Artykuł metodologiczny

Szczurzy model rozległej demielinizacji kory mózgowej indukowanej przez domózgowe wstrzyknięcie cytokin prozapalnych

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57879

⸱

21 września 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Unit of Experimental Neurotraumatology, Department of Neurosurgery, Medical University Graz, 2Department of Neurology, Medical University Graz, 3Centre for Molecular Medicine, Department of Clinical Neuroscience, Karolinska Institutet, 4Division of Vascular Biology, Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Karolinska Institutet

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiony tutaj protokół pozwala na reprodukcję rozległej demielinizacji istoty szarej obu półkul korowych u dorosłych samców szczurów Dark Agouti. Metoda polega na domózgowym wszczepieniu cewnika, subklinicznej immunizacji przeciwko glikoproteinie mielinowych oligodendrocytów oraz domózgowej iniekcji prozapalnej mieszaniny cytokin przez wszczepiony cewnik.

Streszczenie

Stwardnienie rozsiane (MS) jest najczęstszą chorobą ośrodkowego układu nerwowego (OUN) o podłożu immunologicznym i stopniowo prowadzi do niepełnosprawności fizycznej i śmierci, spowodowanej zmianami w istocie białej w rdzeniu kręgowym i móżdżku, a także demielinizacją istoty szarej. Podczas gdy konwencjonalne modele eksperymentalnego alergicznego zapalenia mózgu i rdzenia są odpowiednie do badania zapalenia za pośrednictwem komórek w istocie białej rdzenia kręgowego i móżdżku, nie rozwiązują one patologii istoty szarej. W niniejszej pracy przedstawiono protokół eksperymentalny dla nowego szczurzego modelu demielinizacji kory mózgowej, pozwalającego na badanie mechanizmów patologicznych i molekularnych prowadzących do zmian korowych. Demielinizacja jest indukowana przez immunizację niską dawką glikoproteiny oligodendrocytów mieliny (MOG) w niekompletnym adiuwancie Freunda, a następnie przez cewnik domózgowe dostarczanie cytokin prozapalnych. Co więcej, cewnik umożliwia wiele rund demielinizacji bez powodowania urazu wywołanego wstrzyknięciem, a także domózgowe dostarczanie potencjalnych leków terapeutycznych poddawanych badaniom przedklinicznym. Metoda jest również etycznie korzystna, ponieważ ból i niepokój zwierząt lub niepełnosprawność są kontrolowane i stosunkowo minimalne. Przewidywany czas wdrożenia całego protokołu to około 8 - 10 tygodni.

Wprowadzenie

MS to choroba zapalna OUN o podłożu immunologicznym, która przede wszystkim uszkadza arkusze mieliny, ale ostatecznie prowadzi do utraty aksonów i trwałego uszkodzenia neuronów. Stwardnienie rozsiane jest najczęstszą chorobą OUN o podłożu immunologicznym, której częstość występowania szacuje się na około 2,3 miliona osób na całym świecie, według National MS Society1, i stanowi poważne obciążenie osobiste i społeczno-ekonomiczne. Średni wiek wystąpienia choroby wynosi 30 lat i prowadzi do utraty lat produkcyjnych, powodując poważną niepełnosprawność. Stwardnienie rozsiane jest obecnie nieuleczalne, a obecne metody leczenia mają na celu opanowanie objawów podczas ostrego nawrotu w rzutowo-remisyjnym SM oraz modyfikację przebiegu choroby w celu zmniejszenia częstości nawrotów poprzez terapię immunomodulacyjną2,3. Żadna opcja leczenia nie okazała się jeszcze skuteczna dla typów postępujących4, z wyjątkiem niedawnego badania klinicznego terapii zubożającej limfocyty B, które okazało się skuteczne w podgrupie pacjentów z pierwotnie postępującym SM (PPMS) z aktywnym stanem zapalnym5. Chociaż zidentyfikowano kilka potencjalnych genetycznych6 i środowiskowych czynników ryzyka7, etiologia stwardnienia rozsianego pozostaje nieznana.

MS charakteryzuje się dużymi zapalnymi blaszkami demielinizacyjnymi w istocie białej i rozproszonymi uszkodzeniami tej istoty8,9. Zmiany ogniskowe są związane z rozległym atakiem za pośrednictwem limfocytów T, niszczeniem oligodendrocytów, astroglejozą reaktywną i zwyrodnieniem aksonów, co prowadzi do zaniku neuronu ruchowego. Demielinizacja i atrofia istoty szarej zyskały uznanie jako dodatkowe cechy histopatologiczne choroby9,10,11. Sugeruje się, że ten ostatni czynnik przyczynia się do dysfunkcji neurologicznych i pogorszenia funkcji poznawczych u pacjentów12,13. Wyróżniono trzy wzorce demielinizacji korowej, a mianowicie: i) leukokoryjny, przylegający do zmian istoty białej (34%), ii) mały, okołonaczyniowy (16%) i iii) subpialny (50%). W przeciwieństwie do ogniskowych zmian w istocie białej, te zmiany w istocie szarej nie mają ataku za pośrednictwem limfocytów T, a zamiast tego charakteryzują się zwiększoną aktywacją mikrogleju, apoptozą i utratą neuronów12.

Do tej pory nie udało się zrekapitulować ludzkiego SM w jednym modelu zwierzęcym, głównie ze względu na złożoność choroby. Zamiast tego opracowano różne modele zwierzęce stwardnienia rozsianego, z których każdy symuluje inne aspekty patogenezy i progresji choroby14,15. Obecne modele zwierzęce naśladują trzy różne procesy chorobowe: i) ogniskowe zmiany zapalne, ii) rozlane uszkodzenie istoty białej oraz iii) rozlana patologia istoty szarej.

Badania na zwierzętach nad blaszkami istoty białej MS były głównie prowadzone na modelach zapalenia mózgu i rdzenia gryzoni (EAE). Badane zwierzęta są aktywnie immunizowane emulsją zawierającą antygen mielinowy [zwykle glikoproteinę oligodendrocytów mieliny (MOG)16,17, podstawowe białko mieliny (MBP)18, lub białko proteolipidowe (PLP)19], wraz z kompletnym adiuwantem Freunda (CFA)20. Choroba może być również biernie wywołana przez adoptywny transfer limfocytów T specyficznych dla mieliny21. Przebieg choroby zależy od zastosowanej kombinacji antygenu i szczepu myszy. Na przykład MOG35-55 w C57BL/6 powoduje monofazową chorobę przewlekłą22, podczas gdy PLP139-151 u szwajcarskich myszy Jim Lambert (SJL) prowadzi do przebiegu choroby rzutowo-remisyjnej23 w sposób specyficzny dla płci24. Szczurzy MOG35-55 ponadto indukuje encefalitogenną odpowiedź komórek T, podczas gdy ludzki MOG35-55 indukuje stan zapalny zależny od komórek B u myszy C57BL / 625. Różne modele EAE stanowią doskonałe narzędzie do badania zapalenia zależnego od komórek, głównie w rdzeniu kręgowym i móżdżku, ale struktury przodomózgowia, takie jak kora, ciało modzelowate i struktury podkorowe, pozostają w dużej mierze oszczędzone26. Ani rozproszone uszkodzenie istoty białej, ani demielinizacja istoty szarej nie są ponadto odpowiednio replikowane w modelach EAE26,27. Demielinizacja korowa związana z aktywną indukcją EAE została zgłoszona w marmozets28,29 oraz w niektórych podszczepach szczurów Lewisa, w tym ostatnim przypadku przypisano dominującym kombinacjom izotypów i alleli MHC klasy I i klasy II30.

