Artykuł metodologiczny

Analiza funkcji wzmacniacza za pomocą interferencji wzmacniacza opartego na multipleksie CRISPR w liniach komórkowych

9.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57883

⸱

2 czerwca 2018

 ,  , 
1Department of Oncological Sciences, Huntsman Cancer Institute, University of Utah

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje kroki potrzebne do zaprojektowania i przeprowadzenia multipleksowanego celowania wzmacniaczy za pomocą dezaktywującego białka fuzyjnego SID4X-dCas9-KRAB, znanego również jako interferencja wzmacniacza (Enhancer-i). Protokół ten umożliwia identyfikację wzmacniaczy, które regulują ekspresję genów i ułatwia analizę relacji między wzmacniaczami regulującymi wspólny gen docelowy.

Streszczenie

Wiele wzmacniaczy często reguluje dany gen, jednak dla większości genów nie jest jasne, które wzmacniacze są niezbędne do ekspresji genów i jak te wzmacniacze łączą się, aby wytworzyć odpowiedź transkrypcyjną. Ponieważ zidentyfikowano miliony wzmacniaczy, potrzebne są narzędzia o wysokiej przepustowości, aby określić funkcję wzmacniacza w skali całego genomu. Obecne metody badania funkcji wzmacniacza obejmują tworzenie delecji genetycznych przy użyciu Cas9 biegłego w nukleazie, ale trudno jest badać kombinatoryczne efekty wielu wzmacniaczy przy użyciu tej techniki, ponieważ należy wygenerować wiele kolejnych klonalnych linii komórkowych. Tutaj przedstawiamy Enhancer-i, metodę opartą na interferencji CRISPR, która pozwala na funkcjonalne badanie wielu wzmacniaczy jednocześnie w ich endogennych loci. Enhancer-i wykorzystuje dwie domeny represyjne połączone z niedoborem nukleazy Cas9, SID i KRAB, aby osiągnąć dezaktywację wzmacniacza poprzez deacetylację histonów w docelowych loci. Protokół ten wykorzystuje przejściową transfekcję przewodnikowych RNA, aby umożliwić przejściową inaktywację docelowych regionów i jest szczególnie skuteczny w blokowaniu indukowalnych odpowiedzi transkrypcyjnych na bodźce w warunkach hodowli tkankowej. Enhancer-i jest wysoce specyficzny zarówno pod względem ukierunkowania genomowego, jak i wpływu na globalną ekspresję genów. Wyniki uzyskane za pomocą tego protokołu pomagają zrozumieć, czy wzmacniacz przyczynia się do ekspresji genów, wielkość tego wkładu oraz jak wpływają na ten wkład inne pobliskie wzmacniacze.

Wprowadzenie

Duże projekty sekwencjonowania, takie jak ENCODE1, Roadmap Epigenomics2, oraz FANTOM3 zidentyfikowały miliony domniemanych wzmacniaczy w ludzkim genomie w setkach typów komórek. Szacuje się, że każdy promotor kojarzy się ze średnio 4,9 wzmacniaczami, a każdy wzmacniacz kontaktuje się średnio z 2,4 genami3, co sugeruje, że ekspresja genów jest często wynikiem integracji wielu rozproszonych interakcji regulacyjnych. Istotnym wyzwaniem pozostaje nie tylko określenie, w jaki sposób poszczególne wzmacniacze przyczyniają się do ekspresji genów, ale także w jaki sposób łączą się, aby wpływać na ekspresję. Podejścia genetyczne są powszechnie stosowane do identyfikacji relacji między wzmacniaczami w organizmach modelowych od Drosophila4 do myszy5. Jednak eksperymenty te są czasochłonne i niskoprzepustowe w przypadku badania wielu wzmacniaczy w wielu genach.

Jednym z podejść do badania funkcji wzmacniacza na dużą skalę są masowo równoległe testy reporterowe. Testy te pozwalają na jednoczesne badanie przesiewowe tysięcy sekwencji DNA pod kątem ich zdolności do kierowania ekspresją genu reporterowego6. Chociaż testy te wykazały, że sekwencja DNA sama w sobie może być wystarczająca do przekazania informacji o regulacji genów7, wiążą się one z zastrzeżeniami dotyczącymi ich przeprowadzania poza kontekstem natywnej chromatyny i z heterologicznym promotorem. Ponadto rozmiar sekwencji DNA analizowanej w masowo równoległych testach reporterowych jest zwykle mniejszy niż 200 par zasad, co może wykluczać odpowiednią sekwencję otaczającą. Co ważne, ponieważ testy reporterowe mierzą aktywność tylko jednej sekwencji na raz, nie uwzględniają złożonych relacji, które mogą istnieć między wzmacniaczami. Tak więc, podczas gdy masowo równoległe testy reporterowe mogą informować o wewnętrznej aktywności sekwencji DNA, niekoniecznie informują nas o funkcji tej sekwencji DNA w kontekście genomu.

Ostatnio opracowane narzędzia CRISPR/Cas98 ułatwiły badania nad regulacją genów, ponieważ pozwalają na delecję wzmacniaczy w endogennym locus. Jednak usunięcie wielu wzmacniaczy jednocześnie może prowadzić do niestabilności genomu, a generowanie kolejnych delecji wzmacniaczy w jednej linii komórkowej jest czasochłonne. Ponadto w miejscu delecji po naprawie tworzona jest nowa sekwencja genomowa, która może zyskać funkcję regulacyjną. Alternatywna wersja Cas9 została opracowana specjalnie do modulowania ekspresji genów, opierając się na fuzjach domen activating9,10 lub repressing11,12 do formy Cas9 (dCas9) z niedoborem nukleazy. Te białka fuzyjne są idealne do jednoczesnego badania wielu loci, ponieważ nie zmieniają fizycznie sekwencji DNA, a zamiast tego modulują epigenetykę w celu zbadania regionu regulatorowego. Najczęściej stosowaną fuzją represyjną jest KRAB, która rekrutuje kompleks korepresorowy KAP1, promując odkładanie się trymetylacji histonu H3 lizyny 9 związanego z represją (H3K9me3)13. dCas9-KRAB, znany również jako interferencja CRISPR14, był używany do celowania i badania przesiewowego poszczególnych wzmacniaczy pod kątem ich wkładu w ekspresję genów15,16; Nie został jednak zoptymalizowany pod kątem jednoczesnego kierowania na wiele regionów. Jedna z wersji multipleksowej interferencji CRISPR dla wzmacniaczy, Mosaic-seq17, wykorzystuje sekwencję RNA pojedynczej komórki jako odczyt, ale ta technologia jest droga i nadaje się tylko do badania genów o wysokiej ekspresji ze względu na niską czułość sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki.

Staraliśmy się opracować metodę opartą na interferencji CRISPR do analizy funkcji wzmacniacza kombinatorycznego w kontekście odpowiedzi transkrypcyjnej na estrogen. Około połowa genów reagujących na estrogen zawiera 2 lub więcej wzmacniaczy związanych przez receptor estrogenowy alfa (ER) w pobliżu18, co sugeruje, że wiele wzmacniaczy może uczestniczyć w odpowiedzi estrogenowej, a zrozumienie logiki regulacyjnej wymagałoby jednoczesnego ukierunkowania na wiele wzmacniaczy. Ponieważ wstępne badania z wykorzystaniem interferencji CRISPR u promotorów sugerowały, że nie wszystkie promotory są jednakowo wrażliwe na represję za pośrednictwem KRAB19, doszliśmy do wniosku, że dodanie odrębnej domeny represyjnej do dCas9 może ułatwić dezaktywację różnych wzmacniaczy. Wybraliśmy domenę interaktywną Sin3a z Mad1 (SID)20, ponieważ prowadzi to do rekrutacji deacetylaz histonowych21, które usuwają grupy acetylowe na histonach, które są związane z aktywnością transkrypcyjną. Co ważne, domena SID była skuteczna w zmniejszaniu ekspresji genów po połączeniu z dCas922 i TALEs23, a Sin3a okazał się silnym represyjnym kofaktorem w różnych kontekstach sekwencji wzmacniacza24. Użyliśmy SID4x-dCas9-KRAB (Enhancer-i), aby celować w 10 różnych wzmacniaczy związanych przez ER i zidentyfikować miejsca wiązania ER (ERBS), które są niezbędne do odpowiedzi transkrypcyjnej estrogenu w 4 genach18. Skupiliśmy się również na kombinacjach wzmacniaczy, aby zidentyfikować miejsca, które współpracują w produkcji estrogenowej odpowiedzi transkrypcyjnej. Odkryliśmy, że nawet 50 miejsc może być potencjalnie atakowanych jednocześnie z wykrywalnymi zmianami ekspresji genów. Korzystając z ChIP-seq i RNA-seq, wykazaliśmy, że Enhancer-i jest wysoce specyficzną techniką do jednoczesnego badania wielu wzmacniaczy.

