Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowane urządzenie i protokół oparty na labiryncie T do analizy podejmowania decyzji w oparciu o opóźnienia i wysiłek u wolno poruszających się gryzoni

14.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57895

⸱

2 sierpnia 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory of Behavioral Genetics, Center for Brain Science, RIKEN, 2Faculty of Human Science, University of Tsukuba

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia zautomatyzowany labirynt T, który wynaleźliśmy, oraz protokół oparty na tym urządzeniu do analizy podejmowania decyzji na podstawie opóźnień i podejmowania decyzji opartych na wysiłku u swobodnie poruszających się gryzoni.

Streszczenie

Wielu pacjentów neurologicznych i psychiatrycznych wykazuje trudności i/lub deficyty w podejmowaniu decyzji. Modele gryzoni są pomocne w głębszym zrozumieniu neurobiologicznych przyczyn leżących u podstaw problemów z podejmowaniem decyzji. Zadanie labiryntu T-labirynt oparty na kosztach i korzyściach służy do pomiaru procesu podejmowania decyzji, w którym gryzonie wybierają między ramieniem o wysokiej nagrodzie (HRA) a ramieniem o niskiej nagrodzie (LRA). Istnieją dwa paradygmaty zadania decyzyjnego w T-labiryncie, jeden, w którym kosztem jest opóźnienie w czasie, a drugi, w którym jest to wysiłek fizyczny. Oba paradygmaty wymagają żmudnego i pracochłonnego zarządzania zwierzętami doświadczalnymi, wielu drzwi, nagród w postaci granulek i nagrań wyboru ramienia. W obecnych pracach wynaleźliśmy aparaturę opartą na tradycyjnym labiryncie w kształcie litery T z pełną automatyzacją do dostarczania pelletu, zarządzania drzwiami i nagrywania wyborów. Ta zautomatyzowana konfiguracja może być wykorzystana do oceny podejmowania decyzji u gryzoni zarówno w oparciu o opóźnienie, jak i wysiłek. Dzięki opisanemu tutaj protokołowi nasze laboratorium zbadało fenotypy decyzyjne wielu genetycznie zmodyfikowanych myszy. W reprezentatywnych danych wykazaliśmy, że myszy z ablacją przyśrodkową habenularą wykazywały awersję zarówno do opóźnienia, jak i wysiłku oraz miały tendencję do wybierania natychmiastowej i łatwej nagrody. Protokół ten pomaga zmniejszyć zmienność spowodowaną interwencją eksperymentatora i zwiększyć wydajność eksperymentu. Ponadto przewlekła sonda krzemowa lub rejestracja mikroelektrod, obrazowanie światłowodowe i/lub manipulacja aktywnością neuronalną mogą być łatwo zastosowane podczas zadania decyzyjnego przy użyciu opisanej tutaj konfiguracji.

Wprowadzenie

Ludzie i inne zwierzęta oceniają koszt (w tym opóźnienie, wysiłek i ryzyko), aby otrzymać nagrodę, a następnie podejmują decyzję o wyborze określonego sposobu działania. Deficyty decyzyjne pojawiają się w wielu chorobach neuropsychiatrycznych, w tym schizofrenii (SZ), zespole nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi (ADHD), zaburzeniu obsesyjno-kompulsywnym (OCD), chorobie Parkinsona (PD) i uzależnieniu1. Badania na ludziach i małpach wykazały, że kilka kluczowych regionów mózgu jest zaangażowanych w podejmowanie decyzji2,3,4. Chociaż naczelne angażują się w bardziej skomplikowane podejmowanie decyzji, doniesiono, że gryzonie są w stanie podejmować decyzje adaptacyjne, aby przetrwać w środowisku, w którym ewentualności nagrody często się zmieniają. Ponadto mechanizmy obwodów neuronalnych i mechanizmy molekularne leżące u podstaw podejmowania decyzji mogą być dokładnie badane na modelach mysich ze względu na dostępność narzędzi chemogenetycznych, narzędzi optogenetycznych i genetycznie modyfikowanych myszy. Istnieje wiele zadań wykorzystywanych do oceny zachowań decyzyjnych gryzoni, w tym zadanie zmiany nastawienia uwagi, zadanie labiryntu T-labirynt oparte na wysiłku lub opóźnieniu, zadanie hazardu w stanie Iowa, zadanie uczenia się odwrócenia dyskryminacji wizualnej5 itp. Analogiczne protokoły kosztów i korzyści T-labiryntu zostały pierwotnie opracowane przez grupę Pierre'a6 i zostały wykorzystane do zbadania wpływu dwóch rodzajów kosztów decyzji (opóźnienia i wysiłku) na swobodnie poruszające się gryzonie7,8,9,10. Szczególną zaletą tego zadania jest to, że zwierzęta nie muszą być szkolone do naciskania dźwigni czy kopania w misce. Zamiast tego zwierzęta dokonują wyboru między opcją z wysokim zyskiem i wysokimi kosztami w jednej grupie (HRA) a opcją niskiej nagrody i niskim kosztem w drugiej grupie (LRA). Dlatego to zadanie jest znacznie łatwiejsze do wykonania.

W paradygmacie opartym na opóźnieniu, drzwi do skrzyżowania są wprowadzane, gdy zwierzę doświadczalne wejdzie do jednego z ramion bramki, tak że zwierzę jest trzymane w ramieniu bramki. Jeśli zwierzę wybierze LRA, drzwiczki bramki w LRA są natychmiast chowane i dostarczana jest niewielka ilość jedzenia. Jeśli zwierzę wybierze HRA, drzwiczki bramki w HRA są chowane po wymaganym opóźnieniu i dostarczana jest duża ilość granulek pokarmu (rysunek 1A). W paradygmacie opartym na wysiłku HRA jest blokowany przez barierę, a zwierzęta muszą się przez nią wspinać, aby uzyskać dużą ilość granulek (ryc. 1B). Ogólnie rzecz biorąc, paradygmat oparty na opóźnieniach jest bardzo przydatny do testowania impulsywności modeli zwierzęcych, a paradygmat oparty na wysiłku może pomóc w rozgryzieniu apatycznych zwierząt2,4,11,12,13. Do tej pory badacze wykonywali ten test poprzez ręczne liczenie opóźnienia czasowego, wkładanie i wyjmowanie drzwi, manewrowanie barierą wysiłku, liczenie liczby wypluwek, umieszczanie granulek na miejscu, umieszczanie i zwracanie zwierząt oraz rejestrowanie wyborów zwierząt dla każdej próby. Te koszty pracy i czasu stanowią poważne wąskie gardło eksperymentalne dla badaczy, utrudniając powszechne stosowanie tego testu behawioralnego. W ramach obecnych prac opracowaliśmy konfigurację opartą na labiryncie T, aby ocenić podejmowanie decyzji przez gryzonie w oparciu o opóźnienia lub wysiłek, z pełną automatyzacją, standaryzacją i wysoką przepustowością.

