Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Single Sensillum Recordings dla Locust Palp Sensilla Basiconica

8.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57863

⸱

23 czerwca 2018

 ,  , 
1Department of Entomology, China Agricultural University, 2Bio-tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje szczegółowy i wysoce skuteczny protokół dla pojedynczych nagrań sensillum z sensilla basiconica na palpach aparatów gębowych owadów.

Streszczenie

Palpy aparatu gębowego szarańczy są uważane za konwencjonalne organy smakowe, które odgrywają ważną rolę w doborze pożywienia szarańczy, szczególnie do wykrywania nielotnych sygnałów chemicznych przez sensilla chaetica (wcześniej nazywaną sensillą terminalną lub czubatą). Obecnie istnieje coraz więcej dowodów na to, że te palpy mają również funkcję węchową. Receptor zapachowy (LmigLUB2) i białko wiążące zapach (LmigOBP1) zostały zlokalizowane odpowiednio w neuronach i komórkach pomocniczych w sensilla basiconica palps. Zapis pojedynczego czujnika (SSR) służy do rejestrowania odpowiedzi neuronów receptora zapachowego, co jest skuteczną metodą badania przesiewowego aktywnych ligandów na określone receptory zapachowe. SSR jest stosowany w badaniach funkcjonalnych receptorów zapachowych w palp sensilla. Budowa sensilla basiconica znajdującej się na kopule palps różni się nieco od budowy tych na czułkach. W związku z tym, podczas wykonywania SSR wywołanego przez substancje zapachowe, pewne konkretne porady mogą być pomocne w uzyskaniu optymalnych wyników. W artykule przedstawiono szczegółowy i wysoce skuteczny protokół SSR z insect palp sensilla basiconica.

Wprowadzenie

Zwierzęta wyewoluowały szereg narządów chemosensorycznych, które wyczuwają egzogenne sygnały chemiczne. U owadów najważniejszymi narządami chemosensorycznymi są czułki i palpy. Na tych narządach kilka rodzajów włosów chemosensorycznych, zwanych sensylami chemosensorycznymi, jest unerwionych przez neurony chemosensoryczne (CSN) we włosach. CSN w sensylii chemosensorycznej rozpoznają określone sygnały chemiczne poprzez transdukcję sygnału od bodźców chemicznych do potencjałów elektrycznych, które są następnie przekazywane do ośrodkowego układu nerwowego1,2,3.

CSN wyrażają różne receptory chemosensoryczne [np. receptory zapachowe (OR)], receptory jonotropowe (IR) i receptory smakowe (GR) na swoich błonach, które kodują egzogenne sygnały chemiczne związane z różnymi typami chemosensacji4,5,6. Charakterystyka CSN jest kluczem do wyjaśnienia komórkowych i molekularnych mechanizmów chemorecepcji owadów. Obecnie rejestracja pojedynczego sensora (SSR) jest szeroko stosowaną techniką charakteryzowania CSN owadów w czułkach czułków wielu owadów, w tym much7, moths8, beetles9, aphids10, locusts11 i ants12. Jednak w niewielu badaniach zastosowano SSR do palpów owadów13,14,15,16,17, ponieważ poszczególne struktury ich sensilli utrudniają zapis elektrofizjologiczny18.

Roje szarańczy (Orthoptera) często powodują poważne szkody w uprawach i straty ekonomiczne19. Uważa się, że palpy odgrywają ważną rolę w wyborze pokarmu dla szarańczy20,21,22,23,24. Dwa rodzaje czubek sensorycznych są badane za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Zazwyczaj na każdej kopule locust palps18 obserwuje się 350 sensilla chaetica i 7 - 8 sensilla basiconica. Sensilla chaetica to zmysły smakowe, które wyczuwają nielotne sygnały chemiczne, podczas gdy sensilla basiconica ma funkcję węchową, wyczuwając lotne sygnały chemiczne.

