Artykuł metodologiczny

Szybka izolacja mitoribosomu z komórek HEK

14.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57877

⸱

4 października 2018

 ,  ,  , 
1Science for Life Laboratory, Department of Biochemistry and Biophysics, Stockholm University

W tym artykule

Podsumowanie

Mitochondria mają wyspecjalizowane rybosomy, które różnią się od swoich bakteryjnych i cytoplazmatycznych odpowiedników. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób mitoribosomy można uzyskać z ich natywnego przedziału w komórkach HEK. Metoda polega na izolacji mitochondriów z komórek zawiesinowych, a następnie oczyszczeniu mitoribosomów.

Streszczenie

Ludzkie mitochondria posiadają dedykowany zestaw rybosomów (mitoribosomów), które przekształcają 13 podstawowych składników białkowych kompleksów fosforylacji oksydacyjnej kodowanych przez genom mitochondrialny. Ponieważ wszystkie białka syntetyzowane przez ludzkie mitoribosomy są integralnymi białkami błonowymi, ludzkie mitopibosomy są przywiązane do wewnętrznej błony mitochondriów podczas translacji. W porównaniu z rybosomem cytozolowym mitoribosom ma współczynnik sedymentacji 55S, połowę zawartości rRNA, brak 5S rRNA i 36 dodatkowych białek. Dlatego wyższy stosunek białka do RNA i nietypowa struktura sprawiają, że ludzki mitoribosom znacznie różni się od swojego cytozolowego odpowiednika.

Pomimo kluczowego znaczenia mitoribosomu dla życia, nie były dostępne żadne protokoły do oczyszczania nienaruszonego kompleksu z ludzkich linii komórkowych. Tradycyjnie mitoribosomy izolowano z bogatych w mitochondria tkanek zwierzęcych, które wymagały kilogramów materiału wyjściowego. Doszliśmy do wniosku, że mitochondria dzielące ludzkie komórki pochodzące z HEK293 hodowane w bogatej w składniki odżywcze pożywce ekspresyjnej miałyby aktywną translację mitochondrialną, a zatem mogłyby być odpowiednim źródłem materiału do badań strukturalnych i biochemicznych mitoribosomu. Aby zbadać jego strukturę, opracowaliśmy protokół oczyszczania na dużą skalę nienaruszonych mitoribosomów z komórek HEK. W niniejszym artykule przedstawiamy metodę kawitacji azotu jako szybszą, mniej pracochłonną i bardziej wydajną alternatywę dla tradycyjnych mechanicznych metod lizy komórek opartych na ścinaniu. Doprowadziło to do przygotowania mitoribosomu, które pozwoliło na jego strukturalne określenie do wysokiej rozdzielczości, ujawniając skład nienaruszonego ludzkiego mitoribosomu i jego produktów pośrednich. W tym miejscu kontynuujemy tę pracę i przedstawiamy zoptymalizowaną i bardziej opłacalną metodę wymagającą tylko ~1010 hodowanych komórek HEK. Metoda może być stosowana do oczyszczania ludzkich kompleksów translacyjnych mitoribosomalnych, mutantów, zespołów kontroli jakości i półproduktów podjednostek mitoribosomalnych. W razie potrzeby oczyszczanie można liniowo zwiększyć dziesięciokrotnie, a także zastosować do innych typów komórek.

Wprowadzenie

Proces syntezy białek mitochondrialnych opiera się na 13 podstawowych mt-mRNA, które są translowane przez wyspecjalizowany mitoribosom przyłączony do błony, tworząc katalityczny rdzeń łańcucha oddechowego. Zmienione genomy mitochondrialne i potrzeba kotranslacyjnego wstawiania białek do błony w znacznym stopniu ukształtowały architekturę rybosomów mitochondrialnych1. Niedawne struktury mitoribosomu ssaków o wysokiej rozdzielczości wykazały uderzająco różny ogólny wygląd od ich bakteryjnego odpowiednika2,3. W szczególności dodaje się co najmniej 36 białek specyficznych dla mitochondriów, wnosząc ~1 MDa dodatkową masę cząsteczkową, podczas gdy mt-rRNA jest dwukrotnie zmniejszone i wysoce rozbieżne. Rearanżacje strukturalne zmieniają prawie wszystkie krytyczne cechy funkcjonalne, które wcześniej były ogólnie akceptowane jako powszechnie zachowane4.

Nowe główne elementy zostały nabyte przez każdą z podjednostek mitoribosomalnych, na przykład mała podjednostka włączyła wewnętrzne białko GTPazy mS29 do swojego regionu 'głowy'. Aktywność GTPazy nie została wykryta w innych systemach translacji, a struktura wskazuje, że GTPase może odgrywać rolę w podjednostce assembly2. 5S rRNA, które uważano za punkt orientacyjny wszystkich znanych dużych podjednostek rybosomalnych, tworzących rdzeń centralnej wypukłości, brakuje w mitoribosomie ssaków i zamiast tego przyjęło mt-tRNA-Val jako integralny blok budulcowy2. Ban i współpracownicy wykazali, że mitoribosom świni ma mt-tRNA-Phe, a nie –Val5. Chrzanowska-Lightowlers, Minczuk i współpracownicy przeanalizowali te dane i odkryli, że mitoribosomy od pacjentów z upośledzoną stabilnością mt-tRNA-Val mogą w zasadzie pomieścić mt-tRNA-Phe6,7. Nie wiadomo, dlaczego mitoribosomy włączyły te specyficzne elementy i jakie szlaki i transczynniki są wymagane dla tych unikalnych zespołów.