W tym protokole opisujemy kroki związane z wykonywaniem Enhancer-i, elastycznej techniki, która umożliwia funkcjonalne badanie wielu wzmacniaczy jednocześnie w warunkach hodowli tkankowej. Enhancer-i jest silnie skorelowany z delecją genetyczną, ale zapewnia przejściową dezaktywację, która jest zależna od deacetylaz histonowych (HDAC). Dostarczając przewodnikowe RNA poprzez transfekcję przejściową, w przeciwieństwie do stabilnej integracji za pośrednictwem wektorów wirusowych, protokół ten pozwala uniknąć osadzania się i potencjalnego rozprzestrzeniania się H3K9me3. Protokół ten szczegółowo opisuje projektowanie i klonowanie RNA za pomocą montażu Gibsona, transfekcję przewodnikowych RNA za pomocą lipofekcji oraz analizę wynikowych zmian ekspresji genów za pomocą qPCR. Uwzględniamy również metody oceny swoistości celowania w Enhancer-i na poziomie genomu i transkryptomu. Chociaż technika ta została opracowana do badania regulacji genów przez wzmacniacze związane z ER w ludzkich liniach komórkowych raka, ma ona zastosowanie do sekcji dowolnego wzmacniacza ssaków.

Protokół

1. Generacja linii komórkowych stabilnie wyrażających SID4X-dCas9-KRAB

Uwaga: Przedstawione tutaj warunki transfekcji i stężenia leków zostały zoptymalizowane dla komórek Ishikawy, linii komórkowej raka endometrium, hodowanej na pożywce RPMI 1640 z dodatkiem 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny (pełne RPMI). Inne linie komórkowe mogą wymagać innych warunków transfekcji i stężeń leku. Użytkownicy mogą również przeprowadzać przejściowe eksperymenty transfekcji w komórkach typu dzikiego, zamiast generować stabilną linię komórkową, z plazmidem eksprymującym SID4X-dCas9-KRAB wraz z plazmidami prowadzącymi ekspresję RNA; jednak wyniki transfekcji przejściowych mogą być trudne do odtworzenia, ponieważ poziomy SID4X-dCas9-KRAB mogą się różnić w zależności od transfekcji.

  1. Umieść komórki Ishikawy w co najmniej 2 dołkach 6-dołkowej płytki przy 30 - 50% konfluencji (około 300 000 komórek Ishikawy) w 3 ml pełnego RPMI.
    1. Odessać pożywkę z komórek. Umyj komórki raz 1x PBS (pH 7,4). Odessać PBS i dodać trypsynę (4 ml na 10-centymetrową półkę lub 5 ml na kolbę T-75).
    2. Inkubować komórki przez ~5 minut w temperaturze 37 °C, sprawdzając co 2 minuty, czy nie ma oderwanych komórek i delikatnie wstrząsając naczyniem.
    3. Po odłączeniu komórek kilkakrotnie pipetą trypsynizuj komórki w górę iw dół, a następnie delikatnie pipetuj w dół po boku naczynia, aby uwolnić przyczepione komórki.
    4. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wiruj przez 5 minut w temperaturze 250 x g.
    5. Odessać trypsynę i ponownie zawiesić komórki w 5 - 10 ml pożywki. W razie potrzeby użyj pipety P1000, aby zdysocjować grudki komórek.
    6. Policz komórki i określ objętość potrzebną do płytki ~ 300 000 komórek na studzienkę w całkowitej objętości 3 ml. Dodaj komórki do 2 oddzielnych dołków na 6-dołkowej płytce. Napełnij każdą studzienkę do 3 ml pełnym RPMI.
    7. Delikatnie potrząsaj płytką co 5 minut w ciągu pierwszych 15 minut po posianiu, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone na płytce. Użyj mikroskopu, aby upewnić się, że komórki rozproszyły się od środka studzienki.
  2. W ciągu 24 godzin od posiewu wykonać następujące transfekcje przy użyciu odczynnika do transfekcji odpowiedniego dla danej linii komórkowej. W przypadku komórek Ishikawy należy zastosować procedurę opisaną poniżej.
    Uwaga: W tym protokole zakłada się użycie odczynników do transfekcji na bazie liposomów kationowych. Elektroporacja stanowi alternatywną metodę dla typów komórek, które są bardzo wrażliwe na te odczynniki lub które wykazują niską wydajność transfekcji z lipofekcją. Warunki transfekcji muszą być zoptymalizowane dla interesującej linii komórkowej przed przystąpieniem do eksperymentów z Enhancer-i.
    1. W probówce Eppendorfa o pojemności 1,7 ml rozcieńczyć 2,5 μg plazmidu SID4X-dCas9-KRAB i 800 ng plazmidu wykazującego ekspresję białka fluorescencyjnego w pożywce wolnej od surowicy, tak aby końcowa objętość w probówce wynosiła 155 μl, a końcowe stężenie plazmidu wynosiło 0,020 μg/μl.
    2. W innej probówce rozcieńczyć 3,3 μg plazmidu, który nie zawiera kasety oporności na neomycynę, takiej jak pCMV-GFP, w pożywce wolnej od surowicy, tak aby końcowa objętość w probówce wynosiła 155 μl, a końcowe stężenie plazmidu wynosiło 0,020 μg/μl.
    3. Krótko przekręć każdą rurkę i odwiruj za pomocą mikrofuge.
    4. Dodać 9,9 μl odczynnika do transfekcji (tabela materiałów) do każdej probówki. Mieszaj, krótko wirując z małą prędkością. Zakręć rurki za pomocą mikrofuge.
    5. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 5 minut, ale nie dłużej niż 20 minut.
    6. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodać kroplami 150 μl przygotowanej mieszanki DNA:odczynnik do jednego dołka na płytce 6-dołkowej. Powtórzyć dla drugiej probówki przygotowanej mieszaniny DNA: odczynnik. Wymieszaj płytki, delikatnie obracając, a następnie włóż płytkę z powrotem do inkubatora.
  3. W 2 dniu po transfekcji zmienić pożywkę i uzupełnić G418 do końcowego stężenia 600 ng/μl. Stężenie to może wymagać optymalizacji pod kątem typu ogniwa.
  4. Zmieniaj kompletne pożywki RPMI i uzupełniaj G418 co drugi dzień przez 2 - 4 tygodnie, aż transfekowane komórki kontrolne zginą, a studzienki zawierające SID4X-dCas9-KRAB staną się zlewne. Dokładny czas potrzebny komórkom na regenerację będzie zależał od czasu podwojenia komórek.
  5. Gdy komórki staną się zlewne, przejdź do naczynia T-25 lub T-75 w pełnym RPMI z niższą dawką G418 (300 ng / μL dla komórek Ishikawy). Podczas tego przejścia wykonaj 2 podwielokrotności po ~ 100 000 komórek każda (około 1/10części płytki 6-dołkowej) w 2 oddzielnych probówkach Eppendorfa o pojemności 1,7 ml do izolacji RNA i DNA, odpowiednio. Zakręć te probówki (5 min, 250 x g), usuń trypsynę przez pipetowanie i zamroź probówki w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
  6. Wyizolować genomowe DNA za pomocą dostępnych na rynku zestawów i przeprowadzić PCR przy użyciu starterów "pAC95_PCR" lub "SID4X_PCR" (Tabela 1) w celu sprawdzenia obecności białka fuzyjnego w linii komórkowej. Użyj genomowego DNA wyekstrahowanego z linii rodzicielskiej jako kontroli negatywnej i plazmidowego DNA SID4x-dCas9-KRAB jako kontroli pozytywnej. Stosować wzorcową mieszaninę polimerazy o wysokiej wierności z 50 - 100 ng genomowego DNA i następujące warunki cyklu: 98 °C przez 30 s, 25 cykli (98 °C przez 10 s, 58 °C przez 30 s, 72 °C przez 2 min), 72 °C przez 5 minut, utrzymywać w temperaturze 4 °C.
  7. Aby zweryfikować ekspresję białka fuzyjnego na poziomie RNA, należy przeprowadzić qPCR z RNA wyekstrahowanym z linii komórkowej przy użyciu dostępnych na rynku zestawów. Należy użyć starterów "dCas9_qPCR" (Tabela 1) oraz jednoetapowego protokołu qPCR podanego w kroku 6.3 tego protokołu.
  8. Aby zweryfikować ekspresję fuzji na poziomie białka, wykonaj Western blot na lizatach z linii komórkowej. Użyj przeciwciał anty-FLAG lub anty-HA, aby wykryć białko fuzyjne.