Na palpach szarańczy średnice oczodołów włosów sensilla basiconica (ok. 12 μm) są znacznie większe niż w sensilla chaetica (ok. 8 μm)18,25. Ściana kutykularna sensilla basiconica na palpach jest znacznie grubsza niż u czułka sensilla18. Ponadto kopuła palpa ma płynną zawartość w bardzo elastycznym naskórku. Te cechy oznaczają, że penetracja mikroelektrodą i uzyskanie dobrych sygnałów elektrofizjologicznych jest trudniejsze niż w przypadku czułki czułkowej. W tym artykule przedstawiono szczegółowy i wysoce skuteczny protokół SSR dla szarańczy palp sensilla basiconica wraz z filmem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie instrumentów i owadów

  1. Przygotowanie elektrod wolframowych i roztworów bodźców
    1. Zamocuj nowy drut wolframowy (średnica 0,125 mm, długość 75 mm) w mikromanipulatorze i naostrz go w 10% (w/v) roztworze azotynu sodu (NaNO2) w strzykawce pod napięciem 10 V dostarczonym przez zasilacz przez około 1 minutę pod mikroskopem stereoskopowym (powiększenie 40x).
    2. Zanurz kilkakrotnie zaostrzony drut wolframowy w 10% roztworze NaNO2, około 4 mm przy 5 V w ciągu < 1 minuty (Rysunek 1A).
    3. Często badaj średnicę zaostrzonej końcówki wolframu pod mikroskopem stereoskopowym, aż będzie wystarczająco delikatna, aby przeniknąć do naskórka palpa malfaktorycznego sensillum (Ryc. 1B).
    4. Przygotuj roztwory stymulacyjne. Rozcieńczyć każdą substancję stymulującą działanie substancji chemicznej w oleju mineralnym. Rozcieńczyć 1-nonanol i kwas nonanowy w 10% rozcieńczeniach. Rozcieńczyć E-2-heksenal i sześciokąt w 10-2, 10-3, 10-4 i 10-5.
    5. Przygotować probówki Pasteura zawierające bodźce: włożyć paski bibuły filtracyjnej (długość 2 cm, szerokość 0,5 cm) do probówek Pasteura, dodać rozcieńczone roztwory stymulacyjne (po 10 μl) do pasków bibuły filtracyjnej, a następnie zatkać probówki Pasteura końcówkami do pipet (1 ml).
  2. Przygotuj owada
    1. Szarańcza tylna (Locusta migratoria) ze świeżymi siewkami pszenicy w zatłoczonych warunkach przy wilgotności względnej 60%, temperaturze 28 - 30 °C i fotoperiodzie 18:6 h (światło: ciemność). Wybierz 1- do 3-dniowe nimfy szarańczy wpiątym stadium rozwojowym i usuń czułki cienkimi nożyczkami, aby uniknąć zakłóceń podczas nagrywania.
  3. Przygotowanie uchwytu palpa na szarańczę szczękową
    1. Użyj szkiełka podstawowego (25 mm x 75 mm) jako podstawy uchwytu palpa szczękowego (MPH). Przymocuj plastikowy element (1 mm wysokości, 10 mm szerokości, 35 mm długości) do rogu szklanego szkiełka za pomocą dwustronnej taśmy klejącej, a na koniec przymocuj szklankę nakrywkową (18 mm x 18 mm) na plastikowym elemencie za pomocą dwustronnej taśmy klejącej. Umieść mały kawałek czerwonej gumowej taśmy na szkle nakrywkowym jako warstwę antypoślizgową. Plastikowy element i szkło nakrywkowe stanowią platformę dla palpa szarańczy. Wysokość platformy wynosi około 1,5 mm.
    2. Zamontuj drut wolframowy (średnica 0,125 mm, długość 36 mm) w odległości 1,5 mm równolegle do wewnętrznej krawędzi platformy. Przymocuj dwa końce drutu do platformy za pomocą dwustronnej taśmy klejącej.