Ogólnie rzecz biorąc, wysoka złożoność ludzkiego mitoribosomu, nowe składniki białkowe i unikalne powiązanie mt-tRNA jako elementu strukturalnego implikują udział nieznanych jeszcze mitochondriów trans-czynników. Ponieważ jednak wiele cech tego systemu jest unikalnych dla mitochondriów, które tradycyjnie były trudne do zbadania8, niewiele wiadomo o mechanizmie molekularnym i kontroli jakości. Wraz z rozwojem wysokorozdzielczej analizy pojedynczych cząstek za pomocą kriomikroskopii elektronowej (cryo-EM)20, pojawiają się możliwości kompleksowego zbadania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw składania, działania i kontroli jakości ludzkiego mitoribosomu. Nasz raport o pierwszej strukturze pośredniej składania ludzkich mitoribosomów zapewnia uznanie, że możliwe jest zobrazowanie, w jaki sposób powstaje ludzki mitoribosom i pokazuje, że cryo-EM jest instrumentalny w identyfikacji nowych czynników montażu transakcyjnego9.

Aby rozwinąć ten początkowy wysiłek, szczegółowo opisujemy protokół szybkiego oczyszczania ludzkich mitoribosomów. W pierwszej części protokołu opisano wielkoskalową izolację wysoce czystych, nienaruszonych mitochondriów z komórek zawiesinowych. Procedura ta trwa 9 godzin i może być łatwo modyfikowana i dostosowywana do różnych typów komórek i skal. Znaczącym krokiem w tym protokole jest zastosowanie kawitacji azotowej do rozbicia komórek. Druga część protokołu została opracowana w celu oczyszczania mitoribosomów. Procedura ta trwa 7 godzin i pozwala uzyskać wystarczającą ilość mitoribosomów do badań biochemicznych i strukturalnych. Zastosowanie czystych mitochondriów jako materiału wyjściowego zapewnia wysokiej jakości preparaty końcowe i może być ekstrapolowane na inne makrocząsteczki mitochondrialne.

Protokół

Wszystkie prace związane z hodowlą komórek ssaków muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Używaj sterylnego sprzętu w kontakcie z komórkami. Nosić rękawice nitrylowe i fartuch laboratoryjny oraz przestrzegać dobrej praktyki hodowli tkankowej.

1. Hodowla komórkowa

  1. Utrzymuj HEK293S komórki zawiesinowe w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% wolną od tetracyklin płodową surowicą bydlęcą (FBS), 5 μg/ml blastycydyny i 200 μg/ml azytromycyny, w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  2. Skalowanie do 9 kolb T175. Przy 90% zbiegu zbierz komórki i wiruj je w temperaturze 500 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić granulowane komórki w Freestyl uzupełnionym 5% FBS wolnym od tetracyklin. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek i dostosuj stężenie komórek do 1,5 x 106 komórek/ml w wentylowanej kolbie wstrząsającej.
    Uwaga: Zazwyczaj odpowiada to początkowej objętości 300 ml w kolbie wentylowanej o pojemności 1 000 ml.
  3. Inkubować komórki w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przy 120 obr./min (średnica wytrząsania 50 mm).
  4. Po 2 dniach policz komórki i przystąp do dzielenia komórek, jeśli gęstość komórek przekracza 3,0 x 106 komórek/ml. Podziel komórki, obracając 2 x 150 ml hodowli komórkowej w stożkowych butelkach 2 x 250 ml po 500 g przez 5 minut. Zawiesić komórki w świeżych pożywkach o pojemności 2 x 10 ml i przenieść do kolb wentylowanych o pojemności 2 x 1 000 ml zawierających odpowiednią objętość dla końcowej gęstości komórek 1,5 x 106 komórek/ml, np. 2 x 300 ml z początkowej gęstości komórek 3,0 x 106 komórek/ml.
  5. Inkubować komórki w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przy 120 obr./min (średnica wytrząsania 50 mm).
  6. Po dwóch dniach policz komórki i przystąp do dzielenia komórek, jeśli gęstość komórek przekracza 3,0 x 106 komórek/ml. Podziel komórki, obracając 4 x 150 ml hodowli komórkowej w stożkowych butelkach 4 x 250 ml po 500 g przez 5 minut. Zawiesić komórki w świeżych pożywkach o pojemności 2 x 10 ml i przenieść do kolby wentylowanej o pojemności 2 x 2 000 ml zawierającej odpowiednią objętość dla końcowej gęstości komórek 1,5 x 106 komórek/ml, np. 2 x 700 ml z początkowej gęstości komórek 3,0 x 106 komórek/ml.
  7. Inkubować komórki w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przy 120 obr./min (średnica wytrząsania 50 mm).
  8. Po dwóch dniach policz komórki i przystąp do dzielenia komórek, jeśli gęstość komórek przekracza 3,0 x 106 komórek/ml. Podzielić komórki, wlewając 2 x 700 ml kultury komórkowej do 2 x 2800 ml wentylowanych kolb i uzupełniając 2 x 300 ml świeżej pożywki, aby uzyskać objętość 2 x 1 l.
  9. Inkubować komórki w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37°C i 5% CO2 przy 120 obr./min (średnica wytrząsania 50 mm).
  10. Po 24 godzinach policz komórki i zbierz komórki, jeśli gęstość komórek wynosi od 3,0 do 4,0 x 106 komórek/ml.

