Method Article

Egzogenne podawanie agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami do neuronów pierwotnych jako potężny model komórkowy tworzenia włókienek

DOI:

10.3791/57884

⸱

June 26th, 2018

 ,  , 
1Bio@SNS Laboratory, Scuola Normale Superiore, 2International School for Advanced Studies (SISSA/ISAS)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest dostarczenie systemu opartego na komórkach, który replikuje tworzenie agregatów alfa-synukleiny in vivo. Wewnątrzkomórkowe inkluzje alfa-synukleiny są wysiewane w pierwotnych neuronach przez internalizację i propagację egzogennych, podawanych natywnych agregatów alfa-synukleiny związanych z mikrosomami wyizolowanych z chorych myszy transgenicznych alfa-synukleiny.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przez lata, niezdolność do replikacji powstawania nierozpuszczalnych inkluzji alfa-synukleiny (αS) w hodowlach komórkowych była dużym ograniczeniem w badaniach nad agregacją αS w chorobie Parkinsona (PD). Niedawne opracowanie nowych modeli zwierzęcych poprzez egzogenną inokulację ekstraktów mózgowych od chorych transgenicznych myszy αS lub pacjentów z chorobą Parkinsona dało nowe nadzieje na możliwość stworzenia bardziej odpowiednich modeli komórkowych agregacji αS. Niestety, jeśli chodzi o komórki w hodowlach, podawanie surowych ekstraktów mózgowych nie okazało się tak skuteczne jak u myszy, a źródłem wyboru agregatów egzogennych są nadal uformowane in vitro fibryle αS.

Opracowaliśmy metodę indukowania powstawania wewnątrzkomórkowych inkluzji αS w pierwotnych neuronach poprzez egzogenne podawanie natywnych agregatów αS związanych z mikrosomami, wysoce toksycznego gatunku αS izolowanego z chorych obszarów transgenicznych myszy. Ta frakcja agregatów αS, która jest związana z pęcherzykami mikrosomów, jest skutecznie internalizowana i indukuje tworzenie inkluzji wewnątrzkomórkowych dodatnich dla zagregowanych i ufosforylowanych αS. W porównaniu z fibrylami uformowanymi in vitro, które są wykonane z rekombinowanego αS, nasza metoda jest szybsza i gwarantuje, że wysiew patogenny jest wykonany z autentycznych agregatów αS wyekstrahowanych z chorych modeli zwierzęcych PD, wierniejsze naśladowanie rodzaju inkluzji uzyskanych in vivo. W związku z tym dostępność tkanek bogatych w inkluzje αS jest obowiązkowa.

Wierzymy, że ta metoda dostarczy wszechstronnego modelu komórkowego do badania mikroskopijnych aspektów agregacji αS i związanej z nią patofizjologii komórkowej in vivo i będzie punktem wyjścia do stworzenia bardziej precyzyjnego i wyrafinowanego paradygmatu komórkowego PD.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nagromadzenie inkluzji białkowych alfa-synukleiny (αS) jest wyraźną i ważną cechą choroby Parkinsona (PD) i alfa-synulceinopatii1. Niestety, podczas gdy modele zwierzęce są w stanie zapewnić wystarczające środowisko komórkowe i biochemiczne do indukowania etapów agregacji niezbędnych do tworzenia włókien białkowych2, replikacja tworzenia złożonych agregatów podobnych do ciał Lewy'ego (LB) w kulturach komórkowych jest trudna i wymagająca.

Tutaj opisujemy metodę indukowania tworzenia inkluzji αS, podobnych do agregatów białkowych uzyskanych w modelach zwierzęcych i pacjentach z PD, w hodowanych komórkach, przy użyciu izolowanych przez mózg pierwotnych neuronów myszy. Nasz protokół opiera się na egzogennym podawaniu agregatów αS związanych z mikrosomami wyizolowanych z objawowych myszy transgenicznych αS (Tg) do pierwotnych neuronów hipokampa lub kory mózgowej myszy. Metoda ta wykorzystuje zdolność rozprzestrzeniania się i rozmnażania toksycznych form αS, które po dodaniu do pożywki hodowlanej są w stanie uwewnętrznić się i indukować tworzenie dojrzałych agregatów αS-dodatnich3,4,5,6,7,8.

Pierwotnie, standardowe metody tworzenia włókienek αS w hodowlach komórkowych opierały się na nadekspresji odpowiadającego im cDNA αS poprzez regularne protokoły transfekcji lub infekcję za pośrednictwem wirusa9. O ile w pierwszym przypadku uzyskanie agregatów αS podobnych do LB było przypadkowe, wykazywało niską skuteczność i zależało od typu komórki, o tyle drugi protokół doprowadził do powstania nierozpuszczalnych włókienek, w tym gatunków o wysokiej masie cząsteczkowej (HMW) w ciągu 24 - 48 godzin od infekcji10. W tych metodach tworzenie agregatów było prawdopodobnie spowodowane nadmierną i niezrównoważoną ilością białka αS, które staje się nierozpuszczalne, a nie patologiczną konformacją αS, która dyktuje agregację. Zamiast tego technika, którą tutaj prezentujemy, nie zmienia poziomu ekspresji αS, ale indukuje rozległą agregację białek z powodu internalizacji egzogennych włókienek. Co więcej, tworzenie agregatów αS poprzez podawanie egzogennych włókien jest długotrwałym procesem, który wymaga dni lub tygodni, aby stać się wyczerpującym, co pozwala nam badać wczesne i pośrednie etapy powstawania inkluzji αS w sposób poklatkowy i korelować je ze zmianami biochemicznymi w komórkach. Tym samym nasza metoda jest cennym zastosowaniem do tworzenia komórkowych modeli agregacji αS, które są pomocne w mikroskopowym badaniu tworzenia włókien αS w odniesieniu do patofizjologii komórkowej.

