Artykuł metodologiczny

Detergent z dopasowaniem kontrastu w eksperymentach z rozpraszaniem neutronów pod małym kątem do analizy strukturalnej białek błonowych i modelowania ab initio

DOI:

10.3791/57901

⸱

21 października 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół pokazuje, jak uzyskać model ab initio o niskiej rozdzielczości i szczegóły strukturalne białka błonowego rozpuszczonego przez detergent w roztworze przy użyciu rozpraszania neutronów pod małym kątem z dopasowaniem kontrastowym detergentu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biologiczny instrument do rozpraszania neutronów pod małym kątem w High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory jest przeznaczony do badania materiałów biologicznych, przetwarzania biopaliw i materiałów inspirowanych biologicznie, w skali od nanometrów do mikrometrów. Przedstawione tutaj metody badania właściwości fizycznych (tj. wielkości i kształtu) białek błonowych (w tym przypadku MmIAP, wewnątrzbłonowej proteazy aspartylowej z Methanoculleus marisnigri) w roztworach detergentów tworzących micele są dobrze dostosowane między innymi do tego instrumentu do rozpraszania neutronów pod małym kątem. Inne techniki charakterystyki biofizycznej są utrudnione ze względu na ich niezdolność do uwzględnienia udziału detergentu w złożonej strukturze białko-detergent. Dodatkowo, dostęp do Laboratorium Bio-Deuteracji zapewnia unikalne możliwości przygotowania upraw na dużą skalę i ekspresji białek znakowanych deuterem w celu wzmocnienia sygnału rozpraszania z białka. Chociaż technika ta nie zapewnia szczegółów strukturalnych w wysokiej rozdzielczości, luka w wiedzy strukturalnej na temat białek błonowych obejmuje wiele adresowalnych obszarów badań bez konieczności uzyskania rozdzielczości zbliżonej do atomowej. Na przykład obszary te obejmują określanie stanów oligomerycznych, tworzenie kompleksów, zmiany konformacyjne podczas perturbacji oraz zdarzenia fałdowania/rozwijania. Badania te można łatwo przeprowadzić dzięki zastosowaniu tej metody.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka błonowe są kodowane przez około 30% wszystkich genów1 i stanowią zdecydowaną większość celów dla nowoczesnych leków. 2 Białka te pełnią szeroki wachlarz ważnych funkcji komórkowych,3, ale pomimo ich obfitości i znaczenia — stanowią tylko około 1% wszystkich struktur zdeponowanych w Banku Danych Białkowych Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB). 4 Ze względu na ich częściowo hydrofobową naturę, strukturalne określanie białek związanych z błoną było niezwykle trudne. 5,6,7

Ponieważ wiele technik biofizycznych wymaga monodyspersyjnych cząstek w roztworze do pomiaru, izolowanie białek błonowych od natywnych błon i stabilizowanie tych białek w rozpuszczalnym naśladownictwie natywnych błon było aktywnym obszarem badań w ostatnich dziesięcioleciach. 8,9,10 Badania te doprowadziły do opracowania wielu nowych zespołów amfifilowych do rozpuszczania białek błonowych, takich jak nanodyski,11,12,13 bicelles,14,15 i amfipole. 16,17 Jednak stosowanie miceli detergentowych pozostaje jednym z najbardziej powszechnych i najprostszych podejść do spełnienia wymagań dotyczących rozpuszczalności danego białka. 18,19,20,21,22,23,24,25 Niestety, obecnie nie istnieje żaden pojedynczy detergent ani magiczna mieszanka detergentów, która spełniałaby wszystkie białka błonowe; W związku z tym warunki te muszą być empirycznie przebadane pod kątem unikalnych wymagań każdego białka. 26,27

Detergenty samoorganizują się w roztworze powyżej ich krytycznego stężenia miceli, tworząc struktury zbiorcze zwane miceli. Micele składają się z wielu monomerów detergentów (zwykle w zakresie od 20 do 200) z hydrofobowymi łańcuchami alkilowymi tworzącymi rdzeń miceli i hydrofilowymi grupami głów ułożonymi w warstwie otoczki miceli skierowanej w stronę wodnego rozpuszczalnika. Zachowanie detergentów i tworzenie miceli zostało klasycznie opisane przez Charlesa Tanforda w The Hydrophobic Effect, 28, a rozmiary i kształty miceli z powszechnie stosowanych detergentów w badaniach białek błonowych zostały scharakteryzowane za pomocą rozpraszania pod małym kątem. 29,30 Organizacja detergentów wokół białek błonowych została również zbadana i oczekuje się tworzenia kompleksów białkowo-detergentowych (PDC) z cząsteczkami detergentu otaczającymi białko w układzie przypominającym schludne micele detergentu. 31

Jedną z dodatkowych zalet korzystania z detergentów jest to, że uzyskane właściwości miceli mogą być manipulowane poprzez włączenie innych detergentów. Wiele detergentów wykazuje idealne mieszanie, a wybrane właściwości mieszanych miceli można nawet przewidzieć na podstawie składników i proporcji mieszania. 22 Jednak obecność detergentu może nadal stanowić wyzwanie dla charakterystyki biofizycznej, przyczyniając się do ogólnego sygnału. Na przykład w przypadku technik promieniowania rentgenowskiego i rozpraszania światła sygnał z detergentu w PDC jest praktycznie nie do odróżnienia od białka. 32 Badania z użyciem mikroskopii krioelektronowej pojedynczej cząstki (cryo-EM) zazwyczaj opierają się na uwięzionych (zamrożonych) cząstkach; Szczegóły strukturalne białka są nadal zasłonięte przez niektóre detergenty lub wysokie stężenie detergentu, które dodaje tła. 33 Alternatywne podejścia do interpretacji pełnej struktury PDC (w tym detergentu) zostały stworzone za pomocą metod obliczeniowych, które mają na celu rekonstrukcję detergentu wokół danego białka błonowego. 34

W przypadku rozpraszania neutronów, układ rdzeń-powłoka detergentu w miceli wytwarza współczynnik kształtu, który przyczynia się do obserwowanego rozpraszania. Na szczęście składniki roztworu można zmienić w taki sposób, aby nie przyczyniały się do obserwowanego rozpraszania netto. Ten proces "dopasowania kontrastowego" uzyskuje się poprzez zastąpienie deuteru wodorem w celu uzyskania gęstości długości rozpraszania, która odpowiada gęstości tła (bufora). Należy wziąć pod uwagę rozsądny wybór detergentu (z dostępnymi deuterowanymi odpowiednikami) i stosunek ich mieszania. W przypadku miceli detergentu substytucję tę można przeprowadzić przy użyciu detergentu o tej samej grupie głównej, ale posiadającym deuterowany łańcuch alkilowy (ogon d zamiast ogona h). Ponieważ detergenty są dobrze wymieszane,35 ich agregaty będą miały gęstość długości rozproszenia, która jest średnią ważoną ułamkiem molowym dwóch składników (ogony h i ogony d). Gdy ten średni kontrast jest zgodny z kontrastem grupy głównej, jednorodne struktury agregacji mogą być w pełni dopasowane, aby usunąć wszystkie czynniki przyczyniające się do obserwowanego rozpraszania.