2. Izolacja mitochondriów

  1. Wymagane
    Uwaga: Ilości podane są dla preparatu z 2 L komórek. Przygotować następujące roztwory podstawowe z wyprzedzeniem dla buforu izolacji mitochondrialnej (MIB), buforu sacharozy/mannitolu (SM4), buforu eksperymentalnego (MIBSM), buforu do reprodukcji (SEM).
    1. Przygotuj 0,5 l buforu MIB: 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, inhibitory proteazy.
    2. Przygotować 100 ml buforu SM4: 280 mM sacharozy, 840 mM mannitolu, 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1m M DTT, inhibitory proteazy.
    3. Przygotuj 160 ml buforu MIBSM: 120 ml buforu MIB + 40 ml buforu SM4.
    4. Przechowywać 200 ml PBS w temperaturze 4 °C.
    5. Przygotuj 5 ml buforu SEM: 250 mM sacharozy, 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 mM EDTA.
    6. Przygotować 4 x 10 ml roztworów podstawowych dla stopniowego gradientu sacharozy zawierającego odpowiednio 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 mM EDTA i 60% / 32% /23% i 15% sacharozy.
  2. Izolacja mitochondriów
    Uwaga: Ważne jest, aby pracować szybko i trzymać wszystko na lodzie przez cały czas trwania zabiegu.
  3. Przed użyciem schłodzić komorę kawitacji azotu.
    1. Zebrać 2 x 1 L komórek (3-4 x 109 komórek na probówkę wirówkową) przez odwirowanie w temperaturze 1 000 x g przez 7 minut, 4 °C.
    2. Ostrożnie zdekantować supernatant i szybko ponownie zawiesić granulowane komórki w 2 x 100 ml PBS. Połącz komórki.
    3. Odwirować zawieszone komórki w temperaturze 1 200 x g przez 10 minut, w temperaturze 4 °C.
    4. Ostrożnie zdekantować supernatant i zważyć osad (~20 g).
    5. Ponownie zawiesić osad w 120 ml buforze MIB.
    6. Pozwól komórkom pęcznieć, delikatnie mieszając w chłodnym pomieszczeniu przez 10 minut.
    7. Umieść komorę kawitacji azotu na lodzie i przenieś spęczniałe komórki do komory kawitacyjnej azotu. Dodać 45 ml buforu SM4 (1/3 końcowej objętości zawieszonych komórek, około 140 ml, otrzymując końcowe stężenie 70 mM sacharozy i 210 mM mannitolu).
    8. Zamocuj komorę kawitacyjną azotu i napełnij ją azotem, aż ciśnienie osiągnie 500 psi. Zamknij krany i trzymaj w izolacji na lodzie przez 20 minut.
    9. Powoli zwolnij ciśnienie w komorze kawitacyjnej azotu i zbierz lizat (około 185 ml).
    10. Odwirować zmielony materiał w celu usunięcia resztek i jąder komórkowych w temperaturze 800 x g przez 15 minut, 4 °C.
    11. Zebrać sklarowany osad, przelewając go przez gazę do zlewki umieszczonej na lodzie. Nie wyrzucaj granulek.
    12. Zawiesić osad w 90 ml buforu MIBSM (1/2 poprzedniej objętości). Homogenizować za pomocą homogenizatora teflonowo-szklanego Dounce i powtarzać wirowanie przy 800 x g przez 15 minut, 4 °C.
    13. Zebrać sklarowany osad, przelewając go przez gazę do zlewki umieszczonej na lodzie. Połączyć ten supernatant z supernatantem z kroku 2.2.11.
    14. Odwirować połączone supernatanty w stężeniu 1 000 x g przez 15 minut, 4 °C.
    15. Zebrać sklarowany osad, przelewając go przez gazę do zlewki umieszczonej na lodzie.
    16. Odrzucić osad i odwirować supernatant zawierający surowe mitochondria w temperaturze 10 000 x g przez 15 minut, 4 °C.
      Uwaga: Pellet zazwyczaj składa się z dwóch części: luźnej i ciasnej.
    17. Ostrożnie wypłucz luźny granulek, nie naruszając ciasnej porcji. Zawiesić szczelny osad w 10 ml buforze MIBSM.
    18. Wykonaj test stężenia białka przy użyciu komercyjnego zestawu do oznaczania białek lub podobnej metody. Typowe plony stężeń z 2 l kultury wyjściowej wynoszą ~ 2 mg/mL.
    19. Dodaj 200 jednostek DNazy wolnej od RNaz i pozostaw do obracania na wałku w chłodni przez 20 minut, aby równomiernie wymieszać DNazę w celu usunięcia genomowego DNA.
    20. Wirować przy 10 000 x g przez 15 minut, 4 °C i ponownie zawiesić osad w 2 ml buforu SEM. Delikatnie homogenizować za pomocą małego homogenizatora teflonowo-szklanego Dounce, aby ponownie zawiesić wszelkie pozostałe kruszywa. Wykonaj nie więcej niż pięć przejść góra-dół, aby uniknąć pęknięcia. Trzymaj na lodzie.
    21. Przygotować gradient sacharozy w 14 ml probówkach SW40, ostrożnie pipetując 1,5 ml 60% buforu sacharozy na dno probówki. Ostrożnie dodaj 4,5 ml 32% buforu sacharozy na wierzch 60% pasma, nie naruszając go. Powtórzyć z 1,5 ml 23% buforu sacharozy i ponownie z 1,5 ml 15% buforu sacharozy.
    22. Załaduj całą zawiesinę mitochondrialną (około 3 ml) na gradient sacharozy.
    23. Wirować w wirniku SW40 przy 139, 065 x g przez 60 min.
    24. Ostrożnie zbierz brązową opaskę migrującą do granicy faz 32% i 60% sacharozy za pomocą pipety transferowej, zwykle 2-3 ml.
    25. Oczyszczone mitochondria należy zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Przygotowanie mitoribosomu

