Tutaj prezentujemy protokół projektowania i produkcji szablonu do układania zarodków danio pręgowanego, a następnie szczegółową procedurę użycia takiego szablonu do wysokowydajnego układania zarodków danio pręgowanego na 96-dołkowej płytce.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Drukowany w 3 wymiarach (3D) szablon do wysokowydajnego układania zarodków danio pręgowanego
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Danio pręgowany jest uznanym na całym świecie organizmem słodkowodnym, często wykorzystywanym w badaniach nad biologią rozwojową, toksykologią środowiskową i chorobami ludzkimi. Dzięki swoim unikalnym cechom, w tym dużej płodności, przezierności zarodków, szybkiemu i jednoczesnemu rozwojowi itp., zarodki danio pręgowanego są często wykorzystywane do oceny toksyczności chemikaliów na dużą skalę i badań przesiewowych leków/związków. Typowa procedura przesiewowa obejmuje tarło dorosłych danio pręgowanego, selekcję zarodków i ułożenie zarodków w wielodołkowych płytkach. Stamtąd zarodki są poddawane ekspozycji, a toksyczność substancji chemicznej lub skuteczność leków/związków można stosunkowo szybko ocenić na podstawie obserwacji fenotypowych. Wśród tych procesów układanie zarodków jest jednym z najbardziej czasochłonnych i pracochłonnych etapów, który ogranicza poziom przepustowości. W tym protokole przedstawiamy innowacyjne podejście, które wykorzystuje wydrukowany w 3D szablon do układania w szyku w połączeniu z manipulacją próżnią, aby przyspieszyć ten pracochłonny krok. Niniejszy protokół opisuje ogólny projekt szablonu macierzy, szczegółową konfigurację eksperymentalną i procedurę krok po kroku, po której następują reprezentatywne wyniki. Po wdrożeniu, podejście to powinno okazać się korzystne w różnych zastosowaniach badawczych z wykorzystaniem zarodków danio pręgowanego jako obiektów testowych.
Wprowadzenie
Jako popularny organizm modelowy, danio pręgowany jest szeroko stosowany w medycynie i toksykologii1,2,3,4. W porównaniu z platformami in vitro, danio pręgowany oferuje znacznie większą złożoność biologiczną, której jeden lub dwa typy komórek nie były w stanie zaoferować. Oprócz tego, że jest to model całego organizmu, duża płodność danio pręgowanego, szybki i jednoczesny rozwój embrionalny oraz wysoka przezroczystość narządów dały temu modelowi unikalne zalety do wykorzystania w przypadku toksyczności na dużą skalę lub badań przesiewowych leków/związków5. Setki zarodków wytwarzanych każdego tygodnia przez jedną parę dorosłych ryb danio pręgowanych przewyższają wszelkie inne modele całych zwierząt i sprawiają, że nadają się one do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości.
Typowa procedura przesiewowa z użyciem danio pręgowanego obejmuje znaczną ilość pracy manualnej, takiej jak tarło dorosłych danio pręgowanego, selekcja zarodków i umieszczanie zarodków w odpowiednich pojemnikach, gdzie są poddawane ekspozycji poprzez zanurzenie w wodzie. Rozwój zarodków jest monitorowany, a obserwowalne punkty końcowe, takie jak śmiertelność, wylęgowość i nieprawidłowości, są często oceniane ręcznie i wykorzystywane jako wstępna identyfikacja toksyczności substancji chemicznych lub wskaźniki skuteczności leków lub związków. Aby przyspieszyć procedurę badań przesiewowych, już wcześniej badano takie podejścia, jak zautomatyzowane obrazowanie i komputerowa analiza obrazu. Na przykład mikroskopy o wysokich możliwościach obrazowania zostały przystosowane do wykonywania zautomatyzowanego obrazowania w jasnym polu lub obrazowania fluorescencyjnego na zarodkach danio pręgowanego na różnych etapach rozwoju z płytek 96/384-dołkowych6. Urządzenia mikroprzepływowe sprzężone z mikroskopami zostały użyte do pozycjonowania larw danio pręgowanego za pomocą manipulacji prądem w celu obrazowania neuronów mózgowych7. Podejścia te mogą znacznie poprawić efektywność pozyskiwania obrazów w porównaniu z tradycyjną obsługą ręczną. Co więcej, ze względu na dużą liczbę generowanych obrazów, opracowano również narzędzia do analizy obrazów w celu przyspieszenia przetwarzania danych, jak wykazali Liu i wsp. oraz Tu i wsp.8,9.