Prezentujemy tutaj protokół do manipulowania kontrastem neutronów miceli detergentu poprzez włączenie chemicznie identycznych cząsteczek detergentu z łańcuchami alkilowymi znakowanymi deuterem. 19,36,37 Pozwala to na pełne jednoczesne dopasowanie kontrastu rdzenia i powłoki miceli, co jest unikalną zdolnością rozpraszania neutronów. 35,38 Dzięki temu znacznie wyrafinowanemu poziomowi szczegółowości, dopasowanie kontrastu może umożliwić badania struktur białek błonowych, które w innym przypadku byłyby niewykonalne. Ponadto to podejście oparte na dopasowaniu kontrastu można rozszerzyć na inne systemy obejmujące detergenty, takie jak reakcje wymiany polimerów39 i dyspergatory olejowo-wodne,40 lub nawet inne środki solubilizujące, takie jak bicele,41 nanodyski,42 lub kopolimery blokowe. 43 Podobne podejście, jak opisane w tym manuspekcie, ale wykorzystujące pojedynczy rodzaj detergentu z częściowymi podstawieniami deuteru na łańcuchu alkilowym i/lub grupie głównej, zostało niedawno opublikowane. 37 Chociaż można się spodziewać, że poprawi to losowy rozkład wodoru i deuteru w całym detergencie w porównaniu z podejściem przedstawionym tutaj, ograniczona liczba dostępnych pozycji na detergencie do zastąpienia i wymaganej dwuetapowej syntezy detergentu stanowi dodatkowe wyzwanie do rozważenia.

Kroki 1 i 2 protokołu opisanego poniżej często się pokrywają, ponieważ wstępne planowanie eksperymentu musi być wykonane w celu złożenia propozycji jakości. Jednak złożenie wniosku jest tutaj uważane za pierwszy krok do podkreślenia, że proces ten powinien zostać rozpoczęty na długo przed eksperymentem neutronowym. Należy również zauważyć, że warunkiem wstępnym, który powinien zostać wykazany we wniosku, jest posiadanie charakterystyki biochemicznej i fizycznej (w tym czystości i stabilności) próbki, co potwierdza potrzebę badań neutronów. Ogólne omówienie rozpraszania neutronów pod małymi kątami (SANS) wykracza poza zakres tego artykułu. Krótkie, ale dokładne wprowadzenie jest dostępne w pracy referencyjnej Characterization of Materials autorstwa Kaufmanna, 44, a niedawno opublikowano obszerny podręcznik poświęcony biologicznemu rozpraszaniu roztworów pod małymi kątami. 45 Dalsze zalecane lektury znajdują się w sekcji Dyskusja. Rozpraszanie pod małym kątem wykorzystuje tak zwany wektor rozpraszania Q jako centralną wielkość opisującą proces rozpraszania. W artykule tym użyto powszechnie przyjętej definicji Q = 4π sin(θ)/λ, gdzie θ jest połową kąta między wiązką przychodzącą a rozproszoną, a λ jest długością fali promieniowania neutronowego w angstremach. Istnieją inne definicje, które używają różnych symboli, takich jak "s" dla wektora rozpraszania, i które mogą różnić się o czynnik 2π lub użycie nanometrów zamiast angstrema (zobacz także dyskusję na temat Rysunek 10).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotuj i prześlij propozycję czasu wiązki i instrumentu do instalacji neutronowej

  1. Zapoznaj się z zasobami internetowymi w celu zidentyfikowania urządzeń do rozpraszania neutronów, które zapewniają ogólny dostęp do czasu wiązki neutronów dla użytkowników, takich jak Oak Ridge National Laboratory (ORNL). Mapa obiektów neutronowych oraz informacje na temat badań neutronów na całym świecie są dostępne online. 46 Pamiętaj, że te obiekty zazwyczaj regularnie zapraszają do składania wniosków; Określa to, kiedy następny czas wiązki będzie dostępny. Neutrony są używane do różnych zastosowań; poszukuje instrumentów do rozpraszania neutronów pod małymi kątami (SANS), szczególnie tych, które mają możliwość pobierania próbek biologicznych.
  2. Korzystaj z zasobów dostarczonych przez urządzenia neutronowe, aby pomóc w poruszaniu się po procesie składania propozycji czasu wiązki neutronów. Skonsultuj się z naukowcem zajmującym się rozpraszaniem neutronów (NSS), który jest związany z instrumentem, o który będziesz się ubiegać. Przegląd bieżących informacji o ośrodku neutronowym dotyczących zaproszeń do składania wniosków, terminów i porad dotyczących składania wniosków; w przypadku Oak Ridge jest to dostępne online. 47 Prześlij propozycję czasu wiązki, postępując zgodnie ze wszystkimi wytycznymi dotyczącymi pomyślnego przesłania.
  3. Jeśli wymagane jest białko deuterowane (patrz 2.2), urządzenia do rozpraszania neutronów są często wspierane przez laboratoria i wiedzę specjalistyczną poświęconą produkcji materiałów deuterowanych. Aby ubiegać się o dostęp do Laboratorium Biodeuteracji (BDL) w ORNL, wybierz BDL jako drugi instrument w systemie wniosków. Podczas gdy propozycja SANS jest weryfikowana pod kątem wykonalności i przez komitet ds. przeglądu naukowego, wnioski BDL są sprawdzane tylko pod kątem wykonalności. Aby pomóc w przeglądzie wykonalności BDL, prześlij wypełniony formularz wniosku o informacje48, który opisuje protokół ekspresji białka i szacowaną wydajność (dostępny online).
  4. Po pomyślnym zrecenzowaniu propozycji czasu wiązki, potwierdź przyznaną datę czasu wiązki przed eksperymentem. Upewnij się, że wszystkie szczegóły próbki i bufora oraz formuły są poprawnie wymienione w propozycji do prawidłowego przeglądu. Wszelkie zmiany w proponowanym planie eksperymentalnym, w tym zmiany w składzie próbki i buforu, wymagają powiadomienia zakładu.
    nuta: Zmiany powinny być jak najszybciej omówione z przypisanym NSS.