  1. Wymagane
    Uwaga: Przygotować z wyprzedzeniem następujące roztwory podstawowe dla buforu do lizy, poduszki/gradientu sacharozy i buforu do rezawiesiny.
    1. Przygotuj 10 ml buforu do lizy: 25 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 150 mM KCl, 50 mM MgOAc, 2% eter oktylofenylowy glikolu polietylenowego, 2 mM DTT, inhibitory proteazy.
    2. Przygotować 10 ml buforu poduszkowego sacharozy: 1 M sacharozy (34% w/v), 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 100 mM KCl, 20 mM MgOAc, 1% eteru oktylofenylowego glikolu polietylenowego, 2 mM DTT.
    3. Przygotować 5 ml buforu do rezaspensji: 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 100 mM KCl, 20mM MgOAc, 2 mM DTT
    4. Wykonaj 15%-30% liniowe gradienty sacharozy z buforem do ponownego zawieszania w probówkach poliwęglanowych TLS-55.
  2. Oczyszczanie mitoribosomów
    1. Rozmrozić zamrożone mitochondria na lodzie.
    2. Dodać 2 objętości buforu do lizy, np. dodać 6 ml buforu do lizy do 3 ml mitochondriów. Natychmiast wymieszaj, kilkakrotnie odwracając rurkę.
    3. Homogenizować za pomocą małego homogenizatora teflonowo-szklanego, aby wspomóc lizę i inkubować przez 5-10 minut na lodzie, aby zakończyć lizę.
    4. Odwirować zmielony materiał (około 9 ml) w temperaturze 30 000 x g przez 20 minut, 4 °C w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału. Ostrożnie zdekantować supernatant ze osadu i wyrzucić osad.
    5. Powtarzać wirowanie przy 30 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, aby zapewnić klarowanie supernatantu. Ostrożnie zdekantować supernatant ze osadu i wyrzucić osad.
    6. Przygotuj poduszkę z sacharozą w probówkach TLA 120.2 (ultra-przezroczystych): 0,4 ml poduszki sacharozy na probówkę. Przygotować jedną probówkę na ml lizowanego materiału.
    7. Warstwy lizowanych mitochondriów na poduszkach sacharozy: około 1 ml na probówkę, co daje stosunek lizatu do poduszki 2,5:1.
    8. Odwirować próbkę o masie 231,550 x g przez 45 minut w wirniku TLA120.2 w temperaturze 4 °C.
    9. Odrzucić sklarowany osad i przepłukać probówki kolejno 100 μl buforu do reprodukcji w celu usunięcia pozostałości sacharozy.
    10. Zawiesić granulki w sumie 100 μl bufora do rezawieszania.
    11. Wirować z małą prędkością przez 30 s w celu rozpuszczenia pozostałych agregatów i odwirować przy 17,949 x g przez 10 minut w wirówce mikroprobówkowej w temperaturze 4 °C.
    12. Ostrożnie zebrać supernatant i powtórzyć wirowanie.
    13. Zmierz absorpcję mitoribosomów przy A260,
      Uwaga: Typowa wydajność to 7 A260, przy stosunku A260: A280 wynoszącym 1,3.
    14. Załaduj całą próbkę na pojedynczą liniową rurkę z gradientem sacharozy. Wirować w wirniku TLS-55 przy 213, 626 x g przez 120 min w temperaturze 4 °C.
    15. Frakcjonować gradient, określić gęstość optyczną w A260 i połączyć frakcję odpowiadającą pikowi kwasu nukleinowego.
      Uwaga: Typowy stosunek A260: A 280 piku wynosi >1,6.
    16. W razie potrzeby wymień bufor, korzystając z wybranej metody. Obliczyć stężenie końcowe, stosując przeliczenie 1 A260 = 0,1 mg/ml.
    17. Oczyszczoną próbkę mitoribosomu należy zamrozić błyskawicznie w buforze do sporządzania zawiesiny i przechowywać w temperaturze -80 °C.

