Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ilościowy pomiar reaktywnych form tlenu i fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się w normalnych ludzkich fibroblastach podczas starzenia się wywołanego onkogenem

7.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57890

⸱

12 sierpnia 2018

 ,  , 
1Department of Biochemistry, College of Medicine, Dong-A University, 2Peripheral Neuropathy Research Center, College of Medicine, Dong-A University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Wykazano, że wewnątrzkomórkowy ROS odgrywa ważną rolę w indukcji starzenia się komórek. W tym miejscu opisujemy czuły test do ilościowego określania poziomów ROS podczas starzenia się komórek. Udostępniamy również protokoły oceny fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się, który podobno przyczynia się do różnych dysfunkcji związanych z wiekiem.

Streszczenie

Starzenie się komórek było uważane za stan nieodwracalnego zatrzymania wzrostu po wyczerpaniu zdolności proliferacyjnych lub wystawieniu na różne stresy. Ostatnie badania rozszerzyły rolę starzenia się komórek na różne procesy fizjologiczne, w tym rozwój, gojenie się ran, nadzór immunologiczny i dysfunkcję tkanek związaną z wiekiem. Chociaż zatrzymanie cyklu komórkowego jest krytyczną cechą charakterystyczną starzenia się komórek, wykazano również, że zwiększona produkcja wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) odgrywa ważną rolę w indukcji starzenia się komórek. Ponadto ostatnie badania wykazały, że komórki starcze wykazują silne działanie parakrynne na sąsiednie komórki i tkanki poprzez fenotyp wydzielniczy związany ze starzeniem się (SASP). Gwałtowny wzrost zainteresowania strategiami terapeutycznymi przeciwko starzeniu się komórek podkreśla potrzebę precyzyjnego zrozumienia mechanizmów starzenia, w tym wewnątrzkomórkowych ROS i SASP. W tym miejscu opisujemy protokoły ilościowej oceny wewnątrzkomórkowych poziomów ROS podczas starzenia się komórek wywołanego H-Ras przy użyciu barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na ROS i cytometrii przepływowej. Ponadto wprowadzamy czułe techniki analizy indukcji ekspresji mRNA i wydzielania czynników SASP. Protokoły te można zastosować do różnych modeli starzenia się komórek.

Wprowadzenie

Ponad 50 lat temu, Hayflick i Moorhead ujawnili, że normalne komórki wchodzą w nieodwracalne zatrzymanie wzrostu po wyczerpaniu ich potencjału proliferacyjnego po pewnej liczbie podziałów komórkowych1. Zjawisko to jest obecnie znane jako starzenie replikacyjne i uważa się, że silnie koreluje ze starzeniem się organizmów2. Chociaż postępująca erozja telomerów jest uważana za główną przyczynę starzenia replikacyjnego, doniesiono, że różne stresy komórkowe, takie jak uszkodzenie DNA, aktywacja onkogenna i stres oksydacyjny, wywołują inny rodzaj starzenia się komórek zwany "przedwczesnym starzeniem" lub "starzeniem się wywołanym stresem". Co ciekawe, przedwczesne starzenie się odgrywa silną rolę hamującą rozwój nowotworu po aktywacji onkogenów, takich jak H-Ras i BRAF. Badania na modelach mysich i tkankach ludzkich dostarczyły mocnych dowodów na to, że biomarkery starzenia się komórek były głównie obecne w zmianach przednowotworowych, w których aktywowane są onkogenne Ras i BRAF, ale były zmniejszone w nowotworach złośliwych, które rozwinęły się z tych zmian3,4,5. W poprzednich badaniach wykazano, że poza rolą w starzeniu się i supresji nowotworów, starzenie się komórek odgrywa rolę w różnych procesach fizjologicznych, w tym w gojeniu się ran, naprawie tkanek, nadzorze immunologicznym i rozwoju embrionalnym6.