2. Określ punkty dopasowania kontrastu neutronów i niezbędny kontrast do pomiaru białka

  1. Zbierz informacje (z informacji o produkcie dostawcy, internetowych baz danych, opublikowanych wartości itp.) dotyczące składu atomowego i objętości elementów systemu detergentowego, które mają być dopasowane kontrastowo. Informacje te są wykorzystywane do określania gęstości długości rozpraszania neutronów (SLD), a tym samym punktów dopasowania kontrastu (CMP) w roztworze, co ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości danych SANS i informacji strukturalnych dla białka błonowego będącego przedmiotem zainteresowania w kontekście PDC. Zamieszczono tabelę podsumowującą właściwości fizyczne i punkty dopasowania kontrastu dla detergentów powszechnie stosowanych w badaniach biofizycznych białek błonowych (tab. 1).
  2. Określ SLD neutronów za pomocą aplikacji internetowej MULCh: ModULes For The Analysis Of Contrast Variation Data49 (dostępna online50 bezpłatnie). Link do instrukcji obsługi znajduje się na stronie głównej. Wejdź na stronę internetową i zapoznaj się z dołączoną dokumentacją. Rysunek 1 i Rysunek 2 przedstawia przegląd danych wejściowych i wyjściowych modułu kontrastu dla dwóch powiązanych przykładów.
    nuta: Dostępne są inne strony internetowe do obliczania SLD, takie jak ta prowadzona przez National Institute of Standards and Technology (NIST) Center for Neutron Research. 51
    1. Otwórz moduł Kontrast, klikając "Kontrast" znajdujący się w lewym okienku nawigacji. Podaj tekst tytułu projektu i wprowadź poniżej szczegóły dotyczące dwóch komponentów (np. grupy głowicy detergentu i końcówki) jako "podjednostka 1" i "podjednostka 2".
    2. Wprowadź wzór cząsteczkowy dla każdego składnika w polu tekstowym "Formuła".
      UWAGA: Aby wprowadzić wzór cząsteczkowy, należy wybrać przycisk opcji "M" w obszarze "Typ substancji". Dodatkowo użyj litery "X" we wzorze, aby wskazać łatwo wymienne atomy wodoru. Sekwencje białek, RNA lub DNA można wprowadzić, jeśli wybrano odpowiednie przyciski radiowe "P", "R" lub "D". Jeśli w podjednostce istnieje wiele kopii składnika, wartość "Nmolekuł" może zostać odpowiednio zmieniona. Praktycznym przykładem są tutaj detergenty podobne do lipidów zawierające dwa identyczne ogony, co pozwala na wprowadzenie wzoru na jeden ogon z Ncząsteczkami równymi 2.
    3. Wprowadź objętość w angstremach sześciennych dla każdego składnika w polu poniżej "Objętość (Å3)". Użyj wzoru Tanforda28 dla łańcuchów alkilowych o długości n, Vtail = 27,4 + n * 26,9, aby obliczyć przybliżoną objętość ogona lub uzyskać objętości molekularne na podstawie dostarczonych informacji o produkcie lub wartości opublikowanych w literaturze.
    4. Wprowadź szczegóły składników bufora. Zmień "Liczbę rozpuszczonych gatunków w rozpuszczalniku" za pomocą menu rozwijanego, aby dodać lub usunąć wiersze dla każdego składnika buforowego. W przypadku detergentów tworzących micele należy uwzględnić wolne monomery detergentu jako oddzielne składniki buforowe przy krytycznym stężeniu miceli detergentu (CMC).
    5. Kliknij "Prześlij", aby wykonać obliczenia kontrastu neutronów i wygenerować stronę wyników, która zawiera tabelę długości rozpraszania, gęstości i punktów dopasowania kontrastu, a także wzory do określania tych parametrów przy dowolnym procencieD2Ow buforze. Przejrzyj parametry rozpraszania, zwracając szczególną uwagę na składniki CMP. Jeśli punkty dopasowania są podobne (w granicach 10%D2O), a stężenie wolnej miceli jest niskie, wówczas można użyć średniej CMP do kontrastowego dopasowania wkładów detergentu. W większości przypadków CMP grupy głowicy i ogona detergentu będzie się różnić o więcej niż 10-15%, tworząc w danych SANS współczynnik kształtu rdzeń-powłoka, który zaciemnia bezpośrednie zbieranie sygnału rozpraszania z samego białka.
  3. Oceń kontrast między grupą głowicy a ogonem detergentu. Gdy grupa głowic detergentu i CMP z ogonem łańcucha alkilowego nie są dobrze dopasowane, dostępność i włączenie detergentu podstawionego deuterem może pozwolić na manipulowanie gęstościami długości rozpraszania wybranych składników. W większości przypadków będzie to wymagało uformowania mieszanej miceli poprzez wprowadzenie identycznego detergentu z łańcuchami alkilowymi podstawionymi deuterem. Dodatek deuteru zwiększa gęstość długości rozpraszania rdzenia utworzonego przez warkocze łańcuchów alkilowych. Pożądany punkt końcowy w tym przypadku jest taki, że CMP powłoki grupy głównej i CMP rdzenia łańcucha alkilowego mają w przybliżeniu równe wartości.
    1. Podnieś CMP rdzenia miceli detergentu, aby był w przybliżeniu równy CMP otoczki grupy głowy, określając odpowiedni stosunek mieszania między ogonami h i d, który zapewnia pełne dopasowanie kontrastu z grupami głów. Warunkiem wstępnym do tego wyznaczenia jest znajomość CMP dla ogona łańcucha alkilowego podstawionego deuterem. Dostępny na rynku odpowiednik n-dodecylu β-D-maltozydu (DDM) jest dostępny z wodorem o wszystkich łańcuchach alkilowych zastąpionym deuterem (d25-DDM). Powtórz obliczenia kontrastu opisane w kroku 2.1 dla "ogona d" zamiast "ogona h".
    2. Oblicz stosunek molowy ogona h do ogona d wymagany do dopasowania kontrastu z grupą głowy CMP. Następujący wzór może pomóc w tym ustaleniu:
      Głowa CMP =ogon h-CMP * χogon h + ogon dCMP * χogon d
      gdzie CMP jest gęstością długości rozpraszania, a χ jest ułamkiem objętościowym głowicy detergentu, ogona h lub składnika d-tail. W przypadku buforowych roztworów DDM, dodanie 44% wagowo (43% mola) całkowitego detergentu jako d25-DDM z łańcuchami alkilowymi podstawionymi deuterem daje pojedynczy CMP w 48,5% D2O zarówno dla składników głowy, jak i ogona.
  4. Rozważ stopień podstawienia deuteru dla białka błonowego. Aby zmierzyć wystarczający sygnał rozpraszania z białka, CMP dla białka powinien wynosić co najmniej 15% D2O w roztworze z dala od detergentu CMP i warunków pomiaru. Sygnał wzrasta wraz z kwadratem tego% różnicy. Ponieważ CMP nieznakowanego białka zwykle występuje z ~ 42% D2O w roztworze (CMP podobny do wielu grup głowic detergentowych), znakowanie deuterem białka jest prawie zawsze konieczne. 52