Aparatura

We współpracy z komercyjnym producentem (zobacz Tabelę Materiałów), opracowaliśmy zmodyfikowany zautomatyzowany aparat do labiryntu T, który wykorzystywał sterowanie instrumentami opartymi na oprogramowaniu (Rysunek 2). W szczególności wprowadziliśmy "tylne drzwi" i "tylne wejście" w porównaniu z tradycyjnym labiryntem w kształcie litery T (Rysunek 2), aby zwierzęta mogły same wrócić do punktu wyjścia i rozpocząć nową próbę. Labirynt T ma matowo-szary kolor, a gdy warunki eksperymentu i oprogramowanie są prawidłowo ustawione, można wykryć zarówno czarne, jak i białe myszy. Składa się z trzech ramion: jednego ramienia startowego i dwóch ramion bramki, każde o długości 410 mm, ze ściankami w kształcie litery V o wysokości 155 mm, podstawą o szerokości 30 mm i otwartym blatem o szerokości 155 mm. Korytarz w kształcie litery V może skutecznie zapobiegać skakaniu myszy. Ponadto korytarz w kształcie litery V ułatwia aplikację nagrywania in vivo za pomocą. Skrzynka startowa jest przymocowana do końca ramienia startowego. Skrzynka na bramkę jest przymocowana na końcu każdego ramienia bramki. W każdym pudełku na bramkę zainstalowany jest automatyczny dozownik żywności, który dostarcza predefiniowaną liczbę słodkich granulek żywności. Wlot granulatu jest wykrywany przez czujnik podczerwieni i jest automatycznie rejestrowany przez komputer. Każda skrzynka bramkowa jest połączona z polem startowym prostym korytarzem. Zwierzęta mogą autonomicznie powrócić do boksu startowego przez korytarz po zakończeniu próby. Przy wejściu i wyjściu z boksów startowych i bramkowych znajdują się drzwi przesuwne o wysokości 155 mm. Dodatkowo przy wejściu do każdego ramienia bramki znajdują się przesuwane drzwi, aby zapobiec cofaniu się zwierząt po dokonaniu wyboru (Rysunek 2A). Wszystkie drzwi przesuwne są sterowane przez komputer i mogą być automatycznie otwierane i zamykane. Nad urządzeniem umieszczono kamerę monoklową 1/2" ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) o wysokiej czułości, aby śledzić zachowanie zwierząt. Ogniskowa obiektywu wynosi 2,8–12 mm. Kamera znajduje się na wysokości około 1,9 m. Ponieważ wysokość labiryntu wynosi 0,5 m od podłogi, odległość między kamerą a labiryntem wynosi około 1,4 m (rysunek 2B). Dane śledzenia uzyskane z kamery CCD są wykorzystywane do sterowania na żywo labiryntem T, otwierania i zamykania określonych drzwi, gdy zwierzęta wchodzą do określonych obszarów zainteresowania (ROI). Bariery wykorzystywane w paradygmacie opartym na wysiłku mają kształt trójwymiarowego trójkąta prostokątnego (rysunek 2C), który idealnie wpasowuje się w ściany w kształcie litery V, i mają około 155 mm wysokości. Zwierzęta muszą wspinać się po stronie pionowej, ale są w stanie zejść ze zbocza o nachyleniu 45°. Podczas eksperymentu aparat jest oświetlany napięciem 100 luksów. Granulki cukru użyte w eksperymencie (patrz Tabela Materiałów) i żel krzemionkowy (patrz Tabela materiałów) są używane do utrzymania granulek w stanie suchym.

Protokół

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Instytutu Nauk o Mózgu RIKEN.

1. Przygotowanie zwierząt

  1. Wybierz płeć, wiek, genotyp i leczenie farmakologiczne myszy eksperymentalnych (lub szczurów) w zależności od celu eksperymentu.
    UWAGA: Tutaj zademonstrowaliśmy wydajność czterech samców myszy C57B/6 w wieku 2 miesięcy.
  2. Myszy należy trzymać w pomieszczeniu utrzymywanym w standardowych warunkach (12 godzin światła/12 godzin ciemności, światła włączone między 8:00 a 20:00, 22 ± 1°C).
    UWAGA: Jeśli celem jest porównanie różnicy między dwoma genotypami, należy wziąć 4 myszy na klatkę i uwzględnić 2 myszy z każdego genotypu.
  3. Dotykaj myszy przez 2 minuty dziennie przez 5 dni, aby przyzwyczaić je do kontaktu z ludźmi. Karm je odmierzonymi dawkami pokarmowymi tak, aby ich masa ciała była mniej więcej utrzymywana na poziomie około 80-85% masy wolnego karmienia przez cały czas trwania eksperymentu. Dostarczaj wodę ad libitum.
  4. Przyzwyczaj myszy do pomieszczenia eksperymentalnego, przenosząc wszystkie myszy z pomieszczenia dla myszy do pomieszczenia eksperymentalnego 30 minut przed eksperymentem każdego dnia.
  5. Rozpocznij eksperymenty o tej samej porze każdego dnia, aby uniknąć wpływu rytmu okołodobowego na wydajność zwierząt.