2. Przewodnik po projektowaniu RNA

Uwaga: Ten protokół jest przeznaczony do użycia z wektorem klonowania RNA przewodnika U6 stworzonym przez laboratorium Kościoła i dostępnym na Addgene (Addgene 41824). Aby stworzyć wersję tego wektora zawierającą oporność na puromycynę, która pozwoliła na taką samą strategię klonowania jak 41824, przenieśliśmy miejsce wielokrotnego klonowania z tego wektora do wektora pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycyny (Addgene 51133). Zarówno Addgene 41824, jak i nasza wersja z puromycyną (Addgene 106404) są zgodne ze strategią klonowania opisaną poniżej.

  1. Uzyskaj 600 - 900 par zasad sekwencji DNA dla każdego regionu regulatorowego będącego przedmiotem zainteresowania. Skorzystaj z miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego i/lub dostępności chromatyny, aby uzyskać wskazówki, gdzie zdefiniować obszar zainteresowania (Rysunek 2A).
    Uwaga: Podczas gdy przykład w Rysunek 2A zawiera wzmacniacze upstream i downstream, możliwe jest również celowanie w elementy regulatorowe znajdujące się w intronach.
  2. Umieść wszystkie uzyskane sekwencje w jednym pliku tekstowym przy użyciu formatu FASTA.
  3. Zidentyfikuj co najmniej jeden region kontroli ujemnej, który nie powinien ulec zmianie w warunkach eksperymentalnych, taki jak promotor genu, który nie ulega ekspresji w linii komórkowej będącej przedmiotem zainteresowania. Uzyskaj sekwencję DNA dla tego regionu i dodaj ją do pliku tekstowego w formacie FASTA.
    Uwaga: Używamy przewodnikowych RNA ukierunkowanych na IL1RN promotor25 jako kontroli negatywnej dla wszystkich regionów, na które kierujemy naszą uwagę. Użytkownicy mogą również wybrać sekwencję międzygenową w pobliżu obszaru zainteresowania, który nie zawiera miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego jako kontroli negatywnej. Jeśli jednak jednocześnie atakowanych jest wiele loci, pojedynczy region kontroli ujemnej upraszcza projektowanie eksperymentalne i interpretację wyników. Jeśli docelowy wzmacniacz jest introniczny, przydatne może być celowanie w region intronowy w tym samym locus, który nie zawiera przypuszczalnego elementu regulatorowego, jako dodatkowa kontrola negatywna, ponieważ fuzja dCas9 może zakłócać transkrypcję.
  4. Zidentyfikuj regiony kontroli pozytywnej, takie jak promotory, które są przypuszczalnymi celami regionów regulacyjnych zainteresowania lub promotory genów, które są wysoce transkrybowane w linii komórkowej będącej przedmiotem zainteresowania. Uzyskaj sekwencję DNA dla tych regionów i dodaj ją do pliku tekstowego w formacie FASTA.
  5. Użyj programu takiego jak e-crisp26 (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/) na wygenerowanych sekwencjach DNA, aby znaleźć przewodnikowe RNA o niskich odchyleniach od celów (najlepiej 0-3). Przewodnikowe RNA składają się z 20 nukleotydów znajdujących się przed sąsiednim motywem protospacerowym (PAM), który przyjmuje postać "NGG" dla dCas9 z S. pyogenes.
    1. Na stronie e-crisp wybierz interesujący Cię organizm za pomocą rozwijanego menu. Zespół genomu pojawia się po prawej stronie nazwy gatunku.
    2. Wybierz przycisk radiowy Wejście to sekwencja FASTA. Skopiuj sekwencje FASTA z góry i wklej je do okna dialogowego. Upewnij się, że nagłówek FASTA jest dołączony do każdej sekwencji.
      Uwaga: Jednocześnie można odpytywać do 50 sekwencji.
    3. Wybierz przycisk radiowy Średni i Pojedynczy projekt z menu rozwijanego.
    4. Kliknij przycisk Rozpocznij wyszukiwanie sgRNA. Otworzy się nowa karta przeglądarki i zostaną wyświetlone wyniki. Pobierz proponowane sekwencje, klikając przycisk Pobierz raport tabelaryczny w formacie programu Excel dla wszystkich sekwencji zapytań razem.
    5. Otwórz raport tabelaryczny przy użyciu programu Excel lub programu do edycji tekstu.
  6. Użyj przeglądarki genomu UCSC, aby BLAT kandydatów na pełnowymiarowe sekwencje gRNA (23 pary zasad) do genomu.
    1. W przeglądarce przejdź do witryny internetowej przeglądarki genomu UCSC (http://genome.ucsc.edu). W sekcji Nasze narzędzia znajdź słowo BLAT i kliknij na nie. Otworzy się narzędzie wyszukiwania BLAT.
    2. Użyj menu rozwijanych znajdujących się pod tekstem BLAT Search Genome, aby wybrać interesujący Cię organizm i zespół genomu.
    3. Skopiuj przewodnikowe sekwencje RNA z raportu tabelarycznego wygenerowanego przez e-crisp i wklej je do okna dialogowego. Upewnij się, że każda sekwencja ma unikatowy nagłówek FAPSA, a następnie kliknij przycisk Prześlij u dołu okna dialogowego.
      Uwaga: Jednocześnie można zbadać do 25 sekwencji. Na stronie wyników wyszukiwania BLAT pojawią się wyrównania każdej przewodnikowej sekwencji RNA, przy czym każda linia reprezentuje wyrównanie. Idealnie byłoby, gdyby dla każdego przewodnika RNA istniało jedno wyrównanie, wskazujące na unikalność tego przewodnika RNA.
    4. Jeśli to możliwe, unikaj przewodników, które są wyrównane do wielu lokalizacji w genomie.
    5. Aby sprawdzić lokalizację i dystrybucję przewodnika RNA w regionie zainteresowania, kliknij łącze Przeglądarka w sekcji DZIAŁANIA dla jednego z poszukiwanych przewodników RNA. Pojawi się przeglądarka genomu, która zostanie wyśrodkowana na wybranym przewodniku RNA. Użyj przycisków Pomniejsz u góry strony, aby zwizualizować rozkład innych przewodnikowych RNA zidentyfikowanych przez e-crisp w obszarze zainteresowania.
  7. Wybierz 4 najlepiej nienakładające się na siebie sekwencje przewodnikowego RNA, które są rozmieszczone w całym obszarze zainteresowania (Rysunek 2B). Jeśli obszar zainteresowania przekracza 600 pz, rozważ dodanie 1-2 dodatkowych prowadnic. Należy unikać przewodników RNA o rozciągnięciu homopolimerowym i ekstremalnej zawartości GC, ponieważ te cechy mogą utrudniać proces klonowania przewodnika RNA i zmniejszać skuteczność celowania w przewodnikowe RNA.
  8. Po wybraniu przewodników utwórz plik zawierający pełną sekwencję przewodnika RNA (23 nukleotydy) dla każdego żądanego przewodnika, a następnie usuń nukleotyd 5' oraz PAM (NGG) z końca 3'. Ten krok ułatwia zamawianie oligo.
  9. Dodaj następującą sekwencję do końca 5' sekwencji oligonukleotydowej: GTGGAAAGGACGAAACACCG.
  10. Dodaj następującą sekwencję do końca 3' sekwencji oligonukleotydowej: GTTTTAGAGCTAGAAATAGC.
    Uwaga: Ostateczna sekwencja powinna mieć długość 59 nukleotydów i wyglądać następująco: GTGGAAAGGACGAAACACCG-target (19 nt)-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC.
  11. Upewnij się, że każdy element regulatorowy, który ma być ukierunkowany za pomocą Enhancer-i, ma co najmniej 4 unikalne oligonukleotydy przeznaczone do niego. Sekwencje te należy uporządkować razem ze starterami "U6_internal" wymienionymi w Tabeli 1.

3. Przewodnik po klonowaniu RNA

Uwaga: Klonowanie RNA za pomocą zespołu Gibsona okazało się bardzo skuteczne w naszych rękach, dając setki kolonii na płytkę, przy czym niewiele jeśli w ogóle kolonie są obecne tylko w kontroli wektora. Taka wydajność ma kluczowe znaczenie dla utrzymania złożoności podczas klonowania zbiorczego. Kolejną zaletą klonowania zespołów Gibsona jest to, że użytkownicy nie muszą się martwić o obecność miejsca cięcia enzymu restrykcyjnego w przewodniku RNA, który próbują wprowadzić do wektora klonowania U6. Niemniej jednak, w razie potrzeby, protokół ten można dostosować do tradycyjnego klonowania opartego na enzymach restrykcyjnych.