3. Ekspresja i oczyszczanie interesującego białka błonowego

  1. Przygotuj pożywkę LB (bulion lizogeniczny) i wyhoduj komórki Escherichia coli (E. coli) zawierające indukowalny wektor ekspresji dla docelowej sekwencji białka.
    1. Przygotuj minimalną ilość nośnika. WH2Olub D2O rozpuścić 7,0 g/L (NH4)2SO4, 5,25 g/L Na2HPO4, 1,6 g/L KH2PO4, 0,50 g/L wodorocytrynianu diamonu, 5,0 g/l glicerolu, 1,0 ml/L 20% m/v MgSO4·7H2Oi 1,0 ml/L metali śladowych Holme (0,50 g/L CaCl2·2H2O, 0,098 g/L CoCl2, 0,102 g/L CuSO4, 16,7 g/L FeCl3·6H2O, 0,114 g/L MnSO4·H2O, 22,3 g/L Na2EDTA·2H2O i 0,112 g/L ZnSO4·H2O). 53,54
    2. Przygotować odpowiednie roztwory podstawowe antybiotyków przy użyciuH2OlubD2O.
    3. Przygotować roztwór podstawowy izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozydu, używającH2OlubD2O.
    4. Sterylnie przefiltruj wszystkie roztwory do suchych, sterylnych pojemników za pomocą butelkowych filtrów próżniowych i strzykawkowych o wielkości porów 0,22 mikrona.
  2. Dostosuj komórki E. coli do pożywki znakowanej deuterem przed zwiększeniem skali w celu nadekspresji białka deuterowanego.
    1. Zaszczepić 3 ml pożywki LB izolowaną kolonią z płytki agarowej bulionu lizogenicznego (LB) lub komórkami z zamrożonego bulionu glicerynowego. Hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem przy 250 obr./min lub obniżyć temperaturę do 30 °C lub niższej, aby uniknąć przerostu kultury podczas inkubacji przez noc.
      nuta: Procedura adaptacji może być różna. 55,56,57
    2. Gdy kultura LB osiągnie gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) ~1, rozcieńczyć ją w stosunku 1:20 w 3 ml minimalnej pożywki H2O i osiągnąć OD600 ~1. Powtórzyć rozcieńczenia w stosunku 1:20, używając minimalnej pożywki zawierającej 50, 75 i 100%D2O(lub do pożądanej zawartości D2O).
      UWAGA: Wraz ze wzrostem zawartościD2Otempo wzrostu będzie się zmniejszać. Związek między procentową zawartościąD2Ow pożywce wzrostowej a substytucją deuteru w białku został opisany w literaturze. 58,59,60
    3. Kontynuuj hodowlę w bioreaktorze, aby zwiększyć wydajność deuterowanej masy komórkowej (Rysunek 3).
      nuta: Procedury działania bioreaktora krok po kroku zostały omówione w innym miejscu. 61,62,63,64
  3. Zbieranie i liza komórek E. coli w celu ekstrakcji błonowej i oczyszczania białek
    1. Granulować komórki przez odwirowanie w temperaturze ~6,000 x g przez ~30-45 min w temperaturze 4 °C.
    2. Zmiękcz osad komórkowy, mocząc go w buforze na lodzie przez ~30 min. Następnie delikatnie zawiesić osad komórkowy w buforze, delikatnie pipetując pipetą serologiczną lub delikatnie kołysząc na bujaku 2D, do końcowego stężenia ~1 g mokrej masy komórek/10 ml buforu.
      UWAGA: Przykładowym buforem jest 50 mM HEPES (kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy), pH 7,5, 200 mM NaCl uzupełniony tabletką inhibitora proteazy.
    3. Liza zawieszonych komórek z trzema przejściami przez homogenizator wysokociśnieniowy przy 10 000 psi podczas schładzania odpływu.
      nuta: W zależności od wymaganej skali można zastosować inne metody lizy (np. za pomocą prasy francuskiej lub sonikacji).
    4. Resztki komórek osadu przez odwirowanie w temperaturze ~4 000 - 5 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Powtarzać ten krok, aż supernatant się sklaruje.
    5. Ultraodwirować (~150 000 x g przez 30-45 min) supernatant z poprzedniego etapu, który zawiera frakcję rozpuszczalną i membranową. Osad po ultraodwirowaniu zawiera frakcję membranową.
    6. Zawiesić osad membrany w dużym homogenizatorze Dounce i ponownie wyizolować frakcję membranową przez ultrawirowanie (etap 3.3.5). Powtórz ten krok co najmniej raz, aby usunąć luźno związane białka.
    7. Rozpuszczaj membrany poprzez delikatne kołysanie przez ~30 min w temperaturze 4 °C w buforze zawierającym detergent odpowiedni do oczyszczania. Solubilizacja jest widoczna, gdy zawiesina zmienia kolor z mętnego na przezroczysty. Usunąć nierozpuszczalny materiał przez ultrawirowanie (~150 000 x g przez 30-45 min).
      nuta: Przykładowym buforem jest 50 mM HEPES, pH 7,5, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol i 4% (w/v) DDM do oczyszczania metodą chromatografii powinowactwa Ni2+.
  4. Oczyść białko zgodnie z protokołem opracowanym wcześniej dla form protonowanych.
    nuta: Zobacz Naing i wsp., aby zapoznać się z przykładowym protokołem oczyszczania wewnątrzbłonowej proteazy aspartylowej M. marisnigri JR1 znakowanej heksahistydyną (d-MmIAP). 65 Ostateczny wynik wynosił ~ 1 mg deuteracji z 5 L deuterowanej hodowli komórkowej, z których wszystkie zostały użyte w eksperymencie SANS (Rysunek 4).
  5. Zamień oczyszczone białko na "bufor końcowej wymiany" w celu dopasowania kontrastu.
    1. Przygotuj 200 ml "buforu do końcowej wymiany" zawierającego odpowiednią mieszaninę do dopasowania kontrastu, np. 20 mM HEPES, pH 7,5, 250 mM NaCl i 0,05% całkowitego DDM (0,028% DDM i 0,022% d25-DDM) w 49% D2O.
    2. Zrównoważyć kolumnę wykluczającą rozmiar z objętościami >2 kolumn (CV) "bufora końcowej wymiany" w ppkt 3.5.1 przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC).
    3. Po wstrzyknięciu próbki uruchomić kolumnę i wyizolować frakcje odpowiadające białku będącemu przedmiotem zainteresowania.
    4. Skoncentrować białko do pożądanego stężenia końcowego (2 - 5 mg/ml).
      nuta: Objętość ~300 μL jest wymagana do napełnienia cylindrycznej kuwety kwarcowej o średnicy 1 mm używanej do SANS.
    5. Zarezerwuj porcję dopasowanego bufora do odejmowania tła SANS.
      nuta: Podwielokrotność można pobrać bezpośrednio z przygotowanego buforu lub najlepiej z czystej frakcji elucyjnej na końcu przebiegu FPLC.

4. Dokonaj ostatnich przygotowań do czasu wiązki i zbierz dane SANS

  1. Po zaakceptowaniu propozycji i zatwierdzeniu dostępu do terenu należy ukończyć wszystkie wymagane szkolenia przed wyznaczonym czasem wiązki. Obejmuje to szkolenie przed przyjazdem, szkolenie internetowe, a także szkolenie radiologiczne, laboratoryjne i specjalistyczne dla urządzeń.
    nuta: Wymagania szkoleniowe mogą dyktować wcześniejsze przybycie dla początkujących użytkowników. Więcej informacji można znaleźć na stronie internetowej. 66
  2. Załaduj próbki i do zbierania danych.
    nuta: Przegląd obszaru środowiska próbki przyrządu do biologicznego rozpraszania neutronów pod małym kątem (Bio-SANS) jest pokazany w Rysunek 5.
    1. Załaduj próbki i do ogniw kwarcowych. Ogniwa kwarcowe są dostępne w instrumencie naukowym lub placówce. Użyj końcówek do ładowania żelem, aby uzyskać dostęp do wąskiego otworu większości komórek próbki.
    2. Upewnij się, że przesłona wiązki jest zamknięta, a następnie zbliż się do obszaru środowiska próbki i umieść ogniwa kwarcowe w podajniku próbek. Zapisać pozycję podajnika próbek dla każdej celi próbki.
    3. Sprawdź obszar i upewnij się, że ścieżka wiązki jest wolna od przeszkód, a następnie opuść obszar środowiska próbki i otwórz żaluzję wiązki.
      nuta: Uważnie przestrzegaj wszystkich zasad i przepisów obiektu, przestrzegaj wszystkich postów i słuchaj rad naukowca zajmującego się instrumentem. Próbki nie mogą być usuwane z wiązki i manipulowane nią po wystawieniu na działanie wiązki bez zachowania specjalnych środków ostrożności. Przed wykonaniem tych procedur skonsultuj się z technikiem kontroli radiologicznej (RCT).
  3. Wykonaj skanowanie tabeli w celu automatycznego zbierania danych
    1. Obsługuj urządzenie za pomocą niestandardowego oprogramowania sterującego opartego na LabVIEW, Spectrometer Instrument Control Environment (SpICE). Postępuj zgodnie z instrukcjami obsługi instrumentu dostarczonymi przez Naukowca Zajmującego się Rozpraszaniem Neutronów. Przegląd okien operacji skanowania tabeli znajduje się w Rysunek 6.
    2. Po wprowadzeniu wymaganych informacji w odpowiednich obszarach, wykonaj skanowanie tabeli, a rozpocznie się automatyczny proces zbierania danych. Monitoruj postęp za pomocą zakładki "Status skanowania tabel".

