Częste pobieranie próbek krwi na końcówce ogona u myszy w celu oceny pulsacyjnego wydzielania hormonu luteinizującego

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół pobierania próbek krwi z końcówki ogona do częstego pobierania próbek u nieskrępowanych myszy. Metoda ta jest przydatna do oceny wzorców pulsacyjnego wydzielania hormonu luteinizującego i może być dostosowana do analizy innych krążących czynników.

Streszczenie

W wielu układach hormonalnych czynniki krążące lub hormony nie są uwalniane w sposób ciągły, ale są wydzielane jako dyskretny impuls w odpowiedzi na czynnik uwalniający. Jednopunktowe pomiary próbek są niewystarczające, aby w pełni zrozumieć biologiczne znaczenie wzorca wydzielniczego hormonów pulsacyjnych zarówno w normalnych warunkach fizjologicznych, jak i w warunkach rozregulowania. Hormon luteinizujący (LH) jest syntetyzowany przez komórki gonadotropowe przedniego płata przysadki mózgowej i wydzielany w pulsacyjnym wzorcu, który wymaga częstego pobierania próbek krwi w celu oceny pulsu. Do niedawna nie było to możliwe u myszy, ze względu na opracowanie testu LH o wysokiej czułości i postęp w technice częstego pobierania próbek o małej objętości, początkowo opisanej przez Steyna i współpracowników. ¹ Tutaj opisujemy protokół częstego pobierania próbek krwi obwodowej od myszy z wystarczającą aklimatyzacją do wykrywania pulsacyjnego wydzielania LH. Obecny protokół szczegółowo opisuje rozszerzony okres aklimatyzacji, który pozwala na ocenę solidnych i ciągłych impulsów LH przez wiele godzin. W tym protokole końcówka ogona jest obcinana, a krew jest pobierana z ogona za pomocą ręcznej pipety. W celu oceny pulsacyjnego LH u myszy poddanych gonadektomii, próbki seryjne pobiera się co 5-6 minut przez 90-180 minut. Co ważne, pobieranie krwi i pomiar silnych impulsów LH można przeprowadzić u obudzonych, swobodnie zachowujących się myszy, pod warunkiem odpowiedniej aklimatyzacji i wysiłku w celu zminimalizowania stresorów środowiskowych. Wystarczającą aklimatyzację można osiągnąć w ciągu 4-5 tygodni przed pobraniem krwi. Protokół ten podkreśla postępy w metodologii zapewniającej pobieranie próbek krwi pełnej do oceny pulsacyjnych wzorców wydzielania LH przez wiele godzin u myszy, potężnego modelu zwierzęcego do badań neuroendokrynnych.

Wprowadzenie

Funkcja gonad u ssaków jest zależna od wydzielania gonadotropin, hormonu luteinizującego (LH) i hormonu folikulotropowego z przysadki mózgowej. Gonadotropiny są wydzielane w sposób pulsacyjny lub nagły w odpowiedzi na podwzgórze wydzielanie hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRH). Synteza i wydzielanie zarówno LH, jak i FSH są regulowane przez działanie hormonalne, parakrynne i autokrynne z różnych cząsteczek, w tym podwzgórza GnRH, hormonów steroidowych gonad i układu aktywina-inhibina-folistatyna, a także niezliczonych stanów fizjologicznych, w tym stresu i równowagi energetycznej. ²

Pulsacyjny wzór LH we krwi wynika z dość nagłego wyładowania LH do krwi obwodowej, po którym następuje w przybliżeniu wykładnicza eliminacja. Ważnymi cechami wzorca są częstotliwość każdego wyładowania LH i amplituda odpowiedzi LH, z których obie są częściowo podyktowane uwalnianiem GnRH. Ze względu na trudności w pobieraniu krwi wrogiej podwzgórze-przysadka do pomiaru pulsacyjnego GnRH, pobieranie próbek i pomiar LH jest używany jako wskaźnik zastępczy dla regulacji GnRH osi podwzgórze-przysadka-gonady. W związku z tym krytyczne informacje są kodowane w częstotliwości i amplitudzie impulsów LH, których nie można określić na podstawie pojedynczej próbki.