  1. Rozpuść oligonukleotydy przewodnika RNA w końcowym stężeniu 100 μM w wodzie ultraczystej (bez RNaz, bez DNaz). Dla każdego regionu zainteresowania powinny znajdować się co najmniej 4 oddzielne oligonukleotydy przewodnika RNA.
  2. Dla każdego regulacyjnego regionu zainteresowania utwórz pulę wszystkich oligonukleotydów odpowiadających regionowi zainteresowania. W probówce Eppendorfa połącz 5 μl każdego odtworzonego oligo przewodnika RNA dla każdego regionu. Dobrze wymieszaj basen przez wirowanie, a następnie usuń 1 μl i rozcieńcz tę porcję 1:200 w ultraczystej wodzie.
    Uwaga: W razie potrzeby te pule przeznaczone dla poszczególnych regionów regulacyjnych można dodatkowo połączyć w celu wygenerowania złożonej puli przeznaczonej dla wielu regionów. Do 50 regionów regulacyjnych może być jednocześnie docelowych w jednej puli (Rysunek 3C).
  3. Wykonaj krótki PCR ze starterami U6, aby przyłączyć regiony homologii do oligonukleotydów przed montażem Gibsona. Do każdego oligonukleotydu zostanie dodanych około 40 zasad, co da iloczyn ~100 pz, który zawiera wystarczającą homologię do wektora U6 na obu końcach.
    1. Dla każdej puli przewodnikowego RNA należy przeprowadzić PCR o objętości 20 μl z główną mieszanką polimerazy o wysokiej wierności i następującymi składnikami: 1 μl rozcieńczonej puli oligonucyklocytów z kroku 3.2, 1 μl startera U6 (10 μM), 1 μl startera odwrotnego U6 (10 μM) i wodą do 20 μL.
    2. Inkubować w termocyklerze w następujących warunkach: 98 °C przez 30 s, 10 cykli (98 °C przez 10 s, 55 °C przez 30 s, 72 °C przez 2 min), 72 °C przez 5 min i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
    3. Przeprowadź 5 μl reakcji na 1 - 2% żelu agarozowym z drabinką o niskiej masie cząsteczkowej. Produktem końcowym powinno być ~100 par zasad (Rysunek 2C).
    4. Oczyść reakcję przedłużania za pomocą zestawu do oczyszczania DNA opartego na kolumnie i eluuj w 20 μl buforu elucyjnego dostarczonego w zestawie.
      Uwaga: Ponieważ produkt jest krótki, unikaj stosowania środków czyszczących na bazie kulek, które mają na celu wykluczenie małych fragmentów mniejszych niż 100 pz.
    5. Oznacz ilościowo oczyszczone DNA za pomocą fluorometru lub spektrofotometru (oczekiwana wydajność wynosi 10-20 ng/μl). Inserty prowadzącego RNA mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C lub mogą być natychmiast używane w montażu Gibsona z linearyzowanym wektorem U6.
  4. Aby przygotować wektor klonowania odbiorcy U6 do montażu Gibsona, skonfiguruj trawienie enzymu restrykcyjnego. Jeśli ma być przeprowadzonych wiele reakcji montażu Gibsona, należy ustawić wiele skrótów, aby zapewnić wystarczającą wydajność wektora cięcia.
    1. Użyć 20 jednostek enzymu AflII i 1 μg plazmidu w reakcji 20 μl z odpowiednim buforem enzymu restrykcyjnego. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny.
    2. Oczyścić trawienie za pomocą kulek lub zestawu kolumnowego do oczyszczania DNA i eluować w 20 μl buforu elucyjnego. Określić ilościowo oczyszczone DNA za pomocą fluorometru lub spektrofotometru. Próbki można zamrozić w temperaturze -20 °C w celu późniejszego wykorzystania.
  5. Wykonaj montaż Gibsona na przygotowanym wektorze i wstaw.
    1. Ustaw reakcje montażowe Gibsona na lodzie. Użyć 50 ng wektora i 7 ng wstawki w reakcji 20 μl. Rozcieńczyć wkładki w stosunku 1:10 w ultraczystej wodzie, aby ułatwić pipetowanie. Ustaw reakcję montażu Gibsona tylko wektorową, używając 50 ng wektora i zastępując wkładkę wodą.
    2. Inkubować reakcje montażu Gibsona przez 15 minut w temperaturze 50 °C, a następnie podtrzymać w temperaturze 4 °C.
    3. Przenieś zmontowane produkty na lód. Rozcieńczyć zmontowane produkty w stosunku 1:4 w ultraczystej wodzie na lodzie. Na przykład dodaj 5 μl produktu montażowego Gibson do 15 μl ultraczystej wody.
  6. Przekształć rozcieńczone produkty montażowe Gibsona.
    1. Rozmrozić kompetentne komórki o wysokiej wydajności na lodzie i wykonać 25 μl porcji na każdą przemianę. Jeśli pożądana jest złożona pula ukierunkowana na wiele miejsc, rozmrozić wystarczającą liczbę komórek w różnych probówkach, aby wykonać wiele niezależnych transformacji tej samej złożonej puli gRNA.
    2. Do każdego rozcieńczonego produktu dodać 1 μl tego rozcieńczenia do 1,7 ml probówki Eppendorfa zawierającej 25 μl kompetentnych komórek. Wymieszaj, krótko przesuwając rurkę. Inkubować probówki na lodzie przez 30 minut.
    3. Szok termiczny ogniw przez 30 s w temperaturze 42 °C, a następnie natychmiast przenieść do lodu na 2 minuty.
    4. Dodać 300 μl pożywki SOC (2% tryptonu, 0,5% ekstraktu drożdżowego, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mMMgSO4 i 20 mM glukozy) i pozostawić komórki na regenerację przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem (300 obr./min). W tym czasie ogrzać płytki agarowe ampicyliną/karbenicyliną do temperatury 37 °C w inkubatorze. Użyj jednej płytki do każdej transformacji.
    5. Umieścić na płytce 50 μl komórek i umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C na noc. W przypadku basenów przeznaczonych do poszczególnych miejsc, umieścić bezpośrednio w 3 - 5 ml bulionu LB (tabela materiałów) zawierającego ampicylinę/karbenicylinę (1 mg/ml) i inkubować przez noc z wytrząsaniem przy 250 obr./min w temperaturze 37 °C dla miniprepów.
  7. Zbierz komórki i wyizoluj DNA.
    1. W przypadku dużych bibliotek przewodnikowych RNA przeznaczonych do wielu miejsc, użyj skrobaka do płytek, aby zebrać wszystkie kolonie z każdej pojedynczej płytki do jednego maxiprepu (150 ml płynnej kultury). Można to ułatwić, wlewając ~5 ml LB z odpowiednim antybiotykiem do probówki sokoła o pojemności 50 ml i zeskrobując kolonie do probówki. W przypadku bibliotek przeznaczonych dla poszczególnych witryn, zeskrob płytki do minipreparatu (3 - 5 ml płynnej kultury).
    2. Inkubować te kultury z odpowiednim antybiotykiem przez 3 - 5 godzin w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 250 obr./min.
    3. Wykonaj ekstrakcję DNA za pomocą zestawu, który powoduje przygotowanie wolne od endotoksyn.
    4. Określić ilościowo DNA za pomocą fluorometru lub spektrofotometru. Plazmidy mogą być używane natychmiast podczas transfekcji lub przechowywane w temperaturze -20 °C do wykorzystania w przyszłości.
  8. Aby potwierdzić obecność sekwencji przewodnika RNA w wektorze U6 dla małych pul ukierunkowanych na pojedyncze miejsca, należy zastosować sekwencjonowanie Sangera na przygotowanym minipreparze ze starterem "U6_PCR_R" wymienionym w tabeli 1. Ze względu na łączenie przewodnikowych RNA, docelowa sekwencja gRNA z 19 parami zasad da mieszane zasady, ale rusztowanie promotora U6 i przewodnika RNA otaczające tę sekwencję powinno pozostać nienaruszone.

4. Transfekcja Enhancer-i

Uwaga: Dla skutecznego zablokowania odpowiedzi estrogenowej za pomocą Enhancer-i w komórkach Ishikawy, konieczne jest pozbawienie komórek estrogenu przez 5 - 7 dni przed transfekcją poprzez utrzymywanie ich w RPMI wolnym od czerwieni fenolowej z 10% FBS pozbawionym węgla drzewnego i 1% penicyliny/streptomycyny. Komórki powinny być hodowane w tym pożywce podczas i po transfekcji, jeśli próbuje się zablokować odpowiedź estrogenową. Zalecamy stosowanie trypsyny wolnej od czerwieni fenolowej do przechodzenia komórek w pełnym RPMI wolnym od czerwieni fenolowej.