5. Zmniejsz dane SANS z obrazu 2D do wykresu 1D

  1. Zidentyfikuj każdą próbkę i plik danych bufora na podstawie zarejestrowanych numerów skanów. Do każdego pomiaru zostanie przypisany unikalny numer skanowania. Informacje te są pomocne podczas redukcji danych w celu identyfikacji każdej odpowiadającej im pary próbek i.
  2. Użyj oprogramowania MantidPlot i skryptu Python do redukcji
    1. Użytkownicy rozpraszania neutronów otrzymują dane konta w celu uzyskania dostępu do swoich danych w klastrze analizy zdalnej. 67 Zaloguj się do Klastra Zdalnej Analizy i uruchom polecenie "MantidPlot" z wiersza poleceń. Rysunek 7 i Rysunek 8 są podane, aby pomóc w tych krokach.
    2. Uzyskaj skrypt redukcji użytkownika od naukowca zajmującego się rozpraszaniem neutronów (zwykle dzieje się to podczas eksperymentu); skrypt ten jest oparty na Pythonie i będzie zawierał wszystkie niezbędne korekty kalibracji i skalowania, aby zredukować obraz rozpraszania 2D do wykresu 1D intensywności rozproszenia w funkcji kąta rozpraszania, I(Q).
    3. Otwórz dostarczony skrypt redukcji użytkownika w MantidPlot i umieść odpowiednie numery skanowania lub identyfikację dla par próbki i bufora na odpowiedniej liście.
    4. Uruchom skrypt, aby wygenerować zredukowane dane jako czterokolumnowy plik tekstowy (kolejność kolumn to Q, I(Q), I(Q) błąd, błąd Q) w określonej lokalizacji. Kliknij prawym przyciskiem myszy odpowiedni obszar roboczy w MantidPlot i wybierz "Wykres z błędami...", aby wstępnie sprawdzić profile rozproszenia.

6. Analizuj dane pod kątem parametrów strukturalnych cząstki rozpraszającej

  1. Przenieś zredukowany plik danych z serwera analiz na komputer lokalny za pomocą bezpiecznego transferu plików FTP. Można to zrobić za pomocą oprogramowania takiego jak FileZilla lub CyberDuck. Dodatkowe instrukcje i szczegóły dotyczące nawiązywania połączenia z systemem plików serwera Analysis Server znajdują się na stronie logowania analysis.sns.gov.
  2. Pobierz pakiet oprogramowania ATSAS65,68 (cały pakiet ATSAS). 69 Indywidualne programy70 są również dostępne online do analizy danych SANS, a mianowicie do określania parametrów konstrukcyjnych i modeli ab initio.
    nuta: Dostępnych jest wiele opcji analizy danych SANS biomakrocząsteczek. 45
  3. Użyj PRIMUS71 do wykreślania danych, skalowania i odejmowania bufora oraz analizy Guiniera.
    1. Uruchom aplikację ATSAS "SAS Data Analysis" i załaduj zredukowane pliki danych odpowiadające parze próbki i bufora.
      1. Aby prawidłowo przeskalować bufor, wybierz zakres danych na wysokim Q (Q > 0,5 Å-1), gdzie oba profile są podobne i płaskie, a następnie kliknij przycisk 'Skala' znajdujący się pod zakładką 'Operacje'. Do bufora zostanie zastosowany współczynnik skali w taki sposób, aby te dwa płaskie obszary nakładały się na siebie. Należy zachować ostrożność: powinien istnieć wiarygodny fizyczny powód, który uzasadnia skalowanie intensywności bufora w celu dopasowania do próbki. Jeśli rozbieżność jest duża, skonsultuj się z naukowcem zajmującym się instrumentami, aby uzyskać prawidłowe podejścia do odejmowania tła. 44,45,72
      2. Zwiększ zakres danych, aby wyświetlić wszystkie punkty. Kliknij "Odejmij", aby wykonać tę operację. Kliknij prawym przyciskiem myszy plik danych odjęty przez bufor w legendzie i zapisz ten plik do późniejszej analizy. Rysunek 9 przedstawia sposób korzystania z zakładki 'Operacje'.
    2. Wykonaj analizę Guiniera danych próbki odjętych od buforu, korzystając z zakładki "Analiza" w aplikacji "SAS Data Analysis".
      1. Upewnij się, że na liście wybrano właściwy plik i kliknij "Promień bezwładności". Automatyczna próba wykonania dopasowania Guiniera zostanie zapewniona po kliknięciu przycisku "Autorg".
      2. Rozszerz zakres danych używanych do uwzględnienia wszystkich danych o niskiej wartości Q i zacznij zawężać zakres danych, usuwając punkty o wysokim Q, aż limitg Qmax*R spadnie poniżej 1,3. Użyj wykresu reszt, aby sprawdzić, czy dane są liniowe w zakresie dopasowania. Dopasowanie Guiniera daje przybliżone Rg i I0 dla cząstek rozpraszających.
      3. Dokonaj niewielkich korekt w obszarze dopasowania i monitoruj wrażliwość tych wartości na zakres danych używanych w dopasowaniu. Rysunek 10A pokazuje użycie narzędzia 'Promień Bezwładności'.
  4. Uzyskaj funkcję rozkładu prawdopodobieństwa (P(r)) w GNOM. 73 Wygenerowany tutaj plik wyjściowy zostanie użyty jako dane wejściowe dla procesu modelowania ab initio.
    1. Uruchom Kreatora rozkładu odległości w zakładce "Analiza". Uzyskanie dobrego dopasowania do danych jest niezbędne do uzyskania wysokiej jakości modelu. Aby uzyskać więcej informacji na temat uzyskiwania dokładnych dopasowań, zobacz review74 autorstwa Putnama, et al.
      UWAGA: Program GNOM dostarcza dodatkowych informacji o pasowaniu poza Kreatorem rozkładu odległości. Rysunek 10B pokazuje prawidłowe użycie narzędzia 'Rozkład odległości', a Rysunek 11 ilustruje niektóre z najczęściej spotykanych błędów.
    2. Określ Dmax, maksymalną odległość międzyatomową w cząsteczce.
      1. Oszacuj wartość Dmax, odznaczając pole, aby wymusić Rmax=0 i wprowadzając dużą wartość Dmax (na przykład 150 A). Pierwsze przecięcie z osi x na wykresie P(r) daje to oszacowanie.
      2. Wprowadź przyrostowe zmiany w tej wartości Dmax i zakresie użytych danych lub liczbie punktów użytych w pasowaniu, aby zoptymalizować dopasowanie GNOM do danych i wynikowej krzywej P(r).
    3. Kontynuuj udoskonalanie dopasowania GNOM i zapisuj pliki wyjściowe GNOM z dobrymi parametrami dopasowania dla kolejnych kroków modelowania ab initio.
  5. Symuluj profile SANS z modeli PDB o wysokiej rozdzielczości za pomocą programu CRYSON. 75
    1. Otwórz program i wybierz opcję "0". Wybierz nazwę pliku PDB w wyskakującej przeglądarce plików. Naciśnij Enter, aby zaakceptować ustawienia domyślne, z wyjątkiem określenia frakcji deuteracji łańcuchowej i frakcjiD2Ow rozpuszczalniku w celu uzyskania odpowiednich parametrów kontrastu.
    2. Dopasuj model do eksperymentalnego zestawu danych, wpisując "Y" i wybierając plik danych w przeglądarce plików podręcznych. Zaakceptuj pozostałe wartości domyślne, a pliki wyjściowe zostaną zapisane w lokalizacji pliku PDB. Plik ".fit" zawiera informacje o przewidywanym profilu rozpraszania z modelu 3D o wysokiej rozdzielczości.