2. Przygotowanie palpów szczękowych szarańczy

  1. Przeciąć probówkę wirówkową (1,5 ml) pionowo na pół i odciąć spód. Umieść szarańczę w przygotowanej rurce. Pozostaw odsłonięty obszar brzuszny i głowę szarańczy. Przymocuj zespół do szkiełka za pomocą dwustronnej taśmy klejącej (Rysunek 2A).
  2. Pociągnij prawą szczękę na platformę.
  3. Umieść drut wolframowy w czwartym segmencie palp. Umieść szpachlę adhezyjną po obu stronach drutu wolframowego, około 2 mm od palpa szczęki (Rysunek 2A i 2B).

3. Pojedyncze nagrania Sensillum

  1. Preparat do palpowania szarańczy szczękowej umieścić pod mikroskopem w małym powiększeniu (100X). Dostosuj położenie preparatu, aż palp będzie prostopadły do elektrody rejestrującej (Rysunek 3A).
  2. Włóż elektrodę odniesienia (elektrodę wolframową) do oka szarańczy za pomocą mikromanipulatora. Przesuń elektrodę rejestrującą (elektrodę wolframową) blisko palpa szczęki za pomocą mikromanipulatora (Rysunek 3B i 3C).
  3. Ustaw urządzenie dostarczające zapach w odległości około 1 cm od szczęki (Rysunek 3B).
  4. Otwórz oprogramowanie do nagrywania Auto Spike 32. Ustaw parametry nagrywania w następujący sposób: skala zapisu na 500 μV; górne odcięcie filtra przy 300 Hz, dolne odcięcie przy 200 Hz; i wyzwalacz wstępny na 10 s.
  5. Podłącz elektrodę nagrywającą do 10x uniwersalnego wzmacniacza AC/DC.
  6. Przełącz mikroskop na duże powiększenie (500x). Włóż elektrodę rejestrującą do podstawy podstawki sensillum na palpie szczęki i delikatnie wyreguluj elektrodę rejestrującą, aby uzyskać dobre spontaniczne skoki (Rysunek 3D).
  7. Otwórz kontroler bodźca, aby dostarczyć ciągły strumień powietrza z prędkością 20 ml/s. Ustaw czas stymulacji na 1 s. Nagrywaj sygnały przez 10 s, rozpoczynając 10 s przed nadejściem impulsu bodźca.
  8. Użyj 10x uniwersalnego wzmacniacza AC/DC, aby wzmocnić sygnały. Wprowadź sygnały do IDAC 4. Analizuj sygnały za pomocą oprogramowania Auto Spike 32. Sygnały AC są filtrowane pasmowo-przepustowo w zakresie od 200 do 300 Hz. Użyj Auto Spike 32, aby odróżnić amplitudy od szczytu do dołka od szumów. Oblicz reakcje neuronów jako wzrost częstotliwości potencjału czynnościowego (skoki na sekundę) w stosunku do częstotliwości spontanicznych. Wykonaj analizę statystyczną za pomocą GraphPad Prism 7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Dwa podtypy sensyli (pb1 i pb2) na palpie szczękowej szarańczy zostały zidentyfikowane na podstawie różnych dynamik odpowiedzi na chemiczne substancje zapachowe (10% 1-nonanolu i 10% kwasu nonanowego). Neurony w pb1 generują znacząco więcej impulsów w odpowiedzi na 1-nonanol niż na kwas nonanowy, podczas gdy neurony w pb2 są znacznie słabiej aktywowane przez 1-nonanol w porównaniu z kwasem nonanowym (Rysunek 4). Heksanal i E-2-heksenal mogą wywołać reakcję ot...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Owady polegają na palpach do wykrywania zapachów żywności i uważa się, że ich palpy odgrywają ważną rolę w specjacji13,27. Palpy są prostymi narządami węchowymi i cieszą się coraz większym zainteresowaniem jako atrakcyjny model do eksploracji sieci neuromolekularnych leżących u podstaw chemosensacji28.