2. Przyzwyczajenie zwierząt do labiryntu

  1. Rozpocznij przyzwyczajanie się do labiryntu jednocześnie z obsługą myszy (2 min/dzień). Na tym etapie wszystkie drzwi powinny być otwarte. Wykonuj habituację w sumie przez 5 dni.
  2. Pierwszego dnia rozrzuć granulki jedzenia w całym labiryncie.
  3. W dniach 2 i 3 rozsyp śrut wzdłuż dwóch ramion bramki.
  4. W dniach 4 i 5 umieść granulki tylko przy dwóch skrzynkach bramkowych.
  5. Codziennie, po umieszczeniu granulek, umieszczaj myszy w pudełku startowym labiryntu T w grupach po cztery i pozwól myszom eksplorować labirynt przez 10 minut.
    UWAGA: Przyzwyczajenie myszy w czteroosobowych grupach pomoże im uczyć się od siebie nawzajem i przyspieszy szkolenie.

3. Dyskryminacja HRA ze strony LRA

ze względu na zwierzęta

UWAGA: Ten protokół obejmuje zarówno testy podejmowania decyzji oparte na opóźnieniach, jak i na wysiłku. Jednak w zależności od celu badacze mogą przetestować tylko jeden z nich lub oba. Oprogramowanie sterujące (tabela materiałów) służy do automatycznego sterowania konfiguracją labiryntu T dla następujących kroków. Jeśli proces podejmowania decyzji w oparciu o wysiłek zostanie przetestowany, należy wprowadzić bariery zarówno dla HRA, jak i LRA w fazie przymusowego wejścia z ramienia. Następnie zwierzęta będą szkolone zarówno do dyskryminacji, jak i pokonywania barier jednocześnie. Wygłodzone myszy aktywnie wspinają się po barierach, a po tej fazie wszystkie potrafią się umiejętnie wspinać. Dlatego nie jest konieczne rozpoczynanie od niższej bariery w przypadku tego protokołu.

  1. Faza wymuszonego wejścia ramienia
    1. Otwórz okno rejestracji parametrów w oprogramowaniu sterującym i ustaw parametry w następujący sposób (Rysunek 3).
      1. Wybierz "opcję fazy". Ustaw "numer próby" na 10, aby każde zwierzę przechodziło 10 prób dziennie przez 5 kolejnych dni.
        Uwaga: W swoich własnych eksperymentach można wybrać inny numer badania.
      2. Ustaw "Czas trwania" na 900 s, aby trening jednej myszy dziennie nie przekroczył 900 s. Ustaw "Domyślny czas opóźnienia startu" na 3 s, aby drzwi startowe otworzyły się 3 s po wykryciu zwierzęcia w obszarze startu.
      3. Ustawić "numer granulki" dla HRA i LRA tak, aby 4 granulki były zawsze automatycznie dozowane w HRA, a 1 granulka była dozowana w LRA.
        Uwaga: W naszych eksperymentach odkryliśmy, że 1:4 to najlepszy stosunek, gdy używane jest 10 mg granulek cukru. Jeśli użyjemy od 6 do 10 granulek, myszy nie będą mogły dokończyć jedzenia ich wszystkich i nastąpi pominięcie.
      4. Ustaw "Czas opóźnienia" na 0 s, aby w tej fazie nie było opóźnienia zarówno dla HRA, jak i LRA.
    2. Otwórz okno "Rejestracja dowodu tożsamości" w oprogramowaniu sterującym. Zarejestruj identyfikator każdej myszy z osobna w oprogramowaniu zgodnie z lokalizacją HRA, po lewej lub prawej stronie. (Rysunek 4).
      Uwaga: Lokalizacja powinna być zrównoważona w odniesieniu do grup genotypów. Dla 50% każdej grupy genotypowej HRA znajduje się zawsze po lewej stronie, a LRA po prawej stronie. W przypadku pozostałych 50% HRA znajduje się zawsze po prawej stronie, a LRA zawsze po lewej stronie.
    3. Otwórz okno aplikacji oprogramowania, wybierz "Podejmowanie decyzji" z rozwijanej listy "Zadanie". Wprowadź identyfikator podmiotu i wybierz "Faza 2" z listy rozwijanej "Faza". Wybierz numer dnia z listy rozwijanej "Dzień". Naciśnij przycisk "OK", aby przejść do okna interfejsu eksperymentu.
    4. W oknie interfejsu eksperymentu naciśnij "GetBG", aby zarejestrować informacje o tle labiryntu, dzięki czemu zwierzę będzie dokładnie śledzone niezależnie od tła otoczenia. Naciśnij przycisk "START SESJI" (Rysunek 5).
    5. Umieść mysz w polu startowym i rozpocznij trening, naciskając przycisk "start" na pilocie.
      1. Zwróć uwagę, że drzwi startowe, jedne drzwi węzłowe (po lewej lub prawej stronie) otworzą się automatycznie po 3 sekundach; gdy mysz wejdzie w obszar skrzyżowania, drzwi startowe zamkną się automatycznie.
      2. Zwróć uwagę, że gdy mysz znajdzie się w obszarze opóźnienia (po lewej lub prawej stronie), drzwi skrzyżowane automatycznie się zamkną, a drzwi bramki otworzą się automatycznie.
      3. Zwróć uwagę, że gdy mysz weźmie granulkę, tylne drzwiczki i drzwi przed uruchomieniem otworzą się automatycznie. Gdy mysz znajdzie się w tylnym obszarze, tylne drzwiczki automatycznie się zamkną.
      4. Zwróć uwagę, że gdy mysz wejdzie do pola startowego, drzwiczki przedstartowe zamkną się automatycznie i rozpocznie się nowa próba.
        Uwaga: W ciągu 10 prób każdego dnia podczas tej fazy szkolenia oprogramowanie automatycznie zapewni, że każda mysz odwiedzi HRA w przypadku 5 prób i LRA w przypadku 5 prób.
    6. Codziennie dokładnie czyść labirynt.
  2. Faza wejścia wolnego ramienia
    1. Zarejestruj parametry i identyfikator podmiotu w taki sam sposób, jak w fazie przymusowego wejścia (kroki 3.1.1 i 3.1.2). Wybierz "opcję fazy". Ustaw "numer próby" na 20, aby każde zwierzę przechodziło 20 prób dziennie przez 7 kolejnych dni.
    2. W oknie aplikacji wybierz "Faza 3" z listy rozwijanej "Faza". Ustaw inne parametry zgodnie z krokiem 3.1.3.
    3. W oknie interfejsu eksperymentu ustaw wartość "Wskaźnik sukcesu" na 80%, aby szkolenie było automatycznie kontynuowane do momentu, gdy mysz wybierze HRA w 80% prób lub gdy mysz zakończy 20 prób dziennie (zgodnie z ustawieniami parametrów). Zastosuj inne operacje zgodnie z krokiem 3.1.4.
    4. Pozwól myszy swobodnie wybrać jedno ramię, HRA lub LRA.
      1. Zwróć uwagę, że drzwi startowe, dwoje drzwi skrzyżowaczych otworzą się automatycznie po 3 sekundach; gdy mysz wejdzie w obszar skrzyżowania, drzwi startowe zamkną się automatycznie.
      2. Zwróć uwagę, że gdy mysz wybierze jedno ramię i wejdzie w obszar opóźnienia (po lewej lub prawej stronie), drzwi skrzyżowe automatycznie się zamkną, a drzwi bramki otworzą się automatycznie.
      3. Zwróć uwagę, że gdy mysz weźmie granulkę, tylne drzwiczki i drzwi przed uruchomieniem otworzą się automatycznie. Gdy mysz znajdzie się w tylnym obszarze, tylne drzwiczki automatycznie się zamkną.
      4. Zwróć uwagę, że gdy mysz znajdzie się w polu startowym, drzwiczki przedstartowe zamkną się automatycznie i rozpocznie się nowa próba.