Analiza pulsacyjnego wydzielania LH historycznie była ograniczona do dużych ssaków (ludzi, naczelnych i owiec) ze względu na ich dużą objętość krwi i tolerancję na częste pobieranie próbek krwi. U gryzoni częste pobieranie próbek krwi ograniczało się do szczurów i osiągano je za pomocą cewnika przedsionkowego na stałe. ^3,4 Stosunkowo niski koszt i dostępność manipulacji genetycznych (np. cre-lox, CRISPR) i złożonych obwodów neuronowych (np. optogenetyka, chemogenetyka) sprawia, że myszy są atrakcyjnym organizmem modelowym; jednak uzyskanie częstych próbek krwi i późniejsza analiza stężeń LH do niedawna okazywała się nieuchwytna. To monumentalne zadanie zostało zapoczątkowane przez Steyna i jego współpracowników. ¹ Od tego czasu, kilka laboratoriów zaczęło wykorzystywać częste pobieranie próbek krwi i ultraczułe testy LH do oceny pulsacyjnego wydzielania LH w różnych paradygmatach eksperymentalnych. ^5,6,7,8,9 Należy zauważyć, że poszukiwanie praktycznej metody pobierania wielu próbek krwi od myszy trwa od co najmniej 40 lat¹⁰ z wieloma udoskonaleniami dokonanymi po drodze. ^11,12

Ocena wzorców impulsów LH (tj. częstotliwości i amplitudy) stanowi duże udoskonalenie w monitorowaniu podstawowego wydzielania gonadotropin w tym genetycznie podatnym modelu zwierzęcym. Tradycyjnie stężenia LH u myszy oznaczano w pojedynczej próbce krwi. Jedną ze słabości próbek jednopunktowych jest bardzo zmienny zestaw danych, ponieważ stężenia LH naturalnie zmieniają się podczas każdego impulsu. Kolejną słabością jest to, że izolowane pomiary z natury pomijają krytyczne informacje przekazywane przez wzorce wydzielania impulsu LH. W związku z tym metoda częstego pobierania próbek krwi u swobodnie zachowujących się, nieskrępowanych myszy (z wyjątkiem delikatnego obchodzenia się z próbkami) dostarczy lepszych informacji i okaże się przydatna dla wielu laboratoriów badających regulację hormonów pulsacyjnych.

Tutaj opisujemy protokół częstego (co 6 minut) pobierania próbek krwi od przytomnych, nieskrępowanych myszy. Co ważne, dołączamy protokół aklimatyzacji, który pozwala na solidne i ciągłe wykrywanie pulsacyjnego wydzielania LH w próbkach krwi pełnej pobranych przez długi czas, w którym można określić wstępną i końcową ocenę ostrego wyzwania, takiego jak reakcja na stres psychospołeczny związany z unieruchomieniem i unieruchomieniem. Skuteczny test stężeń LH w próbkach krwi pełnej został opisany wcześniej; ¹ ten protokół skupia się na metodzie pobierania próbek krwi do pomiaru tętna LH.

Protokół

Opisana tutaj metoda jest zgodna z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich używania, a także została zatwierdzona przez Institutional Animal Care and Use Committee na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Diego.

1. Aklimatyzacja do obsługi

1. Procedura postępowania
   1. Umieść klatki dla myszy w szafie bezpieczeństwa biologicznego. Wyjmij pierwszą mysz z klatki i umieść ją na odpowiedniej powierzchni (np. czystej pokrywie klatki) w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
   2. Delikatnie przytrzymuj mysz na powierzchni roboczej, przytrzymując podstawę ogona palcem wskazującym i kciukiem jednej ręki. Następnie mocno pogładź brzuszną powierzchnię ogona, od podstawy do czubka ogona, palcem wskazującym i kciukiem drugiej ręki. Powtórz to głaskanie 6 razy (tj. 1 zestaw) i umieść mysz z powrotem w klatce.
   3. Odczekaj 6 minut i powtórz krok 1.1.2.
      UWAGA: W sumie krok 1.1.2 zostanie powtórzony 4 razy na mysz (tj. 4 zestawy po 6 uderzeń), tak aby każda mysz otrzymała łącznie 24 pociągnięcia ogonem w każdym dniu obsługi.
2. Częstotliwość codziennego obchodzenia się z rybami
   1. Od pięciu do dwóch tygodni przed planowanym dniem pobrania krwi należy obchodzić się z myszami zgodnie z opisem w kroku 1.1, pięć dni w tygodniu (myszy nie są obsługiwane w soboty lub niedziele aż do ostatnich dwóch tygodni aklimatyzacji).
   2. Jeżeli eksperymentalne leczenie w okresie pobierania próbek będzie obejmowało jakiekolwiek dodatkowe obchodzenie się (np. chrupanie lub wstrzyknięcie dootrzewnowe), należy przystosować myszy do tej czynności podczas każdej sesji obchodzenia się z myszami.
      Uwaga: W celu aklimatyzacji do zabiegów iniekcyjnych należy użyć igły do wykonania pozorowanego wstrzyknięcia.
   3. W ciągu dwóch tygodni przed planowanym dniem pobrania krwi należy obchodzić się z myszami zgodnie z opisem w punkcie 1.1, siedem dni w tygodniu.
   4. Co najmniej dwa tygodnie przed planowanym dniem pobrania krwi trzymaj myszy w parach, aby zminimalizować zakłócenia dla myszy podczas pobierania próbek.

