Zautomatyzowane urządzenie i protokół oparty na labiryncie T do analizy podejmowania decyzji w oparciu o opóźnienia i wysiłek u wolno poruszających się gryzoni

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia zautomatyzowany labirynt T, który wynaleźliśmy, oraz protokół oparty na tym urządzeniu do analizy podejmowania decyzji na podstawie opóźnień i podejmowania decyzji opartych na wysiłku u swobodnie poruszających się gryzoni.

Streszczenie

Wielu pacjentów neurologicznych i psychiatrycznych wykazuje trudności i/lub deficyty w podejmowaniu decyzji. Modele gryzoni są pomocne w głębszym zrozumieniu neurobiologicznych przyczyn leżących u podstaw problemów z podejmowaniem decyzji. Zadanie labiryntu T-labirynt oparty na kosztach i korzyściach służy do pomiaru procesu podejmowania decyzji, w którym gryzonie wybierają między ramieniem o wysokiej nagrodzie (HRA) a ramieniem o niskiej nagrodzie (LRA). Istnieją dwa paradygmaty zadania decyzyjnego w T-labiryncie, jeden, w którym kosztem jest opóźnienie w czasie, a drugi, w którym jest to wysiłek fizyczny. Oba paradygmaty wymagają żmudnego i pracochłonnego zarządzania zwierzętami doświadczalnymi, wielu drzwi, nagród w postaci granulek i nagrań wyboru ramienia. W obecnych pracach wynaleźliśmy aparaturę opartą na tradycyjnym labiryncie w kształcie litery T z pełną automatyzacją do dostarczania pelletu, zarządzania drzwiami i nagrywania wyborów. Ta zautomatyzowana konfiguracja może być wykorzystana do oceny podejmowania decyzji u gryzoni zarówno w oparciu o opóźnienie, jak i wysiłek. Dzięki opisanemu tutaj protokołowi nasze laboratorium zbadało fenotypy decyzyjne wielu genetycznie zmodyfikowanych myszy. W reprezentatywnych danych wykazaliśmy, że myszy z ablacją przyśrodkową habenularą wykazywały awersję zarówno do opóźnienia, jak i wysiłku oraz miały tendencję do wybierania natychmiastowej i łatwej nagrody. Protokół ten pomaga zmniejszyć zmienność spowodowaną interwencją eksperymentatora i zwiększyć wydajność eksperymentu. Ponadto przewlekła sonda krzemowa lub rejestracja mikroelektrod, obrazowanie światłowodowe i/lub manipulacja aktywnością neuronalną mogą być łatwo zastosowane podczas zadania decyzyjnego przy użyciu opisanej tutaj konfiguracji.

Wprowadzenie

Ludzie i inne zwierzęta oceniają koszt (w tym opóźnienie, wysiłek i ryzyko), aby otrzymać nagrodę, a następnie podejmują decyzję o wyborze określonego sposobu działania. Deficyty decyzyjne pojawiają się w wielu chorobach neuropsychiatrycznych, w tym schizofrenii (SZ), zespole nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi (ADHD), zaburzeniu obsesyjno-kompulsywnym (OCD), chorobie Parkinsona (PD) i uzależnieniu¹. Badania na ludziach i małpach wykazały, że kilka kluczowych regionów mózgu jest zaangażowanych w podejmowanie decyzji^2,3,4. Chociaż naczelne angażują się w bardziej skomplikowane podejmowanie decyzji, doniesiono, że gryzonie są w stanie podejmować decyzje adaptacyjne, aby przetrwać w środowisku, w którym ewentualności nagrody często się zmieniają. Ponadto mechanizmy obwodów neuronalnych i mechanizmy molekularne leżące u podstaw podejmowania decyzji mogą być dokładnie badane na modelach mysich ze względu na dostępność narzędzi chemogenetycznych, narzędzi optogenetycznych i genetycznie modyfikowanych myszy. Istnieje wiele zadań wykorzystywanych do oceny zachowań decyzyjnych gryzoni, w tym zadanie zmiany nastawienia uwagi, zadanie labiryntu T-labirynt oparte na wysiłku lub opóźnieniu, zadanie hazardu w stanie Iowa, zadanie uczenia się odwrócenia dyskryminacji wizualnej⁵ itp. Analogiczne protokoły kosztów i korzyści T-labiryntu zostały pierwotnie opracowane przez grupę Pierre'a⁶ i zostały wykorzystane do zbadania wpływu dwóch rodzajów kosztów decyzji (opóźnienia i wysiłku) na swobodnie poruszające się gryzonie^7,8,9,10. Szczególną zaletą tego zadania jest to, że zwierzęta nie muszą być szkolone do naciskania dźwigni czy kopania w misce. Zamiast tego zwierzęta dokonują wyboru między opcją z wysokim zyskiem i wysokimi kosztami w jednej grupie (HRA) a opcją niskiej nagrody i niskim kosztem w drugiej grupie (LRA). Dlatego to zadanie jest znacznie łatwiejsze do wykonania.