4. Test podejmowania decyzji oparty na opóźnieniach

  1. Zarejestruj parametry i identyfikator podmiotu w taki sam sposób, jak w fazie wprowadzania wolnego ramienia (krok 3.2.1). Ustaw "Czas opóźnienia" odpowiednio na 5, 10,15 s w dniu 1, dniu 2 i dniu 3, tak aby opóźnienie HRA w dniu 1 wynosiło 5 s, 10 s w dniu 2 i 15 s w dniu 3.
  2. W oknie aplikacji wybierz "Faza 4" z listy rozwijanej "Faza". Pozostałe parametry należy ustawić w taki sam sposób, jak w punkcie 3.2.2.
  3. W oknie interfejsu eksperymentu zastosuj wszystkie operacje zgodnie z krokiem 3.2.3.
  4. Pozwól myszy swobodnie wybrać jedno ramię, HRA lub LRA.
    1. Zwróć uwagę, że drzwi startowe, dwoje drzwi skrzyżowaczych otworzą się automatycznie po 3 sekundach; gdy mysz wejdzie w obszar skrzyżowania, drzwi startowe zamkną się automatycznie.
    2. Zwróć uwagę, że gdy mysz wybierze jedno ramię i wejdzie w obszar opóźnienia (po lewej lub prawej stronie), drzwi łączące automatycznie się zamkną.
      Uwaga: Jeśli mysz wybierze LRA, drzwi bramki otworzą się automatycznie natychmiast. Jeśli jednak mysz wybierze HRA, drzwi bramki otworzą się automatycznie po 5 s, 10 s i 15 s odpowiednio w dniach 1, 2, 3.
    3. Zwróć uwagę, że gdy mysz weźmie granulkę, tylne drzwiczki i drzwi przed uruchomieniem otworzą się automatycznie. Gdy mysz znajdzie się w tylnym obszarze, tylne drzwiczki automatycznie się zamkną.
    4. Zwróć uwagę, że gdy mysz znajdzie się w polu startowym, drzwiczki przed uruchomieniem automatycznie się zamkną i rozpocznie się nowa próba.
      Uwaga: Tutaj trenowaliśmy myszy przez 5-7 dni z każdym warunkiem opóźnienia. Jednakże, w oparciu o nasze doświadczenie w testowaniu wielu linii transgenicznych lub zmutowanych myszy, 1 dzień (20 prób) jest absolutnie wystarczający, aby zobaczyć różnicę między myszami o różnych genotypach i nie ma sensu wydłużać czasu treningu (patrz Rysunek 6 jako przykład). Dlatego obecnie stosujemy tylko 1 dzień za każdy czas opóźnienia i działa to dobrze. Nie będzie problemu, jeśli badacze będą chcieli wydłużyć dni szkoleniowe w zależności od własnego celu.
  5. Opcjonalnie: Wykonaj test z odwróconym HRA. Aby sprawdzić, czy wybór myszy jest wynikiem preferencji orientacji, zamień lewą/prawą pozycję HRA i LRA (co może być automatycznie osiągnięte przez oprogramowanie) i pozwól myszom swobodnie wybrać jedno ramię, jak w 4.4.
  6. Opcjonalnie: Wykonaj test kontroli opóźnienia. Aby sprawdzić, czy jakikolwiek zaobserwowany deficyt jest wynikiem zmienionej pamięci przestrzennej lub wrażliwości nagrody, a nie wynikiem zmian w podejmowaniu decyzji, należy wprowadzić 15-sekundowe opóźnienie do LRA, jak również HRA, i pozwolić myszom na swobodny wybór jednego ramienia, jak w 4.4.