Wraz ze wzrostem przepustowości obrazowania i analizy obrazu, stało się jasne, że etap ograniczający szybkość badań przesiewowych polega na procesie przygotowania zarodków danio pręgowanego do ekspozycji, co zazwyczaj oznacza ułożenie ich na 96- lub 384-dołkowych płytkach. Aby rozwiązać ten problem z wąskim gardłem, Mandrell i wsp. opracowali robotykę sterowaną wizją.10 i us11 poprzednio, aby zastąpić ręczną obsługę, ale instrumenty były dość wyrafinowane i istnieje głęboka krzywa uczenia się, aby wdrożyć takie techniki. W związku z tym zapewnienie łatwego w użyciu podejścia staje się jednym z ważnych czynników dalszej poprawy poziomu przepustowości badań przesiewowych danio pręgowanego i jest głównym celem tych prac.
W tej pracy zaprojektowaliśmy i wykonaliśmy szablon do układania zarodków za pomocą druku 3D. Taki szablon do układania został zaprojektowany w celu uwięzienia zarodka danio pręgowanego w studzienkach, które pasują do standardowej płytki 96-dołkowej. Zamiast wybierać zarodki i układać je w osobne studzienki jeden po drugim, można przeprowadzić uwięzienie zarodka i ułożyć wszystkie 96 zarodków w wielościennej płytce jednocześnie. Korzystając z tego szablonu i następującego po nim protokołu, można znacznie zwiększyć wydajność układania zarodków w płytki wielościenne, co w efekcie zwiększyłoby zdolność badań przesiewowych co najmniej dziesięciokrotnie w porównaniu z operacją ręczną. Opisany poniżej protokół zawiera ogólny projekt szablonu do ustawiania w szyku, tarła danio pręgowanego, zbierania zarodków i szykowania. Rysunek 1 pokazuje ogólny wygląd szablonu tablicy. Rysunek 2 pokazuje przegląd protokołu krok po kroku dotyczącego korzystania z szablonu opisanego w częściach 3 i 4.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Projekt i wykonanie szablonu do układania zarodków danio pręgowanego
- Zaprojektuj szablon tablicy z 96-dołkowym układem 12 na 8, który pasuje do standardowej płytki 96-dołkowej. Użyj wymiarów podanych w Rysunek 1A dla górnej komory uwięzienia zarodków (zobacz również plik uzupełniający).
- Użyj wymiarów pokazanych w Rysunek 1B i 1D dla studni pułapki.
- Użyj wymiarów w Rysunek 1C dla dolnej komory próżniowej.
- Użyj wymiarów w Rysunek 1B dla wlotu/wylotu powietrza.
- Użyj drukarki 3D (z dokładnością do 0,1 mm), aby wydrukować szablon; zobacz Tabelę materiałów, aby zapoznać się z zalecaną żywicą do drukowania.
UWAGA: Drukarki 3D o dokładności 0,1 mm są zalecane do wytwarzania szablonu do szykowania (patrz Tabela Materiałów). Sugerowany kolor powierzchni szablonu to ciemnoszary lub.
2. Tarło zarodków danio pręgowanego
- Umieść dwie pary samców i samic ryb w komorze godowej na jeden dzień przed tarłem. Oddziel samce i samice przezroczystą plastikową przegrodą.
- Zdejmij przegrody rano, aby wymieszać samce i samice ryb.
- Usuń samce i samice ryb i zbierz zarodki danio pręgowanego za pomocą sitka o drobnych oczkach. Umyj zarodki 250 ml wody jajecznej (patrz tabela materiałów).
- Przenieść pobrane zarodki na szalki Petriego (o średnicy 90 mm) za pomocą roztworu Holtfretera (patrz tabela materiałów) i usunąć martwe i niezapłodnione zarodki za pomocą stereomikroskopu.
- Umieścić zarodki w inkubatorze o temperaturze 28,5 °C. Po 4 godzinach od zapłodnienia (hpf) obserwuj zarodki i usuń wszelkie martwe i niezdrowe zarodki. Zarodki są teraz gotowe do następnego kroku.
3. Przygotowanie szablonu do tworzenia tablic
- Umyj szablon 2-3 razy 500 ml wody dejonizowanej i włóż do suszarki (45 °C) na 5 minut.
- Zaklej dolną komorę kawałkiem folii uszczelniającej (Rysunek 2, Krok 1).
- Podłącz pompę próżniową przez wylot powietrza na dole szablonu.
UWAGA: Zalecane maksymalne podciśnienie dla pompy próżniowej wynosi 0.1 MPa. Należy pamiętać o sile używanej próżni. Jeśli podciśnienie jest zbyt silne, wytnij otwór w kształcie krzyża w folii uszczelniającej, aby obniżyć ciśnienie.
4. Układanie zarodków danio pręgowanego w 96-dołkowej płytce
- Za pomocą plastikowej pipety transferowej umieść około 150 zarodków w szablonie, jak pokazano w Rysunek 2, Krok 2.