W paradygmacie opartym na opóźnieniu, drzwi do skrzyżowania są wprowadzane, gdy zwierzę doświadczalne wejdzie do jednego z ramion bramki, tak że zwierzę jest trzymane w ramieniu bramki. Jeśli zwierzę wybierze LRA, drzwiczki bramki w LRA są natychmiast chowane i dostarczana jest niewielka ilość jedzenia. Jeśli zwierzę wybierze HRA, drzwiczki bramki w HRA są chowane po wymaganym opóźnieniu i dostarczana jest duża ilość granulek pokarmu (rysunek 1A). W paradygmacie opartym na wysiłku HRA jest blokowany przez barierę, a zwierzęta muszą się przez nią wspinać, aby uzyskać dużą ilość granulek (ryc. 1B). Ogólnie rzecz biorąc, paradygmat oparty na opóźnieniach jest bardzo przydatny do testowania impulsywności modeli zwierzęcych, a paradygmat oparty na wysiłku może pomóc w rozgryzieniu apatycznych zwierząt^2,4,11,12,13. Do tej pory badacze wykonywali ten test poprzez ręczne liczenie opóźnienia czasowego, wkładanie i wyjmowanie drzwi, manewrowanie barierą wysiłku, liczenie liczby wypluwek, umieszczanie granulek na miejscu, umieszczanie i zwracanie zwierząt oraz rejestrowanie wyborów zwierząt dla każdej próby. Te koszty pracy i czasu stanowią poważne wąskie gardło eksperymentalne dla badaczy, utrudniając powszechne stosowanie tego testu behawioralnego. W ramach obecnych prac opracowaliśmy konfigurację opartą na labiryncie T, aby ocenić podejmowanie decyzji przez gryzonie w oparciu o opóźnienia lub wysiłek, z pełną automatyzacją, standaryzacją i wysoką przepustowością.

Aparatura

We współpracy z komercyjnym producentem (zobacz Tabelę Materiałów), opracowaliśmy zmodyfikowany zautomatyzowany aparat do labiryntu T, który wykorzystywał sterowanie instrumentami opartymi na oprogramowaniu (Rysunek 2). W szczególności wprowadziliśmy "tylne drzwi" i "tylne wejście" w porównaniu z tradycyjnym labiryntem w kształcie litery T (Rysunek 2), aby zwierzęta mogły same wrócić do punktu wyjścia i rozpocząć nową próbę. Labirynt T ma matowo-szary kolor, a gdy warunki eksperymentu i oprogramowanie są prawidłowo ustawione, można wykryć zarówno czarne, jak i białe myszy. Składa się z trzech ramion: jednego ramienia startowego i dwóch ramion bramki, każde o długości 410 mm, ze ściankami w kształcie litery V o wysokości 155 mm, podstawą o szerokości 30 mm i otwartym blatem o szerokości 155 mm. Korytarz w kształcie litery V może skutecznie zapobiegać skakaniu myszy. Ponadto korytarz w kształcie litery V ułatwia aplikację nagrywania in vivo za pomocą. Skrzynka startowa jest przymocowana do końca ramienia startowego. Skrzynka na bramkę jest przymocowana na końcu każdego ramienia bramki. W każdym pudełku na bramkę zainstalowany jest automatyczny dozownik żywności, który dostarcza predefiniowaną liczbę słodkich granulek żywności. Wlot granulatu jest wykrywany przez czujnik podczerwieni i jest automatycznie rejestrowany przez komputer. Każda skrzynka bramkowa jest połączona z polem startowym prostym korytarzem. Zwierzęta mogą autonomicznie powrócić do boksu startowego przez korytarz po zakończeniu próby. Przy wejściu i wyjściu z boksów startowych i bramkowych znajdują się drzwi przesuwne o wysokości 155 mm. Dodatkowo przy wejściu do każdego ramienia bramki znajdują się przesuwane drzwi, aby zapobiec cofaniu się zwierząt po dokonaniu wyboru (Rysunek 2A). Wszystkie drzwi przesuwne są sterowane przez komputer i mogą być automatycznie otwierane i zamykane. Nad urządzeniem umieszczono kamerę monoklową 1/2" ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) o wysokiej czułości, aby śledzić zachowanie zwierząt. Ogniskowa obiektywu wynosi 2,8–12 mm. Kamera znajduje się na wysokości około 1,9 m. Ponieważ wysokość labiryntu wynosi 0,5 m od podłogi, odległość między kamerą a labiryntem wynosi około 1,4 m (rysunek 2B). Dane śledzenia uzyskane z kamery CCD są wykorzystywane do sterowania na żywo labiryntem T, otwierania i zamykania określonych drzwi, gdy zwierzęta wchodzą do określonych obszarów zainteresowania (ROI). Bariery wykorzystywane w paradygmacie opartym na wysiłku mają kształt trójwymiarowego trójkąta prostokątnego (rysunek 2C), który idealnie wpasowuje się w ściany w kształcie litery V, i mają około 155 mm wysokości. Zwierzęta muszą wspinać się po stronie pionowej, ale są w stanie zejść ze zbocza o nachyleniu 45°. Podczas eksperymentu aparat jest oświetlany napięciem 100 luksów. Granulki cukru użyte w eksperymencie (patrz Tabela Materiałów) i żel krzemionkowy (patrz Tabela materiałów) są używane do utrzymania granulek w stanie suchym.