  1. Dzień przed transfekcją umieść komórki (typu dzikiego lub stabilnie eksprymującego SID4X-dCas9-KRAB) na 24-dołkowej płytce przy konfluencji 30 - 50% (~ 60 000 komórek na dołek dla komórek Ishikawy). Płytkować wystarczającą liczbę komórek tak, aby transfekcje można było wykonywać w dwóch egzemplarzach, i zawierać studzienki do transfekcji za pomocą kontrolnych przewodnikowych RNA. Upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone w studzience, delikatnie potrząsając płytką po posiewie komórek, jak w kroku 1.1.7.
    Uwaga: W tym protokole zakłada się użycie odczynników do transfekcji na bazie liposomów kationowych. Elektroporacja stanowi alternatywną metodę dla typów komórek, które są bardzo wrażliwe na te odczynniki. Warunki transfekcji muszą być zoptymalizowane dla interesującej linii komórkowej przed przystąpieniem do eksperymentów z Enhancer-i.
  2. Następnego dnia przygotuj transfekcję zgodnie z instrukcją wybranego odczynnika do transfekcji. W przypadku komórek Ishikawy użyj 550 ng całkowitego plazmidu na każdą studzienkę 24-dołkowej płytki. Rozcieńczyć plazmidy do końcowego stężenia 0,020 μg/μl w pożywce bez surowicy (1,1 μg DNA w 52 μl całkowitej objętości do transfekcji 2 dołków). Użyć 3 μl odczynnika do transfekcji na każdy 1 μg DNA, odwirować i inkubować zgodnie z opisem w kroku 1.2. Dodać 25 μl końcowej mieszaniny do każdego dołka.
    Uwaga: Aby celować w kombinacje miejsc, użyj tej samej masy plazmidu dla każdego pojedynczego miejsca, a następnie wypełnij pozostałą masę plazmidem kontrolnym (pusty wektor klonowania prowadzącego RNA lub przewodnik RNA ukierunkowany na region kontroli negatywnej, taki jak promotor IL1RN). W przypadku transfekcji przejściowych należy użyć stosunku 3:2 plazmidu Cas9 fusion:guide RNA. Plazmidy zawierające reportery fluorescencyjne mogą być dodawane w celu monitorowania wydajności transfekcji.
  3. Po 36 godzinach od transfekcji zmień pożywkę za pomocą czerwieni fenolowej RPMI z 10% FBS pozbawionym węgla drzewnego i 1% penicyliny/streptomycyny (dla komórek Ishikawy) i dostarcz puromycynę (końcowe stężenie: 1 μg/ml) i neomycynę (końcowe stężenie: 300 ng/ml). Jeśli komórki są wrażliwe na odczynnik do transfekcji, pożywkę można zmienić wcześniej, ale antybiotyki należy dodać nie wcześniej niż 24 godziny po transfekcji.
    Uwaga: Odczekaj co najmniej 24 godziny po dodaniu antybiotyku przed pobraniem komórek. Zmiany ekspresji spowodowane Enhancer-i można wykryć już po 48 godzinach od transfekcji i do 5 dni po transfekcji. Jeśli pracujesz z komórkami Ishikawy, które zostały pozbawione estrogenu, wykonaj 8-godzinną indukcję 10 nM 17β-estradiolu (E2) następnego dnia po antybiotykoterapii, a następnie natychmiast zbierz komórki.

5. Pobieranie komórek i ekstrakcja RNA

  1. Przygotować bufor do lizy z 1% β-merkaptoetanolem (BME). Upewnij się, że jest wystarczająca ilość mieszaniny lizy i BME (300 μl na każdy zbierany studzienek).
  2. Zassać pożywkę za pomocą aspiratora próżniowego.
  3. Umyj komórki raz równą objętością 1x PBS (500 μL) i odessać, aby usunąć jak najwięcej PBS.
  4. Dodaj 300 μl roztworu lysis-BME do każdego dołka za pomocą pipety wielokanałowej. Pipetować roztwór do lizy w górę i w dół 8 - 10 razy i przenieść do płytki głęboko dołeżkowej lub probówek Eppendorfa o pojemności 1,7 ml na lodzie. RNA można wyekstrahować natychmiast lub zamrozić lizaty w temperaturze -80 °C w celu przyszłego przetworzenia.
  5. Aby wyekstrahować RNA z lizatów, użyj dostępnego na rynku zestawu, który zawiera leczenie DNazą. Eluować w najmniejszej zalecanej objętości wody ultraczystej (bez RNaz, bez DNaz) lub buforu elucyjnego i określić ilościowo RNA. W przypadku małej liczby próbek należy użyć fluorometru lub spektrofotometru. W przypadku dużej liczby próbek należy użyć sondy fluorescencyjnej, która wykrywa RNA i mierzy na czytniku płytkowym. Próbki można zamrażać w temperaturze -80 °C przed lub po oznaczaniu ilościowym.

6. Kwantyfikacja zmian ekspresji genów za pomocą jednoetapowego qPCR i sekwencjonowania RNA

  1. Uzyskać startery qPCR dla genów będących przedmiotem zainteresowania i dla co najmniej jednego genu porządkowego, który ulega ekspresji bliskiej poziomowi docelowych genów i nie zmienia się w warunkach eksperymentalnych. Idealnie byłoby, gdyby te startery obejmowały połączenie ekson-ekson, aby uniknąć amplifikacji genomowego DNA.
    1. Przetestuj te startery na RNA uzyskanym z interesującej nas linii komórkowej. Użyj analizy krzywej topnienia, aby zweryfikować produkcję pojedynczego produktu. Jeśli pojedynczy produkt nie jest produkowany, należy przetestować dodatkowe pary starterów.
  2. Dla każdej próbki poddanej działaniu Enhancer-i i przewodnika kontrolnego RNA określ, ile genów należy oznaczyć w tej próbce. Ten zestaw genów powinien obejmować geny porządkowe, takie jak CTCF lub GAPDH.
  3. Skonfiguruj reakcje qPCR.
    1. Rozcieńczyć wszystkie próbki do tego samego stężenia w wodzie, tak aby 50 ng całkowitego RNA można było łatwo odpipetować i uzyskać wystarczającą ilość rozcieńczonego RNA dla każdej reakcji. Na przykład rozcieńczyć RNA do ~16,6 ng/μL i użyć 3 μL RNA w każdej reakcji. Utrzymuj RNA na lodzie podczas ustawiania mieszanek głównych.
    2. Przygotuj oddzielne mieszanki wzorcowe dla każdego genu, który ma być mierzony, przy użyciu dostępnych na rynku jednoetapowych zestawów qPCR. Użyć 20 μl objętości reakcyjnej z 1 μl każdego startera (10 μM roztworu podstawowego). Ustaw te reakcje na lodzie.
    3. Na płytce reakcyjnej, która jest odpowiednia dla termocyklera, dodać próbki RNA, a następnie mieszanki główne. Uszczelnić za pomocą zgrzewarki do płytek i delikatnie wymieszać, wirując lub pipetując. Krótko odwirować płytkę (140 x g przez 60 s), aby upewnić się, że płyn znajduje się na dnie studzienek.
    4. Inkubować płytkę w termocyklerze w następujący sposób (lub zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu): 48 °C przez 30 minut, 95 °C przez 10 minut, 40 cykli (95 °C przez 15 s, 60 °C przez 1 min).
  4. Uzyskaj wartości Ct dla każdego genu mierzonego w każdej próbce. Użyj porównawczej metody Ct, aby zidentyfikować zmiany w ekspresji genów.
    1. Odejmij Ct genu porządkowania od Ct każdego genu będącego przedmiotem zainteresowania dla każdej próbki, aby wygenerować znormalizowane wartości Ct.
    2. Dla próbek kontrolnych poddanych działaniu substancji należy wziąć średnią ze znormalizowanych wartości Ct dla każdego genu. Tłumienie fałdowania w 2 skali o podstawie logarytmu można następnie obliczyć, odejmując znormalizowaną próbkę traktowaną Enhancer-i Ct dla każdego genu od tej samej wartości dla próbki kontrolnej traktowanej dla odpowiedniego genu.
  5. Aby określić globalne zmiany w ekspresji genów po leczeniu Enhancer-i, należy przygotować próbki do sekwencjonowania RNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu kompatybilnego z technologią sekwencjonowania użytkownika. Użyj ~500 ng RNA jako materiału wyjściowego i przygotuj biblioteki dla co najmniej 2 powtórzeń biologicznych.

7. Weryfikacja specyficznego celowania genomowego przez SID4X-dCas9-KRAB przy użyciu ChIP-seq

Uwaga: Białko fuzyjne SID4X-dCas9-KRAB zawiera zarówno znacznik epitopu FLAG, jak i znacznik epitopu HA, ale najlepsze wyniki dla ChIP-seq uzyskano z przeciwciałami anty-FLAG. W razie potrzeby użytkownik może wykonać dodatkowe eksperymenty ChIP-seq dla czynników transkrypcyjnych, na które potencjalnie wpływa Enhancer-i, lub dla H3K27ac, znaku aktywności wzmacniacza, który jest zmniejszony przez Enhancer-i. Jednak każdy eksperyment ChIP-seq wymaga 10 x 106 komórek, więc zaplanuj odpowiednio.