5. Test podejmowania decyzji w oparciu o wysiłek

  1. Wprowadź barierę do HRA, jak pokazano na schemacie (Rysunek 1).
  2. Ustaw wszystkie parametry i zastosuj wszystkie operacje zgodnie z krokiem 3.2 — faza wejścia z wolnym ramieniem i testuj zwierzęta przez 3 ciągłe dni.
  3. Pozwól myszom swobodnie wybrać jedno ramię, HRA lub LRA.
    UWAGA: Tutaj trenowaliśmy myszy przez 14 dni. Jednakże, w oparciu o nasze doświadczenie w testowaniu wielu linii transgenicznych lub zmutowanych myszy, 3 dni są absolutnie wystarczające, aby zobaczyć różnicę między myszami o różnych genotypach i nie ma sensu wydłużać czasu treningu (Zobacz Rysunek 6 jako przykład). Dlatego obecnie stosujemy tylko 3 dni na test oparty na wysiłku i działa to dobrze. Nie będzie problemu, jeśli badacze będą chcieli wydłużyć dni szkoleniowe w zależności od własnego celu.
  4. Opcjonalnie: Wykonaj test z odwróconym HRA. Aby sprawdzić, czy wybór myszy jest wynikiem preferencji orientacji, zamień pozycję HRA i LRA w lewo / w prawo (co może być automatycznie osiągnięte przez oprogramowanie) i pozwól myszom swobodnie wybrać jedno ramię, jak w kroku 5.3.
  5. Opcjonalnie: Wykonaj test kontroli wysiłku. Aby sprawdzić, czy jakikolwiek zaobserwowany deficyt jest wynikiem zmienionej pamięci przestrzennej lub wrażliwości nagrody, a nie wynikiem zmian w podejmowaniu decyzji, wprowadź barierę zarówno do LRA, jak i HRA i pozwól myszom swobodnie wybrać jedno ramię, jak w kroku 5.3.

6. Analiza danych

  1. Uzyskuj dane i wyniki bezpośrednio z oprogramowania sterującego.
    1. Należy pamiętać, że oprogramowanie automatycznie zarejestruje datę eksperymentu, czas rozpoczęcia i zakończenia, czas trwania, numer próby, lokalizację HRA, numer granulki w HRA i LRA, pozycję (X, Y) oraz ruchomy ślad itp. każdej myszy w folderze "Dane".
    2. Sprawdź, czy oprogramowanie automatycznie przeanalizowało następujące elementy i zapisz je w folderze "Wynik" pod każdym identyfikatorem zwierzęcia: czas trwania, numer badania, numer wyboru HRA, numer wyboru LRA, procent wyboru HRA, procent wyboru LRA, całkowita odległość przemieszczenia i całkowity czas skrzyżowania.
  2. Przeprowadzić analizę statystyczną danych ze wszystkich eksperymentów za pomocą mieszanej ANOVA (ANOVA z podzielonym wykresem), z dniem/sesją jako czynnikiem wewnątrzobiektowym i czynnikiem grupowym (grupa genotypu lub grupy o różnych warunkach eksperymentalnych) jako czynnikiem międzyobiektowym.
  3. Przeanalizuj główny wpływ czynnika grupowego, jeśli nie ma interakcji między dniem/sesją a czynnikiem grupowym. Stosuj porównania parami post hoc, jeśli istnieje znacząca interakcja między dniem/sesją a czynnikiem grupowym.

Wyniki

Przykład zadania decyzyjnego opartego na opóźnieniu i wysiłku, wykonanego przez myszy z ablacją przyśrodkowej części jąder habenularnych (myszy mHb:DTA)14 oraz przez kontrolne myszy z tego samego miotu typu dzikiego (myszy CT), przedstawiono na Rysunku 6. Po odsadzeniu dwie myszy mHb:DTA i dwie myszy CT kwaterowano wspólnie w jednej klatce.

W teście podejmowania decyzji w oparciu o opóźnienie (Rysunek 6A) nie stwierdzono istotnej interakcji między genotypem a sesją w żadnej fazie, w tym w fazie treningu dyskryminacyjnego (gdy czas opóźnienia HRA wynosił 0) oraz w fazie testu podejmowania decyzji w oparciu o opóźnienie (gdy czas opóźnienia HRA wynosił odpowiednio 5 s, 10 s i 15 s). Główny efekt genotypu nie był istotny przy czasie opóźnienia 5 s. Jednakże, gdy czas opóźnienia wydłużono do 10 s i 15 s, myszy mHb:DTA wykazały istotną redukcję procentowej liczby wizyt HRA w porównaniu z myszami CT. Wyniki te wykazały, że ablacja mHb zmniejszyła preferencję myszy do oczekiwania na większą nagrodę, wykazując zamiast tego tendencję do natychmiastowego wyboru małej nagrody, gdy czas oczekiwania wynosił 10 sekund lub więcej. Dane sugerują, że mHb może być ważną strukturą mózgu w kontroli impulsywności i/lub ocenie kosztu i korzyści czasowych, sprawiając, że zwierzęta są bardziej skłonne do tolerowania opóźnionego dostępu w celu uzyskania dużej nagrody.

W teście podejmowania decyzji opartym na wysiłku (Rysunek 6B), odsetek wizyt w HRA był znacząco niższy u myszy mHb:DTA, gdy w HRA umieszczono barierę, niezależnie od lokalizacji HRA po lewej lub prawej stronie (faza jednej bariery i faza odwrócenia). Oznacza to, że fenotyp myszy mHb:DTA nie wynikał z deficytu w preferencjach przestrzennych i pamięci. W teście kontroli wysiłku bariery zostały umieszczone w obu ramionach celu (faza dwóch barier), a zarówno LRA, jak i HRA wiązały się z dużym wysiłkiem. W związku z tym koszt wysiłku był taki sam dla zwierząt wybierających niską lub wysoką nagrodę. Myszy mHb:DTA odwiedzały HRA częściej niż LRA i osiągnęły porównywalną liczbę wizyt w HRA w ostatniej sesji (sesja 5). Wynik ten sugeruje, że wrażliwość na nagrodę oraz pamięć przestrzenna u myszy mHb:DTA były zachowane. Dane te wykazały, że mHb może odgrywać istotną rolę w ocenie kosztów i korzyści związanych z wysiłkiem, umożliwiając zwierzętom wkładanie większej pracy w celu uzyskania większych nagród.