Wyniki

Pasażowanie i utrzymanie wysokiej żywotności komórek jest niezbędnym punktem wyjścia do oczyszczania aktywnych mitorybosomów. Niniejszy protokół ma zastosowanie do dowolnych komórek zawiesinowych HEK293. W pracy wykorzystujemy wewnętrzną linię komórkową T501, która stabilnie ekspresuje transporter pod kontrolą indukowalną tetracykliną. Linią rodzicielską są komórki HEK293S-GnTI- (Tabela materiałów)10. Podczas wzrostu i ekspansji komórek w pożywce FreeStyle 293 Expression Medium minimalna gęstość powinna być utrzymana na poziomie 1,5 x 106 cell/mL, aby zapewnić podwajanie liczby komórek co dwa dni, natomiast maksymalna gęstość komórek nie powinna przekraczać ~5 x 106 cell/mL. Po osiągnięciu gęstości komórek powyżej 3 x 106 cell/mL komórki są wirowane, a następnie resuspenderowane w świeżej, podgrzanej pożywce w zwiększonej objętości, aby uzyskać minimalną gęstość komórek 1,5 x 106 cell/mL. Pasażowanie to jest wykonywane powtarzalnie co 2-3 dni, aż do uzyskania masy komórkowej wymaganej do procedury. Końcowa gęstość komórek może mieścić się w zakresie 3-4,5 x 106 cell/mL, a do rozpoczęcia izolacji mitochondriów wymagane jest co najmniej 2 L hodowli. Żywotność komórek powinna być zazwyczaj utrzymywana na poziomie >90%, a w przypadku końcowej hodowli przeznaczonej do zbioru >95%. Nie zaleca się stosowania antybiotyków w wielkoskalowych hodowlach komórkowych.

Po serii wirowania różnicowego objętość zawiesiny mitochondrialnej po kroku 2.2.20 wynosi zazwyczaj od 3 do 5 mL. Następnie mitochondria są oddzielane od innych organelli na gradiencie sacharozy (Rycina 1). Skokowy gradient sacharozy jest przygotowywany w taki sposób, aby objętość gradientu oraz objętość zawiesiny mitochondrialnej wspólnie wypełniały probówkę do wirowania do jej maksymalnej objętości. Na tym etapie należy zachować szczególną ostrożność podczas zbierania brązowego prążka migrującego do interfejsu 60% / 32%, aby zminimalizować zanieczyszczenie otaczającym buforem. Jest to istotne dla zachowania stałego stosunku białka do detergentu w kolejnym kroku solubilizacji mitochondriów. Zaleca się ocenę stężenia białka mitochondrialnego na tym etapie; typowa wydajność wynosi 15-20 mg całkowitego białka mitochondrialnego z ~1010 hodowanych komórek HEK.

Po pomyślnej izolacji mitochondriów są one lizowane poprzez dodanie oktilofenylu glikolu polietylenowego, a mitoribosomy są oddzielane za pomocą poduszki sacharozy (Rycina 2). Aby oddzielić mitoribosomy od hydrofobowej substancji błonowej, osady są resuspendowane w buforze niezawierającym detergentu, a kompleksy hydrofobowe są osadzane przez wirowanie. Procedurę tę powtarza się, a stopień oczyszczenia mitoribosomów jest określany na podstawie stosunku A260/A280, który powinien wynosić ok. 1,3. Typowa wydajność wynosi 7 A260 z 2 L kultury wyjściowej. Ta frakcja mitoribosomalna zawiera również dodatkowe duże rozpuszczalne kompleksy mitochondrialne, takie jak dehydrogenaza pirynianowa i dehydrogenaza glutaminianowa. Aby oddzielić mitoribosomy od rozpuszczalnych kompleksów mitochondrialnych, nadfiltr nanosi się na gradient gęstości sacharozy. Frakcje zawierające mitoribosomy znajdują się zazwyczaj w dolnej jednej trzeciej probówki. Frakcjonowanie gradientu sacharozy można następnie przeprowadzić za pomocą automatycznego tłoka lub ręcznie, ostrożnie pobierając frakcje 50 µL pipetą lub przebijając dno probówki igłą 21 G i zbierając krople.

W gradiencie zidentyfikowano dwie główne populacje mitoribosomalne: monosomy 55S oraz duże podjednostki 39S, co przedstawiono na Rysunku 3 i Rysunku 4. Obecność frakcji dużych podjednostek sugeruje, że komórki zostały zebrane w stanie intensywnego podziału11. Stosunek między szczytami monosomów a dużych podjednostek może ulegać zmianom. W preparatach z zanieczyszczeniami rybosomów cytoplazmatycznych 80S może pojawić się dodatkowy szczyt położony bliżej dna. Należy zauważyć, że krótki gradient sacharozy z wykorzystaniem rotora z ruchomymi koszykami TLS-55 umożliwia szybkie oczyszczenie ~1 mL mitoribosomów o gęstości optycznej 0,4-1 A260. Stopień rozdzielenia szczytów monosomów i dużych podjednostek może się nieznacznie różnić w zależności od frakcjonowania, jednak zazwyczaj oba szczyty częściowo na siebie nachodzą. W związku z tym, przy wyborze zbieranych i łączonych frakcji należy dążyć do zapewnienia najwyższego udziału monosomów lub, alternatywnie, dużych podjednostek w próbce. W przypadku wysokorozdzielczych badań cryo-EM całkowite rozdzielenie obu populacji mitoribosomalnych nie jest absolutnie wymagane (ze względu na dodatkowe operacje in silico). Jeśli jednak konieczne jest lepsze rozdzielenie, zaleca się zastosowanie większych probówek i odpowiednio wydłużonego czasu wirowania.