Chociaż zatrzymanie wzrostu było szeroko badane jako cecha charakterystyczna starzenia się komórek7, znaczna ilość dowodów sugeruje, że wewnątrzkomórkowe reaktywne formy tlenu (ROS) również przyczyniają się do starzenia się komórek8. Podwyższenie poziomów ROS podczas różnych typów starzenia się komórek, w tym starzenia replikacyjnego i starzenia się wywołanego onkogenami (OIS), zostało pierwotnie zgłoszone kilkadziesiąt lat temu9,10. Bardziej bezpośrednie, egzogenne leczenie subletalną dawkąH2O2 indukuje starzenie się11,12. Hamowanie enzymów wymiatających ROS, takich jak SOD1, również powoduje przedwczesne starzenie się13. W przeciwieństwie do tego, niskie warunki tlenowe w otoczeniu i rosnące wymiatanie ROS opóźniają początek starzenia się10,14,15. Wyniki te niewątpliwie wskazują, że ROS są ważnymi mediatorami lub determinantami indukcji starzenia się komórek. Jednak to, w jaki sposób ROS przyczyniają się do indukcji starzenia się komórek i jak poziomy ROS są podwyższone podczas starzenia się komórek, wymaga dalszych badań.

Ostatnie badania wykazały, że komórki starcze mają silne działanie parakrynne na sąsiednich komórkach i tkankach za pośrednictwem SASP16,17. W starzejącej się tkance komórki starcze sprzyjają dysfunkcjom tkanek związanym z wiekiem poprzez wiele ścieżek poprzez SASP, oprócz autonomicznego zubożenia komórek proliferacyjnych. Różne czynniki prozapalne, takie jak IL-6, IL-8, TGFβ i metaloproteinazy macierzy (MMP), wydzielane przez komórki starcze, powodują związane z wiekiem dysfunkcje tkanek poprzez upośledzenie homeostazy tkanek, zniszczenie architektury tkanki, starzenie się sąsiednich komórek i sterylne zapalenie18,19. Jednak SASP mogą mieć korzystne działanie w zależności od kontekstu biologicznego. Ponadto heterogenetyczny charakter SASP zależy od typu komórki starczej i stadium komórki, co podkreśla potrzebę dalszych badań19.

Tutaj opisujemy szybkie i czułe techniki oparte na cytometrii do oceny wewnątrzkomórkowych poziomów ROS podczas OIS. Ponadto przedstawiono metody analizy czynników SASP z wykorzystaniem ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) i ELISA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wywoływanie starzenia się wywołanego onkogenami

  1. Przygotowanie retrowirusa H -RasV12
    1. Pokryj naczynie hodowlane o średnicy 100 mm, dodając 2 ml 0,001% soli fizjologicznej buforowanej poli-L-lizyną/fosforanem (PBS) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Usunąć roztwór poli-L-lizyny za pomocą szklanej pipety podłączonej do próżni i umyć naczynie hodowlane, dodając 2 ml 1x PBS.
    3. Płytka 3 x 106 ekotropowych komórek opakowaniowych BOSC-23 na powlekanej szalce hodowlanej ze zmodyfikowanym podłożem Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny, a następnie hodować je w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych CO2 przez 1 dzień.
    4. Następnego dnia należy przetransfekować 2 μg DNA pBabe puro-H-RasV12 wraz z retrowirusowym pakietem DNA (2 μg pGAG/pol i 0,25 μg pVSVG) za pomocą odczynnika do transfekcji przez 8 godzin zgodnie z instrukcjami producenta.
    5. Usuń pożywkę do transfekcji i dodaj 8 ml świeżej pożywki.
    6. Po 48 godzinach zebrać pożywkę zawierającą cząstki wirusa i usunąć wszelkie resztki komórkowe przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut.
    7. Przefiltrować pożywkę zawierającą wirusa H-Ras za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm.
      UWAGA: Unikaj zamrażania i rozmrażania supernatantów wirusa, aby zapewnić skuteczną infekcję wirusową. Aby uzyskać najlepszą skuteczność, użyj wirusa, który został zebrany tego samego dnia co infekcja.
  2. Zakażenie normalnych ludzkich fibroblastów WI-38 retrowirusem H-RasV12
    1. Płytka 5 x 104 komórki WI-38 w naczyniu hodowlanym o średnicy 60 mm z DMEM zawierającym 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny 1 d przed pobraniem retrowirusa H-RasV12 i hodować je przez 1 dzień w temperaturze 37 °C.
    2. Następnego dnia usuń pożywkę wzrostową i dodaj 1 ml pożywki retrowirusowej H-RasV12. Dodać dodatkowo 1 ml pożywki wzrostowej zawierającej 2 μl roztworu podstawowego polibrenu (8 mg/ml w wodzie destylowanej). Inkubować próbkę przez 1 dzień w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    3. Usuń mieszaninę retrowirusa H-RasV12 24 godziny później i umyj komórki 2x 1x PBS. Dodać pożywkę wzrostową i traktować komórki 2 μg/ml puromycyny przez 2 dni w wilgotnym inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    4. Po 2 dniach selekcji puromycyny usuń pożywkę wzrostową i umyj komórki 2x 1x PBS. Dodaj pożywkę wzrostową i hoduj komórki w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 do wskazanego punktu czasowego (patrz Rysunek 1A dla schematu ideowego).