Ponadto, mimo że podawanie surowych ekstraktów mózgowych od chorych myszy transgenicznych αS (Tg)11,12 lub ludzkich mózgów PD6,13 jest w stanie wywołać depozycję αS u zwierząt Tg lub dzikich (WT), zastosowanie tej samej procedury do hodowli komórkowych nie okazało się tak skuteczne, prawdopodobnie z powodu małej ilości agregatów w używanych próbkach i brak standardowej procedury izolowania rodzimych gatunków toksycznych αS14. Z tego powodu preformowane fibryle in vitro (PFF) αS były do tej pory źródłem agregatów z wyboru do indukcji inkluzji αS w komórkach i modelach zwierzęcych3,4,6,7,15,16. Dzięki naszemu protokołowi pokazujemy jednak, że agregowane gatunki αS związane z mikrosomami wyizolowane z myszy αS Tg mogą skutecznie indukować akumulację wewnątrzkomórkowych inkluzji αS podobnych do LB w neuronach pierwotnych.

W naszym laboratorium, zagregowane gatunki αS związane z mikrosomami są izolowane z tkanki rdzenia kręgowego (SpC) chorych myszy Tg wyrażających ludzki gen A53T αS pod kontrolą promotora mysiego białka prionowego (PrP) [Prp Ludzkie myszy A53T αS Tg, linia G2-317]. Myszy te wykazują zależny od wieku fenotyp neurodegeneracyjny, który obejmuje silną dysfunkcję motoryczną i tworzenie inkluzji w ośrodkowym układzie nerwowym zbudowanych z fosforylowanych, ubikwitynowanych i nierozpuszczalnych αS, począwszy od 9 miesiąca życia. Gdy pojawia się dysfunkcja motoryczna, fenotyp szybko ewoluuje w paraliż, zaczynając od kończyn tylnych, co prowadzi do śmierci w ciągu 2-3 tygodni. Akumulacja agregatów αS przebiega równolegle z manifestacją choroby. Myszy uśmiercone na początku dysfunkcji motorycznej wykazują silny stopień agregacji αS w SpC, pniu mózgu i móżdżku. Nie ma potrzeby czekać, aż pojawi się paraliż, aby poświęcić mysz. Myszy przedobjawowe są pobierane od 9-miesięcznych zwierząt, które nie wykazują dysfunkcji motorycznych.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie zwierząt WT i Tg zostało zatwierdzone i w pełni przestrzegane przez krajowe i międzynarodowe przepisy dotyczące dobrostanu zwierząt laboratoryjnych i doświadczeń (dyrektywa Rady EWG 86/609, 12 grudnia 1987 r. i dyrektywa 2010/63/UE, 22 września 2010 r.). Wszystkie protokoły opisane w tym dokumencie są zgodne z wytycznymi naszej instytucji dotyczącymi opieki nad zwierzętami.

1. Izolacja agregatów αS związanych z mikrosomami od chorych myszy A53T αS Tg

  1. Przygotować bufor homogenizacyjny, który składa się z 250 mM sacharozy, 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 2 mM EDTA i 1x inhibitorów fosfatazy/proteazy. Utrzymuj bufor na lodzie.
  2. Homogenizować świeżą lub zamrożoną tkankę w lodowatym buforze homogenizacyjnym o objętości 1:10 (w/v) za pomocą homogenizatora teflonowego z tłuczkiem, wykonując 10 - 15 cykli.
  3. Przenieść początkowy homogenat (1 - 2 ml) do probówki do mikrowirówki i odwirować przy 1 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C za pomocą wirówki z chłodzeniem w celu usunięcia jąder i nieuszkodzonych komórek z otrzymanego osadu (P1). Odrzuć P1.
  4. Przenieść supernatant (S1) do czystej probówki do mikrowirówki i odwirować S1 przy 10 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C za pomocą wirówki z chłodzeniem w celu otrzymania drugiego supernatantu (S10) i osadu (P10).
    UWAGA: P10 to surowa osadka błonowa, która zawiera mitochondria i synaptosomy. Odrzuć P10.
  5. Przenieść supernatant (S10) do butelki z poliwęglanu (>1 ml) i odwirować S10 w temperaturze 100 000 × g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C za pomocą ultrawirówki i rotora o stałym kącie nachylenia (90 Ti).
    UWAGA: Supernatant jest czystą frakcją cytozolu, podczas gdy osad P100 zawiera agregaty αS związane z mikrosomami.
  6. Zawiesić osad P100 w 500 μl buforu homogenizacyjnego. Przenieść P100 do czystej probówki do mikrowirówki i odwirować przy 10 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w wirówce z chłodzeniem.
  7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić P100 ze 100 μl buforu homogenizacyjnego.
    UWAGA: Ta frakcja to agregaty αS związane z mikrosomami.
  8. Sonizacja próbek przez 2 s na lodzie [ustaw moc wyjściową 1 wat (RMS)]. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.
  9. Dzień później określ ilość białka za pomocą analizy BCA.