Schemat wirowania różnicowego; gradient gęstości z rozdzieleniem pasm dla mitochondriów i jąder.
Rycina 1: Oczyszczanie mitochondriów w gradiencie sacharozy. Organelle subkomórkowe z 2 L kultury początkowej zostały rozdzielone poprzez serię wirowań różnicowych zgodnie z opisem w protokole, a mitochondria oddzielono w nieciągłym gradiencie sacharozy. Oczyszczone mitochondria znajdują się w dolnym pasmie na granicy 32%/60%.

Probówka laboratoryjna trzymana w rękawiczkach, prawdopodobnie do analizy DNA lub przygotowania próbki.
Rysunek 2: Oczyszczanie mitorybosomów na poduszce sacharozowej. Surowe mitorybosomy z 2 L kultury początkowej są sedymentowane przez 1 M poduszkę sacharozową. Osady są resuspendowane w buforze bez detergentu, a mitorybosomy są klarowane poprzez dwie centrifugacje, zgodnie z opisem w protokole. Rejestrowana jest absorbancja w celu oceny jakości preparatu, a typowy stosunek A260/A280 wynoszący ~1,3 (prawy panel) potwierdza frakcję bogatą w mitorybosomy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres absorbancji w funkcji frakcji pokazuje piki stężenia DNA, wykorzystywane w analizie chromatograficznej.
Rysunek 3: Precyzyjne oczyszczanie mitorybosomów na gradiencie sacharozy. Profil absorbancji z 2 L kultury początkowej. Frakcje są ponumerowane od góry do dołu gradientu. Zidentyfikowano dwie główne populacje mitorybosomalne: podjednostkę dużą (pik 1) oraz monosom 55S (pik 2). Stosunek między populacjami może ulec zmianie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza strukturalna rybosomów metodą Cryo-EM, wyniki rekonstrukcji pojedynczych cząstek, identyfikacja podjednostek rybosomalnych.
Rysunek 4: Mikrograf elektronowy, klasy 2D i rekonstrukcja 3D. Panel lewy: mikrograf próbki z piku monosomów 2 przy skalibrowanym powiększeniu 1,23 A/pixel. Panel środkowy: reprezentatywne dane po przetwarzaniu (klasy 2D) wykazujące nienaruszone monosomy. Panel prawy: rekonstrukcja 3D. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Jeśli chodzi o źródło materiału wyjściowego, chociaż stosunkowo łatwa dostępność tkanek zwierzęcych, o których wiadomo, że są bogatym źródłem mitochondriów, sprawia, że jest to popularny wybór dla mitoribosomów 3,5,12,13, nie można ich łatwo modyfikować genetycznie i rozmnażać w laboratorium. W związku z tym istnieje wyraźna praktyczna potrzeba opracowania protokołów obejmujących jednorodnie hodowane ludzkie linie komórkowe. Główną różnicą między protokołami zajmującymi się tkankami i hodowanymi komórkami jest sposób lizy i homogenizacji. W przypadku komórek hodowanych jako monowarstwa typową metodą jest homogenizacja teflonowo-szklana14. Pierwotne protokoły przygotowania, choć skuteczne, zostały opracowane dla małych skal15. Możliwe jest bezpośrednie zwiększenie skali przy użyciu homogenizatora o pojemności 500 ml11, jednak wymaga to ~2 godzin pracy ręcznej, aby osiągnąć 80% lizy. Spowodowało to co najmniej trzy problemy: agregację organelli z powodu długiego czasu oczekiwania, niejednorodną lizę spowodowaną opadaniem ciężkiego materiału na dno dużego naczynia, nagrzewanie próbki z powodu konieczności wielokrotnych uderzeń. Dlatego preferowaną metodą lizy jest kawitacja azotowa, która opiera się na dekompresji z naczynia ciśnieniowego16,17. W tej metodzie komórki są najpierw pęczniejące w chłodni w celu zmiękczenia komórek i uczynienia ich bardziej podatnymi na lizę. Po umieszczeniu ich w urządzeniu do kawitacji azotu dodaje się bufor zawierający sacharozę i mannitol w celu utrzymania ciśnienia osmotycznego, które pomoże utrzymać mitochondria w stanie nienaruszonym. Urządzenie do kawitacji azotu jest następnie poddawane działaniu dużej ilości azotu beztlenowego, który rozpuszcza się w komórkach. Gdy ciśnienie jest uwalniane, pęcherzyki azotu wydostają się z roztworu, powodując pęknięcie błon komórkowych. Metoda ta ma kilka zalet w porównaniu z metodami homogenizacji mechanicznej obejmującymi naprężenia ścinające i tarcie, w następujący sposób: 1) unika się wszelkich zewnętrznych naprężeń fizycznych na komórkach; 2) ekspandacja adiabatyczna, która chłodzi próbkę, zapewnia brak uszkodzeń termicznych organelli; 3) elementy ogniw są chronione przed utlenianiem przez obojętny azot; 4) brak zmiany pH podłoża zawieszającego; 5) proces jest jednolity i powtarzalny, ponieważ te same siły zakłócające są stosowane w każdej komórce i w całej próbce; 6) Proces jest szybki i można go zakończyć w ciągu 20-30 minut.