Schemat eksperymentu z labiryntem; podejmowanie decyzji w oparciu o nagrodę z uwzględnieniem zmiennych opóźnienia; ustawienie próby dla gryzoni.
Rysunek 1: Schemat tradycyjnego aparatu T-maze do testu podejmowania decyzji. (A) Aparat do testu podejmowania decyzji w oparciu o opóźnienie. Zwierzęta umieszczano w ramieniu startowym, gdzie wybierały między dwoma ramionami docelowymi: HRA i LRA. Gdy zwierzęta wybierały HRA, musiały czekać (w zależności od czasu opóźnienia w sekundach), aby otrzymać większą nagrodę. Badacze muszą ręcznie obsługiwać zwierzęta, pelety i drzwi podczas każdej próby. (B) Aparat do testu podejmowania decyzji w oparciu o wysiłek. Zwierzęta umieszczano w ramieniu startowym, gdzie wybierały między dwoma ramionami docelowymi: HRA i LRA. Gdy zwierzęta wybierały HRA, musiały przeskoczyć przez trójkątną barierę, aby otrzymać większą nagrodę. Badacze muszą ręcznie obsługiwać zwierzęta, pelety, drzwi i bariery podczas każdej próby. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Schematyczny rysunek przedstawiający ustawienie zautomatyzowanego eksperymentu z labiryntem z kamerą CCD do analizy badań behawioralnych.
Rycina 2: Ustawienie zautomatyzowanego labiryntu w kształcie litery T do testu podejmowania decyzji. (A) Widok z góry zautomatyzowanego ustawienia. (B) Widok z boku zautomatyzowanego ustawienia. (C) Trójwymiarowa bariera w kształcie trójkąta prostokątnego stosowana w teście podejmowania decyzji opartym na wysiłku; od lewej do prawej przedstawiono odpowiednio widok boczny, widok przeciwległy oraz widok od strony przeciwprostokątnej. Oryginalne zdjęcia techniczne opracowane za zgodą producenta komercyjnego. GBL: pole celu (lewe), GBR: pole celu (prawe), GDL: drzwi celu (lewe), GDR: drzwi celu (prawe), DAL: obszar opóźnienia (lewy), DAR: obszar opóźnienia (prawy), JDL: drzwi rozwidlenia (lewe), JDR: drzwi rozwidlenia (prawe), BDL: tylne drzwi (lewe), BDR: tylne drzwi (prawe), CCD: kamera CCD). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rekonstrukcja obrazu 3D, interfejs schematyczny do analizy śledzenia cząsteczek w oprogramowaniu badawczym.
Rysunek 3: Okno rejestracji parametrów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Interfejs narzędzia do konfiguracji SubjectID, wyświetlający identyfikator obiektu i tabelę przypisania do grupy.
Rysunek 4: Okno rejestracji Subject ID.Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Interfejs eksperymentu podejmowania decyzji; wprowadzanie danych, kontrola prób i konfiguracja zadania wizualnego.
Rycina 5: Okno interfejsu eksperymentu.Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki eksperymentów behawioralnych; wykres zmian preferencji nagrody w kolejnych sesjach; analiza statystyczna.
Rycina 6: Podejmowanie decyzji w oparciu o opóźnienie i wysiłek u myszy mHb:DTA. (A) Test podejmowania decyzji w oparciu o opóźnienie u myszy mHb:DTA (myszy w wieku 12–14 miesięcy, n = 8/genotyp). Procent wyborów HRA był porównywalny między genotypami, gdy czas opóźnienia wynosił 0 i 5 s, ale znacząco spadł u myszy mHb:DTA, gdy czas opóźnienia wynosił 10 s i 15 s. Przy czasie opóźnienia 5 s, interakcja genotyp×dzień: F(1,14) = 0.594, p = 0.236; efekt genotypu: F(1,14) = 0.61, p = 0.45; przy czasie opóźnienia 10 s: interakcja genotyp×dzień: F(1,14) = 37.5, p = 0.346; efekt genotypu: F(1,14) = 32.4, p <0.0001; przy czasie opóźnienia 15 s: F(1,14) = 38.7, p = 0.243; efekt genotypu: F(1,14) = 31.6 oraz p ≤0.0001. (B) Test podejmowania decyzji w oparciu o wysiłek u myszy mHb:DTA (myszy w wieku 12-14 miesięcy, n = 9/genotyp). Podczas fazy 1x bariera wystąpiła istotna interakcja między genotypem a sesją (interakcja genotyp×dzień: F(1,16) = 2.11, p = 0.015), a porównania parowe post hoc wykazały, że HRA% myszy mHb:DTA znacząco spadło we wszystkich sesjach. Podczas fazy odwrócenia nie stwierdzono istotnej interakcji między genotypem a sesją (interakcja genotyp×dzień: F(1,16) = 1.61, p = 0.08). Myszy mHb:DTA odwiedzały HRA istotnie rzadziej niż myszy CT (główny efekt genotypu: F(1,16) = 8.18, p = 0.01). Podczas fazy 2×bariery wystąpiła istotna interakcja między genotypami a sesjami oraz istotna różnica w sesji 3 i sesji 4 (faza 2x bariery: interakcja genotyp×dzień: F(1,16) = 3.9, p = 0.0067). Myszy mHb:DTA osiągnęły liczbę wizyt w HRA porównywalną z myszami CT w ostatniej sesji, sesji 5. Dane przedstawiają średnią ± SEM. ** p <0.01; *** p <0.001. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Schemat procesu eksperymentu behawioralnego: habituacja, trening dyskryminacyjny, podejmowanie decyzji, odwrócenie.
Figura 7: Schemat testu podejmowania decyzji (opartego na opóźnieniu lub wysiłku).

Dyskusja

Podejmowanie decyzji jest procesem poznawczym wysoce konserwatywnym podczas ewolucji15. Ludzie i zwierzęta mogą ocenić koszt konkurujących ze sobą opcji działania w stosunku do potencjalnej nagrody, a następnie dokonać wyboru. Pacjenci cierpiący na szereg chorób neurologicznych i zaburzeń psychicznych wykazują deficyty w różnych formach podejmowania decyzji16. Dlatego ważne jest zbadanie mechanizmów neurobiologicznych i patofizjologicznych leżących u podstaw procesu podejmowania decyzji. W ciągu ostatnich kilku lat podejmowanie decyzji w oparciu o opóźnienia i wysiłek cieszy się coraz większym zainteresowaniem naukowców. Co więcej, gryzonie, zwłaszcza szczury, były szeroko wykorzystywane do badania tych dwóch form podejmowania decyzji17.

