odniesieniu do interpretacji wyników i dokonywania porównań między badaniami, które zależą od dokładnej orientacji siatkówki. Ogólnie rzecz biorąc, ustandaryzowany protokół zapewni wspólną metodę do naśladowania przez badaczy wzroku, eliminując w ten sposób obecność zmiennej zakłócającej w pozyskiwaniu danych, która może wystąpić przy użyciu niestandardowych metod identyfikacji orientacji siatkówki.
Przedstawione tutaj metody są łatwo powtarzalne i mają zastosowanie do wielu typów protokołów eksperymentalnych. W rzeczywistości jedną z największych zalet tego protokołu jest jego zdolność adaptacji. Ponieważ stwierdzono, że szczelina naczyniówki, ekspresja s-opsyny i mięsień prosty niezawodnie identyfikują orientację siatkówki22 , punkt orientacyjny, który najlepiej odpowiada parametrom eksperymentalnym, można wybrać w celu optymalizacji pozyskiwania danych (Tabela 1). Dodatkowo metody preparacji można łączyć, aby jeszcze bardziej wyjaśnić orientację siatkówki. Na przykład nacięcia szczeliny naczyniówki można połączyć z immunohistochemią s-opsyny w celu zorientowania wszystkich czterech biegunów siatkówki: półkule nosowe i skroniowe można zidentyfikować po nacięciach szczeliny naczyniówki, a immunohistochemia s-opsyny może zidentyfikować półkule brzuszne i grzbietowe. Jednak zdolność adaptacyjna tego protokołu może być ograniczona przez wrażliwy na czas charakter eksperymentów fizjologicznych. Ponieważ czas potrzebny na zidentyfikowanie punktu orientacyjnego, oparzenie rogówki i wykonanie cięcia łagodzącego może spowodować znaczną śmierć tkanki w eksperymentach ex vivo , niektóre z tych metod preparacji mogą być mniej niż optymalne. Na szczęście, gdy sekcja zapozna się ze szczeliną naczyniówki lub metodą rozwarstwienia mięśnia prostego górnego, identyfikacja głębokich punktów orientacyjnych i szybkie wykonanie nacięć łagodzących staje się częścią rutyny preparacji i nie wydłuża znacząco sekcji. Chociaż przyznajemy, że opisane tutaj kroki mogą przyspieszyć eksperymenty, w których czas jest bardzo wrażliwy, sugerujemy użycie gradientu s-opsyny do orientacji siatkówki post hoc , gdy żywotność tkanki nie stanowi już problemu (ryc. 3). Barwienie siatkówki pod kątem s-opsyny jest skutecznym sposobem orientacji siatkówki, ponieważ może zidentyfikować wszystkie cztery bieguny: barwienie s-opsyny dzieli siatkówkę na bieguny grzbietowe i brzuszne i pozwala na identyfikację biegunów nosowych i skroniowych w zależności od tego, czy siatkówka pochodzi z prawego, czy lewego oka (ryc. 3). Dlatego uważamy, że ten protokół zapewnia niezawodny i powtarzalny zestaw metod dokładnej orientacji siatkówki, które mogą spełnić dowolne parametry eksperymentalne.
Podobnie jak w przypadku każdej zmodyfikowanej sekcji siatkówki, ważność metody rozwarstwienia jest ograniczona przez dokładność sekcji i jakość wyizolowanej tkanki. Jeśli jakakolwiek tkanka zostanie utracona podczas sekcji lub siatkówka jest zbyt zniekształcona, aby można ją było dokładnie zrekonstruować, Retistruct i program MATLAB nie będą w stanie wiarygodnie zrekonstruować lub zorientować siatkówki. Dlatego ważne jest, aby przećwiczyć metodę sekcji przed użyciem jej do eksperymentów zbierających dane. Chociaż wyjaśnione tutaj rodzaje sekcji nie są trudne, należy je ćwiczyć, aby zapewnić powtarzalność identyfikacji orientacji siatkówki z konkretnym punktem orientacyjnym. Ponadto ważne jest, aby w ramach procedury przeprowadzania sekcji przeprowadzono wizualną identyfikację anatomicznych punktów orientacyjnych przed rozpoczęciem zbierania danych, aby upewnić się, że używany jest właściwy punkt orientacyjny. Jednym ze sposobów sprawdzenia dokładności konkretnego rozgałęzienia jest wykonanie nacięć szczeliny naczyniówki lub nacięć mięśnia prostego górnego, a następnie porównanie lokalizacji nacięć z gradientem