2. Przygotowanie probówek do pobierania krwi

1. Przygotować ultraczuły bufor do oznaczania LH w szklanej butelce: 0,2% albuminy surowicy bydlęcej i 0,05% Tween-20 w PBS [0,2 g KCl, 8 g NaCl, 1,44 g Na₂HPO₄ (bezwodny), 0,24 g KH₂PO₄, woda ultraczysta do 1 L, pH 7,4, filtr i autoklaw], przechowywać w temperaturze 4°C.¹
   UWAGA: Objętość ultraczułego buforu do oznaczania LH, który ma być przygotowany, można obliczyć na podstawie liczby próbek i objętości na próbkę, jak wskazano poniżej (2.2 i dyskusja)
2. Przygotuj probówki do pobierania krwi (probówki do mikrowirówek o pojemności 0,6 ml). Oznakować probówki i podwielokrotny bufor do oznaczania (57 μl buforu na probówkę; należy pamiętać, że objętość ta może się różnić w zależności od objętości pobranej krwi lub stosunku krwi do pożądanego buforu). Probówki można przygotować na kilka dni przed pobraniem próbek, przechowywać w temperaturze 4°C.

3. Pobieranie krwi

1. Przygotowanie materiałów do pobierania krwi.
   1. Przygotuj szafkę bezpieczeństwa biologicznego do użycia i ułóż następujące materiały w kapturze lub na wózku w pobliżu: pipeta 10 μl (ustawiona na 3 μl lub żądaną objętość do pobrania krwi), końcówki do pipet, kosz na zużyte końcówki do pipet, minutnik, wydruk z numerami zwierząt i numerami próbek (do notatek dotyczących pobierania próbek lub problemów ze zwierzętami), wiadro na lód z probówkami do pobierania krwi, nożyczki i mała gaza (2 "x 2").
      UWAGA: Funkcja "odliczania" w zegarze laboratoryjnym jest przydatna, ponieważ nie ma alarmu dźwiękowego, który mógłby przeszkadzać myszom
   2. Użyj trwałego markera, aby oznaczyć ogon każdej myszy (w pobliżu podstawy), aby pomóc w szybkiej identyfikacji właściwej myszy podczas pobierania próbek.
2. Strzyżenie ogona i przygotowanie do pobrania krwi.
   1. Na 45 minut przed rozpoczęciem pobierania krwi wyjmij pierwszą mysz z klatki i umieść ją na odpowiedniej powierzchni (dobrze sprawdza się czysta pokrywa klatki) w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
   2. Użyj ostrych, sterylnych nożyczek, aby usunąć 1-2 mm czubka ogona myszy, po aseptycznym przygotowaniu (tj. szorowaniu alkoholem i betadyną).
      UWAGA: Można to osiągnąć u zwierząt obudzonych przy delikatnym ograniczeniu lub w znieczuleniu izofluranem. Dodatkowo, analgezja może być zapewniona zgodnie z zaleceniami lokalnego IACUC.
   3. Ostrożnie głaszcz ogon myszy zgodnie z powyższym opisem (1.1.2; 1-2 pociągnięcia są zazwyczaj wystarczające), aż na końcu ogona utworzy się kropla krwi.
   4. Za pomocą pipety z czystą końcówką pobrać 3 μl krwi z końcówki ogonowej i wyrzucić końcówkę pipety wraz z krwią.
   5. Przed powrotem myszy do klatki upewnij się, że przepływ krwi się zatrzymał. W razie potrzeby delikatnie uciskaj sterylną gazą.
   6. Powtórz kroki 3.2.1 - 3.2.5 dla wszystkich myszy. Kolejne próbki krwi można pobierać, mocno głaszcząc ogon myszy, aż na końcu ogona utworzy się kropla krwi.
      UWAGA: Jeśli po mocnych pociągnięciach nie utworzy się kropla krwi, ogon można przetrzeć gazikiem nasączonym solą fizjologiczną. Prawdopodobieństwo tworzenia się skrzepów jest większe podczas rzadszego pobierania próbek (tj. w odstępach >15 minut). Po usunięciu skrzepu z żyły pobieranie próbek można kontynuować.
   7. Kontynuuj pobieranie 3 μl krwi od każdej myszy w sposób opisany powyżej co 6 minut przez około 45 minut w okresie przygotowań do pobrania krwi. Wyrzuć krew i końcówkę pipety.
3. Pobieranie próbek krwi
   1. Zbierz 3 μl krwi z końcówki ogona, jak opisano powyżej. Należy zachować ostrożność, aby upewnić się, że cała próbka o objętości 3 μl została pobrana do końcówki pipety (bez pęcherzyków powietrza i zanieczyszczenia ściółką). Wyrzuć próbkę krwi do buforu testowego w oznakowanej probówce. Wymieszaj przez odwrócenie i umieść probówkę z powrotem w lodzie.
   2. Przed powrotem myszy do klatki upewnij się, że przepływ krwi się zatrzymał. W razie potrzeby delikatnie uciskaj sterylną gazą.
   3. Powtórzyć kroki 3.3.1 - 3.3.2 dla każdej myszy, co 6 minut, dla z góry ustalonego czasu próbkowania. Należy obserwować każde zwierzę pod kątem oznak niepokoju (np. częściowo zamknięte powieki, zgarbiona pozycja [niespowodowana innym leczeniem] lub brak reakcji na obchodzenie się z nim) i w razie potrzeby przerwać pobieranie próbek.
      UWAGA: Zaburzenia behawioralne lub inne powikłania, które wymagają przerwania pobierania próbek, występują niezwykle rzadko w naszym laboratorium.
   4. Jeśli zwierzęta nie zostaną poddane eutanazji po pobraniu próbki krwi, upewnij się, że przepływ krwi z końcówki ogona całkowicie się zatrzymał. Wytrzyj rozlaną krew z wnętrza klatki każdego zwierzęcia (lub zmień klatki) i włóż klatki dla zwierząt z powrotem do stojaka na pomieszczenia.

