Artykuł metodologiczny

Drukowany w 3 wymiarach (3D) szablon do wysokowydajnego układania zarodków danio pręgowanego

DOI:

10.3791/57892

⸱

1 czerwca 2018

 ,  , 
1College of Environmental Science and Engineering, State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, Tongji University, 2UNEP-Tongji Institute of Environment for Sustainable Development, Tongji University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół projektowania i produkcji szablonu do układania zarodków danio pręgowanego, a następnie szczegółową procedurę użycia takiego szablonu do wysokowydajnego układania zarodków danio pręgowanego na 96-dołkowej płytce.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany jest uznanym na całym świecie organizmem słodkowodnym, często wykorzystywanym w badaniach nad biologią rozwojową, toksykologią środowiskową i chorobami ludzkimi. Dzięki swoim unikalnym cechom, w tym dużej płodności, przezierności zarodków, szybkiemu i jednoczesnemu rozwojowi itp., zarodki danio pręgowanego są często wykorzystywane do oceny toksyczności chemikaliów na dużą skalę i badań przesiewowych leków/związków. Typowa procedura przesiewowa obejmuje tarło dorosłych danio pręgowanego, selekcję zarodków i ułożenie zarodków w wielodołkowych płytkach. Stamtąd zarodki są poddawane ekspozycji, a toksyczność substancji chemicznej lub skuteczność leków/związków można stosunkowo szybko ocenić na podstawie obserwacji fenotypowych. Wśród tych procesów układanie zarodków jest jednym z najbardziej czasochłonnych i pracochłonnych etapów, który ogranicza poziom przepustowości. W tym protokole przedstawiamy innowacyjne podejście, które wykorzystuje wydrukowany w 3D szablon do układania w szyku w połączeniu z manipulacją próżnią, aby przyspieszyć ten pracochłonny krok. Niniejszy protokół opisuje ogólny projekt szablonu macierzy, szczegółową konfigurację eksperymentalną i procedurę krok po kroku, po której następują reprezentatywne wyniki. Po wdrożeniu, podejście to powinno okazać się korzystne w różnych zastosowaniach badawczych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego jako obiektów testowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako popularny organizm modelowy, danio pręgowany jest szeroko stosowany w medycynie i toksykologii1,2,3,4. W porównaniu z platformami in vitro, danio pręgowany oferuje znacznie większą złożoność biologiczną, której jeden lub dwa typy komórek nie były w stanie zaoferować. Oprócz tego, że jest to model całego organizmu, duża płodność danio pręgowanego, szybki i jednoczesny rozwój embrionalny oraz wysoka przezroczystość narządów dały temu modelowi unikalne zalety do wykorzystania w przypadku toksyczności na dużą skalę lub badań przesiewowych leków/związków5. Setki zarodków wytwarzanych każdego tygodnia przez jedną parę dorosłych ryb danio pręgowanych przewyższają wszelkie inne modele całych zwierząt i sprawiają, że nadają się one do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości.

Typowa procedura przesiewowa z użyciem danio pręgowanego obejmuje znaczną ilość pracy manualnej, takiej jak tarło dorosłych danio pręgowanego, selekcja zarodków i umieszczanie zarodków w odpowiednich pojemnikach, gdzie są poddawane ekspozycji poprzez zanurzenie w wodzie. Rozwój zarodków jest monitorowany, a obserwowalne punkty końcowe, takie jak śmiertelność, wylęgowość i nieprawidłowości, są często oceniane ręcznie i wykorzystywane jako wstępna identyfikacja toksyczności substancji chemicznych lub wskaźniki skuteczności leków lub związków. Aby przyspieszyć procedurę badań przesiewowych, już wcześniej badano takie podejścia, jak zautomatyzowane obrazowanie i komputerowa analiza obrazu. Na przykład mikroskopy o wysokich możliwościach obrazowania zostały przystosowane do wykonywania zautomatyzowanego obrazowania w jasnym polu lub obrazowania fluorescencyjnego na zarodkach danio pręgowanego na różnych etapach rozwoju z płytek 96/384-dołkowych6. Urządzenia mikroprzepływowe sprzężone z mikroskopami zostały użyte do pozycjonowania larw danio pręgowanego za pomocą manipulacji prądem w celu obrazowania neuronów mózgowych7. Podejścia te mogą znacznie poprawić efektywność pozyskiwania obrazów w porównaniu z tradycyjną obsługą ręczną. Co więcej, ze względu na dużą liczbę generowanych obrazów, opracowano również narzędzia do analizy obrazów w celu przyspieszenia przetwarzania danych, jak wykazali Liu i wsp. oraz Tu i wsp.8,9.