Protokół

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Instytutu Nauk o Mózgu RIKEN.

1. Przygotowanie zwierząt

1. Wybierz płeć, wiek, genotyp i leczenie farmakologiczne myszy eksperymentalnych (lub szczurów) w zależności od celu eksperymentu.
   UWAGA: Tutaj zademonstrowaliśmy wydajność czterech samców myszy C57B/6 w wieku 2 miesięcy.
2. Myszy należy trzymać w pomieszczeniu utrzymywanym w standardowych warunkach (12 godzin światła/12 godzin ciemności, światła włączone między 8:00 a 20:00, 22 ± 1°C).
   UWAGA: Jeśli celem jest porównanie różnicy między dwoma genotypami, należy wziąć 4 myszy na klatkę i uwzględnić 2 myszy z każdego genotypu.
3. Dotykaj myszy przez 2 minuty dziennie przez 5 dni, aby przyzwyczaić je do kontaktu z ludźmi. Karm je odmierzonymi dawkami pokarmowymi tak, aby ich masa ciała była mniej więcej utrzymywana na poziomie około 80-85% masy wolnego karmienia przez cały czas trwania eksperymentu. Dostarczaj wodę ad libitum.
4. Przyzwyczaj myszy do pomieszczenia eksperymentalnego, przenosząc wszystkie myszy z pomieszczenia dla myszy do pomieszczenia eksperymentalnego 30 minut przed eksperymentem każdego dnia.
5. Rozpocznij eksperymenty o tej samej porze każdego dnia, aby uniknąć wpływu rytmu okołodobowego na wydajność zwierząt.

2. Przyzwyczajenie zwierząt do labiryntu

1. Rozpocznij przyzwyczajanie się do labiryntu jednocześnie z obsługą myszy (2 min/dzień). Na tym etapie wszystkie drzwi powinny być otwarte. Wykonuj habituację w sumie przez 5 dni.
2. Pierwszego dnia rozrzuć granulki jedzenia w całym labiryncie.
3. W dniach 2 i 3 rozsyp śrut wzdłuż dwóch ramion bramki.
4. W dniach 4 i 5 umieść granulki tylko przy dwóch skrzynkach bramkowych.
5. Codziennie, po umieszczeniu granulek, umieszczaj myszy w pudełku startowym labiryntu T w grupach po cztery i pozwól myszom eksplorować labirynt przez 10 minut.
   UWAGA: Przyzwyczajenie myszy w czteroosobowych grupach pomoże im uczyć się od siebie nawzajem i przyspieszy szkolenie.

3. Dyskryminacja HRA ze strony LRA

ze względu na zwierzęta

UWAGA: Ten protokół obejmuje zarówno testy podejmowania decyzji oparte na opóźnieniach, jak i na wysiłku. Jednak w zależności od celu badacze mogą przetestować tylko jeden z nich lub oba. Oprogramowanie sterujące (tabela materiałów) służy do automatycznego sterowania konfiguracją labiryntu T dla następujących kroków. Jeśli proces podejmowania decyzji w oparciu o wysiłek zostanie przetestowany, należy wprowadzić bariery zarówno dla HRA, jak i LRA w fazie przymusowego wejścia z ramienia. Następnie zwierzęta będą szkolone zarówno do dyskryminacji, jak i pokonywania barier jednocześnie. Wygłodzone myszy aktywnie wspinają się po barierach, a po tej fazie wszystkie potrafią się umiejętnie wspinać. Dlatego nie jest konieczne rozpoczynanie od niższej bariery w przypadku tego protokołu.