Model cuprizone31 jest użytecznym narzędziem do badania rozproszonej demielinizacji istoty białej i patologii istoty szarej z rozległą demielinizacją kory mózgowej, subkorowej32, oraz hippocampal33 regionów, a także ciałka modzelowatego34 i skorupy ogoniastej35. Zatrucie kupryzonem, które w zasadzie powoduje indukowaną stresem metabolicznym apoptozę oligodendrocytów, naśladuje niektóre cechy korowych zmian demielinizacyjnych w mózgach SM, takie jak aktywacja mikrogleju, astroglejoza i względny brak naciekających obwodowych komórek odpornościowych. Brak apoptozy neuronalnej i atrofii wzgórza, jak również całkowite ustąpienie demielinizacji za pomocą silnej remielinizacji obserwowane po zaprzestaniu suplementacji cuprizonem w diecie32, ograniczają jednak zastosowanie zatrucia cuprizonem jako przedklinicznego modelu stwardnienia rozsianego. Toksyczna demienizacja może być również wywołana przez ogniskowe wstrzyknięcie lizolecytyny lub bromku etydyny do dróg istoty białej36,37, ale te metody są rzadko stosowane. Modele demielinizacji toksycznej są szczególnie przydatne do analizy złożonych mechanizmów remielinizacji, takich jak zapotrzebowanie na komórki progenitorowe oligodendrocytów i astrocyty38,39. Szczegółowe informacje na temat EAE i modeli odurzania znajdują się w dwóch ostatnich recenzjach15,40.

Demielinizacja wywołana cytokinami została początkowo opracowana do badania uszkodzeń istoty białej kręgosłupa w EAE41. Później został zmodyfikowany w celu zbadania patologii istoty szarej kory w SM. Szczury Dark Agouti (DA) lub Lewis są najpierw przygotowywane przez subkliniczne szczepienie za pomocą MOG1-12542,43 lub MOG1-11644 w niekompletnym adiuwantie Freunda (IFA). W przeciwieństwie do klasycznych modeli EAE, te przygotowane zwierzęta nie wykazują objawów klinicznych ogniskowych zmian zapalnych w rdzeniu kręgowym. Zamiast tego reakcja zapalna i demienizacja w mózgu są następnie osiągane przez domózgowe podanie prozapalnej mieszaniny cytokin [czynnik martwicy nowotworu alfa (TNFα) i interferon gamma (IFNγ)], gdy zwierzęta osiągną stabilne miano przeciwciał anty-MOG we krwi.

Badania przeprowadzone przez Merkler et al.42 oraz Gardner et al.44 udowodniły skuteczność indukcji demielinizacji kory mózgowej przez subkliniczną immunizację MOG i wstrzyknięcie cytokiny domózgowej lub podpajęczynówkowej. Zgłaszany czas trwania demielinizacji był jednak zbyt krótki – całkowita remielinizacja nastąpiła w ciągu 14 dni lub krócej, co ograniczyło okno na jakiekolwiek badania interwencji farmakologicznej. Co więcej, oba modele wykorzystują tryb iniekcji urazowej, który sam w sobie może spowodować uraz po wstrzyknięciu i pęknięcie bariery krew-mózg (BBB), a tym samym prowadzić do niekontrolowanej rekrutacji komórek zapalnych do miąższu. Ponadto w obu badaniach wykazano demielinizację, która jest ograniczona do ograniczonego obszaru, w korze ipsilateralnej lub w bliskim sąsiedztwie miejsca wstrzyknięcia cytokiny.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, wszczepiliśmy cewnik w prawą korę ciemieniową szczurów DA, z końcówką cewnika umieszczoną tuż nad ciałem modzelowatym. Aby umożliwić pełne odzyskanie integralności bariery krew-mózg, zwierzętom pozwolono na okres odpoczynku wynoszący 2 tygodnie po implantacji cewnika. Następnie szczury zostały subklinicznie uodpornione 5 μg rekombinowanego MOG1-125 w IFA. Po osiągnięciu stabilnego miana przeciwciał anty-MOG po około 4 tygodniach, 2 μl mieszaniny cytokin wstrzyknięto przez cewnik w ciągu 10 minut za pomocą programowalnej pompy strzykawkowej. Procedura ta wywołała rozległą demielinizację korową zarówno ipsi-, jak i przeciwległej półkuli mózgowej w ciągu 15 dni, z częściową remielinizacją około 30 dni po wstrzyknięciu cytokiny43. Wielokrotne fazy demielinizacji mogą być ponadto indukowane przez wielokrotne podawanie cytokin prozapalnych przez cewnik, a globalny zanik mózgu, powszechna cecha postępujących podtypów SM45, może być indukowany już po drugiej fazie demielinizacji43. Co ważne, wszczepiony cewnik może być również wykorzystywany do testowania interwencji farmakologicznych.

Protokół opisany poniżej zawiera szczegółowe wyjaśnienie etapów eksperymentalnych dla powtarzalnego generowania rozległej demielinizacji korowej w obu półkulach mózgowych szczurów DA za pomocą cewnika śródmózgowego.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez lokalne władze (Bundesministerium für Wissenschaft und Forschung (Austriackie Ministerstwo Nauki i Badań); Numer licencji: 66.010/0132-WF/V/3B/2014). Dorosłe samce szczurów DA (w wieku 10 - 12 tygodni) były trzymane w 12/12 godzinnym cyklu światło/ciemność ze swobodnym dostępem do pożywienia i wody.

1. Przygotowanie materiału
UWAGA: Zabieg przeprowadzany jest w warunkach aseptycznych. Przed rozpoczęciem upewnij się, że wszystkie narzędzia chirurgiczne, w tym wiertła, są oczyszczone odpowiednim środkiem dezynfekującym.

  1. Przygotować mieszaninę znieczulającą: 0,02 mg/ml fentanylu, 0,4 mg/ml midazolamu i 0,2 mg/ml medetomidyny (końcowe stężenia w mieszaninie).
    UWAGA: Zapoznaj się z odpowiednią sekcją Dyskusja, aby zapoznać się z alternatywnymi środkami znieczulającymi.
  2. Przygotować mieszaninę antidotum: 0,07 mg/ml flumazenilu i 0,42 mg/ml atipamezolu (końcowe stężenia w mieszaninie).
  3. Zamontuj cewnik i nasadkę cewnika z wlotem i śrubą. Przyciąć cewnik na długość 2 mm za pomocą skalpela (Rysunek 1).
    UWAGA: Nie używaj do tego nożyczek, ponieważ ściskają one i zniekształcają okrągły kształt przekroju końcówki cewnika.

2. Przygotowanie chirurgiczne

  1. Znieczulić szczura przez dootrzewnowe (i.p.) podanie mieszaniny znieczulenia (1,5 ml/kg masy ciała).
  2. Ogol głowę szczura między uszami za pomocą golarki elektrycznej. Umieść koc homeotermiczny na ramie stereotaktycznej przed ustawieniem zwierzęcia, aby uniknąć hipotermii podczas operacji.
  3. Unieruchomić głowę szczura w ramie stereotaktycznej za pomocą nauszników i płytki zgryzowej, upewniając się, że głowa jest pozioma i stabilna. Sprawdź stabilność, wywierając nacisk na czaszkę palcem lub kleszczami.
    UWAGA: Luźne mocowanie i niepoziome ustawienie w ramie stereotaktycznej może spowodować odchylenie od zamierzonych współrzędnych.
  4. Zastosuj nawilżające krople do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas zabiegu. Zakryj oczy nieprzezroczystym materiałem, aby zapobiec ekspozycji na światło chirurgiczne.
  5. Oczyść ogolone miejsce, stosując naprzemiennie 70% etanolu i 10% kompleksu powidon-jod.
    UWAGA: Przestrzegaj wszystkich środków ostrożności podczas zabiegu, aby uniknąć infekcji. Zabieg przeprowadzany jest w warunkach aseptycznych. Jeśli aseptyka zostanie przerwana, zanieczyszczony materiał musi zostać wymieniony.