2. Western Blot

Uwaga: Biochemiczna charakterystyka agregatów αS związanych z mikrosomami jest oceniana za pomocą Western Blot.

  1. Odleć gradientowy żel poliakryloamidowy 4 - 20% tris-glicyny na pionowym aparacie do elektroforezy.
  2. Załadować 1 μg frakcji αS związanych z mikrosomami, rozpuszczonych w buforze próbki denaturującej.
  3. Do innego dołka załaduj 5 μl standardowego markera białkowego.
  4. Uruchomić żel pod napięciem 100 V w buforze do pracy Tris/glycine/SDS, aż marker białkowy dotrze do końca żelu.
  5. Przenieść białka do membrany nitrocelulozowej za pomocą zasadowego buforu węglanowego (10 mM NaCO3, 3 mM NaHCO3, 20% metanolu) O/N w temperaturze 4 °C, w temperaturze 200 mA, stałej.
  6. Zablokuj membranę PBS-niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym 0,05% (PBS-T) z 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku na wytrząsarce orbitalnej przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Krótko przepłukać membranę PBS-T.
  8. Inkubować błonę z przeciwciałem Syn-1 (1:5 000) lub pSer129-αS (1:5 000) w 2,5% odtłuszczonym mleku w proszku w PBS-T, O/N w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej.
  9. Myć membranę przez 10 minut w temperaturze pokojowej za pomocą PBS-T na wytrząsarce orbitalnej.
  10. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z HRP przeciwko myszom lub królikom (1:3 000) w 2,5% beztłuszczowym mleku w proszku w PBS-T przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  11. Myć membranę przez 10 minut w temperaturze pokojowej za pomocą PBS-T na wytrząsarce orbitalnej. Powtórz 3 razy.
  12. Uzyskaj sygnał za pomocą zwykłych zestawów chemiluminescencyjnych.

3. Pierwotne kultury neuronalne

Uwaga: Pierwotne kultury neuronów zostały przygotowane z hipokampa lub kory myszy nowonarodzonej (P0) WT (Linia C57BL/6). Cała procedura, bez etapów wirowania, odbywa się pod kapturem do hodowli komórkowych, w sterylnych warunkach.

  1. Szkiełka nakrywkowe (Ø 18 mm) należy traktować 65% roztworem kwasu azotowego przez co najmniej 12 godzin w temperaturze pokojowej.
  2. Usuń kwas azotowy. Szkiełka nakrywkowe spłukać dwukrotnie PBS 10x i kilkakrotnie wodą destylowaną.
  3. Umieścić szkiełka nakrywkowe w naczyniach 24-dołkowych i pokryć je poli-D-lizyną (0,1 mg/ml w sterylnej wodzie destylowanej lub PBS 1x) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  4. Usuń poli-D-lizynę i umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie wodą destylowaną. Przechowywać je w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
  5. Poddaj eutanazji młode myszy przez ścięcie głowy i oddziel głowy od ciał. Połóż głowy na naczyniach i delikatnie rozetnij skórę.
  6. Używając cienkich nożyczek, otwórz czaszkę, wykonując nacięcie u podstawy mózgu. Oddziel dwie połówki czaszek i ostrożnie je usuń.
  7. Za pomocą kleszczy oderwij mózgi od podstaw i odizoluj korę i hipokamp. Przenieś je do dwóch oddzielnych naczyń zawierających pożywkę Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) zawierającą 1% penicyliny/streptomycyny.
  8. Powtórz kroki 3.6 i 3.7 dla każdego zwierzęcia. Należy pamiętać, że cały proces nie powinien zająć więcej niż 30 - 45 minut.
  9. Zmielić zebrane tkanki i przenieść je do dwóch stożkowych probówek o pojemności 50 ml (jednej dla hipokampa i jednej dla kory) z 10 ml pożywki HBSS zawierającej trypsynę 0,1%. Inkubować w łaźni wodnej przez 7 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Nie jest wymagane mieszanie.
  10. Dodać 1 ml DMEM zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 10 μg/ml DNazy do homogenatu, aby zablokować aktywność trypsyny.
  11. Powstałą zdysocjowaną tkankę odwirować w stężeniu 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej na wirówce i usunąć supernatant.
    UWAGA: Osad reprezentuje komórki wycięte z tkanki.
  12. Ponownie zawiesić komórki w pożywce galwanowej, zawierającej 2% witaminy B27, 2 mM glutaminy, 6 mg/ml glukozy, 10% FBS, 12,5 μM glutaminianu i 10 μg/ml gentamycyny.
  13. Neurony zdysocjowane na szkiełkach nakrywkowych z poli-D-lizyny w 24 dołkach zgodnie ze stosunkiem: 1 kora / 12 dołków i 1 hipokamp / 6 dołków, co daje około 150 000/200 000 komórek na dołek. Utrzymać komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  14. Dzień później (dzień in vitro, DIV 1) zastąpić pożywkę galwaniczną pożywką zawierającą 2% witaminy B27, 10 μg/ml gentamycyny i 2 mM glutaminy.
  15. W DIV 2 usuń 1/3 pożywki i dodaj 1/3 świeżej pożywki zawierającej 2,5 μM arabinozydu cytozyny przez 48 godzin, aby zmniejszyć zanieczyszczenie glejowe.
  16. Utrzymuj neurony w temperaturze 37 °C i wymieniaj połowę pożywki co trzy dni.