Wraz ze wzrostem przepustowości obrazowania i analizy obrazu, stało się jasne, że etap ograniczający szybkość badań przesiewowych polega na procesie przygotowania zarodków danio pręgowanego do ekspozycji, co zazwyczaj oznacza ułożenie ich na 96- lub 384-dołkowych płytkach. Aby rozwiązać ten problem z wąskim gardłem, Mandrell i wsp. opracowali robotykę sterowaną wizją.10 i us11 poprzednio, aby zastąpić ręczną obsługę, ale instrumenty były dość wyrafinowane i istnieje głęboka krzywa uczenia się, aby wdrożyć takie techniki. W związku z tym zapewnienie łatwego w użyciu podejścia staje się jednym z ważnych czynników dalszej poprawy poziomu przepustowości badań przesiewowych danio pręgowanego i jest głównym celem tych prac.

W tej pracy zaprojektowaliśmy i wykonaliśmy szablon do układania zarodków za pomocą druku 3D. Taki szablon do układania został zaprojektowany w celu uwięzienia zarodka danio pręgowanego w studzienkach, które pasują do standardowej płytki 96-dołkowej. Zamiast wybierać zarodki i układać je w osobne studzienki jeden po drugim, można przeprowadzić uwięzienie zarodka i ułożyć wszystkie 96 zarodków w wielościennej płytce jednocześnie. Korzystając z tego szablonu i następującego po nim protokołu, można znacznie zwiększyć wydajność układania zarodków w płytki wielościenne, co w efekcie zwiększyłoby zdolność badań przesiewowych co najmniej dziesięciokrotnie w porównaniu z operacją ręczną. Opisany poniżej protokół zawiera ogólny projekt szablonu do ustawiania w szyku, tarła danio pręgowanego, zbierania zarodków i szykowania. Rysunek 1 pokazuje ogólny wygląd szablonu tablicy. Rysunek 2 pokazuje przegląd protokołu krok po kroku dotyczącego korzystania z szablonu opisanego w częściach 3 i 4.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projekt i wykonanie szablonu do układania zarodków danio pręgowanego

  1. Zaprojektuj szablon tablicy z 96-dołkowym układem 12 na 8, który pasuje do standardowej płytki 96-dołkowej. Użyj wymiarów podanych w Rysunek 1A dla górnej komory uwięzienia zarodków (zobacz również plik uzupełniający).
    1. Użyj wymiarów pokazanych w Rysunek 1B i 1D dla studni pułapki.
    2. Użyj wymiarów w Rysunek 1C dla dolnej komory próżniowej.
    3. Użyj wymiarów w Rysunek 1B dla wlotu/wylotu powietrza.
  2. Użyj drukarki 3D (z dokładnością do 0,1 mm), aby wydrukować szablon; zobacz Tabelę materiałów, aby zapoznać się z zalecaną żywicą do drukowania.
    UWAGA: Drukarki 3D o dokładności 0,1 mm są zalecane do wytwarzania szablonu do szykowania (patrz Tabela Materiałów). Sugerowany kolor powierzchni szablonu to ciemnoszary lub.

2. Tarło zarodków danio pręgowanego

  1. Umieść dwie pary samców i samic ryb w komorze godowej na jeden dzień przed tarłem. Oddziel samce i samice przezroczystą plastikową przegrodą.
  2. Zdejmij przegrody rano, aby wymieszać samce i samice ryb.
  3. Usuń samce i samice ryb i zbierz zarodki danio pręgowanego za pomocą sitka o drobnych oczkach. Umyj zarodki 250 ml wody jajecznej (patrz tabela materiałów).
  4. Przenieść pobrane zarodki na szalki Petriego (o średnicy 90 mm) za pomocą roztworu Holtfretera (patrz tabela materiałów) i usunąć martwe i niezapłodnione zarodki za pomocą stereomikroskopu.
  5. Umieścić zarodki w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C. Po 4 godzinach od zapłodnienia (hpf) obserwuj zarodki i usuń wszelkie martwe i niezdrowe zarodki. Zarodki są teraz gotowe do następnego kroku.

3. Przygotowanie szablonu do tworzenia tablic

  1. Umyj szablon 2-3 razy 500 ml wody dejonizowanej i włóż do suszarki (45 °C) na 5 minut.
  2. Zaklej dolną komorę kawałkiem folii uszczelniającej (Rysunek 2, Krok 1).
  3. Podłącz pompę próżniową przez wylot powietrza na dole szablonu.
    UWAGA: Zalecane maksymalne podciśnienie dla pompy próżniowej wynosi 0.1 MPa. Należy pamiętać o sile używanej próżni. Jeśli podciśnienie jest zbyt silne, wytnij otwór w kształcie krzyża w folii uszczelniającej, aby obniżyć ciśnienie.