1. Faza wymuszonego wejścia ramienia
   1. Otwórz okno rejestracji parametrów w oprogramowaniu sterującym i ustaw parametry w następujący sposób (Rysunek 3).
      1. Wybierz "opcję fazy". Ustaw "numer próby" na 10, aby każde zwierzę przechodziło 10 prób dziennie przez 5 kolejnych dni.
         Uwaga: W swoich własnych eksperymentach można wybrać inny numer badania.
      2. Ustaw "Czas trwania" na 900 s, aby trening jednej myszy dziennie nie przekroczył 900 s. Ustaw "Domyślny czas opóźnienia startu" na 3 s, aby drzwi startowe otworzyły się 3 s po wykryciu zwierzęcia w obszarze startu.
      3. Ustawić "numer granulki" dla HRA i LRA tak, aby 4 granulki były zawsze automatycznie dozowane w HRA, a 1 granulka była dozowana w LRA.
         Uwaga: W naszych eksperymentach odkryliśmy, że 1:4 to najlepszy stosunek, gdy używane jest 10 mg granulek cukru. Jeśli użyjemy od 6 do 10 granulek, myszy nie będą mogły dokończyć jedzenia ich wszystkich i nastąpi pominięcie.
      4. Ustaw "Czas opóźnienia" na 0 s, aby w tej fazie nie było opóźnienia zarówno dla HRA, jak i LRA.
   2. Otwórz okno "Rejestracja dowodu tożsamości" w oprogramowaniu sterującym. Zarejestruj identyfikator każdej myszy z osobna w oprogramowaniu zgodnie z lokalizacją HRA, po lewej lub prawej stronie. (Rysunek 4).
      Uwaga: Lokalizacja powinna być zrównoważona w odniesieniu do grup genotypów. Dla 50% każdej grupy genotypowej HRA znajduje się zawsze po lewej stronie, a LRA po prawej stronie. W przypadku pozostałych 50% HRA znajduje się zawsze po prawej stronie, a LRA zawsze po lewej stronie.
   3. Otwórz okno aplikacji oprogramowania, wybierz "Podejmowanie decyzji" z rozwijanej listy "Zadanie". Wprowadź identyfikator podmiotu i wybierz "Faza 2" z listy rozwijanej "Faza". Wybierz numer dnia z listy rozwijanej "Dzień". Naciśnij przycisk "OK", aby przejść do okna interfejsu eksperymentu.
   4. W oknie interfejsu eksperymentu naciśnij "GetBG", aby zarejestrować informacje o tle labiryntu, dzięki czemu zwierzę będzie dokładnie śledzone niezależnie od tła otoczenia. Naciśnij przycisk "START SESJI" (Rysunek 5).
   5. Umieść mysz w polu startowym i rozpocznij trening, naciskając przycisk "start" na pilocie.
      1. Zwróć uwagę, że drzwi startowe, jedne drzwi węzłowe (po lewej lub prawej stronie) otworzą się automatycznie po 3 sekundach; gdy mysz wejdzie w obszar skrzyżowania, drzwi startowe zamkną się automatycznie.
      2. Zwróć uwagę, że gdy mysz znajdzie się w obszarze opóźnienia (po lewej lub prawej stronie), drzwi skrzyżowane automatycznie się zamkną, a drzwi bramki otworzą się automatycznie.
      3. Zwróć uwagę, że gdy mysz weźmie granulkę, tylne drzwiczki i drzwi przed uruchomieniem otworzą się automatycznie. Gdy mysz znajdzie się w tylnym obszarze, tylne drzwiczki automatycznie się zamkną.
      4. Zwróć uwagę, że gdy mysz wejdzie do pola startowego, drzwiczki przedstartowe zamkną się automatycznie i rozpocznie się nowa próba.
         Uwaga: W ciągu 10 prób każdego dnia podczas tej fazy szkolenia oprogramowanie automatycznie zapewni, że każda mysz odwiedzi HRA w przypadku 5 prób i LRA w przypadku 5 prób.
   6. Codziennie dokładnie czyść labirynt.
2. Faza wejścia wolnego ramienia
   1. Zarejestruj parametry i identyfikator podmiotu w taki sam sposób, jak w fazie przymusowego wejścia (kroki 3.1.1 i 3.1.2). Wybierz "opcję fazy". Ustaw "numer próby" na 20, aby każde zwierzę przechodziło 20 prób dziennie przez 7 kolejnych dni.
   2. W oknie aplikacji wybierz "Faza 3" z listy rozwijanej "Faza". Ustaw inne parametry zgodnie z krokiem 3.1.3.
   3. W oknie interfejsu eksperymentu ustaw wartość "Wskaźnik sukcesu" na 80%, aby szkolenie było automatycznie kontynuowane do momentu, gdy mysz wybierze HRA w 80% prób lub gdy mysz zakończy 20 prób dziennie (zgodnie z ustawieniami parametrów). Zastosuj inne operacje zgodnie z krokiem 3.1.4.
   4. Pozwól myszy swobodnie wybrać jedno ramię, HRA lub LRA.
      1. Zwróć uwagę, że drzwi startowe, dwoje drzwi skrzyżowaczych otworzą się automatycznie po 3 sekundach; gdy mysz wejdzie w obszar skrzyżowania, drzwi startowe zamkną się automatycznie.
      2. Zwróć uwagę, że gdy mysz wybierze jedno ramię i wejdzie w obszar opóźnienia (po lewej lub prawej stronie), drzwi skrzyżowe automatycznie się zamkną, a drzwi bramki otworzą się automatycznie.
      3. Zwróć uwagę, że gdy mysz weźmie granulkę, tylne drzwiczki i drzwi przed uruchomieniem otworzą się automatycznie. Gdy mysz znajdzie się w tylnym obszarze, tylne drzwiczki automatycznie się zamkną.
      4. Zwróć uwagę, że gdy mysz znajdzie się w polu startowym, drzwiczki przedstartowe zamkną się automatycznie i rozpocznie się nowa próba.