4. Leczenie neuronów

Uwaga: Zabieg został wykonany w DIV 7. Wszystkie etapy są przeprowadzane pod kapturem do hodowli komórkowych w sterylnych warunkach. Przykład gęstości hodowli neuronów korowych w DIV 7 jest zilustrowany na Rysunek 1.

  1. Pula agregatów αS związanych z mikrosomami otrzymanych z rdzenia kręgowego trzech różnych chorych myszy Tg w celu uzyskania roztworu 1 μg / μL, używając oryginalnego buforu homogenizacyjnego do rozcieńczenia.
  2. Usuń 1/3 pożywki i delikatnie zastąp ją świeżą pożywką zawierającą 2% witaminy B27, 1x gentamycynę i 2 mM glutaminę.
  3. Dodać 1 μg zbiorczych agregatów αS związanych z mikrosomami do pożywki komórkowej. Powrót neuronów do inkubatora w temperaturze 37 °C.
  4. Co 3 dni przez 1 tydzień dodawać 1/3 świeżej pożywki. Nie wymieniaj nośnika. Po prostu go dodaj.
  5. Po 1 tygodniu leczenia należy usunąć 1/3 pożywki i delikatnie zastąpić ją świeżą pożywką zawierającą 2% witaminy B27, 10 μg/ml gentamycyny i 2 mM glutaminy. Powtarzaj co 3 dni.
  6. Napraw neurony po 2 tygodniach leczenia (DIV 21).

5. Immunofluorescencja

  1. Napraw neurony za pomocą 2% paraformaldehydu w PBS 1x i 5% roztworze sacharozy przez 15 minut w temperaturze pokojowej bez wstrząsania, pod chemicznym wyciągiem.
  2. Usuń roztwór mocujący. Krótko umyć PBS 1x, 3 razy.
    UWAGA: Wszystkie kroki mycia należy wykonywać delikatnie, ponieważ neurony pierwotne nie przylegają mocno do szkiełek nakrywkowych z polilizyny.
  3. Przepuszczalność neuronów za pomocą 0,3% niejonowego środka powierzchniowo czynnego w PBS 1x przez 5 minut w RT.
  4. Krótko umyć PBS 1x, 3 razy.
  5. Inkubuj neurony z 3% FBS w PBS 1x przez 30 minut w RT, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania, na wytrząsarce orbitalnej.
  6. Inkubować neurony z odpowiednim przeciwciałem pierwszorzędowym rozpuszczonym w 3% FBS w PBS 1x, O/N w temperaturze 4 °C na wytrząsarce orbitalnej.
    UWAGA: zastosowano przeciwciała syn303 (1:1,000), mysie αS (1:200), pser129-αS (1:1,000) i Tau (1:10,000).
  7. Usunąć roztwór przeciwciał i krótko przemyć PBS 1x, 3 razy.
  8. Inkubować neurony z odpowiednim fluorescencyjnym przeciwciałem drugorzędowym rozpuszczonym w 3% FBS w PBS, przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności na wytrząsarce orbitalnej.
  9. Usunąć roztwór przeciwciał i krótko przemyć PBS 1x, 3 razy.
  10. Wybarwić neurony roztworem DAPI (0,1 μg/ml w PBS 1x) przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności na wytrząsarce orbitalnej.
  11. Usunąć roztwór przeciwciał i krótko przemyć PBS 1x, 3 razy.
  12. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełku za pomocą środka montażowego zapobiegającego blaknięciu.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z protokołem opisanym powyżej i podsumowanym w Rysunek 2, oczyściliśmy agregacje αS związane z mikrosomami od trzech chorych myszy A53T αS Tg (Rysunek 3). Mikrosomy to surowe frakcje błony błonowej, które zawierają retikulum endoplazmatyczne, Golgiego i małe pęcherzyki synaptyczne. Stopień czystości mikrosomalnego osadu w porównaniu z innymi frakcjami został wcześniej oceniony przy użyciu określonych markerów organelli18.

Po wyizolowaniu, charakterystyka biochemiczna agregatów αS jest oceniana poprzez denaturację SDS-Page, a następnie inkubację z Syn-1 lub fosforylowanym αS w przeciwciałie Serine 129 (pSer129-αS). W porównaniu z myszami przedobjawowymi (PreS) i dopasowanymi wiekowo bez Tg (nTg), mikrosomy wyizolowane od chorych myszy współwytrącają się z agregatami αS. Gatunki αS związane z mikrosomami wykazują typowe cechy agregatów αS, takie jak akumulacja gatunków odpornych na detergenty HMW, fosforylacja przy serynie 12919 oraz C- i N-końcowe ścięte fragmenty (pełna charakterystyka agregatów αS związanych z mikrosomami znajduje się w reference18,20,21). Są to podstawowe wymagania, ponieważ monomeryczny αS nie ulega efektywnej internalizacji i nie indukuje osadzania αS7,15,22. Ważne jest, aby nie używać żadnych detergentów (jonowych lub niejonowych) do ponownego zawieszania granulek P100, ponieważ może to być szkodliwe dla komórek. Ponadto, aby uniknąć zmienności próbki, agregacje αS związane z mikrosomami od trzech różnych chorych myszy zostaną połączone w celu leczenia neuronalnego.