Testy SSR oznaczające owady i palp zostały z powodzeniem przeprowadzone na Drosophila melanogaster,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez grant z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (No.31472037). Wszelkie wzmianki o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tym artykule służą wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie stanowią rekomendacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Drut wolframowyADVENTW559504Służy do wykonania elektrody i mocowania palp
NaNO2Sigma-aldrich563218-25GSłuży do ostrzenia drutu wolframowego
Zasilacz sieciowySyntechA2-70Zapewnienie napięcia przy ostrzeniu drutu wolframowego
StereoskopMoticSMZ-163Służy do obserwacji ostrzenie drutu wolframowego
MikroskopOlympusW-51Służy do obserwacji sensilli na palpie szczęki szarańczy
Inteligentny kontroler akwizycji danychSyntechIDAC-4Wyświetlanie w czasie rzeczywistym na ekranie wszystkich sygnałów przed i podczas nagrywania
Kontroler bodźcówSyntechCS-55Służy do sterowania aplikacją bodźca
Elektroniczny mikromanipulatorC.M.D.TCFT-8301DSłuży do niewielkiego ruchu elektrody rejestrującej
MikromanipulatorNarishigeMN-151Służy do niewielkiego ruchu elektrody odniesienia
GłośnikEDIFIERR101T06Połączony z IDAC-4 i dostarczający dźwięk do sygnału
Podstawa magnetycznaPDOKPD-101Służy do przytrzymywania elektrody i rurki dostarczającej bodziec
Stół do izolacji drgańTianHeHAP-100-1208Służy do izolowania wibracji od sprzętu
Prowadnica szklanaCITOGLASZBP-407Służy do wykonania podstawy do MPH
Blu-tackBostikBlu-tack-45gMocowanie drutu wolframowego
Rurka PasteuraYAREWITEGUmieszczenie bibuły filtracyjnej zawierającej roztwory bodźców bodźcowych