4. Układanie zarodków danio pręgowanego w 96-dołkowej płytce

  1. Za pomocą plastikowej pipety transferowej umieść około 150 zarodków w szablonie, jak pokazano w Rysunek 2, Krok 2.
  2. Podłącz pompę próżniową do wylotu powietrza, aby wytworzyć podciśnienie w komorze uszczelnionej folią uszczelniającą w kroku 3.3.
  3. Potrząśnij całym szablonem poziomo, aż w każdym dołku uwięziony będzie jeden zarodek (Rysunek 2, Krok 3).
    UWAGA: Jeśli roztwór Holtfretera wyschnie, zanim zarodki zostaną uwięzione w każdym dołku, dodaj dodatkowy roztwór Holtfretera do komory uwięzionej i powtórz ten krok.
  4. Odrzuć nadmiar roztworu Holtfretera i zarodki, które nie są uwięzione w studzienkach (Rysunek 2, Krok 4).
  5. Wyłącz i odłącz pompę próżniową.
  6. Umieść standardową 96-dołkową płytkę do góry nogami na szablonie (Rysunek 2, Krok 5) i obróć obie w tym samym czasie (Rysunek 2, Krok 6).
  7. Postukaj w dolną część szablonu lub podłącz wylot powietrza do puszki do pylenia sprężonym gazem, aby przenieść wszystkie uwięzione zarodki z szablonu do płytki 96-dołkowej (Rysunek 2, Krok 6).
  8. Powtórzyć kroki od 4.1 do 4.8, aby przygotować dodatkowe płytki wielodołkowe.
  9. Usuń folię uszczelniającą i umyj szablon 3 razy od góry do dołu 500 ml wody dejonizowanej do wykorzystania w przyszłości.
    UWAGA: Do czyszczenia szablonu nie używaj żadnych rozpuszczalników organicznych, takich jak etanol.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rysunek 3 przedstawia typowy szablon tablicy wydrukowany w 3D. Ten szablon wykorzystuje żywicę światłoczułą jako surowiec i został wykonany przez drukarkę 3D; Nałożono warstwę czarnej farby, aby zapewnić lepszy kontrast z kolorem zarodków. Pozycja 96 dołków (12 na 8) została zaprojektowana tak, aby pasowała do standardowej płytki 96-dołkowej. Podobnie, szablon odwiertu 384 (24 na 16) może być również zaprojektowany i wykonany przy użyciu tej samej metody. Gór...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole istnieją dwa krytyczne kroki, które wymagają szczególnej uwagi w celu pomyślnego wdrożenia wydrukowanego w 3D szablonu do układania zarodków danio pręgowanego.

Najważniejszym czynnikiem wpływającym na projekt szablonu tablicowego jest studnia uwięzienia. Aby upewnić się, że w każdej studzience uwięziony jest tylko jeden zarodek, należy zwrócić szczególną uwagę na średnicę i głębokość dołka pułapkowego oraz średnicę otworu przelotowego. Zalecana średnica mieści się w zakresie od...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy wypełnili patent na opisywany szablon wydrukowany w 3D.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez program "1000plan Youth", fundusze startowe z Uniwersytetu Tongji oraz grant NSFC# 21607115 i 21777116 (Lin).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zakład Danio PręgowanyShanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.Z-A-S5
Skrzynka godowaShanghai Haisheng Biotech Co., Ltd.
Butelka do mycia, 500 mlSangon BiotechF505001-0001
Chlorek soduVetecV900058-500G
Chlorek potasuSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10016318
Chlorek wapniaSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd20011160
Wodorowęglan sodu VetecV900182-500G
Hydrat błękitu metylenowegoTCIM0501
Kwas solnySinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10011008
Sole morskieInstant OceanSS15-10
PipeterFisherbrand13-675M
Pipeta z kontrolowanym spadkiemPasteura Fisherbrand13-678-30
MikroskopOLYMPUSSZ61
Inkubator biochemicznyShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.LRH-250
UnionTechLite600
Żywica światłoczułaUnionTechUTR9000
Pompa próżniowaShanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd.SHB-IIIA
płytkaCostar3599
lEppendorf3122000.051
Miotełka do kurzu na sprężony gazShanghai Zhantu Chemical Co., Ltd.ST1005
DI WaterThermoGenPure Pro UV/UF
Suszarka do suszeniaShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.BPG-9106A
System wody: Woda z obiektu" s system wodny
jajecznaRozcieńczony 60mg " Natychmiastowy ocean" soli morskich i 0,25 mg/l błękitu metylenowego w 1 l wody
DI Holtfreter' 7,0 g chlorku sodu (NaCl), 0,4 g wodorowęglanu sodu (NaHCO3), 0,1 g chlorku potasu (KCl), 0,235 g chlorku wapnia (CaCl2,2H2O) w 1,9 l wody DI. Dostosuj pH do 7 za pomocą HCl i dostosuj objętość do 2 l za pomocą wody Di
Drukarka 3D Samoprzylepne uszczelki płytkowe do PCR Solarbio YA0245 96-dołkowa Wielokanałowa pipeta 30 - 300 μWoda

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  2. Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017).
  3. Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).
  4. Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
  5. Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
  6. Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).
  7. Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
  8. Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7 (4), (2012).
  9. Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533(2017).
  10. Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
  11. Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

3D Printed TemplateHigh Throughput ScreeningVacuum ManipulationEmbryo SpawningEmbryo Selection96 Well PlateEmbryo TrappingEmbryo TransferTemplate Sterilization

Powiązane artykuły