Wiele badań doprowadziło do interesujących odkryć przy użyciu zadania behawioralnego obejmującego aparat T-labirynt z HRA i LRA 2,6,7,8,9,10,18,19,20,21,22 . W zadaniu HRA kojarzy duże nagrody z opóźnieniem czasowym lub wysiłkiem. W LRA zwierzęta mogą otrzymać niewielką nagrodę od razu, bez żadnych opóźnień i wysiłku fizycznego. Tradycyjne podejście opiera się na ręcznej interwencji eksperymentatora. W każdej próbie eksperymentator musi policzyć granulki i umieścić je w tacach na żywność HRA i LRA, umieścić drzwiczki bramki zarówno na HRA, jak i LRA, a następnie umieścić zwierzę na końcu ramienia startowego. Gdy zwierzę wejdzie do któregokolwiek z ramion, należy umieścić drzwi łączące, aby ograniczyć zwierzę do ramienia bramki. W zależności od protokołu, eksperymentator musi odliczyć czas i otworzyć drzwi celu po ustalonym opóźnieniu. Po tym, jak zwierzę wejdzie do obszaru docelowego i zdobędzie kulkę (kulki), eksperymentator musi zwrócić ją do klatki i zarejestrować wybór ramienia i zachowanie zwierzęcia. Następnie eksperymentator musi przygotować drzwi i granulat T-maze do następnej próby. Cały proces szkolenia i testowania jest niezwykle czasochłonny i pracochłonny. Co więcej, kolejnym problemem jest brak standaryzacji w różnych laboratoriach.

W tym artykule przedstawiliśmy protokół oparty na zmodyfikowanym zautomatyzowanym aparacie T-maze z systemem śledzenia wideo (Rysunek 7) w celu rozwiązania problemów tradycyjnych protokołów. Wprowadzając "tylne drzwi" i "tylny korytarz" do tradycyjnego labiryntu w kształcie litery T, uzyskaliśmy labirynt o kształcie "przeciętego trójkąta równoramiennego". Zaletą tej konfiguracji jest (1) pełna automatyzacja treningu i testowania behawioralnego. Eliminuje to wpływ subiektywizmu eksperymentatora i minimalizuje ludzki czas i zaangażowanie w pracę. W laboratorium mamy cztery konfiguracje, dzięki czemu cztery myszy mogą być trenowane lub testowane jednocześnie przez jednego eksperymentatora, co jest niemożliwe do osiągnięcia przy użyciu tradycyjnych protokołów. (2) Istnieje elastyczność oprogramowania, ponieważ oprogramowanie sterujące pozwala eksperymentatorom na swobodne ustawianie wielu parametrów, w tym liczby granulek, czasu opóźnienia, otwierania i zamykania drzwi, numerów prób, czasu trwania i trybu śledzenia. W związku z tym system ten może spełniać różnego rodzaju potrzeby eksperymentalne. (3) Istnieje szeroka kompatybilność, ponieważ wszystkie drzwi przesuwne w labiryncie T są zaprojektowane tak, aby można je było przechowywać pod podstawą labiryntu, gdy są otwarte. Dzięki temu zestaw można łatwo zintegrować z różnymi systemami fizjologicznymi, w tym z manipulacją optogenetyczną/optyczną, rejestracją elektrofizjologii in vivo i mikrodializą. Ponadto, aby wykluczyć możliwość, że myszy wybrały HRA ze względu na preferencję pozycji, zalecamy zastosowanie testu kontrolnego zarówno dla testu opartego na opóźnieniu, jak i wysiłku. Wyrównując koszty w dwóch ramionach celu, zwierzęta mają możliwość doświadczenia obu wyników nagrody przy tym samym koszcie. Wyboru można dokonać po prostu na podstawie różnicy w nagrodach, eliminując w ten sposób potrzebę uwzględniania zarówno kosztów, jak i korzyści przed podjęciem decyzji. Sprawdza to również, czy jakakolwiek zmiana w wyborach zwierząt jest wynikiem niezdolności do skalowania kosztów lub nagrody, czy też deficytu pamięci, a nie zmiany w sposobie, w jaki oceniały swoje decyzje.

W naszym laboratorium przeanalizowaliśmy około 10 szczepów myszy z tą konfiguracją. Jeden przykład pokazano w reprezentatywnych danych, myszy mHb: DTA wykazały solidny fenotyp zarówno w podejmowaniu decyzji opartych na opóźnieniu, jak i wysiłku. Oznacza to, że wartość nagrody jest silnie obniżona przez czas i wysiłek u myszy mHb:DTA. Uzyskany wynik ujawnił ważną rolę mHb w kontroli impulsywności. Ponadto zastosowaliśmy zapisy sondą krzemową na swobodnie poruszających się myszach podczas procesu podejmowania decyzji (dane niepublikowane). Wszystkie eksperymenty dostarczyły testów porównawczych walidacji możliwości automatycznej konfiguracji. W związku z tym ustandaryzowany protokół podejmowania decyzji w oparciu o labirynt T za pomocą zautomatyzowanego aparatu jest odpowiedni do wykrywania efektów genetycznych, efektów farmakologicznych i wpływu obwodów neuronalnych na opóźnienie i dyskontowanie wysiłku gryzoni. Podsumowując, konfiguracja ma wiele zalet, dzięki czemu służy jako idealny system do testów decyzyjnych opartych na opóźnieniach i wysiłku.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Dr. Matthew F S Rushworthowi (Wydział Psychologii Eksperymentalnej, Uniwersytet Oksfordzki) i Dr. Sakagami Masamichi (Centrum Badań nad Nauką o Mózgu, Uniwersytet Tamagawa) za ich cenne rady dotyczące rozpoczęcia projektu i szczegółów protokołów. Dziękujemy dr Lily Yu za krytyczne uwagi i redakcję manuskryptu. Projekt ten był wspierany przez RIKEN Incentive Research Project (100226201701100443) dla Q.Z, Brain Science Project, Center for Novel Science Initiatives, National Institutes of Natural Sciences (BS291003) dla Q.Z, RIKEN Aging Project (10026-201701100263-340120) dla Q.Z oraz JSPS Kakenhi Grant-in-Aid for Young Scientists (B) (17841749) dla Q.Z.