- Podłącz pompę próżniową do wylotu powietrza, aby wytworzyć podciśnienie w komorze uszczelnionej folią uszczelniającą w kroku 3.3.
- Potrząśnij całym szablonem poziomo, aż w każdym dołku uwięziony będzie jeden zarodek (Rysunek 2, Krok 3).
UWAGA: Jeśli roztwór Holtfretera wyschnie, zanim zarodki zostaną uwięzione w każdym dołku, dodaj dodatkowy roztwór Holtfretera do komory uwięzionej i powtórz ten krok. - Odrzuć nadmiar roztworu Holtfretera i zarodki, które nie są uwięzione w studzienkach (Rysunek 2, Krok 4).
- Wyłącz i odłącz pompę próżniową.
- Umieść standardową 96-dołkową płytkę do góry nogami na szablonie (Rysunek 2, Krok 5) i obróć obie w tym samym czasie (Rysunek 2, Krok 6).
- Postukaj w dolną część szablonu lub podłącz wylot powietrza do puszki do pylenia sprężonym gazem, aby przenieść wszystkie uwięzione zarodki z szablonu do płytki 96-dołkowej (Rysunek 2, Krok 6).
- Powtórzyć kroki od 4.1 do 4.8, aby przygotować dodatkowe płytki wielodołkowe.
- Usuń folię uszczelniającą i umyj szablon 3 razy od góry do dołu 500 ml wody dejonizowanej do wykorzystania w przyszłości.
UWAGA: Do czyszczenia szablonu nie używaj żadnych rozpuszczalników organicznych, takich jak etanol.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rycina 3 przedstawia typowy szablon do układania w macierz wydrukowany w technologii 3D. Szablon ten został wykonany za pomocą drukarki 3D z żywicy światłoczułej jako materiału bazowego; naniesiono na niego warstwę czarnej farby, aby zapewnić lepszy kontrast względem koloru embrionów. Rozmieszczenie 96 dołków (12 na 8) zaprojektowano tak, aby odpowiadało standardowej płytce 96-dołkowej. Podobnie, stosując tę samą metodę, można zaprojektować i wykonać szablon ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym protokole istnieją dwa krytyczne kroki, które wymagają szczególnej uwagi w celu pomyślnego wdrożenia wydrukowanego w 3D szablonu do układania zarodków danio pręgowanego.
Najważniejszym czynnikiem wpływającym na projekt szablonu tablicowego jest studnia uwięzienia. Aby upewnić się, że w każdej studzience uwięziony jest tylko jeden zarodek, należy zwrócić szczególną uwagę na średnicę i głębokość dołka pułapkowego oraz średnicę otworu przelotowego. Zalecana średnica mieści się w zakresie od...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy wypełnili patent na opisywany szablon wydrukowany w 3D.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez program "1000plan Youth", fundusze startowe z Uniwersytetu Tongji oraz grant NSFC# 21607115 i 21777116 (Lin).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Zakład Danio Pręgowany | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Skrzynka godowa | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Butelka do mycia, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Chlorek sodu | Vetec | V900058-500G | |
| Chlorek potasu | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | |
| Chlorek wapnia | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 20011160 | |
| Wodorowęglan sodu | Vetec | V900182-500G | |
| Hydrat błękitu metylenowego | TCI | M0501 | |
| Kwas solny | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011008 | |
| Sole morskie | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipeter | Fisherbrand | 13-675M | |
| Pipeta z kontrolowanym spadkiem | Pasteura Fisherbrand | 13-678-30 | |
| Mikroskop | OLYMPUS | SZ61 | |
| Inkubator biochemiczny | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| UnionTech | Lite600 | ||
| Żywica światłoczuła | UnionTech | UTR9000 | |
| Pompa próżniowa | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| płytka | Costar | 3599 | |
| l | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Miotełka do kurzu na sprężony gaz | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Water | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Suszarka do suszenia | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A | |
| System wody | : Woda z obiektu" s system wodny | ||
| jajeczna | Rozcieńczony 60mg " Natychmiastowy ocean" soli morskich i 0,25 mg/l błękitu metylenowego w 1 l wody | ||
| DI Holtfreter' | 7,0 g chlorku sodu (NaCl), 0,4 g wodorowęglanu sodu (NaHCO3), 0,1 g chlorku potasu (KCl), 0,235 g chlorku wapnia (CaCl2,2H2O) w 1,9 l wody DI. Dostosuj pH do 7 za pomocą HCl i dostosuj objętość do 2 l za pomocą wody Di |
Bibliografia
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017).
- Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).
- Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
- Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).
- Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533(2017).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