Podanie 1 μg zbiorczych agregatów αS związanych z mikrosomami od chorych myszy A53T do pożywki hodowlanej neuronów korowych lub hipokampowych indukuje zależne od czasu tworzenie inkluzji αS, dodatnich dla przeciwciał αS specyficznych dla agregatów, takich jak Syn303 (Rysunek 4, 5) lub pser129-αS (Rysunek 5). Po dwóch dniach (2d) leczenia agregaty te pojawiają się jako małe, rozproszone punkcta, które staną się bardziej obfite w późniejszych punktach czasowych. Po dwóch tygodniach inkluzje αS przypominają długie i dojrzałe struktury przypominające koraliki, silnie rozsiane w kulturach neuronalnych, podążające za wzorcem neurytów i częściowo kolokalizujące się z markerami presynaptycznymi i neurytowymi (Ryc. 5). Czasami można zaobserwować, że nowo powstałe inkluzje αS kolokalizują i barwią somę komórkową lub pokrywają cały proces, przypominając nekrotyty nekrotyty.

Chociaż frakcje agregacji αS związane z mikrosomami mogą skutecznie rozprzestrzeniać się w kulturach neuronalnych, ich ilość musi być precyzyjnie dostosowana do liczby platerowanych neuronów (Rysunek 1). W rzeczywistości, przekroczenie zalecanego stosunku, μg agregatów związanych z mikrosomami: liczba neuronów, wywoła przedwczesną śmierć komórki w ciągu kilku dni (Ryc. 6), podczas gdy niewystarczająca ilość agregatów αS związanych z mikrosomami doprowadzi do rzadkiej i zmniejszonej liczby inkluzji po dwóch tygodniach leczenia, podobnie jak w poprzednich punktach czasowych (Figura 4A).

figure-results-1
Rysunek 1. Hodowle neuronów korowych. Reprezentatywny obraz przedstawiający gęstość w DIV 7 kultur neuronów korowych. Zdjęcia wykonano za pomocą mikroskopu z odwróconym światłem, obiektywu 10X. Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Izolacja agregatów αS związanych z mikrosomami z mysiego SpC. Schemat blokowy protokołu oczyszczania agregatów αS związanych z mikrosomami z SpC chorych myszy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Izolacja frakcji mikrosomów od chorych, przedobjawowych myszy A53T αS Tg i nTg. Analiza Western blot pokazująca oczyszczone agregaty αS związane z mikrosomami wyizolowane od trzech chorych (chorych), przedobjawowych (PreS) i dopasowanych w wieku myszy nTg. Chore myszy to myszy A53T αS Tg, które wykazują dysfunkcję motoryczną i neurologiczną, w tym nagromadzenie inkluzji αS, podczas gdy zwierzęta przedobjawowe to zdrowe A53T αS Tg w wieku 9 miesięcy, które nie wykazują jeszcze żadnego fenotypu związanego z patologią αS. Myszy nTg są rodzeństwem z chorych myszy, które nie są nosicielami transgenu αS i dlatego nie rozwijają patologii wywołanej przez αS. 1 μg każdej oczyszczonej frakcji poddano denaturującej SDS-Page, przeniesiono na membranę nitrocelulozową i osuszono przeciwciałem Syn-1 lub pSer129-αS. Tylko frakcje mikrosomów wyizolowane od chorych myszy zawierały odporne na detergenty agregaty αS HMW, które były fosforylowane przy serynie 129 i wykazywały obcięcie C-i N-końcowe. Rysunek ten został zaadaptowany z Colla i wsp.18. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Zależna od czasu indukcja depozycji αS po podaniu agregatów αS związanych z mikrosomami. (A) Immunofluorescencja pierwotnych neuronów hipokampa potraktowanych 1 μg agregacji αS związanych z mikrosomami frakcji zbiorczych pochodzących od trzech różnych chorych myszy. Neurony utrwalono po 2 dniach (2d), 1 tygodniu (1w) lub 2 tygodniach (2w) leczenia i podano barwieniu immunologicznemu za pomocą syn303 (S303, 1:1000), przeciwciała specyficznego dla utlenionych i zagregowanych αS. Komórki podbarwiono przeciwwagą za pomocą DAPI. Obrazy konfokalne wykonano za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, obiektyw 63X. Podziałka = 50 μm. (B) Analizę ilościową całkowitej fluorescencji, po odjęciu tła, przeprowadzono przy użyciu wtyczki do liczenia cząstek w oprogramowaniu Image J. Wartości zostały znormalizowane dla liczby jąder w polu (liczba DAPI) i wyrażone jako procent sygnału fluorescencji S303 w 2D. Wartości podane są jako średnia ± SD (n = 5). **p <0,001, ****p <0,00001, jednoczynnikowa ANOVA, a następnie test post-hoc LSD Fishera. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5. Wewnątrzkomórkowe inkluzje αS kolokalizują się z siecią neurytów korowych. Reprezentatywne obrazy konfokalne neuronów korowych traktowanych agregatami αS związanymi z mikrosomami uzyskanymi od chorych myszy Tg. Po 2 tygodniach leczenia neurony utrwalono i podwójnie wybarwiono przeciwciałami specyficznymi dla agregatów [S303 (A, B) lub pser129-αS, 1:1,000 (C)] i markerami neurytowymi [mysie αS, 1:200 (A,B) lub Tau, 1:10,000 (C)]. Wspólne znakowanie sygnałów fluorescencyjnych wykazało częściową kolokalizację nowo powstałych struktur podobnych do koralików αS z siecią neurytów. Czasami inkluzje αS gromadzą się w somie neuronalnym (A, B, groty strzał). Obrazy piętrowe uzyskano za pomocą laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego, obiektywu 63X. Podziałka = 50 μm. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Colla i wsp.20. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6. Dodanie nieoptymalnej ilości agregatów αS związanych z mikrosomami jest toksyczne dla neuronów. Barwienie DAPI neuronów traktowanych rosnącym stężeniem agregatów αS związanych z mikrosomami prowadzi do śmierci komórki. (A) Neurony korowe potraktowano 1,2 μg agregatów αS związanych z mikrosomami wyekstrahowanych od chorych myszy lub tylko buforem, który nie zawiera agregatów (B) i wybarwiono DAPI. Obrazy fluorescencyjne uzyskano za pomocą mikroskopu epi-fluorescencyjnego przy użyciu obiektywu 20X. Podziałka = 100 μm.(B) Komórki DAPI-dodatnie zliczono za pomocą oprogramowania Image J. Wykres pokazuje zmniejszenie liczby jąder wraz ze wzrostem stężenia agregatów αS związanych z mikrosomami dodawanych do pożywek neuronalnych. Wartości są wyrażone jako % b i podane jako średnia ± SD (n = 5), ***p <0,0001, jednoczynnikowa ANOVA, po której następuje test post-hoc LSD Fishera. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy metodę uzyskiwania powstawania inkluzji αS w pierwotnych kulturach neuronalnych pochodzących z mózgu od myszy WT, poprzez dodanie oczyszczonych agregatów αS związanych z mikrosomami wyizolowanych z modeli zwierzęcych αS Tg.