  1. Komórki transfekcyjne z pulami Enhancer-i.
    1. Płytka 10 x 106 komórek w 15 cm naczyniu do hodowli tkankowych. Każde danie reprezentuje 1 eksperyment ChIP-seq dla 1 czynnika zainteresowania.
    2. Następnego dnia należy przeprowadzić transfekcję komórek, używając 20 μg całkowitego DNA na naczynie. W przypadku transfekcji w liniach komórkowych ze stabilną ekspresją SID4X-dCas9-KRAB, DNA powinno być pulą plazmidową przewodników RNA ukierunkowanych na wszystkie interesujące miejsca i opcjonalnie plazmidem eksprymującym białko fluorescencyjne. W przypadku transfekcji przejściowych należy użyć stosunku 3:2 białka fuzyjnego dCas9 do puli RNA przewodnika. W przypadku sekwencji ChIP innych TF lub modyfikacji histonów, należy wykonać co najmniej jedną dodatkową transfekcję RNA przewodnika kontrolnego na innej szalce.  
    3. Potraktuj naczynia puromycyną (1 μg/ml) i neomycyną (300 ng/ml) po 24 - 48 godzinach od transfekcji. Odczekaj co najmniej 24 godziny przed pobraniem chromatyny.
  2. Zbierz chromatynę z naczyń.
    Uwaga: Aby zbadać wpływ Enhancer-i na wiązanie genomowe ER w komórkach Ishikawy, przed zbiorem należy wykonać zabieg 1 h 10 nM E2 na naczyniach transfekowanych kontrolnymi przewodnikiem RNA i Enhancer-i. Aby zbadać wpływ Enhancer-i na H3K27ac, przed zbiorem należy przeprowadzić 8-godzinną indukcję E2 10 nM na naczyniach transfekowanych kontrolnymi RNA i Enhancer-i.
    1. Nałóż 500 μl 37% formaldehydu na każde naczynie (końcowe stężenie 1%). Krótko zakręć talerzami. Pozostaw talerze w temperaturze pokojowej na 10 minut.
    2. Dodać 1 ml 2,5 M glicyny (końcowe stężenie 125 mM). Krótko zakręć talerzami.
    3. Odlej podłoże z formaldehydem i glicyną. Dodaj równą objętość (~20 ml) zimnego 1x PBS.
    4. Odlej PBS. Zassać za pomocą aspiratora próżniowego, aby usunąć jak najwięcej PBS. Ułóż naczynia na lodzie.
    5. Dodaj 3 - 5 ml zimnego 1x PBS lub buforu do lizy Farnham (5mM PIPES pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40) z 1x inhibitorem proteazy (dodanym tuż przed użyciem) do każdej płytki. Zeskrobać naczynie za pomocą skrobaka do płytek i przenieść roztwór do stożkowej probówki o pojemności 15 ml na lodzie.
    6. Chromatynę osadzać przez obracanie probówek w wirówce przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 1000 x g. Odrzucić supernatant i przechowywać granulki w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości lub postępować zgodnie z wybranym protokołem ChIP-seq przy użyciu przeciwciała lub przeciwciał anty-FLAG skierowanych przeciwko innym czynnikom transkrypcyjnym lub modyfikacjom histonów będącym przedmiotem zainteresowania (H3K27ac, H3K9me3).

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia schemat przepływu pracy opisany w protokole. Aby określić wkład enhancerów związanych z ER w pobliżu regulowanego przez estrogeny genu MMP17, który posiada 3 pobliskie miejsca wiązania zdefiniowane za pomocą ChIP-seq (Rysunek 2A), zaprojektowano gRNA dla każdego z tych regionów. W celu zaprojektowania gRNA wybrano okno sekwencji o długości 600 - 900 bp otaczające każde interesujące miejsce wiązania ER i wprowadzono je do programu do projektowania gRNA. Wynikowe sekwencje gRNA z 0-2 przewidywanymi miejscami off-target zostały dopasowane do ludzkiego genomu przy użyciu BLAT. Do targetowania wybrano cztery niezachodzące na siebie gRNA, które obejmowały region zdefiniowany przez ChIP-seq i nadwrażliwość na DNaseI (Rysunek 2B). Na każdym końcu dodano dodatkową sekwencję (Tabela 1), aby ułatwić późniejszy klonowanie, a następnie zamówiono otrzymane fragmenty o długości 59 nukleotydów. Po otrzymaniu gRNA zostały rozcieńczone i połączone w pule według miejsc, a następnie przeprowadzono krótką reakcję PCR w celu dodania regionów homologii przed montażem Gibsona. Rysunek 2C pokazuje oczekiwany produkt gRNA po krótkiej reakcji PCR z użyciem starterów „U6_internal” (Tabela 1), co dodaje 20 par zasad sekwencji na każdym końcu 59-pzp fragmentu gRNA, dając w efekcie sekwencję o długości ~100 pzp. Po montażu Gibsona pule gRNA przetransformowano do bakterii, a następnego dnia przygotowano miniprepy plazmidów. Rysunek 2D przedstawia wyniki eksperymentu z analizy enhancerów, w którym wiele enhancerów w pobliżu MMP17 jest targetowanych pojedynczo oraz w kombinacjach przy użyciu Enhancer-i. Miejsca targetowane przez Enhancer-i są oznaczone czarnym sześciokątem. Plazmidy gRNA targetujące wskazane miejsca przetransformowano do linii komórkowej Ishikawa pozbawionej estrogenów, stabilnie wykazującej ekspresję SID4X-dCas9-KRAB. Dwa dni później zmieniono medium i dodano puromycynę, aby wzbogacić populację o komórki przetransformowane. Następnego dnia komórki zebrano po 8 h traktowaniu 10 nM estradiolu. Izolowano RNA i przeprowadzono jednokrokowy qPCR. W tym przykładzie miejsca 1 i 2 są niezbędne do pełnej odpowiedzi estrogenowej MMP17, podczas gdy miejsce 3 nie wykazuje wkładu w tych warunkach (Rysunek 2D, ścieżki ii-iv). Gdy aktywne są tylko miejsca 2 lub 3 (vi i vii), odpowiedź na estrogen jest podobna do sytuacji, gdy żadne miejsca nie są aktywne (viii), co sugeruje, że miejsca te nie mogą przyczyniać się do ekspresji niezależnie. Miejsce 1 może samoistnie przyczyniać się do pewnego poziomu ekspresji (v), ale największą aktywność obserwuje się, gdy aktywne są miejsca 1 i 2 (iv).

Aby jednocześnie manipulować 10 enhancerami w pobliżu 4 różnych genów (Ryc. 3A), utworzono złożone pule gRNA zawierające 42 przewodniki dla enhancerów i 16 przewodników dla promotorów. Oligonukleotydy gRNA połączono w pule przed wstępną reakcją PCR w celu wydłużenia gRNA (Krok 3.3), a otrzymane produkty PCR oczyszczono i połączono z pustym wektorem klonującym puromycyny U6 za pomocą metody Gibson assembly. Po przeprowadzeniu Gibson assembly wykonano i wysiano wiele niezależnych transformacji. Płytki zeskrobano do medium LB i inkubowano przez 2 - 4 h przed przeprowadzeniem maxiprepu. Ryc. 3B przedstawia reprezentatywne spadki ekspresji genów określone za pomocą qPCR, gdy pule gRNA przetransfekowano do linii komórkowej Ishikawa pozbawionej estrogenu, stabilnie wykazującej ekspresję SID4X-dCas9-KRAB i traktowanej zgodnie z powyższym opisem (Ryc. 2D). Spadki wywołane przez Enhancer-i są podobne do tych uzyskanych poprzez celowanie w promotor domniemanego genu docelowego. Ryc. 3C pokazuje wpływ rozcieńczenia gRNA na redukcję odpowiedzi na estrogen z wykorzystaniem Enhancer-i. Rozcieńczenie 1:50 puli gRNA celującej w enhancer w pobliżu G0S2 nadal prowadzi do istotnej redukcji ekspresji genu, co sugeruje, że Enhancer-i może być stosowany do jednoczesnego celowania w maksymalnie 50 miejsc. Jednakże efekt dezaktywacji może zostać zniesiony przez rozcieńczenie, co wskazuje, że nie można jednocześnie celować w setki miejsc, chyba że zastosuje się bardziej czułe metody detekcji.