2. Monitorowanie starzenia się za pomocą związanego ze starzeniem się barwienia β-galaktozydazy

  1. Przygotuj następujące roztwory podstawowe.
    1. Przygotować 20 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolylu β-D-galaktopyranozydu (X-gal) w dimetyloformamidzie (DMF). Przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.
    2. Przygotować bufor kwasu cytrynowego/fosforanu sodu, rozpuszczając 3,377 g Na2HPO, 4,7H 2O (126 mM) i 0,708 g kwasu cytrynowego (36,8 mM) w 100 ml wody destylowanej. W razie potrzeby dostosuj pH do 6,0.
    3. Przygotować 0,5 M żelazocyjanku potasu. Przechowywać roztwór w ciemności w temperaturze 4 °C.
    4. Przygotować 0,5 M żelazocyjanku potasu. Roztwór przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: pH roztworu barwiącego β-galaktozydazę (SA β-gal) związanego ze starzeniem się ma kluczowe znaczenie dla uzyskania dokładnych wyników.
  2. Przygotować świeży roztwór barwiący SA β-gal, rozcieńczając roztwór podstawowy zawierający 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM żelazocyjanku potasu, 5 mM żelazocyjanku potasu, 20% (v/v) kwas cytrynowy/bufor fosforanu sodu i 1 mg/ml X-gal.
  3. Usuń pożywkę hodowlaną i umyj komórki 1x 1x PBS. Utrwal komórki 3% formaldehydem przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Komórki, które nie są zakażone retrowirusem, powinny być używane jako kontrola ujemna. Niezakażone komórki kontrolne powinny być nadal przenoszone, aby utrzymać ich status proliferacji.
  4. Usuń roztwór utrwalający z komórek i umyj je 1x PBS. Dodać świeżo przygotowany 1x SA β-galonowy roztwór barwiący (1,5 ml w naczyniu hodowlanym o średnicy 60 mm). Uszczelnić naczynie folią parafinową, aby zapobiec wysuszeniu i inkubować je przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Alternatywnie, inkubować szalki razem w komorze wilgotnościowej.
    UWAGA: Roztwór utrwalający zawierający 3% formaldehydu należy usunąć jako odpad niebezpieczny. Inkubator bez CO2 jest pożądany, aby zapobiec zmianom pH podczas inkubacji.
  5. Następnego dnia sprawdź stan wybarwienia komórek pod mikroskopem; Komórki SA β-gal-dodatnie pojawiają się na niebiesko w obszarze okołojądrowym.
    UWAGA: Proliferujące komórki kontrolne wykazują niską częstotliwość komórek SA β-gal-dodatnich. Jeśli barwienie jest zbyt jasne, kontynuuj inkubację przez nieco dłuższy okres (zobacz Rysunek 1B dla reprezentatywnych przykładów).
  6. Uzyskaj obraz barwienia SA β-gal za pomocą kamery CCD przy użyciu obiektywu 10X lub większego. Uchwyć wystarczającą liczbę obrazów, aby obliczyć procent barwienia (>200 komórek).
  7. Obliczyć procent komórek zabarwionych SA β-galem, określając ilościowo liczbę komórek SA β-gal-dodatnich w stosunku do całkowitej liczby komórek.
    UWAGA: Barwienie β-gal SA należy powtarzać niezależnie co najmniej 3 razy, a średnie wartości powinny być obliczane na podstawie wyników powtórzonych eksperymentów (Rysunek 1C). Odpowiednia gęstość komórek ma kluczowe znaczenie dla eksperymentu barwienia SA β-gal. Wysoka konfluencja może zakłócać zmianę morfologii związanej ze starzeniem się i indukować fałszywie dodatni sygnał w komórkach kontrolnych.