Krytyczne etapy tego protokołu są następujące: stosunek μg agregatów/neuronów αS związanych z mikrosomami oraz źródło agregatów αS. Jak wykazano w sesji wyników, kluczowe znaczenie ma optymalizacja stosunku μg agregatów αS związanych z mikrosomami do liczby neuronów, ponieważ praca w nieoptymalnych warunkach może prowadzić do przedwczesnej śmierci komórki lub zbyt rzadkiej agregacji wewnątrzkomórkowej (patrz sekcja Reprezentatywne wyniki). Z tego powodu bardzo ważne jest, aby ocenić gęstość hodowli neuronalnej w DIV 7 (pokazanej na rycinie 1) przed rozpoczęciem leczenia. Dodatkowo agregaty αS muszą zostać oczyszczone z chorych myszy αS Tg, tj. z modeli zwierzęcych, które gromadzą inkluzje podobne do LB charakteryzujące się fosforylowanymi i nierozpuszczalnymi w detergentach włókienkami αS HMW.

Możliwe modyfikacje tego protokołu dotyczą tkanki, zamrożonej lub świeżej, z której można wyizolować mikrosomy oraz ilości wyjściowej. Chociaż użyliśmy SpC myszy Tg ze względu na wysoką zawartość nierozpuszczalnych agregatów αS, protokół jest odpowiedni do izolowania agregatów związanych z mikrosomami z dowolnych tkanek, pod warunkiem, że obszar ma wysoką zawartość w agregatach αS. Można również stosować próbki mrożone, ponieważ zamrażanie nie wpływa na etapy oczyszczania agregatów związanych z mikrosomami ani na same agregaty. Podczas gdy zalecana masa wyjściowa dla tkanek wynosi około 100 - 150 mg, protokół ten jest odpowiedni do otrzymywania mikrosomów już od 50 mg surowca (brak maksymalnego limitu wagowego). Jednakże w przypadku ilości mniejszej niż 100 mg, odpowiedni stosunek homogenizacji będzie wynosił 1:20 (w/v) w celu załadowania co najmniej 1 ml supernatantu S10 do załadowania do butelki z poliwęglanu w celu wytrącania przez ultrawirówkę. W rzeczywistości objętości ładunku mniejsze niż 1 ml mogą spowodować zapadnięcie się probówki i utratę próbki. Zwiększenie objętości homogenizacji doprowadzi do uzyskania bardziej rozcieńczonego supernatantu, ale stężenie mikrosomalnego osadu pozostanie nienaruszone.

Ograniczenie tego protokołu dotyczy nieefektywnego siewu krzyżowego w tworzeniu inkluzji αS, które ostatnio zgłoszono w przypadku podawania αS PFF pochodzenia ludzkiego mysimu hodowlom neuronów, w przeciwieństwie do mysich αS PFF24. Ponieważ zwiększenie ilości egzogennych włókienek αS podawanych mysimskim hodowlom może ominąć ten problem, zalecamy precyzyjne dostrojenie ilości agregatów związanych z mikrosomami w przypadku podawania włókienek uzyskanych z innych wariantów αS lub z innych gatunków do mysich kultur neuronalnych niż to, co opisaliśmy.

Egzogenne agregaty αS dodawane do pożywek hodowlanych mogą pochodzić z różnych źródeł. W warunkach in vitro αS PFF były wcześniej używane jako matryca wysiewająca wewnątrzkomórkowych agregatów αS w hodowlach komórkowych, neuronach pierwotnych i modelach zwierzęcych 3,7,8,15. W porównaniu z naszą metodą, w której agregaty αS związane z mikrosomami można wyizolować w ciągu kilku godzin, tworzenie PFF jest długotrwałe i pracochłonne, wymagając wielu etapów oczyszczania, a następnie dodatkowych testów w celu sprawdzenia konfekcjonacji agregatów αS25. Ponadto PFF otrzymywane z ludzkich lub mysich αS ulegających ekspresji bakteryjnej, tj. pozbawionych modyfikacji potranslacyjnych typowych dla eukariontów, mogą wykazywać różne konformacje, z selektywnym wysiewem i właściwościami patogennymi, zgodnie z zastosowanymi protokołami zarodkowania (tj. wstęgi kontra fibryle)5,8, co prowadzi do różnych wyników i wniosków. Zamiast tego, pojedyncze podanie oczyszczonych in vivo agregatów αS gwarantuje transmisję bardziej autentycznych patogennych matryc, ściśle naśladując proces tworzenia inkluzji αS w modelach zwierzęcych i pacjentach z chorobą Parkinsona.