Bibliografia

  1. Carey, A. F., Carlson, J. R. Insect olfaction from model systems to disease control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), 12987-12995 (2011).
  2. Leal, W. S. Odorant reception in insects: roles of receptors, binding proteins, and degrading enzymes. Annual Review of Entomology. 58, 373-391 (2013).
  3. Zhang, J., Walker, W. B., Wang, G. Pheromone reception in moths: from molecules to behaviors. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 130, 109-128 (2015).
  4. Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96 (5), 725-736 (1999).
  5. Benton, R., Vannice, K. S., Gomez-Diaz, C., Vosshall, L. B. Variant ionotropic glutamate receptors as chemosensory receptors in Drosophila. Cell. 136 (1), 149-162 (2009).
  6. Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review of Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
  7. de Bruyne, M., Foster, K., Carlson, J. R. Odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 30, 537-552 (2001).
  8. Roelofs, W., et al. Sex pheromone production and perception in European corn borer moths is determined by both autosomal and sex-linked genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7585-7589 (1987).
  9. Larsson, M. C., Leal, W. S., Hansson, B. S. Olfactory receptor neurons detecting plant odours and male volatiles in Anomala cuprea beetles (Coleoptera: Scarabaeidae). Journal of Insect Physiology. 47 (9), 1065-1076 (2001).
  10. Zhang, R., et al. Molecular basis of alarm pheromone detection in aphids. Current Biology. 27 (1), 55-61 (2017).
  11. Cui, X., Wu, C., Zhang, L. Electrophysiological response patterns of 16 olfactory neurons from the trichoid sensilla to odorant from fecal volatiles in the locust, Locusta migratoria manilensis. Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 77 (2), 45-57 (2011).
  12. Sharma, K. R., et al. Cuticular hydrocarbon pheromones for social behavior and their coding in the ant antenna. Cell Reports. 12 (8), 1261-1271 (2015).
  13. de Bruyne, M., Clyne, P. J., Carlson, J. R. Odor coding in a model olfactory organ: the Drosophila maxillary palp. Journal of Neuroscience. 19 (11), 4520-4532 (1999).
  14. Syed, Z., Leal, W. S. Maxillary palps are broad spectrum odorant detectors in Culex quinquefasciatus. Chemical Senses. 32 (8), 727-738 (2007).
  15. Lu, T., et al. Odor coding in the maxillary palp of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Current Biology. 17 (18), 1533-1544 (2007).
  16. Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. Journal of Visualized Experiments. 36, e1725(2010).
  17. Grant, A. J., Wigton, B. E., Aghajanian, J. G., O'Connell, R. J. Electrophysiological responses of receptor neurons in mosquito maxillary palp sensilla to carbon dioxide. Journal of Comparative Physiology A. 177 (4), 389-396 (1995).
  18. Blaney, W. The ultrastructure of an olfactory sensillum on the maxillary palps of Locusta migratoria (L.). Cell and Tissue Research. 184 (3), 397-409 (1977).
  19. Hassanali, A., Njagi, P. G. N., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annual Review of Entomology. 50, 223-245 (2005).
  20. Chapman, R. F. Contact chemoreception in feeding by phytophagous insects. Annual Review of Entomology. 48, 455-484 (2003).
  21. Chapman, R. F., Sword, G. The importance of palpation in food selection by a polyphagous grasshopper (Orthoptera: Acrididae). Journal of Insect Behavior. 6, 79-91 (1993).
  22. Winstanley, C., Blaney, W. Chemosensory mechanisms of locusts in relation to feeding. Entomologia Experimentalis et Applicata. 24, 750-758 (1978).
  23. Blaney, W., Duckett, A. The significance of palpation by the maxillary palps of Locusta migratoria (L.): an electrophysiological and behavioural study. Journal of Experimental Biology. 63, 701-712 (1975).
  24. Blaney, W. Electrophysiological responses of the terminal sensilla on the maxillary palps of Locusta migratoria (L.) to some electrolytes and non-electrolytes. Journal of Experimental Biology. 60, 275-293 (1974).
  25. Jin, X., Zhang, S., Zhang, L. Expression of odorant-binding and chemosensory proteins and spatial map of chemosensilla on labial palps of Locusta migratoria (Orthoptera: Acrididae). Anthropod Structure & Development. 35 (1), 47-56 (2006).
  26. Zhang, L., Li, H., Zhang, L. Two olfactory pathways to detect aldehydes on locust mouthpart. International Journal of Biological Sciences. 13 (6), 759-771 (2017).
  27. Dweck, H. K. M., et al. Olfactory channels associated with the Drosophila maxillary palp mediate short- and long-range attraction. eLife. 5, e14925(2016).
  28. Bohbot, J. D., Sparks, J. T., Dickens, J. C. The maxillary palp of Aedes aegypti, a model of multisensory Integration. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 48, 29-39 (2014).
  29. Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. Journal of Visualized Experiments. 84, e51355(2014).
  30. Ng, R., Lin, H. H., Wang, J. W., Su, C. Y. Electrophysiological recording from Drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility. Journal of Visualized Experiments. 125, e56147(2017).
  31. Syed, Z., Leal, W. S. Electrophysiological measurements from a moth olfactory system. Journal of Visualized Experiments. 49, e2489(2011).
  32. Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. Multi-unit recording methods to characterize neural activity in the locust (Schistocerca Americana) olfactory circuits. Journal of Visualized Experiments. 71, e50139(2013).
  33. Liu, F., Liu, N. Using single sensillum recording to detect olfactory neuron responses of bed bugs to semiochemicals. Journal of Visualized Experiments. 107, e53337(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Rejestracja z pojedynczego sensillaelektroda wolframowareceptor zapachowybodziec chemicznypalpus szczękowyelektrofizjologiawęch owadówpreparatyka sensillum
Single Sensillum Recordings dla Locust Palp Sensilla Basiconica
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.