3. Kwantyfikacja indukcji reaktywnych form tlenu podczas starzenia się wywołanego H-Ras

  1. Płytka 2 x 105 komórek WI-38 na naczyniu hodowlanym o średnicy 60 mm i wywołać starzenie się wywołane przez H-Ras, jak opisano w kroku 1.
    UWAGA: Ten protokół może być stosowany do innych typów modeli starzenia się komórek.
  2. Usuń pożywkę wzrostową we wskazanym punkcie czasowym (2, 4 lub 6 dni) i umyj komórki 1x PBS. Odłącz komórki, traktując je 1 ml 0,05% roztworu trypsyny/EDTA i dezaktywuj trypsynę, dodając 1 ml pożywki wzrostowej zawierającej 10% FBS. Określ liczbę komórek.
  3. Przenieść 1 x 105 komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i zebrać komórki przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut.
  4. Przygotować świeżą pożywkę barwiącą 2',7'-dichlorofluorescinianu (DCF-DA), dodając 50 μl 10 mM DCF-DA do 10 ml pożywki hodowlanej (stężenie robocze DCF-DA wynosi 50 μM).
    UWAGA: DCF-DA jest wrażliwy na światło. Należy unikać ekspozycji na światło. Stężenie DCF-DA i czas barwienia można regulować w zależności od typu ogniwa.
  5. Ostrożnie wyjąć pożywkę wzrostową z probówki stożkowej o pojemności 15 ml i dodać 1 ml świeżo przygotowanego podłoża barwiącego DCF-DA. Ostrożnie zawiesić ponownie osad komórkowy i inkubować go w temperaturze 37 °C przez 30 minut w ciemności. Dołączyć niebarwioną próbkę jako ujemną kontrolę barwienia.
    UWAGA: Komórki proliferacyjne niebarwione DCF-DA powinny być przygotowane jako kontrola ujemna.
  6. Zebrać komórki przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut i umyć je 1x 2 ml 1x PBS. Ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml 1x PBS i przenieść próbkę do odpowiedniej probówki do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).
  7. Zmierzyć sygnał fluorescencji dioctanu 2′,7′-dichlorodihydrofluoresceiny (DCF-DA) za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w odpowiednie źródło lasera. Wzbudzić próbki za pomocą niebieskiego lasera (488 nm) i wykryć emitowaną fluorescencję za pomocą detektora 530 ± 30 nm (FITC) przy użyciu skali logarytmicznej.
    1. Najpierw przeanalizuj niebarwione komórki kontroli ujemnej. Na wykresie kropkowym rozproszenia do przodu (FSC) w porównaniu z rozproszeniem bocznym (SSC) wybierz żywe komórki za pomocą narzędzia do bramkowania i wyeliminuj martwe komórki i resztki komórkowe.
      UWAGA: Zmiana rozmiaru komórki powinna być uważnie monitorowana na wykresie kropkowym FSC w porównaniu z SSC. Jeśli rozmiar komórek starczych jest znacznie zwiększony, intensywność DCF-DA należy porównać w populacjach komórek tej samej wielkości po bramkowaniu na wykresie kropkowym FSC i SSC.
    2. Na jednoparametrowym histogramie wyświetlającym fluorescencję DCF-DA (488 nm) na skali logarytmicznej osi x i liczbę zdarzeń (liczbę komórek) na skali liniowej osi y, dostosuj napięcie lasera 488 nm, aby umieścić pik z niebarwionych komórek na lewej krawędzi.
    3. Przeanalizuj próbki barwione DCF-DA i zarejestruj co najmniej 10 000 zdarzeń dla każdej próbki. Uzyskać średnią wartość fluorescencji każdej próbki za pomocą oprogramowania analitycznego specyficznego dla cytometru przepływowego.
      UWAGA: Pomiary ROS należy powtarzać niezależnie co najmniej 3x, a średnie wartości należy obliczać na podstawie tych wyników. Reprezentatywne wyniki starzenia się wywołanego przez H-Ras są pokazane na Rysunek 2.