4. Test podejmowania decyzji oparty na opóźnieniach

1. Zarejestruj parametry i identyfikator podmiotu w taki sam sposób, jak w fazie wprowadzania wolnego ramienia (krok 3.2.1). Ustaw "Czas opóźnienia" odpowiednio na 5, 10,15 s w dniu 1, dniu 2 i dniu 3, tak aby opóźnienie HRA w dniu 1 wynosiło 5 s, 10 s w dniu 2 i 15 s w dniu 3.
2. W oknie aplikacji wybierz "Faza 4" z listy rozwijanej "Faza". Pozostałe parametry należy ustawić w taki sam sposób, jak w punkcie 3.2.2.
3. W oknie interfejsu eksperymentu zastosuj wszystkie operacje zgodnie z krokiem 3.2.3.
4. Pozwól myszy swobodnie wybrać jedno ramię, HRA lub LRA.
   1. Zwróć uwagę, że drzwi startowe, dwoje drzwi skrzyżowaczych otworzą się automatycznie po 3 sekundach; gdy mysz wejdzie w obszar skrzyżowania, drzwi startowe zamkną się automatycznie.
   2. Zwróć uwagę, że gdy mysz wybierze jedno ramię i wejdzie w obszar opóźnienia (po lewej lub prawej stronie), drzwi łączące automatycznie się zamkną.
      Uwaga: Jeśli mysz wybierze LRA, drzwi bramki otworzą się automatycznie natychmiast. Jeśli jednak mysz wybierze HRA, drzwi bramki otworzą się automatycznie po 5 s, 10 s i 15 s odpowiednio w dniach 1, 2, 3.
   3. Zwróć uwagę, że gdy mysz weźmie granulkę, tylne drzwiczki i drzwi przed uruchomieniem otworzą się automatycznie. Gdy mysz znajdzie się w tylnym obszarze, tylne drzwiczki automatycznie się zamkną.
   4. Zwróć uwagę, że gdy mysz znajdzie się w polu startowym, drzwiczki przed uruchomieniem automatycznie się zamkną i rozpocznie się nowa próba.
      Uwaga: Tutaj trenowaliśmy myszy przez 5-7 dni z każdym warunkiem opóźnienia. Jednakże, w oparciu o nasze doświadczenie w testowaniu wielu linii transgenicznych lub zmutowanych myszy, 1 dzień (20 prób) jest absolutnie wystarczający, aby zobaczyć różnicę między myszami o różnych genotypach i nie ma sensu wydłużać czasu treningu (patrz Rysunek 6 jako przykład). Dlatego obecnie stosujemy tylko 1 dzień za każdy czas opóźnienia i działa to dobrze. Nie będzie problemu, jeśli badacze będą chcieli wydłużyć dni szkoleniowe w zależności od własnego celu.
5. Opcjonalnie: Wykonaj test z odwróconym HRA. Aby sprawdzić, czy wybór myszy jest wynikiem preferencji orientacji, zamień lewą/prawą pozycję HRA i LRA (co może być automatycznie osiągnięte przez oprogramowanie) i pozwól myszom swobodnie wybrać jedno ramię, jak w 4.4.
6. Opcjonalnie: Wykonaj test kontroli opóźnienia. Aby sprawdzić, czy jakikolwiek zaobserwowany deficyt jest wynikiem zmienionej pamięci przestrzennej lub wrażliwości nagrody, a nie wynikiem zmian w podejmowaniu decyzji, należy wprowadzić 15-sekundowe opóźnienie do LRA, jak również HRA, i pozwolić myszom na swobodny wybór jednego ramienia, jak w 4.4.

5. Test podejmowania decyzji w oparciu o wysiłek

1. Wprowadź barierę do HRA, jak pokazano na schemacie (Rysunek 1).
2. Ustaw wszystkie parametry i zastosuj wszystkie operacje zgodnie z krokiem 3.2 — faza wejścia z wolnym ramieniem i testuj zwierzęta przez 3 ciągłe dni.
3. Pozwól myszom swobodnie wybrać jedno ramię, HRA lub LRA.
   UWAGA: Tutaj trenowaliśmy myszy przez 14 dni. Jednakże, w oparciu o nasze doświadczenie w testowaniu wielu linii transgenicznych lub zmutowanych myszy, 3 dni są absolutnie wystarczające, aby zobaczyć różnicę między myszami o różnych genotypach i nie ma sensu wydłużać czasu treningu (Zobacz Rysunek 6 jako przykład). Dlatego obecnie stosujemy tylko 3 dni na test oparty na wysiłku i działa to dobrze. Nie będzie problemu, jeśli badacze będą chcieli wydłużyć dni szkoleniowe w zależności od własnego celu.
4. Opcjonalnie: Wykonaj test z odwróconym HRA. Aby sprawdzić, czy wybór myszy jest wynikiem preferencji orientacji, zamień pozycję HRA i LRA w lewo / w prawo (co może być automatycznie osiągnięte przez oprogramowanie) i pozwól myszom swobodnie wybrać jedno ramię, jak w kroku 5.3.
5. Opcjonalnie: Wykonaj test kontroli wysiłku. Aby sprawdzić, czy jakikolwiek zaobserwowany deficyt jest wynikiem zmienionej pamięci przestrzennej lub wrażliwości nagrody, a nie wynikiem zmian w podejmowaniu decyzji, wprowadź barierę zarówno do LRA, jak i HRA i pozwól myszom swobodnie wybrać jedno ramię, jak w kroku 5.3.