Izolacja mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek została obszernie opisana w literaturze i opiera się na delikatnym rozerwaniu komórek, po którym następuje seria różnicowych wirowań. Większość obecnie stosowanych protokołów jest zgodna z oryginalnymi procedurami opracowanymi w połowie ubiegłego wieku18 . Chociaż podstawowe podejścia biochemiczne są poprawne, istnieje kilka błędnych przekonań, które zostały podkreślone w literaturze i pozostały niewykryte. Aby zoptymalizować protokół dla mitoribosomów, systematycznie badaliśmy zgłoszone zasady ogólne i doszliśmy do wniosku, że: 1) Włączenie Mg2+ i K+ do buforu nie jest kluczowe. Argumentowano, że KCl pomaga zapobiegać tworzeniu się żelu19 przez białka cytoplazmatyczne, jednak pod warunkiem wystarczającego rozcieńczenia, jak opisano w naszym protokole, zjawisko to nie występuje. Ponadto wykluczenie Mg2+ jest przydatne w celu zmniejszenia zanieczyszczeń rybosomami cytoplazmatycznymi20; 2) Nie ma potrzeby utrzymywania maksymalnego możliwego stosunku objętości komórek do podłoża w celu ochrony uwolnionych organelli przed środowiskiem hipoosmotycznym. Wsparcie osmotyczne w naszym protokole jest wystarczająco zapewnione przez zawierające sacharozę, a rozcieńczenie komórek buforem izolacyjnym mitochondriów (krok 2.II.5) ma kluczowe znaczenie dla skutecznego oddzielenia organelli w preparacie na dużą skalę.

pH buforu izolacyjnego mitochondriów jest zbliżone do wartości fizjologicznych, tj. 7,5, które jest również optymalnym pH dla kolejnego preparatu mitoribosomu. Środki wiążące EDTA i EGTA są dodawane do pożywki izolacyjnej w celu chelatowania jonów zanieczyszczających i chelatują odpowiednio wolny magnez i wapń. Omówiono to, że włączenie EDTA może prowadzić do uszkodzenia wewnętrznej błony mitochondrialnej14, dlatego stężenie jest ograniczone do 1 mM jako środek ostrożności. Nie zaobserwowaliśmy żadnej różnicy przy użyciu 5 mM EDTA w końcowym etapie oczyszczania gradientu gęstości sacharozy.

Opisany w niniejszym dokumencie protokół wykorzystuje komórki ludzkie pochodzące z HEK293S do oczyszczania mitoribosomu. Jakość preparatu pozwala na zbadanie otrzymanej próbki biochemicznie i strukturalnie do rozdzielczości atomowej. Pozwala to na zastosowanie metody do ludzkich kompleksów translacyjnych mitoribosomalnych, zespołów kontroli jakości i półproduktów podjednostek mitoribosomalnych. Co więcej, ponieważ komórki nowotworowe mają zwiększoną zdolność OXPHOS i zwiększoną translację białek mitochondrialnych w porównaniu z sąsiednią tkanką zrębu21, mitoribosomy są ustalonymi celami leków dla raka22. Dlatego stosowanie tego protokołu do specyficznego oczyszczania mitoribosomów w obecności inhibitorów będzie miało zastosowania medyczne. Ponadto mutacje mitoribosomalne zostały powiązane z dziedzicznymi chorobami mitochondrialnymi23. Ponieważ mutacje te mają bezpośredni wpływ na strukturę, przedstawione tutaj podejście będzie przydatne do ich charakterystyki strukturalnej. Protokół może zostać eksperymentalnie rozszerzony i zastosowany do różnych zagadnień naukowych dotyczących podstawowej wiedzy na temat translacji w ludzkich mitochondriach i jej medycznego znaczenia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Szwedzką Fundację Badań Strategicznych (Future Leaders Grant FFL15:0325), Fundację Ragnara Söderberga (Fellowship in Medicine M44/16), Szwedzką Radę ds. Badań Naukowych (Starting Grant NT×2015-04107), FEBS Long-Term Fellowship (SA), Horyzont 2020 - Innowacyjną Sieć Szkoleniową Marie Skłodowska-Curie (721757) (VS).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy, suplement GLUTAMAX, pirogronianThermo Scientific31966-021
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Thermo Scientific16000-044
Blasticidin S HClThermo ScientificR210-01
Odczynnik selekcyjny ZeocinThermo ScientificR25001100 mg/ml
Freestyle 293 Expression mediumThermo Scientific12338026
Kolba do hodowli tkankowych T175 z wentylowanąnakrętką Sarstedt83.3912.002
Kolby do wytrząsania z wentylowaną nakrętkąThermo Scientific4115-0500, 4115-1000, 4115-2000, 4115-2800
Stożkowe probówki do butelek o pojemności 250 ml, sterylneCorning430776
Eve automatyczny licznik komórekNanoEnTekE1000
Naczynie do rozbijania komórek kawitacyjnych azotuParr Instruments4635, 4639objętość bezpieczeństwa: odpowiednio 40 ml, 600 ml
Dnaza (bez RNA)HT BiotechnologyN401a
Homogenizatory teflonowo-szklaneCambridge Glassblowing LimitedRozmiar zaprojektowany na zamówienie
Rurki SW40 do gradientu mitochondriówBeckman344060Polipropylen, cienkościenny
Pipety transferoweSarstedt86.1171
TLA 120.2 probówki do poduszkiBeckman343778Poliwęglanowe, grubościenne
rurki TLS-55 do gradientuBeckman347356Ultra-clear
Gradient Station IPBioComp153-002