Jako przyszłe zastosowanie tej techniki, uważamy, że protokół ten może być z powodzeniem stosowany do izolowania patogennych nasion αS z mózgu pacjentów z PD lub innych modeli zwierzęcych αS Tg, pod warunkiem, że chory obszar, z którego izolowane są mikrosomy, jest bogaty w inkluzje αS.

Według naszej wiedzy jest to pierwsza metoda, która pozwala na oczyszczanie rodzimych toksycznych gatunków αS z modeli PD in vivo , które można wykorzystać jako matrycę zasiewu do uzyskania inkluzji αS w neuronach pierwotnych.

Uważamy, że ta metoda jest niezwykle wszechstronna i może zapewnić wyjątkowy model oparty na komórkach do badania różnych aspektów agregacji αS i jej wpływu na patofizjologię komórki. Ponieważ powstawanie inkluzji αS stanowi złożony proces, który był trudny do odtworzenia w hodowanych komórkach, mamy nadzieję, że ten model dostarczy świetnych spostrzeżeń na temat ostrych mechanizmów patogennych, trudnych do zidentyfikowania w przewlekłych i bardziej skomplikowanych systemach, takich jak modele zwierzęce.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta przez włoskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań (MIUR) poprzez program grantów na reintegrację zawodową (RLM Program dla Młodego Naukowca) oraz przez Scuola Normale Superiore. Dziękujemy prof. Michaelowi Lee z University of Minnesota w USA za dostarczenie myszy Prp Human A53T αS Tg, od których wyizolowane są agregaty.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Sacharoza Sigma-Aldrich84097-1KG
Hepes Sigma-AldrichH0887-100ML1M pH = 7-7,6
EDTA Sigma-Aldrich0390-100mlpH = 8 0,5 M
MgCl2< / sub>Sigma-AldrichM8266-100G
NaCO3< / sub>Sigma-AldrichS7795-500G
NAHCO3Sigma-AldrichS5761-500G
MetanolSigma-Aldrich322415-6X1L
KClSigma-AldrichP9541-500G
cOmplete Mini Roche11836170001inhibitor proteazy
PhosStop Inhibitor fosfatazy4906837001
Roche Zestaw do oznaczania białek BCA EurocloneEMPO14500
Criterion TGX 4-20% Bez plam, 18 dołkówBiorad5678094
Wspierana membrana nitrocelulozowa Biorad16200970,2 &m;
m Bloker klasy blotting Biorad1706404Beztłuszczowe mleko w proszku
SuperSignal West Pico Podłoże chemiluminescencyjneTermo Fisher Scientific34077
Kwas azotowy Sigma-Aldrich100441100065%
Szkiełka nakrywkowe Termo Fisher Scientific1014355118NR118 mm x 
Poly-D-LysineSigma-AldrichP7280
Zbilansowany roztwór soli HankaTermo Fisher Scientific14170-500 ml
Penicylina/Streptomycyna Termo Fisher Scientific1514012210 000 U/ml, 100 ml
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Średni Termo Fisher ScientificD5796-500 ml
Trypsyna-EDTA Termo Fisher Scientific154000540,50%
Suplement B27 Termo Fisher Scientific1750404450X
Glutamax Termo Fisher Scientific35050-038100x
DNAzaSigma-AldrichD5025
Płodowa surowica bydlęcaEurocloneEC50182L
GlutaminianSigma-Aldrich1446600-1G
Gentamycyna Termo Fisher Scientific1571010 mg/ml
Podłoże neurobazalne Termo Fisher Scientific10888-022 
Arabinozyd cytozyny (AraC)Sigma-AldrichC3350000 
VECTASHIELD antibre medium montażowe Vector LaboratoriesH-1000
DAPITermo Fisher Scientific62247
90 Ti rotorBeckmanN/AWirnik ultrawirówkowy
Optima L-90K UltrawirówkaBeckmanN/A
przeciwciało Syn-1, klon 42 BD Biosciences610786przeciwciało przeciw myszom WB: 1:5000
Przeciwciało Syn303 BioLegend824301przeciwciało anty-mysie IF: 1:1000
Przeciwciało Tau Układy synaptyczne314  002anty-królik IF: 1:10 000
pser129-α Przeciwciało S Prezent od Fujiwara i wsp., odniesienie 19anty-królik WB: 1:5000
pser129-α Przeciwciało SAbcamab51253anty-królik  JEŻELI: 1:1000
Mysz i alfa; S (D37A6) XP Sygnalizacja komórkowa4179anty-królicze IF 1:200
Alexa fluor 555-sprzężone przeciwciało anty-królicze Termo Fisher ScientificA27039
Alexa fluor 488-sprzężone przeciwciało anty-mysie Termo Fisher ScientificA-11029
Microson XL-2000 Dźwiękowóz Misonix 
Butelki Ultra (butelki Oakridge), PCB, 16x76mm, Montaż, Nasadka Noryl, Serwis naukowy typu BeckmanEUS4484Probówki ultrawirówkowe
AXIO Observer Mikroskop światła odwróconego ZeissN/A
TCS SP2 Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyLeicaN/A
Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny NikonN/A
Triton x-100Sigma-AldrichX100-500MLNiejonowy środek powierzchniowo czynny 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goedert, M., Spillantini, M. G., Del Tredici, K., Braak, H. 100 years of Lewy pathology. Nat. Rev. Neurol. 9, 13-24 (2012).
  2. Visanji, N. P., et al. α-Synuclein-Based Animal Models of Parkinson's Disease: Challenges and Opportunities in a New Era. Trends Neurosci. 39, 750-762 (2016).