7. Utwórz modele ab initio na podstawie danych SANS.

UWAGA: DAMMIF76 i DAMMIN77 w pakiecie oprogramowania ATSAS służy do rekonstrukcji fikcyjnych modeli atomów (DAM) przy użyciu symulowanego procesu wyżarzania z wyjścia GNOM, które zawiera dane P(r) lub informacje o prawdopodobieństwie lub częstotliwości odległości międzyatomowych w obrębie cząstki rozpraszającej. Programy te mogą być uruchamiane w trybie wsadowym lub na serwerze WWW ATSAS-Online.

  1. Uruchom Kreatora kształtów PRIMUS za pomocą przycisku "Dammif" w zakładce "Analiza" w "Analizie danych SAS" i użyj ręcznego wyboru parametrów. Dane wejściowe dla kreatora są zilustrowane w Rysunek 12.
    1. Zdefiniuj zakres Guiniera od dopasowania (krok 6.3.2) i przejdź do następnego kroku za pomocą przycisków nawigacyjnych. Zdefiniuj wartości dopasowania z wykresu P(r) (krok 6.4) i przejdź do następnego kroku.
    2. Podaj parametry procesu modelowania ab initio. Wprowadź prefiks dla nazw plików wyjściowych modelu (np. SANSEnvelope), wybierz modelowanie w trybie "szybkim" lub "wolnym", wprowadź wartość liczby modeli (17 zalecanych dla istotności statystycznej), wybierz jedną z dostępnych opcji symetrii cząstek, anizometrii i skali kątowej (jeśli jest znana). Upewnij się, że pola są zaznaczone do uśrednienia modeli za pomocą DAMAVER i dopracuj ostateczny model za pomocą DAMMIN.
    3. Rozpocznij proces za pomocą przycisku "zatwierdź". Po zakończeniu procesu wyświetl i zapisz katalog roboczy.
      UWAGA: Typowy proces modelowania pojedynczego, małego białka może zająć do kilku godzin na typowym komputerze osobistym. Pliki są przechowywane w katalogach tymczasowych do momentu ich zapisania.
  2. Nałóż i nałóż końcową obwiednię SANS na powiązany model o wysokiej rozdzielczości za pomocą SUPCOMB w ATSAS. Umieść kopię modelu PDB o wysokiej rozdzielczości, który ma być dopasowany do koperty SANS w katalogu roboczym. Uruchom polecenie SUPCOMB z wiersza polecenia, używając nazw plików PDB jako dwóch argumentów, przy czym struktura szablonu jest wymieniona jako pierwsza: $ supcomb HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    nuta: Druga wymieniona nazwa pliku zostanie przepisana jako nowy plik z literą "r" dołączoną na końcu i mającą nowe współrzędne do nałożenia na strukturę szablonu.
  3. Wizualizuj wyniki modelu ab initio za pomocą PyMOL (pymol.org), programu do przeglądania grafiki molekularnej 3D. Rysunek 13 przedstawia przegląd operacji PyMOL.
    nuta: Istnieją wytyczne dotyczące modelowania strukturalnego danych rozpraszania pod małym kątem z biomolekuł w roztworze. 78
    1. Uruchom aplikację PyMOL i otwórz pliki .pdb odpowiadające obwiedni 3D SANS i strukturze o wysokiej rozdzielczości wyrównanej do SUPCOMB, które mają być wyświetlane.
    2. Zwizualizuj obwiednię SANS, przedstawiając ten model jako powierzchnię. Kliknij przycisk "S" obok modelu i wybierz opcję "Pokaż: Jako: Powierzchnia".
    3. Wizualizuj strukturę szkieletu białkowego o wysokiej rozdzielczości, przedstawiając ten model jako kreskówkę. Wybierz przycisk "S" obok tego modelu i wybierz "Pokaż: Jako: Kreskówka". Wyświetl łańcuch jako tęczę od końca N do C, wybierając przycisk "C" i "Przez łańcuch: łuki łańcuchowe".
    4. Zmodyfikuj przezroczystość reprezentacji powierzchni w celu zwiększenia przejrzystości. Z paska menu "Ustawienia" wybierz "Przezroczystość » Powierzchnia » 40%".
    5. Spraw, aby tło było białe i nieprzezroczyste. Z paska menu "Wyświetlacz" wybierz "Tło »" i wybierz "Nieprzezroczyste", aby odznaczyć tę opcję i "Biały", aby zaznaczyć ten kolor tła.
      UWAGA: Dodatkowe operacje i zastosowania PyMOL można znaleźć na stronie PyMolWiki.org.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Propozycja czasu wiązki i instrumentu powinna jasno przekazywać wszystkie potrzebne informacje do komisji rewizyjnej, aby można było dokonać prawidłowej oceny proponowanego eksperymentu. Komunikacja z NSS jest wysoce zalecana dla niedoświadczonych użytkowników. NSS może ocenić wstępną wykonalność i pokierować złożeniem propozycji, aby podkreślić wykonalność, bezpieczeństwo i potencjał nauki o dużym wpływie. Informacje zawarte we wniosku powinny zawierać informacje ogólne i kontekst znacze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naukowcy zajmujący się biologią strukturalną wykorzystują uzupełniające techniki strukturalne, takie jak rozpraszanie roztworu, w celu uzyskania szczegółów biochemicznych i strukturalnych (takich jak ogólny rozmiar i kształt) z biomolekuł w roztworze. SANS jest szczególnie atrakcyjną techniką do określania struktur białek błonowych o niskiej rozdzielczości, która jest głównym przedmiotem zainteresowania współczesnej biologii strukturalnej i biochemii. SANS wymaga ilości oczyszczonych białek porównywalnych z ilościami uzy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss i Ryan C. Oliver są zakontraktowani przez UT-Battelle z US DOE w celu wspierania Neutron Science User Program i instrumentu Bio-SANS w Oak Ridge National Laboratory, o których mowa w tym artykule.

Współautorem tego manuskryptu jest UT-Battelle, LLC na podstawie umowy DE-AC05-00OR22725 z Departamentem Energii Stanów Zjednoczonych (DOE). Rząd Stanów Zjednoczonych zachowuje, a wydawca, przyjmując artykuł do publikacji, przyjmuje do wiadomości, że rząd Stanów Zjednoczonych zachowuje niewyłączną, opłaconą, nieodwołalną, ogólnoświatową licencję na publikację lub powielanie opublikowanej formy tego rękopisu lub zezwalanie na to innym osobom do celów rządu Stanów Zjednoczonych. DOE zapewni publiczny dostęp do tych wyników badań sponsorowanych przez rząd federalny zgodnie z Planem Publicznego Dostępu DOE. Rozdział 82