4. Kwantyfikacja ekspresji mRNA IL-6 i IL-8 dla analizy fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym

  1. Przygotowanie całkowitego RNA
    1. Płytkę 3 x 105 komórek WI-38 na naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm w DMEM zawierającym 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny i hodować je w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 1 dzień. Przygotuj zduplikowane kultury dla każdego punktu czasowego.
    2. Indukuj starzenie się poprzez zakażenie komórek retrowirusem H-RasV12, jak opisano w kroku 1.
    3. Na 1 dzień przed zbiorem przemyj komórki 2x 1x PBS i dodaj 3 ml DMEM bez FBS.
      UWAGA: Ten etap jest przeprowadzany w celu wytworzenia kondycjonowanej pożywki używanej do testu ELISA, jak opisano w kroku 5. Głód surowicy może indukować ekspresję mRNA IL-6 i IL-8 w niektórych wrażliwych komórkach. W związku z tym należy wstępnie porównać ekspresję mRNA IL-6 i IL-8 w komórkach hodowanych z głodem surowicy i bez niego. Jeśli głód surowicy wywołuje znaczące zmiany w ekspresji mRNA IL-6 lub IL-8, całkowite RNA do qPCR i kondycjonowaną pożywkę dla ELISA należy przygotować oddzielnie.
    4. Pobrać kondycjonowaną pożywkę z każdej próbki 24 godziny później i przechowywać pożywkę w temperaturze -80 °C do testu ELISA.
    5. Odłącz komórki, traktując je 1 ml 0,05% roztworu trypsyny/EDTA i dezaktywuj trypsynę, dodając 1 ml pożywki wzrostowej zawierającej 10% FBS. Określ liczbę komórek w celu normalizacji wyników testu ELISA zgodnie z opisem w kroku 5. Zebrać komórki w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut.
    6. Usunąć pożywkę przez delikatne odsysanie i dodać 1 ml roztworu do ekstrakcji RNA. Następnie energicznie wiruj probówkę mikrowirówki przez 15 sekund. Następnie dodać 200 μl chloroformu i energicznie ponownie wirować mieszaninę przez dodatkowe 15 sekund.
    7. Odwirować probówki z próbkami o masie 17 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie ostrożnie przenieś górną fazę do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Interfaza i dolna faza organiczna nie powinny być zakłócane podczas przenoszenia górnej fazy do nowej rurki.
    8. Dodaj 400 μl izopropanolu, aby wytrącić RNA i dobrze wymieszaj je przez delikatną inwersję. Następnie inkubować probówkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    9. Odwirować probówkę o stężeniu 17 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie wyrzuć supernatant, uważając, aby zachować osad RNA. Umyj RNA, dodając 1 ml 75% etanolu i odwróć probówkę 2–3 razy. Odwirować probówkę przez 5 minut przy 17 000 x g w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
    10. Wysuszyć osad RNA w temperaturze pokojowej i rozpuścić RNA w 50 μl wody destylowanej uzdatnionej pirowęglanem dietylu (DEPC). Używając 1 μl roztworu RNA, oznacz ilościowo całkowite stężenie RNA za pomocą spektrofotometru.
      UWAGA: Przesuszenie zmniejszy rozpuszczalność RNA; dlatego należy unikać przesuszenia RNA.
  2. Przygotowanie cDNA
    1. Przygotować mieszaninę reakcji odwrotnej transkrypcji dla każdej próbki, dodając do cienkościennej probówki PCR: 2 μg całkowitego RNA (dostosować objętość do 10 μl wodą wolną od RNaz), 2 μL 10x buforu RT, 1 μL losowego startera (50 pmol), 0,8 μL 25x mieszanki dNTP (100 mM), 1 μl odwrotnej transkryptazy MMLV (50 U/μL) i 5,2 μl wody wolnej od RNaz.
    2. Ustaw program reakcji odwrotnej transkrypcji na termocyklerze w następujących warunkach: 42 °C przez 60 min i 95 °C przez 5 min. Umieść probówki PCR w termocyklerze i uruchom program.
  3. Reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym
    1. Przygotuj główną mieszankę PCR w czasie rzeczywistym dla wszystkich reakcji. Mieszanina reakcyjna dla każdej próbki jest następująca: 25 μL 2x PCR Master Mix w czasie rzeczywistym, 1 μl każdego ze starterów do przodu i do tyłu dla IL-6 lub IL-8 oraz 21 μL ultraczystej wody destylowanej (bez DNaz i RNaz). Patrz tabela 1.
      UWAGA: Przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR w czasie rzeczywistym dla każdej próbki zawierającej startery aktynowego RNA jako kontrolę wewnętrzną. GAPDH może być również stosowany jako wewnętrzna kontrola normalizacji.
    2. Dodać 48 μl mieszanki wzorcowej i 2 μl 3-krotnie rozcieńczonego produktu cDNA z wodą do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce optycznej qPCR. Każdą reakcję należy przeprowadzić w trzech egzemplarzach. Przygotować studzienkę kontrolną, która nie zawiera matrycy cDNA jako kontrolę PCR.
    3. Ustaw program reakcji PCR w czasie rzeczywistym na termocyklerze w następujących warunkach: 10 min w 95 °C, 40 cykli po 15 s w 95 °C (denaturacja) i 1 min w 60 °C (wyżarzanie i przedłużanie).
    4. Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym i zarejestruj wartość progową cyklu (CT) po zakończeniu cykli PCR. Oblicz poziomy mRNA dla IL-6 lub IL-8 za pomocą metody 2-ΔΔCΤ 20.
      UWAGA: Względna zmiana krotności w wyrażeniu jest określana po normalizacji do poziomów aktyny przy użyciu następującego wzoru:
      Zmiana zagięcia = 2-Δ(ΔCT)
      Tutaj,
      ΔCT = CT, IL-6 lub IL-8-C T, aktyna; oraz
      Δ(ΔCT) = ΔCT, stymulowany-ΔC T, kontrola.
    5. Obliczyć średnią wartość dla każdej zduplikowanej próbki.
      UWAGA: qPCR należy powtórzyć niezależnie co najmniej 3 razy, a średnie wartości należy obliczyć na podstawie tych wyników. Reprezentatywne wyniki starzenia się wywołanego przez H-Ras są pokazane w Rysunek 3. Głód surowicy może indukować ekspresję mRNA IL-6 i IL-8 w niektórych wrażliwych komórkach. W związku z tym należy wstępnie porównać ekspresję mRNA IL-6 i IL-8 w komórkach hodowanych z głodem surowicy i bez niego. Jeśli głód surowicy wywołuje znaczące zmiany w ekspresji mRNA IL-6 lub IL-8, całkowite RNA do qPCR i kondycjonowaną pożywkę dla ELISA należy przygotować oddzielnie.