s-opsyny, ponieważ jest to stały marker, a zatem nie zależy od dokładności sekcji. Potencjalne dyssektory mogą również porównać swoje zrekonstruowane siatkówki z przykładami zrekonstruowanych siatek z dokładnymi cięciami punktów orientacyjnych, które pokazano na rycinach 1 i 2. Zasadniczo, potencjalna sekcja powinna wykonać kroki opisane w tym protokole dla określonego typu sekcji, niezależnie od tego, czy jest to górny mięsień prosty, czy metoda szczeliny naczyniówki, i porównać wyniki z gradientem s-opsyny w celu ustalenia ważności konkretnego rozsektorowania. Ponieważ jeśli sekcja nie ma pewności co do lokalizacji punktu orientacyjnego, może to spowodować niedokładną orientację siatkówki, która domyślnie wpłynie na gromadzenie i interpretację danych.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Brittany Day i Jessice Onyak za ich pomoc techniczną oraz Dr. Liu za uprzejme umożliwienie nam korzystania ze swojego mikroskopu epifluorescencyjnego. Podziękowania za wsparcie: NIH R15EY026255-01 oraz Fundacja Karla Kirchgessnera.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,1 M sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Sigma-Aldrich | P5244 | |
| Mikroskop epifluorescencyjny Axioplan2 | Zeiss | N/A | |
| Bezbarwny lakier do paznokci | N/A | N/A | |
| Corning LSE Low Speed Orbital Shaker | Sigma-Aldrich | CLS6780FP | |
| Costar 24-dołkowe płytki z powłoką TC | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Mikroskop preparacyjny | Olympus | SZ51 | |
| Osioł anty-kozioł Alexa 594 | Life Technologies | A11058 | |
| Osioł anty-Królik Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Osioł Normalna surowica | miliporowa | 566460 | Stosować w dawce 5,2% (52 μ L z 86 μ L 20% Triton X-100 i 863 μ L 0,1 M PBS na 1 ml roztworu blokującego) |
| Szkiełka mikroskopowe Fisherbrand Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Kozia anty-s-opsyna | Santa Cruz Biotechnologies | sc-14363 | Niedostępne komercyjnie od 2017 |
| Graefe Zakrzywione kleszcze | Fine Science Tools | 11052-10 | |
| ImageJ lub FIJI | National Institute of Health | N/A | Bezpłatnie dostępne oprogramowanie |
| Kauteryzacja niskotemperaturowa Okulistyczny kauteryzator z cienką końcówką | Bovie Medical Corporation | AA00 | |
| MATLAB | MathWorks | N/A | Przynajmniej wersja 2007b lub nowsze |
| Okulary Micro Cover | VWR International | 48393-241 | |
| Mikrotacki przesuwne | VWR International | 82020-913 | |
| Ultracienkie kleszcze Moira | Narzędzia do nauki precyzyjnej | 11370-40 | |
| Membrana nitrocelulozowa | Millipore | HAWP04700 | |
| Paraformaldehyd | Mikroskopia elektronowa Nauki | 15714-S Stosować | przy 4% (25 μ L oraz 875 μ L 0,1 M PBS na 1 ml utrwalacza |
| Igła PrecisionGlide 20G (0,90 mm x 25 mm) | BD PrecisionGlide | 305175 | |
| Szkło Pyrex Szalka Petriego | Sigma-Aldrich | CLS3160152 | |
| R | Projekt R do obliczeń statystycznych | Nie dotyczy | Bezpłatnie dostępne oprogramowanie; wersja 3.4.3 lub nowsza |
| Anty-s-opsin królika | Millipore | ABN1660 | |
| Retiga R3 Kamera mikroskopowa | Qimaging | 01-RET-R3-R-CLR-14-C | |
| Retistruct | N/A | N/A | Swobodnie dostępne oprogramowanie kompatybilne z Windows 7 lub Windows 10 |
| Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media | Fisher Scientific | 14-390-5 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Użyj 1.7% (86 μ L 20% Triton-X z 52 μ L Surowicy Normalnej Osła i 863 μ L 0,1 M PBS na 1 ml roztworu blokującego) |
| Nożyczki do rozwarstwiania Vannas Spring | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Mikroskop USB 5MP Aparat cyfrowy | AmScope | MU500 | Do użytku z mikroskopem preparacyjnym Olympus |
Bibliografia
- Applebury, M. L., et al. The murine cone photoreceptor: A single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning. Neuron. 27 (3), 513-523 (2000).