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biuro Badań Biologicznych i Środowiskowych wspierało badania w Centrum Strukturalnej Biologii Molekularnej (CSMB) ORNL oraz Bio-SANS przy użyciu urządzeń wspieranych przez Wydział Obiektów Naukowych Użytkowników, Biuro Podstawowych Nauk Energetycznych Departamentu Energii USA. Prace strukturalne nad białkami błonowymi w laboratorium Liebermana były wspierane przez NIH (DK091357, GM095638) i NSF (0845445).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Koncentrator Amicon Ultra MWCO 50KDa EMD MilliporeUFC905096sprzęt laboratoryjny
Dwuzasadowy cytrynian amonuFisher ScientificA663średni składnik
Siarczan amonuEMD Millipore2150średni składnik
System bioreaktorów Bioflo 310EppendorfM1287-2110
Chlorek wapnia dwuwodnyAcros423525000składnik
KarbenicylinaIBI NaukowyantybiotykIB02025
ChloramfenikolEMD Milipore3130antybiotyk
Chlorek kobaltu (II)AcrosAC21413-0050średni składnik
Siarczan miedzi (II)AcrosAC19771-1000 Średni składnik
Tlenek deuteruSigma-Aldrich756822średni składnik
Drierite Gas PurifierWA Hammond Drierite Co., Ltd.27068
EDTA, disód, dihydratEMD Millipore4010średni składnik
Emulsiflex-C3AvestinEF-C3sprzęt
i Auml; kta Purifier UPC100GE Healthcare sprzęt
GlicerolSigma-AldrichG5516średni składnik
HEPESSigma-AldrichH4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR kolumnaGE Healthcare 
ImidazolVWR97064-622
IPTGTeknovaI3325
Sześciowodny chlorek żelaza(III)MP BiochemikaliaICN19404590składnik średni
LB Agar MillerFisher ScientificBP1425-2
Siarczan magnezu siedmiowodnyVWR97062-134średni składnik
Monohydrat siarczanu manganu(II)AcrosAC20590-5000średni składnik
MaxQ 6000 Wytrząsarka inkubowana/z chłodzeniemThermo ScientificSHKE6000-7 sprzęt
n-Dodecyl-d25-β-D-maltopyranozydAnatraceD310T
n-Dodecyl-β-D-maltopyranozydAnatraceD310A
Fosforan potasu jednozasadowyVWR97062-346średni składnik
Wirówka RC 6 PlusSprzęt Thermo Scientific Sorvall46910
SIGMAFAST inhibitor proteazy tabletki koktajlowe, Bez EDTASigma-AldrichS8830
Chlorek soduSigma-AldrichS3014
Wodorotlenek soduSigma-Aldrich795429
Fosforan sodu dwuzasadowySigma-AldrichS7907średni składnik
Sterylny filtr strzykawkowy 25 mm z 0,2 i mikro; m Membrana PESVWR28145-501laboratoryjny
Sterylny jednorazowy filtr do butelek z 0,2 i mikro; m Membrana PESThermo Scientific596-4520 Sprzęt laboratoryjny
Superdex 200 10/300 GL GE Healthcare 
Kolumna Superose-12 10/300 GL GE Healthcare 
Gęstościomierz Ultrospec 10 komórek GEHealthcare 80211630urządzenia
Siarczan jednowodnyAcrosAC38980-2500 Średni składnik
sprzęt średni17116701 sprzęt 1751750117517301