6. Analiza danych

1. Uzyskuj dane i wyniki bezpośrednio z oprogramowania sterującego.
   1. Należy pamiętać, że oprogramowanie automatycznie zarejestruje datę eksperymentu, czas rozpoczęcia i zakończenia, czas trwania, numer próby, lokalizację HRA, numer granulki w HRA i LRA, pozycję (X, Y) oraz ruchomy ślad itp. każdej myszy w folderze "Dane".
   2. Sprawdź, czy oprogramowanie automatycznie przeanalizowało następujące elementy i zapisz je w folderze "Wynik" pod każdym identyfikatorem zwierzęcia: czas trwania, numer badania, numer wyboru HRA, numer wyboru LRA, procent wyboru HRA, procent wyboru LRA, całkowita odległość przemieszczenia i całkowity czas skrzyżowania.
2. Przeprowadzić analizę statystyczną danych ze wszystkich eksperymentów za pomocą mieszanej ANOVA (ANOVA z podzielonym wykresem), z dniem/sesją jako czynnikiem wewnątrzobiektowym i czynnikiem grupowym (grupa genotypu lub grupy o różnych warunkach eksperymentalnych) jako czynnikiem międzyobiektowym.
3. Przeanalizuj główny wpływ czynnika grupowego, jeśli nie ma interakcji między dniem/sesją a czynnikiem grupowym. Stosuj porównania parami post hoc, jeśli istnieje znacząca interakcja między dniem/sesją a czynnikiem grupowym.

Wyniki

Przykład zadania decyzyjnego opartego na opóźnieniu i wysiłku wykonywanym przez myszy z ablacją przyśrodkową habenularną (myszy mHb:DTA)¹⁴ z ich kontrolnymi myszami z dzikiego typu (myszy CT) jest pokazany w Rysunek 6. Dwie myszy mHb: DTA i dwie myszy CT były trzymane razem w jednej klatce po odsadzeniu.

W teście podejmowania decyzji na podstawie opóźnienia (Rysunek 6A) nie było znaczącej interakcji między genotypem a sesją w żadnej fazie, w tym w fazie treningu dyskryminacji (gdy czas opóźnienia HRA wynosił 0) i fazie testu podejmowania decyzji opartej na opóźnieniu (gdy czas opóźnienia HRA wynosił odpowiednio 5 s, 10 s i 15 s). Główny wpływ genotypu nie był istotny, gdy czas opóźnienia wynosił 5 s. Jednak, gdy czas opóźnienia został wydłużony do 10 s i 15 s, myszy mHb:DTA wykazały znaczne zmniejszenie odsetka wizyt HRA w porównaniu z myszami CT. Wyniki te ujawniły, że ablacja mHb zmniejszyła preferencję myszy do czekania na większą nagrodę, a zamiast tego wykazywała tendencję do natychmiastowego wybierania małej nagrody, gdy czas oczekiwania wynosił 10 sekund lub nawet dłużej. Dane sugerują, że mHb może być ważną strukturą mózgu w kontroli impulsywności i/lub oceny kosztów / korzyści w czasie, co sprawia, że zwierzęta są bardziej podatne na tolerowanie opóźnionego dostępu do uzyskania dużej nagrody.

W teście podejmowania decyzji opartym na wysiłku (Rysunek 6B), odsetek wizyt HRA był znacznie zmniejszony u myszy mHb:DTA, gdy bariera została umieszczona w HRA, niezależnie od lokalizacji HRA w lewo/w prawo (1x faza bariery i faza odwrócenia). Oznacza to, że fenotyp myszy mHb:DTA nie był spowodowany deficytem preferencji przestrzennych i pamięci. W teście kontroli wysiłku bariery umieszczono w obu ramionach celu (faza barier 2×) i zarówno LRA, jak i HRA wiązały się z dużym wysiłkiem. W związku z tym koszt wysiłku był taki sam dla zwierząt, które wybierały albo niską nagrodę, albo wysoką nagrodę. Myszy mHb:DTA odwiedzały HRA częściej niż LRA i osiągnęły porównywalną liczbę wizyt HRA podczas ostatniej sesji (sesja 5). Wynik ten sugeruje, że wrażliwość na nagrodę i pamięć przestrzenna u myszy mHb:DTA były nienaruszone. Dane wyjaśniły, że mHb może odgrywać ważną rolę w ocenie kosztów i korzyści wysiłku, umożliwiając zwierzętom włożenie większej ilości pracy w celu uzyskania większych nagród.