Bibliografia

  1. Ott, M., Amunts, A., Brown, A. Organization and regulation of mitochondrial protein synthesis. Annual review of biochemistry. 85, 77-101 (2016).
  2. Amunts, A., Brown, A., Toots, J., Scheres, S. H., Ramakrishnan, V. The structure of the human mitochondrial ribosome. Science. 348 (6230), 95-98 (2015).
  3. Greber, B. J., Bieri, P., Leibundgut, M., Leitner, A., Aebersold, R., Boehringer, D., Ban, N. The complete structure of the 55S mammalian mitochondrial ribosome. Science. 348 (6232), 303-308 (2015).
  4. Greber, B. J., Ban, N. Structure and function of the mitochondrial ribosome. Annual review of biochemistry. 85, 103-132 (2016).
  5. Greber, B. J., Boehringer, D., Leitner, A., Bieri, P., Voigts-Hoffmann, F., Erzberger, J. P., Ban, N. Architecture of the large subunit of the mammalian mitochondrial ribosome. Nature. 505 (7484), 515-519 (2014).
  6. Rorbach, J., Gao, F., Powell, C. A., D'Souza, A., Lightowlers, R. N., Minczuk, M., Chrzanowska-Lightowlers, Z. M. Human mitochondrial ribosomes can switch their structural RNA composition. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 201609338(2016).
  7. Chrzanowska-Lightowlers, Z., Rorbach, J., Minczuk, M. Human mitochondrial ribosomes can switch structural tRNAs-but when and why? RNA biology. 14 (12), 1668-1671 (2017).
  8. Gammage, P. A., Moraes, C. T., Minczuk, M. Mitochondrial Genome Engineering: The Revolution May Not Be CRISPR-Ized. Trends in Genetics. , (2017).
  9. Brown, A., Rathore, S., Kimanius, D., Aibara, S., Bai, X. C., Rorbach, J., Ramakrishnan, V. Structures of the human mitochondrial ribosome in native states of assembly. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 866(2017).
  10. Reeves, P. J., Callewaert, N., Contreras, R., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin: high-level expression of rhodopsin with restricted and homogenous N-glycosylation by tetracycline-inducible N-acetylglucosaminyltransferase I-negative HEK293S stable mammalian cell line. Proceedings of National Academy of Sciences USA. 99, 13419-13424 (2002).
  11. Brown, A., Amunts, A., Bai, X. C., Sugimoto, Y., Edwards, P. C., Murshudov, G., Ramakrishnan, V. Structure of the large ribosomal subunit from human mitochondria. Science. 346 (6210), 718-722 (2014).
  12. O'Brien, T. W., Kalf, G. F. Ribosomes from rat liver mitochondria I. Isolation procedure and contamination studies. Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2172-2179 (1967).
  13. Spremulli, L. L. Large-scale isolation of mitochondrial ribosomes from mammalian tissues. Mitochondria: Practical Protocols. , 265-275 (2007).
  14. Rice, J. E., Lindsay, J. G. Subcellular fractionation of mitochondria. Subcellular Fractionation: A Practical Approach. Grahamand, J. M., Rickwood, D. , IRL Press. Oxford. 107-142 (1997).
  15. Attardi, G., Ching, E. Biogenesis of mitochondrial proteins in HeLa cells. Methods in enzymology. 56, 66-79 (1979).
  16. Gottlieb, R. A., Adachi, S. Nitrogen cavitation for cell disruption to obtain mitochondria from cultured cells. Methods in enzymology. 322, 213-221 (2000).
  17. Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), (2010).
  18. Kennedy, E. P., Lehninger, A. L. Oxidation of fatty acids and tricarboxylic acid cycle intermediates by isolated rat liver mitochondria. Journal of Biological Chemistry. 179 (2), 957-972 (1949).
  19. Graham, J. M. Isolation of mitochondria from tissues and cells by differential centrifugation. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3, Unit 3.3, (2001).
  20. Amunts, A., Brown, A., Bai, X. C., Llácer, J. L., Hussain, T., Emsley, P., Ramakrishnan, V. Structure of the yeast mitochondrial large ribosomal subunit. Science. 343 (6178), 1485-1489 (2014).
  21. Sotgia, F., Martinez-Outschoorn, U. E., Howell, A., Pestell, R. G., Pavlides, S., Lisanti, M. P. Caveolin-1 and cancer metabolism in the tumor microenvironment: markers, models, and mechanisms. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 7, 423-467 (2012).
  22. Škrtić, M., Sriskanthadevan, S., Jhas, B., Gebbia, M., Wang, X., Wang, Z., Lai, C. K. Inhibition of mitochondrial translation as a therapeutic strategy for human acute myeloid leukemia. Cancer cell. 20 (5), 674-688 (2011).
  23. Boczonadi, V., Horvath, R. Mitochondria: impaired mitochondrial translation in human disease. The international journal of biochemistry & cell biology. 48, 77-84 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oczyszczanie mitorybosomówkawitacja azotowakomórki HEK293rybosomy mitochondrialnegradient sacharozyliza komórekizolacja mitochondriówanaliza strukturalnaultrawirowaniekompleks białkowy
Szybka izolacja mitoribosomu z komórek HEK
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.