figure-results-1
Rycina 1. Schemat protokołu dla multipleksowej analizy enhancerów przy użyciu Enhancer-i. Przewodniki RNA (czerwone i niebieskie) są projektowane za pomocą narzędzia e-crisp i wybierane z wykorzystaniem przeglądarki genomu UCSC. Wybierane są cztery gRNA obejmujące regiony zainteresowania (miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych zdefiniowane przez ChIP-seq). Oligonukleotydy gRNA, zgrupowane według regionu zainteresowania (czerwone i niebieskie), są poddawane reakcji PCR w celu dodania regionów homologii (pomarańczowe) przed montażem Gibsona i transformacją. Powstałe pule plazmidów są transfekowane metodą lipofekcji do linii komórkowych stabilnie ekspresujących SID4X-dCas9-KRAB lub do komórek typu dzikiego wraz z plazmidem SID4X-dCas9-KRAB. Pule plazmidów gRNA mogą być transfekowane pojedynczo w celu celowania w jedno miejsce na raz lub w kombinacjach w celu jednoczesnego celowania w wiele miejsc. Transfekowane komórki są traktowane antybiotykami w celu wzbogacenia populacji komórek zawierających gRNA. Około 72 h po transfekcji komórki są zbierane. Kwasy nukleinowe mogą być ekstrahowane do analiz qPCR, RNA-seq lub ChIP-seq. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rycina 2. Projektowanie gRNA i analiza sekwencji enhancerów dla MMP17. (A) Zrzut ekranu z przeglądarki genomu przedstawiający enhancery związane z ER alfa (szare), które mają być celem w pobliżu MMP17. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Carleton et al.18. (B) Projekty gRNA dla 3 miejsc wiązania18. Celem jest miejsce wiązania ER zdefiniowane za pomocą ChIP-seq, a 4 gRNA pokrywają ten region. Sygnał wrażliwości na DNaseI, który obejmuje miejsce wiązania, może również służyć do zdefiniowania sekwencji docelowej dla projektu gRNA. Dane ChIP-seq i DNaseI HS uzyskano z komórek Ishikawa traktowanych 10 nM estradiolu przez 1 h. (C) Reprezentatywne sekwencje gRNA gotowe do montażu metodą Gibsona, po krótkiej reakcji PCR w celu dodania regionów homologii. (D) Względna ekspresja MMP17 zmierzona za pomocą qPCR po targetowaniu konkretnych regionów za pomocą Enhancer-i i 8-godzinnej inkubacji z 10 nM estradiolu. Ekspresja jest wyrażona względem CTCF oraz poziomu ekspresji MMP17 w komórkach nietraktowanych estradiolem. Kontrolne gRNA targetują promotor IL1RN. Wszystkie słupki błędów reprezentują SEM, podwójne gwiazdki oznaczają p <0.01, a pojedyncze gwiazdki oznaczają p <0.05 w sparowanym teście t. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Carleton et al.18. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3. Jednoczesne celowanie w wiele enhancerów w pobliżu różnych genów za pomocą puli Enhancer-i. (A) Schemat miejsc wiązania i promotorów będących celem w puli Enhancer-i. (B) Wpływ na ekspresję mierzony za pomocą qPCR po traktowaniu E2 komórek Ishikawa transfekowanych pulą plazmidów Enhancer-i (zielony), pulą plazmidów Promoter-i (niebieski) lub kontrolnymi gRNA (biały)18. W przypadku Enhancer-i obserwuje się znaczną redukcję we wszystkich genach. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Carleton et al.18. (C) Wpływ na poziomy ekspresji G0S2 po traktowaniu E2 komórek Ishikawa transfekowanych różnymi ilościami guide RNA celujących w G0S2. Znaczną redukcję można zaobserwować nawet przy niewielkich ilościach guide RNA (rozcieńczenie 1:50), co sugeruje, że jednocześnie można celować w maksymalnie 50 miejsc. Wszystkie słupki błędu reprezentują SEM, podwójne gwiazdki oznaczają p <0,01, a pojedyncze gwiazdki oznaczają p <0,05 w sparowanym teście t. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

NazwaSekwencja
U6_internal_FTTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG
U6_internal_R GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC
U6_PCR_FCCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTA
U6_PCR_RAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA
gRNA_qPCR_FGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG
gRNA_qPCR_RAAAAAGCACCGACTCGGTGCC
dCas9_qPCR_FGTGACCGAGGGAATGAGAAA
dCas9_qPCR_RAGCTGCTTCACGGTCACTTT
pAC95_PCR_FAGAAGAGAAAGGTGGAGGCC
pAC95_PCR_RCGTCACCGCATGTTAGAAGG
SID4X_PCR_FCAATAGAAACTGGGCTTGTCG
SID4X_PCR_RTCGTGCTTCTTATCCTCTTCC

Tabela 1. Startery użyte do elongacji gRNA i sekwencjonowania, qPCR oraz detekcji białka fuzyjnego.

Dyskusja

Protokół ten opisuje prostą i elastyczną metodę analizy funkcji wzmacniacza w endogennym locus genomu bez fizycznej zmiany sekwencji DNA. Chociaż Enhancer-i jest podobny w koncepcji do wcześniej opublikowanych protokołów interferencyjnych CRISPR wykorzystujących dCas9-KRAB27, różni się od tych protokołów na 3 główne sposoby. Po pierwsze, Enhancer-i wykorzystuje domenę oddziałującą SIN3A MAD120 w celu uzyskania dezaktywacji wzmacniacza. Dezaktywację wzmacniacza można uratować za pomocą inhibitorów HDAC, co sugeruje, że główny mechanizm dezaktywacji jest zależny od HDAC. W przeciwieństwie do interferencji CRISPR z dCas9-KRAB, Enhancer-i nie prowadzi do osadzania się H3K9me3. Jest to prawdopodobnie spowodowane faktem, że Enhancer-i opiera się na przejściowym wprowadzeniu przewodnikowych RNA, przy czym komórki są zbierane 3 dni po transfekcji. W interferencji CRISPR wzrost H3K9me3 obserwuje się po 7 dniach od transdukcji12. Wreszcie, protokół Enhancer-i zapewnia strategię kierowania na wiele witryn jednocześnie i monitorowania skuteczności kierowania. W Mosaic-seq17, dCas9-KRAB jest używany do jednoczesnego celowania w wiele wzmacniaczy, ale technika ta opiera się na sekwencjonowaniu RNA pojedynczej komórki w celu identyfikacji zmian ekspresji, a wiele genów (takich jak geny reagujące na estrogeny) pozostaje niewykrytych ze względu na niską czułość sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki. Enhancer-i zapewnia wiarygodną metodę badania wzmacniaczy indywidualnie i w połączeniu dla dowolnego genu.

Najbardziej krytycznym etapem Enhancer-i jest transfekcja, która powinna być zoptymalizowana pod kątem interesującej nas linii komórkowej. Protokół ten opiera się na leczeniu puromycyną w celu wzbogacenia dla transfekowanych komórek, ale możliwe jest, że kotransfekcja przewodnikowych RNA z białkiem fluorescencyjnym i sortowanie komórek fluorescencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej może okazać się lepszą metodą wzbogacania dla niektórych typów komórek. Zalecamy monitorowanie poziomu ekspresji przewodnikowych RNA i SID4x-dCas9-KRAB za pomocą qPCR w celu rozwiązania problemów i potwierdzenia transfekcji. Jeśli poziomy przewodnikowego RNA są niskie (próg cyklu >30), użytkownicy mogą również rozważyć alternatywne strategie produkcji przewodnikowego RNA, takie jak transkrypcja in vitro 28. Możliwe jest również, że pomimo wysokich poziomów gRNA, celowanie w białko SID4x-dCas9-KRAB w przewodnikowym RNA jest nieefektywne, w takim przypadku może być konieczny wybór różnych sekwencji przewodnika RNA. Wykonując sekwencję ChIP-seq na białku fuzyjnym z chromatyną z komórek leczonych Enhancer-i, można monitorować skuteczność celowania. Jeśli w regionie zainteresowania występuje wysoki sygnał SID4x-dCas9-KRAB i nie zostaną wykryte żadne zmiany ekspresji w jego domniemanym genie docelowym, oznacza to, że region prawdopodobnie nie przyczynia się do ekspresji tego genu w badanych warunkach.

Jednym z potencjalnych ograniczeń Enhancer-i jest to, że efekty off-target mogą się kumulować, jeśli zbyt wiele miejsc jest celowanych jednocześnie. Niemniej jednak strategie interferencji CRISPR w celu knockdownu mają mniej efektów poza celem niż RNAi29, szczególnie gdy używana jest poliklonalna linia komórkowa eksprymująca dCas9-KRAB. Chociaż zaobserwowaliśmy niedocelowe wiązanie genomowe SID4X-dCas9-KRAB podczas jednoczesnego celowania w 10 miejsc, nie zidentyfikowaliśmy zmian ekspresji genów w wyniku tych zdarzeń wiązania. Ponieważ niektóre wzmacniacze mogą kontaktować się z wieloma promotorami i / lub innymi wzmacniaczami, możliwe jest, że wiele genów może zmienić ekspresję po skierowaniu na pojedynczy wzmacniacz, chociaż nie jest jasne, czy ta forma regulacji genów jest powszechna. Aby potwierdzić, że zaobserwowane zmiany ekspresji są spowodowane celowaniem w określony wzmacniacz, a nie efektami niezamierzonymi, użytkownicy mogą wykonać Enhancer-i z dwoma odrębnymi zestawami nienakładających się przewodnikowych RNA ukierunkowanych na ten sam region. Ponadto genetyczna delecja regionu za pomocą kompetentnego nukleazy Cas9 może dodatkowo potwierdzić jego wpływ na ekspresję genów.