  3. Luk, K. C., et al. Pathological α-Synuclein Transmission Initiates Parkinson-like Neurodegeneration in Nontransgenic Mice. Science. 338, 949-953 (2012).
  4. Rey, N. L., Petit, G. H., Bousset, L., Melki, R., Brundin, P. Transfer of human α-synuclein from the olfactory bulb to interconnected brain regions in mice. Acta Neuropathol. (Berl). 126, 555-573 (2013).
  5. Guo, J. L., et al. Distinct α-Synuclein Strains Differentially Promote Tau Inclusions in Neurons. Cell. 154, 103-117 (2013).
  6. Masuda-Suzukake, M., et al. Prion-like spreading of pathological α-synuclein in brain. Brain. 136, 1128-1138 (2013).
  7. Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous α-Synuclein Fibrils Induce Lewy Body Pathology Leading to Synaptic Dysfunction and Neuron Death. Neuron. 72, 57-71 (2011).
  8. Peelaerts, W., et al. α-Synuclein strains cause distinct synucleinopathies after local and systemic administration. Nature. 522, 340-344 (2015).
  9. Lázaro, D. F., Pavlou, M. A. S., Outeiro, T. F. Cellular models as tools for the study of the role of alpha-synuclein in Parkinson's disease. Exp. Neurol. 298, 162-171 (2017).
  10. Lee, H. -J., Patel, S., Lee, S. -J. Intravesicular localization and exocytosis of alpha-synuclein and its aggregates. J. Neurosci. Off. J. Soc. Neurosci. 25, 6016-6024 (2005).
  11. Luk, K. C., et al. Intracerebral inoculation of pathological α-synuclein initiates a rapidly progressive neurodegenerative α-synucleinopathy in mice. J. Exp. Med. 209, 975-986 (2012).
  12. Mougenot, A. -L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol. Aging. 33, 2225-2228 (2012).
  13. Recasens, A., et al. Lewy body extracts from Parkinson disease brains trigger α-synuclein pathology and neurodegeneration in mice and monkeys: LB-Induced Pathology. Ann. Neurol. 75, 351-362 (2014).
  14. Woerman, A. L., et al. Propagation of prions causing synucleinopathies in cultured cells. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 4949-4958 (2015).
  15. Luk, K. C., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils seed the formation of Lewy body-like intracellular inclusions in cultured cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 20051-20056 (2009).
  16. Sacino, A. N., et al. Intramuscular injection of α-synuclein induces CNS α-synuclein pathology and a rapid-onset motor phenotype in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 10732-10737 (2014).
  17. Lee, M. K., et al. Human alpha-synuclein-harboring familial Parkinson's disease-linked Ala-53 --> Thr mutation causes neurodegenerative disease with alpha-synuclein aggregation in transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 8968-8973 (2002).
  18. Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of -Synucleinopathy In Vivo. J. Neurosci. 32, 3306-3320 (2012).
  19. Fujiwara, H., et al. alpha-Synuclein is phosphorylated in synucleinopathy lesions. Nat. Cell Biol. 4, 160-164 (2002).
  20. Colla, E., et al. Toxic properties of microsome-associated alpha-synuclein species in mouse primary neurons. Neurobiol. Dis. 111, 36-47 (2018).
  21. Colla, E., et al. Accumulation of Toxic -Synuclein Oligomer within Endoplasmic Reticulum Occurs in -Synucleinopathy In Vivo. J. Neurosci. 32, 3301-3305 (2012).
  22. Volpicelli-Daley, L. A., Luk, K. C., Lee, V. M. -Y. Addition of exogenous α-synuclein preformed fibrils to primary neuronal cultures to seed recruitment of endogenous α-synuclein to Lewy body and Lewy neurite-like aggregates. Nat. Protoc. 9, 2135-2146 (2014).
  23. Li, W., et al. Aggregation promoting C-terminal truncation of alpha-synuclein is a normal cellular process and is enhanced by the familial Parkinson's disease-linked mutations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 2162-2167 (2005).
  24. Luk, K. C., et al. Molecular and Biological Compatibility with Host Alpha-Synuclein Influences Fibril Pathogenicity. Cell Rep. 16, 3373-3387 (2016).
  25. Volpicelli-Daley, L. A., Kirik, D., Stoyka, L. E., Standaert, D. G., Harms, A. S. How can rAAV-α-synuclein and the fibril α-synuclein models advance our understanding of Parkinson's disease. J. Neurochem. 139, 131-155 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Alpha synuclein AggregatesMicrosomes associated Alpha synucleinPrimary NeuronsFibrils FormationTissue HomogenizationDifferential CentrifugationWestern Blot AnalysisImmunofluorescence StainingProtein Aggregation DetectionNeurodegenerative Disease Model

Related Articles