3. Implantacja cewnika

  1. Wykonaj podłużne nacięcie o długości około 2 cm na środku skóry głowy. Użyj zacisków buldoga, aby przytrzymać skórę na boki. Aby zapoznać się z omówieniem tych kroków, zobacz Rysunek 2.
  2. Usuń krew za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką.
  3. Usuń okostną czaszki. Oczyść tkankę za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką i odsłoń kość czaszki. Pozostaw czaszkę do wyschnięcia na około 1 minutę.
  4. Zidentyfikuj anatomiczne punkty orientacyjne, lambda, Bregma i szew przyśrodkowy. Po zamontowaniu wiertła na ramie stereotaktycznej, umieść końcówkę wiertła w Bregma jako punkt początkowy. Przesunąć się o 2 mm w tył od Bregmy i przesunąć ~2,4 mm w bok do szwu przyśrodkowego.
  5. W tym miejscu wywierć otwór o średnicy 0,5 mm na cewnik. Delikatnie zdmuchnij pył kostny.
    UWAGA: Ważne jest, aby opona twarda pozostała nienaruszona podczas wiercenia. Aby to zapewnić, 1) użyj wiertła, które można zainstalować na ramie stereotaktycznej, 2) często sprawdzaj otwór podczas wiercenia i 3) wierc małymi krokami - jeśli na czaszkę zostanie przyłożony zbyt duży nacisk, końcówka wiertła będzie nadal wchodzić i uszkadza mózg, gdy czaszka zostanie w pełni przebita.
  6. Wywierć 3 kolejne otwory (o średnicy ~1,3 mm) na kotwiące w odległości kilku milimetrów od pierwszego otworu. Delikatnie zdmuchnij pył kostny.
    UWAGA: Wybierz miejsca kotwiących, które zapewniają wystarczająco dużo miejsca na górną część cewnika (o średnicy ~2 mm) i zaślepki kotwiących (~1 mm).
  7. Usunąć pył kostny przez przepłukanie około 1 - 2 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) lub soli fizjologicznej za pomocą strzykawki. Oczyść czaszkę. Dokręć kotwiące o 2-3 pełne obroty.
    UWAGA: kotwiące są niezbędne do ustabilizowania zestawu poprzez przytrzymanie cementu dentystycznego, a tym samym cewnika, na miejscu. Podczas dokręcania kotwiącej upewnij się, że nie można jej łatwo wyjąć, delikatnie podnosząc ją do góry za pomocą kleszczy. Ponieważ samo wszczepienie cewnika powoduje uraz tkanki, dodatkowe uszkodzenie opony twardej podczas wiercenia lub dokręcania kotwiących doprowadzi do wielu urazów i może utrudnić porównywalność w grupie. Najpierw dokręć kotwiące, a na końcu włóż cewnik.
  8. Wprowadzić cewnik o długości 2 mm przez pierwszy otwór, prostopadle do powierzchni czaszki. Trzymając cewnik w środku, nałóż niewielką ilość cementu dentystycznego i pozwól mu spolimeryzować po krótkiej (~5 s) ekspozycji na światło utwardzające zęby, aby ustabilizować cewnik, umożliwiając użycie obu rąk w następnym kroku.
    UWAGA: Podczas pracy z lampą do utwardzania zębów należy unikać patrzenia bezpośrednio na końcówkę lub na światło odbite od obszaru aplikacji, ponieważ duże natężenie tego światła może spowodować uszkodzenie siatkówki. Używaj odpowiednich okularów ochronnych.
  9. Nałóż więcej cementu dentystycznego wokół cewnika, zakotwicz i zestal cement dentystyczny za pomocą światła do utwardzania zębów (~15 - 30 s). Potwierdź twardnienie cementu końcówką kleszczy.

4. Zamykanie rany i antagonizacja znieczulenia

  1. Zamknij skórę głowy za pomocą wchłanialnych szwów, z przodu i z tyłu cewnika.
    UWAGA: Ponieważ pod koniec implantacji nad czaszką pojawi się wyboiste ustawienie, należy odpowiednio zamknąć ranę. Zbyt mocne uniesienie skóry spowoduje dyskomfort dla zwierzęcia.
  2. Mieszaninę antidotum należy wstrzyknąć podskórnie (1,5 ml/kg masy ciała) za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o sile 26 g.
  3. Enrofloksacynę (2,5%) należy podawać we wstrzyknięciu podskórnym (7,5 mg/kg masy ciała) w profilaktycznym leczeniu antybiotykami. Karprofen (1 mg/ml; 5 mg/kg masy ciała) i buprenorfina (1,2 mg/kg mc.) należy podawać w celu złagodzenia bólu we wstrzyknięciu podskórnym.

5. Opieka pooperacyjna i leki

  1. Umieść zwierzę z powrotem w zmodyfikowanej klatce i trzymaj je pod obserwacją przez 1 - 3 godziny, stosując światło podczerwone, aby uniknąć hipotermii. Stale obserwuj i zmieniaj pozycję zwierzęcia co 5 do 10 minut, aż do rekonwalescencji pooperacyjnej. Zachowaj szczególną ostrożność, aby unikać stałej ekspozycji oczu na światło aż do rekonwalescencji.
  2. Powtórzyć podawanie enrofloksacyny (7,5 mg/kg masy ciała) i karprofenu (1 mg/ml; 5 mg/kg masy ciała) we wstrzyknięciach podskórnych następnego dnia po zabiegu. Buprenorfina nie musi być odświeżana, ponieważ poprzednia kuracja jest skuteczna przez 72 godziny.

6. Przygotowanie mieszanki uodparniającej (najwcześniej 14 dni po wszczepieniu cewnika)

Uwaga: Umieść strzykawki na lodzie podczas procedury przygotowania.

  1. Podłącz dwie szklane strzykawki Luer lock o pojemności 10 ml do krótkich ramion 3-kierunkowego kranu i zamknij trzeci wylot długim ramieniem.
  2. Upewnij się, że połączenia są bezpieczne i szczelne: dodać około 4 ml sterylnego PBS do otwartej strzykawki, trzymając tłok 2. Włóż tłok 1 i popychaj oba tłoki do przodu ido tyłu, sprawdzając, czy nie ma wycieków. Jeśli nie wystąpi żaden wyciek, wyrzuć PBS i ponownie wyjmij tłok 1.
  3. Odpipetować razem 1 ml IFA i 50 μg rMOG1-125 i dostosować mieszaninę do końcowej objętości 2 ml za pomocą sterylnego PBS (pH 7,4) w odpowiedniej probówce.
    UWAGA: Ze względu na ubytki emulsji na końcach lub ściankach strzykawek podczas przygotowania, należy przygotować większą objętość niż przeznaczona do podania. Podobnie praktyczne jest przygotowanie się na więcej niż 1 zwierzę na raz.
  4. Umieścić rozcieńczoną mieszaninę IFA i rMOG1-125 w otwartej strzykawce. Delikatnie włóż tłok, utrzymując luźny nacisk na przeciwległy tłok (Rysunek 3A).
  5. Emulgować inokulum, przesuwając je z jednej strzykawki do drugiej, popychając tłoki w przód i w tył, aż stanie się białe i lepkie (Rysunek 3B).
  6. Przymocuj strzykawkę Luer lock o pojemności 1 ml do otwartego krótkiego ramienia 3-kierunkowego kurka i napełnij go inokulum (Rysunek 3C). Rozprowadź całe inokulum w strzykawkach o pojemności 1 ml. Lek należy przechowywać na lodzie do czasu wstrzyknięcia. Mieszaninę podawać w dniu przygotowania.

7. Szczepienia

ochronne
  1. Znieczulić szczura izofluoranem w komorze (~2 min, zmieszany z tlenem 2 l/min), a następnie podtrzymać znieczulenie przez maskę (zmieszaną z tlenem 1,5 l/min).
  2. Wstrzyknąć 200 μl inokulum podskórnie u podstawy ogona za pomocą igły 21 G.
    UWAGA: Wstrzyknięcie należy podawać powoli, ponieważ roztwór jest lepki.