4. Przetwarzanie i analiza próbek

1. Próbki krwi należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu analizy.
   UWAGA: LH oznacza się w próbkach krwi pełnej rozcieńczonych w buforze do oznaczania; Nie jest wymagane oddzielanie surowicy lub osocza przed przechowywaniem lub analizą.
2. Oznacz próbki krwi za pomocą ultraczułego testu ELISA, jak opisano wcześniej¹ i podać wartości w ng/ml krwi pełnej po korekcie o rozcieńczenie objętości próbki w buforze testowym.
3. Zidentyfikuj impulsy LH w zestawie danych. Obliczyć i porównać średnią amplitudę impulsu i częstotliwość impulsów (lub interwał między impulsami) odpowiednio dla zbioru danych.
   UWAGA: Dostępne są opublikowane kryteria^13,14 oraz programy,^15,16 do wykrywania impulsów LH.

Wyniki

Reprezentatywne wzorce impulsów LH u 4 myszy przedstawiono na Rysunku 1 (dane powtórzone z publikacji Yang et al., 2017). Poziom LH mierzono w częstych próbkach krwi, aby określić odpowiedź na ostry stres psychospołeczny. Dorosłe samice myszy C57/Bl6 poddano ovariektomii i obchodzono się z nimi zgodnie z opisem w niniejszym protokole w celu częstego pobierania krwi. Próbki krwi pobierano od wszystkich zwierząt przez pierwsze 90 min, aby ustalić bazow...

Dyskusja

Tutaj opisujemy protokół częstego pobierania krwi z próbek krwi pełnej na końcówkach ogona w celu oceny pulsacyjnego wydzielania LH u myszy. Protokół ten umożliwia pobieranie próbek w celu wykrycia ostrych zmian w pulsacyjnym wydzielaniu LH po ekspozycji na stres psychospołeczny i dobrze nadaje się do oceny impulsów LH w przypadku innych ostrych lub przewlekłych manipulacji.

Kluczowym elementem tego protokołu dla uzyskania wiarygodnych i solidnych profili impulsów LH jest okres aklimatyzacji d...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szafka biobezpieczna	Lab Products Inc	L/F-B
Albumina surowicy bydlęcej	Sigma	A5403
Tween-20	Sigma	P2287
KCl	Sigma	P9333
NaCl	Sigma	S7653
Na2HPO4 (bezwodna)	Sigma	S7907
KH2PO4	Sigma	P5655
Woda ultraczysta	Millipore		Oczyszczona i przefiltrowana woda
Urządzenie do powstrzymywania gryzoni Broome	Aparat Harvard	52-0460	Nie jest konieczne do pobierania krwi, ale zostały wykorzystane do zbierania reprezentatywnych danych.
DynPeak	n/a	nie dotyczy	http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0039001