- Hughes, S., Watson, T. S., Foster, R. G., Peirson, S. N., Hankins, M. W. Nonuniform distribution and spectral tuning of photosensitive retinal ganglion cells of the mouse retina. Curr Biol. 23 (17), 1696-1701 (2013).
- Sondereker, K. B., Onyak, J. R., Islam, S. W., Ross, C. L., Renna, J. M. Melanopsin ganglion cell outer retinal dendrites: Morphologically distinct and asymmetrically distributed in the mouse retina. J Comp Neurol. 525 (17), 3653-3665 (2017).
- Bleckert, A., Schwartz, G. W., Turner, M. H., Rieke, F., Wong, R. O. L. Visual space is represented by nonmatching topographies of distinct mouse retinal ganglion cell types. Current Biology. 24 (3), 310-315 (2014).
- Warwick, R. A., Kaushansky, N., Sarid, N., Golan, A., Rivlin-Etzion, M. Inhomogeneous Encoding of the Visual Field in the Mouse Retina. Curr Biol. 28 (5), 655-665 (2018).
- Valiente-Soriano, F. J., et al. Distribution of melanopsin positive neurons in pigmented and albino mice: evidence for melanopsin interneurons in the mouse retina. Front Neuroanat. 8, 131(2014).
- Sabbah, S., et al. A retinal code for motion along the gravitational and body axes. Nature. 546 (7659), 492-497 (2017).
- Vaney, D. I., Sivyer, B., Taylor, W. R. Direction selectivity in the retina: Symmetry and asymmetry in structure and function. Nat Rev Neurosci. 13 (3), 194-208 (2012).
- Huberman, A. D., et al. Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion. Neuron. 62 (3), 327-334 (2009).
- Ueki, Y., Ramirez, G., Salcedo, E., Stabio, M. E., Lefcort, F. Loss of Ikbkap causes slow, progressive retinal degeneration in a mouse model of familial dysautonomia. eNeuro. 3 (5), (2016).
- Maiorano, N. A., Hindges, R. Restricted perinatal retinal degeneration induces retina reshaping and correlated structural rearrangement of the retinotopic map. Nat Commun. 4, 1938(2013).
- Hadj-Said, W., et al. Quantitative and topographical analysis of the losses of cone photoreceptors and retinal ganglion cells under taurine depletion. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (11), 4692-4703 (2016).
- Tao, Y., et al. The temporal topography of the N-Methyl- N-nitrosourea induced photoreceptor degeneration in mouse retina. Sci Rep. 5, 18612(2015).
- Risner, M. L., Pasini, S., Cooper, M. L., Lambert, W. S., Calkins, D. J. Axogenic mechanism enhances retinal ganglion cell excitability during early progression in glaucoma. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2018).
- Estevez, M. E., et al. Form and function of the M4 cell, an intrinsically photosensitive retinal ganglion cell type contributing to geniculocortical vision. J Neurosci. 32 (39), 13608-13620 (2012).
- Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Transretinal ERG recordings from mouse retina: Rod and cone photoresponses. J Vis Exp. (61), (2012).
- Lin, B., Wang, S. W., Masland, R. H. Retinal ganglion cell type, size, and spacing can be specified independent of homotypic dendritic contacts. Neuron. 43 (4), 475-485 (2004).
- Ortin-Martinez, A., et al. Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain. PLoS One. 9 (7), 102392(2014).
- Zhang, H., et al. The degeneration and apoptosis patterns of cone photoreceptors in rd11 Mice. J Ophthalmol. 2017, 9721362(2017).
- Wei, W., Elstrott, J., Feller, M. B. Two-photon targeted recording of GFP-expressing neurons for light responses and live-cell imaging in the mouse retina. Nat Protoc. 5 (7), 1347-1352 (2010).
- Wang, J., et al. Anatomy and spatial organization of Muller glia in mouse retina. J Comp Neurol. 525 (8), 1759-1777 (2017).
- Stabio, M. E., et al. A novel map of the mouse eye for orienting retinal topography in anatomical space. J Comp Neurol. 526 (11), (2018).
- Lamb, T. D., Collin, S. P., Pugh, E. N. Evolution of the vertebrate eye: Opsins, photoreceptors, retina and eye cup. Nat Rev Neurosci. 8 (12), 960-976 (2007).
- Sterratt, D. C., Lyngholm, D., Willshaw, D. J., Thompson, I. D. Standard anatomical and visual space for the mouse retina: Computational reconstruction and transformation of flattened retinae with the Retistruct package. PLoS Comput Biol. 9 (2), 1002921(2013).
Przedruki i uprawnienia