8. Oznaczanie miana przeciwciał

  1. Pobrać ~200 μL krwi 4 tygodnie po szczepieniu w celu określenia miana przeciwciał anty-MOG.
  2. Pokryć dołki 96-dołkowej płytki MOG (5 μg/ml w PBS) i inkubować je przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  3. Zablokować płytkę 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  4. Inkubować płytkę z surowicą szczurzą (1:50) i standaryzować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Przemyć płytkę 3x 200 μl PBS/Polisorbatu 20.
  5. Inkubować płytkę z przeciwciałem drugorzędowym anty-szczurzej IgG sprzężonym z peroksydazą chrzanową (1:10 000). Umyj płytkę 3x 200 μL PBS/Polysorbate 20.
  6. Dodać 100 μl roztworu substratu peroksydazy do dołka i inkubować go przez 20 - 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
  7. Zmierzyć gęstość optyczną przy długości fali 405 nm i obliczyć miano przeciwciał na podstawie gęstości optycznej za pomocą krzywej wzorcowej.

9. Wstrzyknięcie cytokin domózgowych

  1. Dostosuj długość kaniuli łącznika (2 mm). (Zobacz Rysunek 4, aby zapoznać się z krokami przygotowawczymi.)
  2. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml mieszaniną cytokin (500 ng/μL TNF-alfa, 300 U/μL rekombinowanego szczurzego IFN-gamma w sterylnym PBS). Podłączyć strzykawkę do kaniuli łącznika. Napełnij kaniulę mieszaniną cytokin. Unikaj pęcherzyków.
  3. Zamontuj strzykawkę na programowalnej pompie strzykawkowej i zaprogramuj ją tak, aby wstrzykiwała 0,2 μl/min (Rysunek 5A). Uruchom pompę i utrzymuj ją w ruchu, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza na końcu kaniuli.
    UWAGA: Prędkość wstrzykiwania musi uwzględniać średnicę wewnętrzną konkretnej używanej strzykawki; W związku z tym średnica strzykawki musi być zarejestrowana podczas ustawiania pompy.
  4. Znieczulić szczura izofluranem w komorze (~2 min, zmieszane z 2 l/min tlenu), a następnie podtrzymać znieczulenie przez maskę (zmieszaną z 1,5 l/min tlenu) (ryc. 5B i 5C). Zastosuj nawilżające krople do oczu, ponieważ zwierzę będzie znieczulone przez co najmniej 30 minut.
  5. Zdejmij nasadkę cewnika wraz z wlotem. Włóż kaniulę łącznika do cewnika, przykręć ją i dokręć (rysunki 5D i 5E).
    UWAGA: Nie dokręcaj go zbyt mocno, ponieważ spowoduje to zniszczenie górnej końcówki cewnika.
  6. Pozostawić wstrzyknięcie na 10 minut (całkowita objętość wstrzyknięcia wynosi 2 μl). Zatrzymaj pompę. Pozostaw kaniulę wewnątrz cewnika na 20 minut, aby wstrzyknięta objętość mogła się całkowicie rozproszyć.
  7. Odkręć kaniulę złącza i wyjmij ją powoli, aby uniknąć efektu podciśnienia.
  8. Ponownie załóż nasadkę cewnika z wlotem i przykręć ją. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu w klatce.

Wyniki

Demielinizację kory można oceniać w różnych punktach czasowych po wstrzyknięciu cytokin za pomocą immunohistochemii przeciwko białku proteolipidowemu (PLP) (Rysunek 6). Rysunek 6A przedstawia nienaruszoną immunoreaktywność PLP w 15. dniu u zwierzęcia kontrolnego immunizowanego MOG, które otrzymało jedynie sterylny PBS przez wszczepiony cewnik. W 1. dniu po wstrzyknięciu cytokin u zwierząt primowanyzowanych MOG można było już wykryć demielinizację, choć jedynie w bezpośrednim sąsiedztwie obszaru cewnikowania (Rysunek 6B). Immunoreaktywność PLP pozostaje nienaruszona w korze przeciwstawnej w 1. dniu po wstrzyknięciu cytokin. W 3. dniu można było zaobserwować stopniowy wzrost utraty immunoreaktywności PLP, która rozprzestrzenia się w korze jednostronnej (Rysunek 6C). Demielinizację kory przeciwstawnej można było również wykryć w 3. dniu (Rysunek 6D), jednak jest ona raczej ograniczona do obszaru pod śrubami mocującymi, co prawdopodobnie wynika z obszaru o niskim przepływie płynu śródmiąższowego spowodowanego przez śruby mocujące43. Brak podobnej obserwacji u zwierząt kontrolnych, którym wstrzyknięto PBS, wyklucza możliwość demielinizacji wywołanej urazem wynikającym z zastosowania śrub mocujących.

Między 9. a 15. dniem demielinizacja obejmuje duże obszary kory obu półkul (Rycina 6E, 6F oraz 6G). Zbiega się to z obserwacją spowolnienia zachowania, choć bez statystycznie istotnego spadku sprawności motorycznej w teście rotarod43. Demielinizacja korowa utrzymuje się do 30 dni po wstrzyknięciu cytokin w obu półkulach (Rycina 6H oraz 6I), przy jedynie częściowej remielinizacji. Rycina 6J przedstawia ilościowe określenie utraty PLP w szarej materii kory po wewnątrzczaszkowym wstrzyknięciu cytokin. Należy zauważyć, że immunoreaktywność PLP nie była jeszcze oceniana po okresach dłuższych niż 30 dni; w związku z tym natychmiastowa rozdzielczość remielinizacji, o ile występuje, pozostaje do oceny w dalszych eksperymentach. Druga administracja mieszaniny cytokin przez wszczepiony cewnik 30 dni po pierwszym wstrzyknięciu skutkuje wyraźnym zanikiem mózgu w 15. dniu (Rycina 7).