Ponieważ Enhancer-i działa poprzez deacetylację histonów, możliwe jest, że jego zdolności dezaktywacji są ograniczone do wzmacniaczy, które mają znaczny poziom acetylacji histonów. Istnieje wiele alternatywnych fuzji represyjnych, które mogą być bardziej skuteczne w ukierunkowaniu na określone wzmacniacze. Fuzje metylotransferazy DNA z dCas9 mogą być stosowane w celu zmniejszenia ekspresji genów, gdy są ukierunkowane na dystalne wzmacniacze30, ale ta represja często nie jest przejściowa. Inna fuzja represyjna wykorzystuje domenę Przyjaciela GATA1 (FOG1), która prowadzi do trimetylacji histonu H3 lizyny 27 i hamuje ekspresję genów na poziomach podobnych do dCas9-KRAB w różnych liniach komórkowych i promotorach31. Co ciekawe, dodanie większej liczby kopii FOG1 do dCas9 zmniejszyło potencjał represyjny u promotorów, co sugeruje, że pojedyncza kopia domeny SID może zapewnić większą dezaktywację wzmacniacza niż 4 kopie obecnie używane w Enhancer-i. Możliwe, że niektóre loci mogą skorzystać z podwójnego celowania przez różne kombinacje powyższych fuzji dCas9. Na przykład, stabilną długotrwałą represję można osiągnąć poprzez jednoczesną transdukcję dCas9-DNMT3a i dCas9-KRAB32. Większość z tych represyjnych fuzji była ukierunkowana tylko na jedno locus na raz i pozostaje niejasne, który z nich jest najbardziej skuteczny w manipulowaniu wieloma wzmacniaczami jednocześnie.

Enhancer-i, choć jest odpowiednią metodą do badania kombinacji wzmacniaczy dla kilku genów, jest nadal nieco ograniczony pod względem przepustowości, jeśli użytkownik chce badać domniemane wzmacniacze dla setek genów. Przyszłe zastosowania tej techniki będą obejmować technologie oparte na obrazowaniu w celu ilościowego oznaczania wielu genów w wielu próbkach jednocześnie. Co ważne, technologie te są kompatybilne z bezpośrednią detekcją cząsteczek RNA z lizatu, eliminując potrzebę czasochłonnej izolacji RNA. Te adaptacje ułatwią przesłuchiwanie większych zestawów wzmacniaczy.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez NIH/NHGRI R00 HG006922 i NIH/NHGRI R01 HG008974 do J.G. oraz Huntsman Cancer Institute. J.B.C. był wspierany przez NIH Training Program in Genetics T32GM007464.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ZR 96-dołkowy zestaw Quick-RNAZymo ResearchR1053
Power SYBR Zielony RNA-to-CT 1-etapowystosowany biosystems4389986
enzym restrykcyjny AflIINEBR0520S
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix z buforem HFNEBM0531L
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621L
FuGENE HDPromegaE2312
DNA Czyste & Zestaw koncentratoraZymo ResearchD4013
Bufor RLT PlusQiagen1053393
b-estradiolSigma-AldrichE2758
Człowiek: komórki IshikawyECACC99040201
H3K27ac królik poliklonalnyMotyw aktywny 39133
H3K9me3 królik poliklonalnyAbcam ab8898
Mysz FLAG monoklonalnaSigma-Aldrich F1804
ER alfa królik poliklonalnySanta Cruzsc-544
pGL3-U6-PGK-Puroplazmid Addgene 51133Shen i wsp., 2014
gRNA_cloningVector plazmidAddgene 41824Mali i wsp., 2013
AflII U6 plazmid puromycynyAddgene 106404Carleton i wsp., 2017
Addgene plazmid SID4X-dCas9-KRAB 106399Carleton i wsp., 2017
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM6250-10ML
Ultraczysta woda destylowana bez DNazy/RNazThermoFisher Scientific10977-023
Opti-MEM I Zredukowana surowica MediumGibco31985070
KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, z koralikami wychwytującymi mRNA KAPABiosytemy KapaKK8420
Pierce Inhibitor proteazy i fosfatazy Mini tabletkiThermoFisher ScientificA32959
Roztwór formaldehyduSigma-Aldrich252549-25ML
Selektywny antybiotyk Geneticin (siarczan G418) (50 mg / ml)ThermoFisher Scientific10131035
LB RosółThermoFisher Scientific10855001
Quick-DNA MiniprepKit Zymo ResearchD3020
Szybko ładowana fioletowa drabina DNA z 2 kłódamiNEBN0050S

Bibliografia

  1. Consortium, E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  3. Andersson, R., et al. An atlas of active enhancers across human cell types and tissues. Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).
  4. Perry, M. W., Boettiger, A. N., Bothma, J. P., Levine, M. Shadow enhancers foster robustness of Drosophila gastrulation. Curr Biol. 20 (17), 1562-1567 (2010).
  5. Lam, D. D., et al. Partially redundant enhancers cooperatively maintain Mammalian pomc expression above a critical functional threshold. PLoS Genet. 11 (2), e1004935(2015).
  6. Patwardhan, R. P., et al. Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo. Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).
  7. Savic, D., et al. Promoter-distal RNA polymerase II binding discriminates active from inactive CCAAT/ enhancer-binding protein beta binding sites. Genome Res. 25 (12), 1791-1800 (2015).
  8. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  9. Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Res. 23 (10), 1163-1171 (2013).
  10. Hilton, I. B., et al. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nat Biotechnol. , (2015).
  11. Kearns, N. A., et al. Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion. Nat Methods. 12 (5), 401-403 (2015).
  12. Thakore, P. I., et al. Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements. Nat Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).
  13. Groner, A. C., et al. KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading. PLoS Genet. 6 (3), e1000869(2010).
  14. Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
  15. Fulco, C. P., et al. Systematic mapping of functional enhancer-promoter connections with CRISPR interference. Science. 354 (6313), 769-773 (2016).
  16. Joo, J. Y., Schaukowitch, K., Farbiak, L., Kilaru, G., Kim, T. K. Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers. Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).
  17. Xie, S., Duan, J., Li, B., Zhou, P., Hon, G. C. Multiplexed Engineering and Analysis of Combinatorial Enhancer Activity in Single Cells. Mol Cell. 66 (2), 285-299 (2017).
  18. Carleton, J. B., Berrett, K. C., Gertz, J. Multiplex Enhancer Interference Reveals Collaborative Control of Gene Regulation by Estrogen Receptor alpha-Bound Enhancers. Cell Syst. 5 (4), 333-344 (2017).
  19. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  20. Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P., Eisenman, R. N. Mad proteins contain a dominant transcription repression domain. Mol Cell Biol. 16 (10), 5772-5781 (1996).
  21. Alland, L., et al. Role for N-CoR and histone deacetylase in Sin3-mediated transcriptional repression. Nature. 387 (6628), 49-55 (1997).
  22. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  23. Rennoll, S. A., Scott, S. A., Yochum, G. S. Targeted repression of AXIN2 and MYC gene expression using designer TALEs. Biochem Biophys Res Commun. 446 (4), 1120-1125 (2014).
  24. Stampfel, G., et al. Transcriptional regulators form diverse groups with context-dependent regulatory functions. Nature. 528 (7580), 147-151 (2015).
  25. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nat Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  26. Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nat Methods. 11 (2), 122-123 (2014).
  27. Parsi, K. M., Hennessy, E., Kearns, N., Maehr, R. Using an Inducible CRISPR-dCas9-KRAB Effector System to Dissect Transcriptional Regulation in Human Embryonic Stem Cells. Methods Mol Biol. , 221-233 (2017).
  28. Romanienko, P. J., et al. A Vector with a Single Promoter for In Vitro Transcription and Mammalian Cell Expression of CRISPR gRNAs. PLoS One. 11 (2), e0148362(2016).
  29. Smith, I., et al. Evaluation of RNAi and CRISPR technologies by large-scale gene expression profiling in the Connectivity Map. PLoS Biol. 15 (11), e2003213(2017).
  30. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  31. O'Geen, H., et al. dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repression. Nucleic Acids Res. 45 (17), 9901-9916 (2017).
  32. Amabile, A., et al. Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing. Cell. 167 (1), 219-232 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Interferencja CRISPRprojektowanie gRNAmultipleksowa interferencja wzmacniaczytransfekcja przejściowaanaliza regulacji genówrepresja dCas9dezaktywacja wzmacniaczyhodowle tkankowecelowanie genomowe
Analiza funkcji wzmacniacza za pomocą interferencji wzmacniacza opartego na multipleksie CRISPR w liniach komórkowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.