Wkład autorów: Q.Z wymyślił i zainicjował projekt, Q.Z, Y.K i H.G przeprowadzili eksperymenty i analizę danych, H.G koordynował prace między laboratorium a O'HARA & Co., Ltd., Q.Z i Y.K napisali manuskrypt, S.I nadzorował projekt.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
zautomatyzowany labirynt t do testowania decyzjiO' HARA & Co., ltdbrak numeru katalogowego, niestandardoweAdres żądany przez recenzenta: 4-28-16 Ekoda, Nakano-ku, Tokio 165-0022
TEL: 81-3-3389-2451 FAKS:81-3-3389-2453
żel slica Nacalai Tesque1709155
AIN-76A Tabletka dla gryzoni 10 mgTest diety1811213 (5TUL)Wyprodukowano dla Japonii, oprogramowanie SLC
Time TM1 O' HARA & Co., ltdbrak numeru katalogowego
SPSS statistics V21.0IBM

Bibliografia

  1. Frank, M. J., Scheres, A., Sherman, S. J. Understanding decision-making deficits in neurological conditions: insights from models of natural action selection. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 362 (1485), 1641-1654 (2007).
  2. Prevost, C., Pessiglione, M., Metereau, E., Clery-Melin, M. L., Dreher, J. C. Separate valuation subsystems for delay and effort decision costs. J Neurosci. 30 (42), 14080-14090 (2010).
  3. Kennerley, S. W., Walton, M. E. Decision Making and Reward in Frontal Cortex: Complementary Evidence From Neurophysiological and Neuropsychological Studies. Behavioral Neuroscience. 125 (3), 297-317 (2011).
  4. Kurniawan, I. T., Guitart-Masip, M., Dolan, R. J. Dopamine and Effort-Based Decision Making. Frontiers in Neuroscience. 5, 81(2011).
  5. Izquierdo, A., Belcher, A. M. Rodent models of adaptive decision making. Methods Mol Biol. 829, 85-101 (2012).
  6. Thiebot, M. H., Le Bihan, C., Soubrie, P., Simon, P. Benzodiazepines reduce the tolerance to reward delay in rats. Psychopharmacology. 86 (1-2), 147-152 (1985).
  7. Green, M. F., Horan, W. P., Barch, D. M., Gold, J. M. Effort-Based Decision Making: A Novel Approach for Assessing Motivation in Schizophrenia. Schizophr Bull. 41 (5), 1035-1044 (2015).
  8. Fatahi, Z., Sadeghi, B., Haghparast, A. Involvement of cannabinoid system in the nucleus accumbens on delay-based decision making in the rat. Behav Brain Res. 337, 107-113 (2018).
  9. Iodice, P., et al. Fatigue modulates dopamine availability and promotes flexible choice reversals during decision making. Sci Rep. 7 (1), 017-00561 (2017).
  10. Rudebeck, P. H., Walton, M. E., Smyth, A. N., Bannerman, D. M., Rushworth, M. F. Separate neural pathways process different decision costs. Nat Neurosci. 9 (9), 1161-1168 (2006).
  11. Bonnelle, V., et al. Characterization of reward and effort mechanisms in apathy. J Physiol Paris. 109 (1-3), 16-26 (2015).
  12. Hartmann, M. N., et al. Apathy but not diminished expression in schizophrenia is associated with discounting of monetary rewards by physical effort. Schizophr Bull. 41 (2), 503-512 (2015).
  13. Lockwood, P. L., et al. Prosocial apathy for helping others when effort is required. Nat Hum Behav. 1 (7), 017-0131 (2017).
  14. Kobayashi, Y., et al. Genetic dissection of medial habenula-interpeduncular nucleus pathway function in mice. Frontiers in behavioral neuroscience. 7 (17), (2013).
  15. Hanks, T. D., Summerfield, C. Perceptual Decision Making in Rodents, Monkeys, and Humans. Neuron. 93 (1), 15-31 (2017).
  16. Lee, D. Decision Making: from Neuroscience to Psychiatry. Neuron. 78 (2), 233-248 (2013).
  17. Carandini, M., Churchland, A. K. Probing perceptual decisions in rodents. Nature Neuroscience. 16 (7), 824-831 (2013).
  18. Denk, F., et al. Differential involvement of serotonin and dopamine systems in cost-benefit decisions about delay or effort. Psychopharmacology. 179 (3), 587-596 (2005).
  19. Walton, M. E., Bannerman, D. M., Rushworth, M. F. S. The Role of Rat Medial Frontal Cortex in Effort-Based Decision Making. The Journal of Neuroscience. 22 (24), 10996-11003 (2002).
  20. Bardgett, M. E., Depenbrock, M., Downs, N., Points, M., Green, L. Dopamine Modulates Effort-Based Decision-Making in Rats. Behavioral Neuroscience. 123 (2), 242-251 (2009).
  21. Floresco, S. B., Tse, M. T., Ghods-Sharifi, S. Dopaminergic and glutamatergic regulation of effort- and delay-based decision making. Neuropsychopharmacology. 33 (8), 1966-1979 (2008).
  22. Assadi, S. M., Yucel, M., Pantelis, C. Dopamine modulates neural networks involved in effort-based decision-making. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 33 (3), 383-393 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Podejmowanie decyzji w labiryncie Tzautomatyzowany aparat labiryntu Tpodejmowanie decyzji w zale no ci od czasu op nieniapodejmowanie decyzji u gryzoniablacja przy rodkowej cz habenulypodawanie granulek pokarmurejestracja wyboru ramieniaanaliza obwod w neuronalnychprotok podejmowania decyzji
Zautomatyzowane urządzenie i protokół oparty na labiryncie T do analizy podejmowania decyzji w oparciu o opóźnienia i wysiłek u wolno poruszających się gryzoni
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.