Złożenie kapilarnej mikrosondy do analizy mikrofluidycznej; obrazy A, B i C pokazują poszczególne etapy montażu.
Rysunek 1: Przygotowanie cewnika. (A i B) Kanula prowadząca oraz kanula pomocnicza (nakrętka cewnika z wlotem) są montowane i skręcane. (C) Następnie cewnik jest przycinany skalpelem do długości 2 mm. Obserwacje mikroskopowe wykazały, że użycie nożyczek do tego celu zniekształca okrągły kształt końcówki kanuli, dlatego należy ich unikać. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Sekwencja implantacji chirurgicznej, kroki a-g, przedstawiająca procedurę eksperymentalną na czaszce gryzonia.
Rysunek 2: Implantacja cewnika. (A) Operację rozpoczyna się od nacięcia podłużnego i usunięcia okostnej. (B, C) Ten panel przedstawia wyznaczenie miejsca na cewnik 2 mm tylnie od Bregma i 2,4 mm bocznie w prawo od szwu strzałkowego; a także miejsc na otwory przeznaczone dla trzech śrub kotwiczących w odpowiedniej odległości od cewnika i Lambda. (D) Po wywierceniu otworu na cewnik (o średnicy 0,5 mm, wiertłem o okrągłym czubku) oraz otworów na śruby kotwiczące (o średnicy 1,3 mm, wiertłem spiralnym), śruby kotwiczące zostają dokręcone. (E, F) Następnie wprowadza się cewnik, a cały zestaw stabilizuje polimeryzującym cementem dentystycznym. (G) Ranę zszywa się dwoma lub trzema szwami przed i za cewnikiem. B = Bregma; L = Lambda; C = Cewnik; S1, S2 i S3 = miejsca na otwory dla trzech śrub kotwiczących. Paski skali = 1 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Oczyszczanie białka za pomocą filtra strzykawkowego w kąpieli lodowej; układ eksperymentalny do precyzyjnej ekstrakcji.
Rycina 3: Przygotowanie emulsji rMOG/IFA. (A) Mieszaninę rMOG, PBS i IFA emulguje się poprzez przeciskanie inokulum z jednej strzykawki do drugiej, przesuwając tłoki w przód i w tył, (B) aż do uzyskania białej i lepkej konsystencji. (C) Następnie inokulum rozdziela się do strzykawek 1 mL w celu podania iniekcji. Do subklinicznej immunizacji jednego szczura wykorzystuje się 5 µg rMOG w 200 µL mieszaniny PBS/IFA; jednak ze względu na straty na końcówkach i ściankach strzykawek podczas przygotowania, należy przygotować większą objętość. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat konstrukcji i sekwencji montażu cewnika dla urządzenia medycznego lub układu do transferu płynów.
Rycina 4: Przygotowanie kaniuli łącznika. (A - D) Panele te przedstawiają sposób montażu łącznika i elementu wewnętrznego przy użyciu kaniuli prowadzącej służącej jako szablon o rozmiarze 2 mm. (E) Element wewnętrzny jest przycinany do tej samej długości co kaniula prowadząca za pomocą skalpela (F), a następnie szablon prowadzący zostaje odkręcony. (G) Drugi koniec kaniuli łącznika zostaje przymocowany igłą 20 G do strzykawki 1 mL zawierającej mieszaninę do iniekcji. Paski skali = 3 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces znieczulania gryzonia z zestawem respiratora, przedstawiający sedację i przygotowanie eksperymentalne.
Rysunek 5: Iniekcja wewnątrzczaszkowa. (A) Programowalna pompa strzykawkowa jest ustawiona na prędkość iniekcji 2 µL/min, a strzykawka o pojemności 1 mL wypełniona mieszanką cytokin (lub sterylnym PBS dla grup kontrolnych) zostaje zamocowana do pompy. (B) Zwierzę jest najpierw znieczulone w komorze przy użyciu 5% isofluranu z przepływem tlenu 2 L/min, a następnie (C) znieczulenie jest podtrzymywane przez maskę przy użyciu 2,5% isofluranu z przepływem tlenu 1,5 L/min. (D) Nakrętka cewnika z wlotem (kanula ślepa) zostaje odkręcona, a kanula do iniekcji zostaje wprowadzona przez wszczepiony cewnik. Ponieważ objętość iniekcji jest bardzo mała, badacz powinien zachować ostrożność, aby uniknąć pęcherzyków powietrza w końcówce kanuli. Z tego powodu ważne jest rozpoczęcie wprowadzania kanuli podczas pracy pompy i dopiero wtedy, gdy w końcówce pojawi się rosnący pęcherzyk cieczy. Nadmiar objętości i tak nie dostanie się do mózgu, ponieważ zostanie przerwany na szczycie cewnika przed wprowadzeniem. (E>) Następnie dokręca się kanulę łącznikową i pozwala pompie pracować przez 10 min. Po 10 min iniekcji pompowanie zostaje zatrzymane, a kanulę pozostawia się wewnątrz przez 15 - 20 min, aby umożliwić dyfuzję wstrzykniętej objętości do płynu śródmiąższowego. Paski skali = 5 cm, chyba że wskazano inaczej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Przekroje histologiczne i wykres słupkowy tkanki kory po wstrzyknięciu cytokin; dołączono paski skali.
Rycina 6: Immunoreaktywność PLP w czołowych przekrojach mózgu. (A) Ten panel przedstawia mózg kontrolny (uodporniony na MOG) po wstrzyknięciu PBS (dzień 15), co nie skutkuje demielinizacją kory. (B) Już w 1. dniu po wstrzyknięciu cytokin demielinizacja jest widoczna w obszarze cewnika. (C) Szersza utrata immunoreaktywności PLP jest obserwowana w korze jednostronnej w 3. dniu, (D) jak również po stronie przeciwległej. Rozległa utrata immunoreaktywności PLP jest obserwowana w obu półkulach w 15. dniu, gdzie (E) ten panel pokazuje korę jednostronną, a (F) ten panel pokazuje korę przeciwległą. (G) Przegląd obu półkul pokazuje rozległą utratę PLP w 15. dniu. W 30. dniu, jak pokazuje (H) ten panel dla kory jednostronnej i (I) ten panel dla kory przeciwległej, nadal występuje znaczna demielinizacja, ale można zaobserwować również niektóre obszary remielinizowane. (J) Ten panel przedstawia ilościowe określenie demielinizacji (utrata PLP w mm2/półkula). Do detekcji PLP z użyciem przeciwciał MS anty-PLP przy rozcieńczeniu 1:500 wykorzystano czołowe przekroje mózgu o grubości 1,5 - 2 µm. Przekroje przeciwbarwiono hematoksyliną w celu uwidocznienia jąder komórkowych. Szczegółowe informacje na temat immunohistochemii znajdują się w pracy Ucal et al.43. Panele G i J zostały zmodyfikowane na podstawie Ucal et al.43. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Histologiczny przekrój mózgu, obrazy mikroskopowe A, B, do porównania i analizy anatomicznej.
Rycina 7: Zanik mózgu po drugiej iniekcji cytokin. (A) Ten panel przedstawia mózg kontrolny (uwrażliwiony na MOG) po iniekcji PBS (dzień 15). (B) W 15. dniu po pierwszej iniekcji cytokin, druga iniekcja prowadzi do zaniku mózgu w ciągu 15 dni. Do detekcji PLP z użyciem przeciwciała MS anti-PLP przy rozcieńczeniu 1:500 wykorzystano koronalne przekroje mózgu o grubości 1,5 - 2 µm. Przekroje przeciwbarwiono hematoksyliną w celu uwidocznienia jąder komórkowych. Szczegółowe informacje na temat immunohistochemii znajdują się w pracy Blakemore37. Paski skali = 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Układ pomieszczeń dla gryzoni; klatka z podściółką do badania zachowania zwierząt; środowisko eksperymentalne.
Rysunek 8: Zmodyfikowane klatki zapobiegające usunięciu cewnika przez zwierzę. W standardowych klatkach miejsce na uchwyt do karmy na kratce znajduje się bliżej dna klatki, co tworzy ryzykowną, wąską przestrzeń zwiększającą prawdopodobieństwo zaplątania się cewnika w kratkę i w konsekwencji jego usunięcia. Aby tego uniknąć, klatka musi zostać zmodyfikowana. Ta wąska przestrzeń została zablokowana przezroczystą szybką, co umożliwia obserwację zwierzęcia. W tych zmodyfikowanych klatkach karmę należy podawać do wnętrza klatki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Nasza metoda wykorzystuje szczury DA. Adaptacja do myszy będzie prawdopodobnie wymagała użycia mniejszego cewnika i. Należy również pamiętać, że przebieg choroby, odpowiedź zapalna i stopień demielinizacji mogą różnić się od tego, co jest tutaj przedstawione, jeśli stosuje się inny gatunek/szczep. Takie różnice zaobserwowano w klasycznych modelach EAE wykorzystujących różne szczepy myszy. Na przykład MOG92-106 pochodzenia szczurzego powodował pierwotnie postępujące lub wtórnie postępujące EAE u myszy A.SW, podczas gdy indukował nawrotowo-remisyjne EAE u myszy SJL / J46. W związku z tym należy wykorzystać zwierzęta tego samego szczepu. Różnice między płciami w manifestacji EAE zostały również zgłoszone w różnych wcześniejszych badaniach24. Wystąpienia takich efektów płci można się spodziewać w przypadku opisanego tutaj protokołu, ale pozostaje to do potwierdzenia w dalszych eksperymentach.

W interwencji chirurgicznej stosuje się dootrzewnowe (IP) podanie dootrzewnowe mieszaniny środków znieczulających składającej się z 0,02 mg/ml fentanylu, 0,4 mg/ml midazolamu i 0,2 mg/ml medetomidyny. Dorosłe samce szczurów DA o wadze 270 - 300 g wymagają około 0,4 - 0,6 ml tej mieszanki (tj. ~1,5 ml / kg) do wywołania znieczulenia trwającego 60 - 90 min. Po zabiegu znieczulenie antagonizuje się przez podskórne wstrzyknięcie antidotum składającego się z 0,07 mg/ml flumazenilu i 0,42 mg/ml atipamezolu w soli fizjologicznej (0,9% NaCl). Dawka 1 - 1,5 ml/kg antagonizuje znieczulenie w ciągu 5 minut. Alternatywnie, zwierzętom można pozwolić obudzić się spontanicznie po fizjologicznym wypłukaniu środków znieczulających, ale w takim przypadku zwierzęta musiałyby być trzymane pod obserwacją, dopóki nie uzyskają pełnej świadomości.