5. Kwantyfikacja poziomów wydzielanych białek IL-6 i IL-8 dla analizy fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się za pomocą testu ELISA

  1. Rozmrozić 3 ml kondycjonowanej pożywki zebranej ze starzejących się komórek WI-38 zgodnie z opisem w kroku 4. Usunąć resztki komórek przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 min.
  2. Zagęścić kondycjonowane podłoże 10-krotnie przez odwirowanie przy 3 000 x g przez 20 minut za pomocą filtra odśrodkowego.
    UWAGA: Stężenie kondycjonowanego podłoża niekoniecznie musi zależeć od typu próbki.
  3. Przeprowadzić test ELISA, używając 50 μl każdej stężonej próbki kondycjonowanego podłoża z odpowiednimi zestawami ELISA IL-6 i IL-8.
    UWAGA: Przetestuj każdą próbkę w dwóch studzienkach ELISA. Ponieważ każdy punkt czasowy jest duplikowany w kroku 4, analiza ta pozwala nam monitorować zmiany zarówno w teście ELISA, jak i w technice przygotowania próbki.
    1. W przypadku powlekania płytki ELISA należy rozcieńczyć przeciwciało IL-6 lub IL-8 1x PBS do stężenia 0,5 μg/ml dla IL-6 lub 0,125 μg/ml dla IL-8. Dodać 100 μl rozcieńczonych przeciwciał do każdego dołka płytki ELISA. Uszczelnić płytkę folią uszczelniającą do płytek ELISA i inkubować bez wstrząsania przez noc w temperaturze pokojowej.
    2. Usunąć roztwór przeciwciała przez aspirację. Przemyj każdą studzienkę 4x 300 μl 1x buforu do płukania (0,05% Tween-20 w PBS). Dodać 300 μl buforu blokującego (1% BSA w PBS) do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    3. Usunąć roztwór blokujący przez aspirację. Przemyć każdą studzienkę 4x 300 μL 1x buforu do płukania. Przygotować seryjnie rozcieńczone wzorce ELISA w buforze rozcieńczania (0,05% Tween-20 i 0,1% BSA w PBS) w celu wygenerowania krzywej wzorcowej.
      UWAGA: Seryjne rozcieńczenie dla IL-6 wynosi 31,25, 62,5, 125, 250, 500, 1,000 i 2,000 pg/ml. Seryjne rozcieńczenie IL-8 wynosi 2,34, 4,69, 9,38, 18,75, 37,5, 75 i 150 pg/ml.
    4. Dodać 100 μl roztworu wzorcowego lub 100 μl roztworu próbki (50 μl stężonej pożywki z 50 μl buforu rozcieńczającego) do każdego studzienki. Inkubować studzienki w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
    5. Usunąć roztwór wzorcowy lub próbkę przez aspirację. Przemyć każdą studzienkę 4x 300 μL 1x buforu do płukania. Rozcieńczyć przeciwciało detekcji buforem rozcieńczającym do stężenia 0,1 μg/ml dla IL-6 lub 0,25 μg/ml dla IL-8. Dodać 100 μl rozcieńczonego przeciwciała do dołka. Inkubować studzienki w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
    6. Usunąć roztwór przeciwciała przez aspirację. Przemyć każdą studzienkę 4x 300 μL 1x buforu do płukania. Rozcieńczyć peroksydazę streptawidyny i chrzanu (HRP) w buforze rozcieńczającym do stężenia 0,05 μg/ml. Dodać 100 μl roztworu streptawidyny-HRP do dołka. Inkubować studzienki w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
    7. Usunąć roztwór przeciwciała przez aspirację. Przemyć każdą studzienkę 4x 300 μL 1x buforu do płukania. Dodać 100 μl roztworu substratu 3,3′,5,5′-tetrametylobenzydyny (TMB) do każdej studzienki. Inkubuj studzienki w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby umożliwić rozwój koloru. Zatrzymać reakcję, dodając 100 μl 1 M roztworu zatrzymującego HCl.