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wallin, E., Heijne, G. V. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Science. 7 (4), 1029-1038 (1998).
  2. Tautermann, C. S. GPCR structures in drug design, emerging opportunities with new structures. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 24 (17), 4073-4079 (2014).
  3. Cournia, Z., et al. Membrane protein structure, function, and dynamics: A perspective from experiments and theory. The Journal of Membrane Biology. 248 (4), 611-640 (2015).
  4. Doerr, A. Membrane protein structures. Nature Methods. 6, 35(2008).
  5. Bill, R. M., et al. Overcoming barriers to membrane protein structure determination. Nature Biotechnology. 29, 335(2011).
  6. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  7. Sanders, C. R., Sönnichsen, F. Solution NMR of membrane proteins: Practice and challenges. Magnetic Resonance in Chemistry. 44 (S1), S24-S40 (2006).
  8. Garavito, R. M., Ferguson-Miller, S. Detergents as tools in membrane biochemistry. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 32403-32406 (2001).
  9. Privé, G. G. Detergents for the stabilization and crystallization of membrane proteins. Methods. 41 (4), 388-397 (2007).
  10. Wessel, D., Flügge, U. I. A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Analytical Biochemistry. 138 (1), 141-143 (1984).
  11. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Letters. 2 (8), 853-856 (2002).
  12. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  13. Skar-Gislinge, N., et al. Elliptical structure of phospholipid bilayer nanodiscs encapsulated by scaffold proteins: Casting the roles of the lipids and the protein. Journal of the American Chemical Society. 132 (39), 13713-13722 (2010).
  14. Sanders, C. R., Schwonek, J. P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry. 31 (37), 8898-8905 (1992).
  15. Vestergaard, M., Kraft, J. F., Vosegaard, T., Thøgersen, L., Schiøtt, B. Bicelles and other membrane mimics: comparison of structure, properties, and dynamics from MD simulations. The Journal of Physical Chemistry B. 119 (52), 15831-15843 (2015).
  16. Popot, J. -L., et al. Amphipols From A to Z. Annual Review of Biophysics. 40 (1), 379-408 (2011).
  17. Tribet, C., Audebert, R., Popot, J. -L. Amphipols: Polymers that keep membrane proteins soluble in aqueous solutions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 93 (26), 15047(1996).
  18. Fernández, C., Wüthrich, K. NMR solution structure determination of membrane proteins reconstituted in detergent micelles. FEBS Letters. 555 (1), 144-150 (2003).
  19. Hiruma-Shimizu, K., Shimizu, H., Thompson, G. S., Kalverda, A. P., Patching, S. G. Deuterated detergents for structural and functional studies of membrane proteins: Properties, chemical synthesis and applications. Molecular Membrane Biology. 32 (5-8), 139-155 (2015).
  20. Krueger-Koplin, R. D., et al. An evaluation of detergents for NMR structural studies of membrane proteins. Journal of Biomolecular NMR. 28 (1), 43-57 (2004).
  21. Linke, D. Methods in Enzymology. Burgess, R. R., Deutscher, M. P. 463, Academic Press. 603-617 (2009).
  22. Oliver, R. C., et al. Tuning micelle dimensions and properties with binary surfactant mixtures. Langmuir. 30 (44), 13353-13361 (2014).
  23. Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Current Protocols in Protein Science. 84 (1), (2016).
  24. Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Biomembranes. 457 (2), 133-170 (1976).
  25. Tulumello, D. V., Deber, C. M. Efficiency of detergents at maintaining membrane protein structures in their biologically relevant forms. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (5), 1351-1358 (2012).
  26. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. Tanford, C. The Hydrophobic Effect: Formation of Micelles and Biological Membranes. , 2nd edn, John Wiley. (1980).
  29. Littrell, K., Urban, V., Tiede, D., Thiyagarajan, P. Solution structure of detergent micelles at conditions relevant to membrane protein crystallization. Journal of Applied Crystallography. 33 (3 Part 1), 577-581 (2000).
  30. Oliver, R. C., et al. Dependence of micelle size and shape on detergent alkyl chain length and head group. PLOS ONE. 8 (5), e62488(2013).
  31. Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  32. Hong, X., Weng, Y. -X., Li, M. Determination of the topological shape of integral membrane protein light-harvesting complex LH2 from photosynthetic bacteria in the detergent solution by small-angle X-ray scattering. Biophysical Journal. 86 (2), 1082-1088 (2004).
  33. Vinothkumar, K. R. Membrane protein structures without crystals, by single particle electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 33, 103-114 (2015).
  34. Pérez, J., Koutsioubas, A. Memprot: A program to model the detergent corona around a membrane protein based on S-SAXS data. Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 86-93 (2015).
  35. Oliver, R. C., Pingali, S. V., Urban, V. S. Designing mixed detergent micelles for uniform neutron contrast. The Journal of Physical Chemistry Letters. 8 (20), 5041-5046 (2017).
  36. Hiruma-Shimizu, K., Kalverda, A. P., Henderson, P. J. F., Homans, S. W., Patching, S. G. Synthesis of uniformly deuterated n-dodecyl-β-D-maltoside (d39-DDM) for solubilization of membrane proteins in TROSY NMR experiments. Journal of Labelled Compounds & Radiopharmaceuticals. 57 (14), 737-743 (2014).
  37. Midtgaard, S. R., et al. Invisible detergents for structure determination of membrane proteins by small-angle neutron scattering. The FEBS Journal. 285 (2), 357-371 (2018).
  38. Gabel, F. Biological Small Angle Scattering: Techniques, Strategies and Tips. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S. , Springer. Singapore. 201-214 (2017).
  39. Schantz, A. B., et al. PEE-PEO Block copolymer exchange rate between mixed micelles is detergent and temperature activated. Macromolecules. 50 (6), 2484-2494 (2017).
  40. Liyana-Arachchi, T. P., et al. Bubble bursting as an aerosol generation mechanism during an oil spill in the deep-sea environment: Molecular dynamics simulations of oil alkanes and dispersants in atmospheric air/salt water interfaces. Environmental Science: Processes & Impacts. 16 (1), 53-64 (2014).
  41. Dos Santos Morais, R., et al. Contrast-matched isotropic bicelles: A versatile tool to specifically probe the solution structure of peripheral membrane proteins using SANS. Langmuir. 33 (26), 6572-6580 (2017).
  42. Maric, S., et al. Stealth carriers for low-resolution structure determination of membrane proteins in solution. Acta Crystallographica Section D. 70 (2), 317-328 (2014).
  43. Pedersen, J. S., Svaneborg, C., Almdal, K., Hamley, I. W., Young, R. N. A small-angle neutron and x-ray contrast variation scattering study of the structure of block copolymer micelles: Corona shape and excluded volume interactions. Macromolecules. 36 (2), 416-433 (2003).
  44. Urban, V. S. Characterization of Materials. Kaufmann, E. N. , John Wiley and Sons. (2012).
  45. Chaudhuri, B., Muñoz, I. G., Qian, S., Urban, V. S., et al. Advances in Experimental Medicine and Biology. Cohen, I. R. 1009, Springer Singapore. Singapore. 1-268 (2017).
  46. Neutron Facilities WorldWide. , Available from: http://neutronsources.org (2018).
  47. Submitting a Research Proposal. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/users/proposals (2018).
  48. Accompanying Bio-Deuteration Laboratory Proposal. , Available from: https://www.ornl.gov/sites/default/files/BDL_info_request.docx (2014).
  49. Whitten, A. E., Cai, S., Trewhella, J. MULCh: Modules for the analysis of small-angle neutron contrast variation data from biomolecular assemblies. Journal of Applied Crystallography. 41 (1), 222-226 (2008).
  50. MULCh: ModULes for the Analysis of Contrast Variation Data. , Available from: http://smb-research.smb.usyd.edu.au/NCVWeb/ (2018).
  51. Scattering Length Density Calculator by National Institute of Standards and Technology (NIST) Center for Neutron Research. , Available from: https://www.ncnr.nist.gov/resources/activation/ (2018).
  52. Ibel, K., Stuhrmann, H. B. Comparison of neutron and X-ray scattering of dilute myoglobin solutions. Journal of Molecular Biology. 93 (2), 255-265 (1975).
  53. Holme, T., Arvidson, S., Lindholm, B., Pavlu, B. Enzymes: Laboratory-scale production. Process Biochemistry. 5 (9), 62-66 (1970).
  54. Larsson, G., Enfors, S. -O. Protein release and foaming in Escherichia coli cultures grown in minimal medium. Bioprocess Engineering. 15 (5), 231-237 (1996).
  55. Artero, J. -B., Hartlein, M., McSweeney, S., Timmins, P. A comparison of refined X-ray structures of hydrogenated and perdeuterated rat [gamma]E-crystallin in H2O and D2O. Acta Crystallographica Section D. 61 (11), 1541-1549 (2005).
  56. Paliy, O., Bloor, D., Brockwell, D., Gilbert, P., Barber, J. Improved methods of cultivation and production of deuteriated proteins from E. coli strains grown on fully deuteriated minimal medium. Journal of applied microbiology. 94 (4), 580-586 (2003).
  57. Sivashanmugam, A., et al. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Science. 18 (5), 936-948 (2009).
  58. Hoopes, J. T., Elberson, M. A., Preston, R. J., Reddy, P. T., Kelman, Z. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 27-44 (2015).
  59. Leiting, B., Marsilio, F., O'Connell, J. F. Predictable deuteration of recombinant proteins expressed in Escherichia coli. Analytical Biochemistry. 265 (2), 351-355 (1998).
  60. Perkins, S. J. Estimation of deuteration levels in whole cells and cellular proteins by 1H n.m.r. spectroscopy and neutron scattering. Biochemical Journal. 199 (1), 163-170 (1981).
  61. Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J. Operation of a benchtop bioreactor. Journal of Visualized Experiments. (79), e50582(2013).
  62. Duff, A. P., Wilde, K. L., Rekas, A., Lake, V., Holden, P. J. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 565, Academic Press. 3-25 (2015).
  63. Haertlein, M., et al. Methods in Enzymology. Kelman, Z. 566, Academic Press. 113-157 (2016).
  64. Meilleur, F., Weiss, K. L., Myles, D. A. A. T Micro and Nano Technologies in Bioanalysis. Methods in Molecular Biology. 544, 281-292 (2009).
  65. Naing, S. -H., Oliver, R. C., Weiss, K. L., Urban, V. S., Lieberman, R. L. Solution structure of an intramembrane aspartyl protease via small angle neutron scattering. Biophysical Journal. 114 (3), 602-608 (2018).
  66. Training Requirements for First Time and Repeat Users. , Available from: https://neutrons.ornl.gov/users (2018).
  67. Remote Analysis Cluster. , Available from: https://analysis.sns.gov (2018).
  68. Franke, D., et al. ATSAS 2.8: A comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions. Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).
  69. Software Suite. , Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html (2018).
  70. Software Individual Programs. , Available from: https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/software.html (2018).
  71. Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: A Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. Journal of Applied Crystallography. 36 (5), 1277-1282 (2003).
  72. Jacques, D. A., Trewhella, J. Small-angle scattering for structural biology-Expanding the frontier while avoiding the pitfalls. Protein Science. 19 (4), 642-657 (2010).
  73. Svergun, D. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. Journal of Applied Crystallography. 25 (4), 495-503 (1992).
  74. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 40 (3), 191-285 (2007).
  75. Svergun, D. I., et al. Protein hydration in solution: Experimental observation by x-ray and neutron scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2267-2272 (1998).
  76. Franke, D., Svergun, D. I. DAMMIF, a program for rapid ab-initio shape determination in small-angle scattering. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 342-346 (2009).
  77. Svergun, D. I. Restoring Low Resolution Structure of Biological Macromolecules from Solution Scattering Using Simulated Annealing. Biophysical Journal. 76 (6), 2879-2886 (1999).
  78. Jacques, D. A., Guss, J. M., Svergun, D. I., Trewhella, J. Publication guidelines for structural modelling of small-angle scattering data from biomolecules in solution. Acta Crystallographica Section D. 68 (6), 620-626 (2012).
  79. Heller, W. T., et al. The Bio-SANS instrument at the High Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory. Journal of Applied Crystallography. 47 (4), 1238-1246 (2014).
  80. Svergun, D. I., Koch, M. H. J. Small-angle scattering studies of biological macromolecules in solution. Reports on Progress in Physics. 66 (10), 1735(2003).
  81. Johnson, J. L., Kalyoncu, S., Lieberman, R. L. Heterologous Expression of Membrane Proteins: Methods and Protocols. Mus-Veteau, I. , Springer. New York. 281-301 (2016).
  82. Department of Energy Public Access Plan. , Available from: http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza bia ek b onowychbia ko znakowane deuteremanaliza Guinierachromatografia wykluczaniadopasowanie kontrastu neutronowegoredukcja danych SANSwizualizacja w programie PyMOL

Powiązane artykuły