Inne opcje znieczulenia często stosowane w operacjach na zwierzętach, takie jak wstrzyknięcie IP ketaminy i ksylazyny47 lub pentobarbitalu sodu48 lub wdychanie lotnych środków znieczulających, takich jak izofluoran49 i halotan50, mogą być również brane pod uwagę w przedstawionej tutaj operacji. Bardzo ważne jest jednak, aby wybrać środek znieczulający, który nie koliduje z zamierzoną dalszą interwencją (interwencjami).

Podczas immunizacji i iniekcji cytokin domózgowych do znieczulenia stosuje się 5% izofluranu. Opisany tutaj model został opracowany przy użyciu szczurów, a zatem wymienione szczegóły eksperymentalne mają szczególne zastosowanie do szczura. Współrzędne implantacji cewnika zostały dobrane tak, aby umożliwić jednoczesną analizę ewentualnych zmian w istocie białej (końcówka cewnika w ciele modzelowatym). Podczas gdy miejsce wprowadzenia cewnika może być zróżnicowane w zależności od pozycji przednio-tylnej i bocznej, wybór bruzdy centralnej wymaga uniknięcia uszkodzenia zatoki strzałkowej górnej.

Kolejną cechą opisanej metody jest równoważna demienizacja zarówno półkuli ipsi, jak i przeciwległej, prawdopodobnie wynikająca z przenoszenia wstrzykniętej mieszaniny cytokin do przestrzeni podpajęczynówkowej przez fizjologiczny przepływ płynu śródmiąższowego z obszarów korowych51. Tryb wstrzykiwania, a nie lokalizacja cewnika, powoduje zatem demielinizację w całej korze mózgowej, a zatem wybór prawej lub lewej kory ciemieniowej powinien być pod tym względem nieistotny.

W protokole zastosowano cewnik 26 G, który jest wystarczająco mały, aby uniknąć rozległych urazów i wystarczająco duży, aby uniknąć zwiększonego tempa zatykania końcówki cewnika w długim trakcie eksperymentu. Z pewnością implantacja i obecność samego cewnika powodują aktywację astrocytarną i mikrogleju, również u zwierząt kontrolnych otrzymujących tylko implantację cewnika; Jest to jednak niewielka liczba w porównaniu ze zwierzętami, którym wstrzyknięto cytokiny. 43 Aby uniknąć zakłóceń w późniejszych analizach, zastosowaliśmy cewniki kompatybilne z MRI wykonane z polieteroeteroketonu (PEEK).

Podobna głębokość demielinizacji jest w rzeczywistości tworzona zarówno w regionach ipsi, jak i przeciwległych za pomocą prezentowanej metody. Oznacza to, że głębokość/długość cewnika może nie odgrywać głównej roli we wzorcu i zakresie demielinizacji w korze mózgowej. W związku z tym można rozważyć modyfikację długości cewnika w celu zmniejszenia rozmiaru zmiany wywołanej przez cewnik. Niemniej jednak znacznie krótsza długość cewnika może powodować nieco mniej wyraźną demielinizację korową, podczas gdy ostateczną odpowiedź można uzyskać tylko za pomocą eksperymentów testujących długość cewnika.

Jedną z zalet modelu jest to, że wszczepiony cewnik pozwala na testowanie potencjalnych środków terapeutycznych podawanych do kory mózgowej za pośrednictwem cewnika, aby umożliwić remielinizację w momencie lub po szczycie histologicznie wykrywalnej demielinizny korowej (15 dzień lub później), podczas gdy w warunkach przed leczeniem byłoby to po szczepieniu, ale przed wstrzyknięciem cytokin. Decyzja o ramach czasowych, w których terapia będzie podawana, będzie zatem zależała od konkretnego pytania badawczego i interesującego leku.

Po wszczepieniu cewnika ważne jest, aby zwierzęta były trzymane pojedynczo w zmodyfikowanych (najlepiej wysokich) klatkach, aby uniknąć usunięcia cewnika do końca badania (ryc. 8). Zwierzęta mogą również odkręcić nasadkę cewnika z wlotem, chociaż zdarza się to rzadko. Zwierzęta powinny być obserwowane codziennie, a zdjęte nakrętki należy wymienić na nowe, aby uniknąć zablokowania końcówki cewnika w przypadku braku wlotu oraz zapewnić dokładne podanie do miąższu po wstrzyknięciu domózgowym. Zwierzęta są szczepione najwcześniej 2 tygodnie po implantacji cewnika, aby umożliwić gojenie i zamknięcie bariery krew-mózg.

Po szczepieniu należy oznaczyć miana przeciwciał anty-MOG w surowicy. Eksperyment dawka-odpowiedź wykazał, że 5 μg MOG1-125 (w IFA) zapewniało wystarczającą immunizację w ciągu 4 tygodni u dorosłych samców szczurów DA. Miano na poziomie 5 000 μg/ml i wyższym byłoby wystarczające, ale z pewnością będzie zależało od kilku czynników, w tym preparatu MOG i szczepu zwierząt, a zatem będzie musiało być ustalane indywidualnie. Ważne jest, aby unikać zbyt wysokich dawek antygenu, które mogą prowadzić do klasycznego fenotypu EAE ze sparaliżowanymi kończynami tylnymi jeszcze przed wstrzyknięciem cytokin.

Każde zwierzę uodparnia się 5 μg rekombinowanej glikoproteiny oligodendrocytów mieliny (rMOG1-125) zemulgowanej w 200 μl niekompletnego adiuwanta Freunda (IFA). Ze względu na to, że część emulsji zostaje utracona w strzykawce podczas przygotowania, zaleca się przygotowanie większej ilości niż ta ilość dla każdego zwierzęcia. Użyliśmy rekombinowanego MOG (1-125 z N-końca szczurzego MOG), który ulegał ekspresji w Escherichia coli, a następnie został oczyszczony do jednorodności za pomocą chromatografii chelaowej, rozpuszczony w 6 M moczniku i dializowany przeciwko PBS w celu uzyskania preparatu fizjologicznego52,53. Dostępny na rynku MOG może być jednak również stosowany.

Inne preparaty antygenowe, takie jak MOG1-116, MOG35-55 lub PLP139-151 , są stosowane w różnych modelach EAE, a wiadomo, że różnice w antygenach i szczepach zwierzęcych wywołują różne fenotypy choroby w tych modelach20. Te preparaty antygenowe nie były testowane na szczurach DA i, jeśli są stosowane zamiast rMOG1-125, mogą wywołać fenotyp choroby lub wyniki histologiczne różniące się od przedstawionych tutaj.

Przed wstrzyknięciem domózgowym przygotowuje się kaniulę łącznikową o tej samej długości co cewnik. Można to zrobić, składając go za pomocą cewnika szablonowego i przycinając do tego samego rozmiaru (2 mm długości) (ryc. 4). Ważne jest, aby kaniula łącznika była wolna od pęcherzyków powietrza podczas wstrzykiwania cytokin - ponieważ objętość wstrzyknięcia wynosi tylko 2 μl, nawet niewielki pęcherzyk powietrza na końcu kaniuli znacznie zmniejszy objętość płynu pomyślnie dostarczonego do mózgu. Osiąga się to poprzez utrzymywanie pompy w ruchu i wkładanie kaniuli tylko wtedy, gdy na końcówce znajduje się rosnąca kropla płynu iniekcyjnego. Po wprowadzeniu kaniuli łącznik jest przykręcany do cewnika, unikając nadmiernego dokręcenia, aby nie uszkodzić górnej końcówki cewnika, co utrudni jego ponowne zamknięcie po wstrzyknięciu. Prędkość wstrzykiwania wynosi 0,2 μl/min, aby uniknąć urazu wywołanego wstrzyknięciem. Co więcej, powolne wstrzykiwanie, w połączeniu z 20-minutowym okresem oczekiwania po wstrzyknięciu, zapewnia dyfuzję wstrzykniętej cieczy do płynu śródmiąższowego i skuteczny odpływ do płynu mózgowo-rdzeniowego. Kaniula jest następnie powoli usuwana, aby uniknąć efektu podciśnienia.