    8. Odczytać absorbancję każdej studzienki za pomocą czytnika ELISA przy długości fali 450 nm.
    9. Wykreśl krzywą standardową dla wygenerowanych standardów. Obliczyć stężenia IL-6 i IL-8 w kondycjonowanym podłożu zgodnie z krzywymi wzorcowymi. Wykreśl wyniki po normalizacji do liczby komórek. Obliczyć średnie wartości dla zduplikowanych próbek.
      UWAGA: Test ELISA należy powtarzać niezależnie co najmniej 3 razy, a średnie wartości powinny być obliczane na podstawie tych wyników (Rysunek 4).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przykład starzenia indukowanego przez H-Ras przedstawiono na Rysunku 1. Zakażenie prawidłowych ludzkich fibroblastów WI-38 retrowirusem H-RasV12 wywołało gwałtowne zmiany morfologiczne (Rysunek 1B). Ponadto, jak pokazano na Rysunku 1C, aktywność barwienia SA β-gal znacząco wzrosła po ekspresji H-RasV12. Ponad 70% komórek wykazywało aktywność barwienia SA β-gal 6 d po zakażeniu retrowirusem H-RasV12, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiliśmy metody monitorowania wewnątrzkomórkowych poziomów ROS podczas starzenia się wywołanego przez H-Ras w normalnych ludzkich fibroblastach WI-38. Wewnątrzkomórkowe poziomy ROS w żywych komórkach można mierzyć ilościowo za pomocą przepuszczalnego dla komórek odczynnika DCF-DA i cytometrii przepływowej. Po wychwycie komórkowym DCF-DA jest deacetylowany przez esterazy wewnątrzkomórkowe, a następnie utleniany przez ROS, tworząc wysoce fluorescencyjną 2',7'-dichlorofluoresceinę (DCF). Fluorescencję D...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została wsparta grantem z Narodowej Fundacji Badawczej Korei (2015R1D1A1A01060839) (dla Young Yeon Kim) oraz grantem Narodowej Fundacji Badawczej Korei (NRF) finansowanym przez rząd Korei (MSIT) (nr 2016R1A2B2008887, nr 2016R1A5A2007009) (dla Jeanho Yuna).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ODCZYNNIKI
poly-L-lizynaSigma-AldrichP2636
BOSC 23ATCCCRL-11269
FBSGIBCO16000-044
penicylina/streptomycynawellgeneLS202-02
PBSHyclonSH30013.02
DMEMGIBCO12800-082
OPTI-MEM GIBCO31985-070
pBabe puro-H-RasV12 Addgene1768
pGAG/polAddgene14887
pVSVGAddgene1733
TurbofectThermo Fisher ScientificR0531
polibrenSigma-AldrichH92688 mg/mL
puromycynaSigma-AldrichP88332 mg/mL 
formaldehydSigma-AldrichF8775
5-bromo-4-chloro-3-indolyl β D-galaktopiranozyd (X-gal)Sigma-AldrichB4252
żelazocyjanek potasuSigma-AldrichB4252
żelazocyjanek potasuSigma-AldrichP9387
trypsyna-EDTAwellgeneLS015-01
DCF-DASigma-Aldrich D688310 mM 
TrizolThermo Fisher Scientific15596026
MMLV Odwrotna transkryptazaPromegaM1701
SYBR Green PCR master 2x mixTakaraPR820A
Random PrimerPromegaC118A
Tween-20Sigma-AldrichP9416
Ultraczysta woda destylowanaInvitrogen10977015
ELISA u człowieka IL-6PeproTech#900-TM16
Test ELISA u człowieka IL-8PeproTech#900_TM18
EQUIPMENTS
0,45 μ m filtr strzykawkowysartorius16555
ParafilmBEMIS PM-996
MikroskopNIKONTS100
Cytometr przepływowyBD BioscienceLSR Fortessa
Amicon Ultra-4mlMerk MilliporeUFC800324
Spektrofotometr NanoDropBioDrop80-3006-61
System PCR w czasie rzeczywistymApplied BiosystemsABI Prism 7500
ELISA CzytnikMolecular DevicesCzytnik
Test mikropłytek EMax