Rysunek 1: Schemat ideowy tradycyjnego aparatu T-labirynt do testu podejmowania decyzji. (A) Aparatura badawcza do podejmowania decyzji w oparciu o opóźnienia. Zwierzęta zostały umieszczone w ramieniu startowym i miały do wyboru dwie ręce bramkowe, HRA i LRA. Kiedy zwierzęta wybierały HRA, musiały czekać (w zależności od czasu opóźnienia w sekundach), aby otrzymać większą nagrodę. Naukowcy muszą ręcznie obchodzić się ze zwierzętami, granulkami i drzwiami podczas każdej próby. (B) Aparatura badawcza do podejmowania decyzji w oparciu o wysiłek. Zwierzęta zostały umieszczone w ramieniu startowym i miały do wyboru dwie ręce bramkowe, HRA i LRA. Kiedy zwierzęta wybierały HRA, musiały wspiąć się na trójkątną barierę, aby otrzymać większą nagrodę. Naukowcy muszą ręcznie obchodzić się ze zwierzętami, granulkami, drzwiami i barierami podczas każdej próby. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zautomatyzowana konfiguracja labiryntu T-labirynt do testu podejmowania decyzji. (A) Widok z góry automatycznej konfiguracji. (B) Widok z boku automatycznej konfiguracji. (C) Bariera trójkąta prostokątnego 3D używana do testu podejmowania decyzji w oparciu o wysiłek, od lewej do prawej, to odpowiednio widok z boku, widok z przeciwnej strony i widok z boku przeciwprostokątnej. Oryginalne zdjęcia techniczne edytowane za zgodą producenta komercyjnego. GBL: skrzynka bramkowa (po lewej), GBR: skrzynka bramkowa (po prawej), GDL: bramka (po lewej), GDR: bramka (po prawej), DAL: strefa opóźnienia (po lewej), DAR: strefa opóźnienia (po prawej), JDL: brama rozjazdowa (po lewej), JDR: bramka rozjazdowa (po prawej), BDL: tylne drzwi (po lewej), BDR: tylne drzwi (po prawej), CCD: kamera urządzenia sprzężonego z ładowaniem). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Okno rejestracji parametrów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Okno rejestracji identyfikatora podmiotu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Okno interfejsu eksperymentu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Podejmowanie decyzji w oparciu o opóźnienia i wysiłek u myszy mHb:DTA. (A) Test podejmowania decyzji oparty na opóźnieniu u myszy mHb:DTA (myszy miały 12–14 miesięcy, n = 8/genotyp). Odsetek wyboru HRA był porównywalny między genotypami, gdy czas opóźnienia wynosił 0 i 5 s, ale znacznie zmniejszył się u myszy mHb:DTA, gdy czas opóźnienia wynosił 10 s i 15 s. Gdy czas opóźnienia wynosił 5 s, interakcja genotypowo×dniowa: F(1,14) = 0,594, p = 0,236; wpływ genotypu: F(1,14) = 0,61, p = 0,45; gdy czas opóźnienia wynosił 10 s: interakcja genotyp×dniowa: F(1,14) = 37,5, p = 0,346; wpływ genotypu: F(1,14) = 32,4, p <0,0001; gdy czas opóźnienia wynosił 15 s: F(1,14) = 38,7, p = 0,243; wpływ genotypu: F(1,14) = 31,6, a p ≤0,0001. (B) Test podejmowania decyzji oparty na wysiłku u myszy mHb:DTA (myszy miały 12-14 miesięcy, n = 9/genotyp). Podczas fazy bariery 1x wystąpiła istotna interakcja między genotypem a sesją (interakcja genotyp×dniowa: F(1,16) = 2,11, p = 0,015), a porównanie parami post hoc wykazało, że HRA% myszy mHb: DTA znacznie spadło we wszystkich sesjach. Podczas fazy odwrócenia nie stwierdzono istotnej interakcji między genotypem a sesją (interakcja genotyp×dzień: F(1,16) = 1,61, p = 0,08). mHb: myszy DTA odwiedzały HRA znacznie rzadziej niż myszy CT (główny efekt genotypu: F(1,16) = 8,18, p = 0,01). Podczas fazy 2×barier zaobserwowano istotną interakcję między genotypami i sesjami oraz istotną różnicę w sesji 3 i sesji 4 (faza 2 x bariery: interakcja genotyp×dzień: F(1,16) = 3,9, p = 0,0067). Myszy mHb: DTA osiągnęły liczbę wizyt HRA porównywalną z myszami CT w ostatniej sesji, sesji 5. Dane reprezentują średnią ± SEM. ** p <0,01; p <0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Schemat blokowy testu podejmowania decyzji (oparty na opóźnieniu lub wysiłku).

Dyskusja

Podejmowanie decyzji jest procesem poznawczym wysoce konserwatywnym podczas ewolucji¹⁵. Ludzie i zwierzęta mogą ocenić koszt konkurujących ze sobą opcji działania w stosunku do potencjalnej nagrody, a następnie dokonać wyboru. Pacjenci cierpiący na szereg chorób neurologicznych i zaburzeń psychicznych wykazują deficyty w różnych formach podejmowania decyzji¹⁶. Dlatego ważne jest zbadanie mechanizmów neurobiologicznych i patofizjologicznych leżących u podstaw procesu podejmowania decyzji. W ciągu ostatnich kilku lat podejmowanie decyzji w oparciu o opóźnienia i wysiłek cieszy się coraz większym zainteresowaniem naukowców. Co więcej, gryzonie, zwłaszcza szczury, były szeroko wykorzystywane do badania tych dwóch form podejmowania decyzji¹⁷.

Wiele badań doprowadziło do interesujących odkryć przy użyciu zadania behawioralnego obejmującego aparat T-labirynt z HRA i LRA 2,6,7,8,9,10,18,19,20,21,22 . W zadaniu HRA kojarzy duże nagrody z opóźnieniem czasowym lub wysiłkiem. W LRA zwierzęta mogą otrzymać niewielką nagrodę od razu, bez żadnych opóźnień i wysiłku fizycznego. Tradycyjne podejście opiera się na ręcznej interwencji eksperymentatora. W każdej próbie eksperymentator musi policzyć granulki i umieścić je w tacach na żywność HRA i LRA, umieścić drzwiczki bramki zarówno na HRA, jak i LRA, a następnie umieścić zwierzę na końcu ramienia startowego. Gdy zwierzę wejdzie do któregokolwiek z ramion, należy umieścić drzwi łączące, aby ograniczyć zwierzę do ramienia bramki. W zależności od protokołu, eksperymentator musi odliczyć czas i otworzyć drzwi celu po ustalonym opóźnieniu. Po tym, jak zwierzę wejdzie do obszaru docelowego i zdobędzie kulkę (kulki), eksperymentator musi zwrócić ją do klatki i zarejestrować wybór ramienia i zachowanie zwierzęcia. Następnie eksperymentator musi przygotować drzwi i granulat T-maze do następnej próby. Cały proces szkolenia i testowania jest niezwykle czasochłonny i pracochłonny. Co więcej, kolejnym problemem jest brak standaryzacji w różnych laboratoriach.