Opisana metoda obejmuje interwencję chirurgiczną i dlatego wymaga personelu zdolnego do przeprowadzenia stereotaktycznej operacji przeżycia. Personel mający bezpośredni kontakt ze zwierzętami powinien odbyć odpowiednie kursy doświadczalne na zwierzętach. Pozostała część protokołu może być przeprowadzona przez kompetentnych członków laboratorium.

Metoda ma na celu wywołanie wywołanej stanem zapalnym demielinizacji kory mózgowej i nie odtwarza wszystkich cech stwardnienia rozsianego u człowieka (np. występowania ogniskowych zmian zapalnych istoty białej, co jest cechą charakterystyczną stwardnienia rozsianego u człowieka).

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować całemu personelowi Instytutu Badań Biomedycznych Uniwersytetu Medycznego w Grazu za pomoc i współpracę, a także Christopherowi Johnowi Wrightonowi za korektę manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dorosłe samce szczurów Dark Agouti (300 ± 25 g) 
FentanylHameln pharma plus, Niemcy  jako cytrynian fentanylu, 50 i mikro; g/ml
MidazolamERWO Pharma, Austria500390175 mg/ml
Medetomidin Orion Pharma, Finlandiajako chlorowodorek medetomidyny, 1mg/ml
Flumazenil Roche, Szwajcaria0,1 mg/ml
Atipamezol Orion Pharma, Finlandiajako chlorowodorek Atipamezolu, 5 mg/ml
10% kompleks powidon-jod Mundipharma, Austria
Cement dentystyczny Heraeus Kulzer, Niemcy6603 7633
Fizjologiczny roztwór soli fizjologicznej Fresenius Kabi, Austria0,9% NaCl
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Sigma-Aldrich, NiemcyP3813
Izofluoran AbbVie, Austria
Nawilżające krople do oczu Thea Pharma, Austria
70% EtOHMerck, Niemcy1070172511Etanol absolutny rozcieńczono w ddH2O w celu przygotowania 70% v/v
2,5% enrofloksacynyBayer, NiemcyAntybiotyki profilaktyczne 
karprofenPfizer, USALeki przeciwbólowe, 50 mg/ml 
Tween-20 Sigma-Aldrich, NiemcyP9416
Pentobarbital Richter Pharma, Austriapentobarbital sod, 400 mg/ml
Interferon gamma PeproTech, Stany Zjednoczone  400-20
Czynnik martwicy nowotworu alfaR& D Systems, USA510-RT-050/CF
rMOG1-125własny produkt w Centrum Medycyny Molekularnej, Instytut Karolinska, SzwecjaRekombinowana glikoproteina oligodendrocytów mieliny szczura, aminokwasy 1-125 z N-końca, dostępne również w handlu: AnaSpec, AS-55152-500, USA
Przeciwciało anty-MOG Ana Spec/Kaneka Corporation, JaponiaAS-555157Standard od ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka   
Niekompletny Freund' s adiuwant Sigma-Aldrich, Niemcy  F5506
Przeciwciało drugorzędowe anty-szczurzej IgG sprzężone z peroksydazą chrzanowa Ana Spec/Kaneka Corporation, JaponiaAS-555157Przeciwciało drugorzędowe z zestawu ELISA-Kit; Ana Spec/Kaneka Corporation
Albumina surowicy bydlęcej Sigma-Aldrich, NiemcyA9576
Roztwór substratu peroksydazyVector Laboratories, USASK-45000
Ramka stereotaktyczna David Kopf Instruments, USA
Cewniki, odpowiedni rezonans magnetyczny PlasticsOne, USA8IC315GPKXXC
Atrapy kaniul PlasticsOne, USA8IC315DCNSPC
plastikowe, odpowiednie do rezonansu magnetycznego PlasticsOne, USA8L080X093N01
Kaniula łącznika PlasticsOne, USA8IC313CXSPCC
Śrubokręt z końcówką
Wiertarka z elastycznym przedłużeniem wałka Proxxon, NiemcyNO 28 472, NO 28 706, NO 28 620,   
Wiertło okrągłe 0,5 mm Hager & Meisinger, Niemcy REF310 104 001 001 009
Wiertło skręcane 1,3 mm Hager & Meisinger, Niemcy REF350 104 417 364 013
Skalpel Braun, NiemcyBB510
Rękojeść skalpela Fine Science Tools, Niemcy91003-12
Aplikator z bawełnianą końcówką Henry Schein Medical, Austria900-3155
Nożyczki chirurgiczneFine Science Tools, Niemcy14101-14, 14088-10 
Kleszcze chirurgiczneFine Science Tools, Niemcy11002-12, 11251-35
Zaciski Bulldog Fine Science Tools, Niemcy18050-35
Koc homeotermiczny TSE systems, Niemcy
Lampa na podczerwieńBeurer, Niemcy616.51
Światło do utwardzania zębów Guilin Woodpecker Medical, Chiny
Szew wchłanialny Johnson & Johnson, BelgiaV792E
Programowalna pompa strzykawkowa World Precision Instruments, USAAL-1000
Rękawice
Fartuch
Golarka elektrycznaAesculap, NiemcyGT420
Waporyzator do znieczulania lotnego Rothacher Medical, SzwajcariaCV 30-301-D
Źródło tlenu do parownika do znieczulenia lotnegoAir Liquide, Austria19,113
Komora do znieczulenia lotnego Rothacher Medical, SzwajcariaPS-0347
Maska anestezjologiczna dla szczurów Rothacher Medical, SzwajcariaPS-0307-A
Strzykawka 1 ml Codan, DaniaREF 62.1612
Igła o rozmiarze 26 do wstrzykiwań Braun, Niemcy4657683
Igła o rozmiarze 20 do wstrzykiwania cytokin i immunizacji Braun, Niemcy4657519
Szklane strzykawki z końcówką Luer lock Poulten & Graf, Niemcy7.140-37
Kran 3-drogowy Becton Dickinson, Szwecja394600
Płytka 96-dołkowa Thermo Fisher Scientific, USA442404
Czytnik płytek Cole-Parmer, Stany ZjednoczoneEW-1396-00
37° C inkubatorKendro, Niemcy50042301
Mikropipety Gilson, Stany ZjednoczoneF167350
2mmegzaminacyjnechirurgiczny