Bibliografia

  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
  3. Braig, M., et al. Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development. Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).
  4. Michaloglou, C., et al. BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi. Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).
  5. Collado, M., et al. Tumour biology: senescence in premalignant tumours. Nature. 436 (7051), 642(2005).
  6. Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype. Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).
  7. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes & Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  8. Lu, T., Finkel, T. Free radicals and senescence. Experimental Cell Research. 314 (9), 1918-1922 (2008).
  9. Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress. Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).
  10. Lee, A. C., et al. Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species. The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).
  11. Chen, Q., Ames, B. N. Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).
  12. Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).
  13. Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts. The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).
  14. Packer, L., Fuehr, K. Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells. Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).
  15. Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening. The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).
  16. Rodier, F., Campisi, J. Four faces of cellular senescence. The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).
  17. Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).
  18. Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).
  19. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  20. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  21. Kim, Y. Y., et al. Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence. Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).
  22. Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a. Cell. 88 (5), 593-602 (1997).
  23. Wu, D., Yotnda, P. Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).
  24. Wojtala, A., et al. Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry. Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).
  25. Duncan, F. E., et al. Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte. Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).
  26. Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence. Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).
  27. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  28. Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
  29. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  30. Baker, D. J., et al. Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency. Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).
  31. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  32. Baar, M. P., et al. Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging. Cell. 169 (1), 132-147 (2017).
  33. Farr, J. N., et al. Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice. Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).
  34. Chang, J., et al. Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).
  35. Yosef, R., et al. Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL. Nature Communications. 7, 11190(2016).
  36. Jeon, O. H., et al. Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment. Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Starzenie kom rkowestarzenie indukowane bia kiem H Rasbarwienie SA Beta galcytometria przep ywowabarwienie DCF DAReal time PCRtest ELISA
Ilościowy pomiar reaktywnych form tlenu i fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem się w normalnych ludzkich fibroblastach podczas starzenia się wywołanego onkogenem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.