W tym artykule przedstawiliśmy protokół oparty na zmodyfikowanym zautomatyzowanym aparacie T-maze z systemem śledzenia wideo (Rysunek 7) w celu rozwiązania problemów tradycyjnych protokołów. Wprowadzając "tylne drzwi" i "tylny korytarz" do tradycyjnego labiryntu w kształcie litery T, uzyskaliśmy labirynt o kształcie "przeciętego trójkąta równoramiennego". Zaletą tej konfiguracji jest (1) pełna automatyzacja treningu i testowania behawioralnego. Eliminuje to wpływ subiektywizmu eksperymentatora i minimalizuje ludzki czas i zaangażowanie w pracę. W laboratorium mamy cztery konfiguracje, dzięki czemu cztery myszy mogą być trenowane lub testowane jednocześnie przez jednego eksperymentatora, co jest niemożliwe do osiągnięcia przy użyciu tradycyjnych protokołów. (2) Istnieje elastyczność oprogramowania, ponieważ oprogramowanie sterujące pozwala eksperymentatorom na swobodne ustawianie wielu parametrów, w tym liczby granulek, czasu opóźnienia, otwierania i zamykania drzwi, numerów prób, czasu trwania i trybu śledzenia. W związku z tym system ten może spełniać różnego rodzaju potrzeby eksperymentalne. (3) Istnieje szeroka kompatybilność, ponieważ wszystkie drzwi przesuwne w labiryncie T są zaprojektowane tak, aby można je było przechowywać pod podstawą labiryntu, gdy są otwarte. Dzięki temu zestaw można łatwo zintegrować z różnymi systemami fizjologicznymi, w tym z manipulacją optogenetyczną/optyczną, rejestracją elektrofizjologii in vivo i mikrodializą. Ponadto, aby wykluczyć możliwość, że myszy wybrały HRA ze względu na preferencję pozycji, zalecamy zastosowanie testu kontrolnego zarówno dla testu opartego na opóźnieniu, jak i wysiłku. Wyrównując koszty w dwóch ramionach celu, zwierzęta mają możliwość doświadczenia obu wyników nagrody przy tym samym koszcie. Wyboru można dokonać po prostu na podstawie różnicy w nagrodach, eliminując w ten sposób potrzebę uwzględniania zarówno kosztów, jak i korzyści przed podjęciem decyzji. Sprawdza to również, czy jakakolwiek zmiana w wyborach zwierząt jest wynikiem niezdolności do skalowania kosztów lub nagrody, czy też deficytu pamięci, a nie zmiany w sposobie, w jaki oceniały swoje decyzje.

W naszym laboratorium przeanalizowaliśmy około 10 szczepów myszy z tą konfiguracją. Jeden przykład pokazano w reprezentatywnych danych, myszy mHb: DTA wykazały solidny fenotyp zarówno w podejmowaniu decyzji opartych na opóźnieniu, jak i wysiłku. Oznacza to, że wartość nagrody jest silnie obniżona przez czas i wysiłek u myszy mHb:DTA. Uzyskany wynik ujawnił ważną rolę mHb w kontroli impulsywności. Ponadto zastosowaliśmy zapisy sondą krzemową na swobodnie poruszających się myszach podczas procesu podejmowania decyzji (dane niepublikowane). Wszystkie eksperymenty dostarczyły testów porównawczych walidacji możliwości automatycznej konfiguracji. W związku z tym ustandaryzowany protokół podejmowania decyzji w oparciu o labirynt T za pomocą zautomatyzowanego aparatu jest odpowiedni do wykrywania efektów genetycznych, efektów farmakologicznych i wpływu obwodów neuronalnych na opóźnienie i dyskontowanie wysiłku gryzoni. Podsumowując, konfiguracja ma wiele zalet, dzięki czemu służy jako idealny system do testów decyzyjnych opartych na opóźnieniach i wysiłku.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
zautomatyzowany labirynt t do testowania decyzji	O' HARA & Co., ltd	brak numeru katalogowego, niestandardowe	Adres żądany przez recenzenta: 4-28-16 Ekoda, Nakano-ku, Tokio 165-0022 TEL: 81-3-3389-2451 FAKS:81-3-3389-2453
żel slica	Nacalai Tesque	1709155
AIN-76A Tabletka dla gryzoni 10 mg	Test diety	1811213 (5TUL)	Wyprodukowano dla Japonii, oprogramowanie SLC
Time TM1	O' HARA & Co., ltd	brak numeru katalogowego
SPSS statistics V21.0	IBM