Bibliografia

  1. MS Prevalence. National Multiple Sclerosis Society. , Available from: http://www.nationalmssociety.org/About-the-Society/MS-Prevalence (2017).
  2. Berkovich, R. Treatment of acute relapses in multiple sclerosis. Neurotherapeutics. 10 (1), 97-105 (2013).
  3. Kalincik, T. Multiple Sclerosis Relapses: Epidemiology, Outcomes and Management. A Systematic Review. Neuroepidemiology. 44 (4), 199-214 (2015).
  4. Feinstein, A., Freeman, J., Lo, A. C. Treatment of progressive multiple sclerosis: what works, what does not, and what is needed. The Lancet Neurology. 14 (2), 194-207 (2015).
  5. Montalban, X., et al. Ocrelizumab versus Placebo in Primary Progressive Multiple Sclerosis. The New England Journal of Medicine. 376 (3), 209-220 (2017).
  6. Dyment, D. A., Ebers, G. C., Sadovnick, A. D. Genetics of multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 3 (2), 104-110 (2004).
  7. Ascherio, A. Environmental factors in multiple sclerosis. Expert Review of Neurotherapeutics. 13, 12 Suppl 3-9 (2013).
  8. Allen, I. V., McQuaid, S., Mirakhur, M., Nevin, G. Pathological abnormalities in the normal-appearing white matter in multiple sclerosis. Neurological Sciences. 22 (2), 141-144 (2001).
  9. Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128 (11), 2705-2712 (2005).
  10. Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Cortical lesions and brain atrophy in MS. Journal of the Neurological Sciences. 233 (1-2), 55-59 (2005).
  11. Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
  12. Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced inflammation in cortical multiple sclerosis lesions. Annals of Neurology. 50 (3), 389-400 (2001).
  13. Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Cortical demyelination in multiple sclerosis: a substrate for cognitive deficits. Journal of the Neurological Sciences. 245 (1-2), 123-126 (2006).
  14. Procaccini, C., De Rosa, V., Pucino, V., Formisano, L., Matarese, G. Animal models of Multiple Sclerosis. European Journal of Pharmacology. 759, 182-191 (2015).
  15. Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: a clinical and histopathological perspective. Brain Pathology. 27 (2), 123-137 (2017).
  16. Lebar, R., Lubetzki, C., Vincent, C., Lombrail, P., Boutry, J. M. The M2 autoantigen of central nervous system myelin, a glycoprotein present in oligodendrocyte membrane. Clinical and Experimental Immunology. 66 (2), 423-434 (1986).
  17. Linington, C., Bradl, M., Lassmann, H., Brunner, C., Vass, K. Augmentation of demyelination in rat acute allergic encephalomyelitis by circulating mouse monoclonal antibodies directed against a myelin/oligodendrocyte glycoprotein. The American Journal of Pathology. 130 (3), 443-454 (1988).
  18. Panitch, H., Ciccone, C. Induction of recurrent experimental allergic encephalomyelitis with myelin basic protein. Annals of Neurology. 9 (5), 433-438 (1981).
  19. Tuohy, V. K., Sobel, R. A., Lees, M. B. Myelin proteolipid protein-induced experimental allergic encephalomyelitis. Variations of disease expression in different strains of mice. The Journal of Immunology. 140 (6), 1868-1873 (1988).
  20. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1810-1819 (2006).
  21. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nature Protocols. 1 (4), 1952-1960 (2006).
  22. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25 (7), 1951-1959 (1995).
  23. McRae, B. L., et al. Induction of active and adoptive relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) using an encephalitogenic epitope of proteolipid protein. Journal of Neuroimmunology. 38 (3), 229-240 (1992).
  24. Bebo, B. F., Vandenbark, A. A., Offner, H. Male SJL mice do not relapse after induction of EAE with PLP 139-151. Journal of Neuroscience Research. 45 (6), 680-689 (1996).
  25. Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. The Journal of Immunology. 171 (1), 462-468 (2003).
  26. Scheld, M., et al. Neurodegeneration Triggers Peripheral Immune Cell Recruitment into the Forebrain. The Journal of Neuroscience. 36 (4), 1410-1415 (2016).
  27. Chanaday, N. L., Roth, G. A. Microglia and astrocyte activation in the frontal cortex of rats with experimental autoimmune encephalomyelitis. Neuroscience. 314, 160-169 (2016).
  28. Pomeroy, I. M., Matthews, P. M., Frank, J. A., Jordan, E. K., Esiri, M. M. Demyelinated neocortical lesions in marmoset autoimmune encephalomyelitis mimic those in multiple sclerosis. Brain. 128 (11), 2713-2721 (2005).
  29. Merkler, D., et al. Differential macrophage/microglia activation in neocortical EAE lesions in the marmoset monkey. Brain Pathology. 16 (2), 117-123 (2006).
  30. Storch, M. K., et al. Cortical demyelination can be modeled in specific rat models of autoimmune encephalomyelitis and is major histocompatibility complex (MHC) haplotype-related. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 65 (12), 1137-1142 (2006).
  31. Ludwin, S. K. Central nervous system demyelination and remyelination in the mouse: an ultrastructural study of cuprizone toxicity. Laboratory Investigation. 39 (6), 597-612 (1978).
  32. Skripuletz, T., et al. Cortical demyelination is prominent in the murine cuprizone model and is strain-dependent. The American Journal of Pathology. 172 (4), 1053-1061 (2008).
  33. Norkute, A., et al. Cuprizone treatment induces demyelination and astrocytosis in the mouse hippocampus. Journal of Neuroscience Research. 87 (6), 1343-1355 (2009).
  34. Acs, P., et al. 17beta-estradiol and progesterone prevent cuprizone provoked demyelination of corpus callosum in male mice. Glia. 57 (8), 807-814 (2009).
  35. Pott, F., et al. Cuprizone effect on myelination, astrogliosis and microglia attraction in the mouse basal ganglia. Brain Research. 1305, 137-149 (2009).
  36. Jeffery, N. D., Blakemore, W. F. Remyelination of mouse spinal cord axons demyelinated by local injection of lysolecithin. Journal of Neurocytology. 24 (10), 775-781 (1995).
  37. Blakemore, W. F. Ethidium bromide induced demyelination in the spinal cord of the cat. Neuropathology and Applied Neurobiology. 8 (5), 365-375 (1982).
  38. Mason, J. L., et al. Oligodendrocytes and progenitors become progressively depleted within chronically demyelinated lesions. The American Journal of Pathology. 164 (5), 1673-1682 (2004).
  39. Franco, P. G., Silvestroff, L., Soto, E. F., Pasquini, J. M. Thyroid hormones promote differentiation of oligodendrocyte progenitor cells and improve remyelination after cuprizone-induced demyelination. Experimental Neurology. 212 (2), 458-467 (2008).
  40. Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
  41. Kerschensteiner, M., et al. Targeting experimental autoimmune encephalomyelitis lesions to a predetermined axonal tract system allows for refined behavioral testing in an animal model of multiple sclerosis. The American Journal of Pathology. 164 (4), 1455-1469 (2004).
  42. Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, Pt 8 1972-1983 (2006).
  43. Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).
  44. Gardner, C., et al. Cortical grey matter demyelination can be induced by elevated pro-inflammatory cytokines in the subarachnoid space of MOG-immunized rats. Brain. 136, Pt 12 3596-3608 (2013).
  45. Minagar, A., et al. The thalamus and multiple sclerosis: modern views on pathologic, imaging, and clinical aspects. Neurology. 80 (2), 210-219 (2013).
  46. Tsunoda, I., Kuang, L. Q., Theil, D. J., Fujinami, R. S. Antibody association with a novel model for primary progressive multiple sclerosis: induction of relapsing-remitting and progressive forms of EAE in H2s mouse strains. Brain Pathology. 10 (3), 402-418 (2000).
  47. Lifshitz, J., Witgen, B. M., Grady, M. S. Acute cognitive impairment after lateral fluid percussion brain injury recovers by 1 month: evaluation by conditioned fear response. Behavioural Brain Research. 177 (2), 347-357 (2007).
  48. Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5 (9), 1552-1563 (2010).
  49. Leonard, J. R., Grady, M. S., Lee, M. E., Paz, J. C., Westrum, L. E. Fluid percussion injury causes disruption of the septohippocampal pathway in the rat. Experimental Neurology. 143 (2), 177-187 (1997).
  50. Hare, G. M., et al. Severe hemodilutional anemia increases cerebral tissue injury following acute neurotrauma. Journal of Applied Physiology. 103 (3), 1021-1029 (2007).
  51. Abbott, N. J. Evidence for bulk flow of brain interstitial fluid: significance for physiology and pathology. Neurochemistry International. 45 (4), 545-552 (2004).
  52. Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. The Journal of Immunology. 153 (10), 4349-4356 (1994).
  53. Adzemovic, M. Z., Zeitelhofer, M., Hochmeister, S., Gustafsson, S. A., Jagodic, M. Efficacy of vitamin D in treating multiple sclerosis-like neuroinflammation depends on developmental stage. Experimental Neurology. , 39-48 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Glikoproteina mielinowa oligodendrocyt wchirurgia stereotaktycznaimmunohistochemiaimmunoreaktywno PLPmodel stwardnienia rozsianegoimplantacja cewnika
Szczurzy model rozległej demielinizacji kory mózgowej indukowanej przez domózgowe wstrzyknięcie cytokin prozapalnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.