Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Streszczenie

In vivo, białka są często częścią dużych kompleksów makromolekularnych, gdzie specyficzność wiązania i dynamika ostatecznie dyktują funkcjonalne wyniki. W tej pracy przedendosomalna toksyna wąglika jest składana i przekształcana w kompleks endosomalny. Po pierwsze, N-końcowa domena śmiertelnego czynnika mutanta cysteiny (LF_N) jest przyłączona do bioczujnika interferometrii biowarstwowej (BLI) poprzez sprzężenie dwusiarczkowe w optymalnej orientacji, umożliwiając wstępne związanie antygenu ochronnego (PA) (K_d 1 nM). Optymalnie zorientowany kompleks_preporowy LF_N-PA wiąże się następnie z rozpuszczalnym receptorem powierzchniowym komórki kapilarnego morfogennego genu-2 (CMG2) (K_d 170 pM), w wyniku czego powstaje reprezentatywny kompleks preendosomalny wąglika, stabilny przy pH 7,5. Ten złożony kompleks jest następnie poddawany zakwaszeniu (pH 5,0) reprezentatywnemu dla późnego środowiska endosomu w celu przejścia_preporu PA w stan porów wstawionych przez membranę. Ten stan_porów PA powoduje osłabione wiązanie między receptorem CMG2 a_{porem LF N-PA} oraz znaczną dysocjację CMG2 od porów przejściowych. Tio-przyłączenie LF_N do powierzchni biosensora można łatwo odwrócić za pomocą ditiotreitolu. Redukcja na powierzchni biosensora BLI uwalnia trójskładnikowy kompleks LF_{N-PA prepore-CMG2} lub kompleksy_porowe LF_N-PA z przemianami kwasowymi do objętości mikrolitrów. Uwolnione kompleksy są następnie wizualizowane i identyfikowane za pomocą mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas. Eksperymenty te pokazują, jak monitorować kinetyczne składanie/rozkładanie określonych kompleksów białkowych przy użyciu bezznacznikowych metodologii BLI oraz oceniać strukturę i tożsamość tych złożonych kompleksów BLI za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas, przy użyciu łatwych do odtworzenia procedur sekwencyjnych.

Wprowadzenie

Identyfikacja i zrozumienie specyfiki rządzącej składaniem kompleksów białkowych in vivo jest niezwykle interesujące dla badaczy biochemii. Duże heterogeniczne zespoły białek są raczej normą niż wyjątkiem. Pogląd ten jest wspierany przez spektroskopowe monitorowanie składania in vivo, izolowanie kompleksów przy użyciu łagodniejszych technik rozbijania komórek, ocenę produktów z metod oczyszczania opartych na powinowactwie i wizualizację ich za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej o wysokiej rozdzielczości (cryo-EM). Aby zrozumieć kontrolę specyficzności składania w komórce, naukowcy muszą rutynowo izolować, identyfikować i ostatecznie charakteryzować te dynamiczne struktury składania/demontażu. Najintensywniej używanym narzędziem molekularnym do identyfikacji składników tych zespołów często wymaga immunoprecypitacji opartej na przeciwciałach, która opiera się na utrzymaniu złożonej stabilności podczas rozbijania komórek. Niedawno opracowano różne sprzężone techniki analityczne w celu wychwytywania kompleksów z próbek komórkowych przy użyciu podejść opartych na mikroprzepływach, takich jak powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR). Po usunięciu z powierzchni SPR, próbki te analizowano za pomocą matrycowo wspomaganej desorpcji/jonizacji laserowej czasu przelotu (MALDI-TOF)^1,2. Rozwinięcie tej metodologii przy użyciu łatwiejszych protokołów pozwoli naukowcom na wizualizację i walidację przewidywanych kompleksów występujących w środowisku komórkowym. Ponieważ SPR jest systemem opartym na mikrofluidyce, często pojawiają się problemy z tworzeniem agregatów. Obejście tego problemu wymaga rozcieńczenia próbki, co z kolei może zmniejszyć integralność kompleksów biologicznych podatnych na stężenia.

Stosunkowo niedawnym osiągnięciem w technologiach bezetykietowych jest rozwój systemu interferometrii biowarstw (BLI)³. Te szczególne systemy odbicia oparte na świetle replikują lub najlepiej emulują wiązanie SPR i wyniki kinetyczne za ułamek kosztów^3,4, szczególnie jeśli używane są jednostki jednokanałowe. BLI mierzy zmiany we wzorcach interferencji światła odbitego między warstwą odniesienia (kontrolną) a powierzchnią biowarstwy (eksperymentalną). Wynikająca z tego zmiana fazy jest mierzona w czasie rzeczywistym jako odczyt kinetyczny i ilościowy⁵. Powierzchnia biosensora, zawierająca specyficzne substancje chemiczne immobilizacji, jest fizycznie przenoszona między roztworami, w przeciwieństwie do zmian za pomocą podejść mikroprzepływowych w SPR, w celu pomiaru za pomocą odchyleń fazowych długości fali. Efektom przenoszenia masy zapobiega się poprzez mieszanie roztworu. W przeciwieństwie do SPR, systemy te są bardzo przydatne w ocenie kompleksów z surowych próbek biologicznych. Parametr fizyczny mierzony podczas eksperymentów BLI zależy przede wszystkim od zmiany masy lub grubości na powierzchni biosensora, która wynika z montażu lub demontażu kompleksu białkowego.

Te biosensory światłowodowe są łatwe w użyciu i stosunkowo niedrogie. Jednym z pojawiających się użytecznych aspektów BLI jest łatwe usuwanie nowo złożonych kompleksów białkowych z powierzchni. Niedawne zastosowanie tej metody pozwoliło naszemu laboratorium obserwować w czasie rzeczywistym kinetykę indukowanej pH na dużą skalę rearanżacji struktury białka składnika antygenu ochronnego toksyny wąglika (PA), gdy prepor (PA_prepore) przechodzi do swojej postaci porowej (PA_pore). To przejście na końcówce biosensora zostało zweryfikowane za pomocą mikroskopii elektronowej (EM)⁶. Usuwanie kompleksów z powierzchni biosensorów pozwala uniknąć efektów rozcieńczenia większej objętości, często występujących podczas uwalniania kompleksów z powierzchni chipów podczas korzystania z systemów mikroprzepływowych.

W obecnej pracy, kompleksy toksyny wąglika są montowane i demontowane na powierzchni biosensora, a następnie uwalniane do objętości mikrolitrów. Otrzymane złożone składniki są weryfikowane ortogonalnie za pomocą EM i spektrometrii mas (MS).

Protokół

1. Montaż zdefiniowanych kompleksów makromolekularnych na powierzchniach biosensorów interferometrycznych (BLI)

1. Montaż kompleksu preporowej toksyny wąglika na powierzchni biosensora modyfikowanego przez PDEA w postaci aminoreaktywnych
   1. Uwodnić końcówkę biosensora BLI drugiej generacji reagującą aminą (AR2G) w 250 μl wody przez dziesięć minut.
   2. Czasy kroku programu, podane w Tabeli 1, w oprogramowaniu sterującym jednostką BLI (patrz Tabela materiałów).
   3. Rozpocznij bieg BLI, zanurzając końcówkę biosensora w wodzie o objętości 250 μl na 30 sekund, aby zmierzyć początkową linię bazową grubości i gęstości bioczujnika.
   4. Aktywuj bioczujnik, zanurzając końcówkę w 250 μl 50 mM NHS (N-hydroksysukcynimid) i 200 mM EDC (1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiiimid) na 7 minut.
   5. Zanurz aktywowany bioczujnik w 50 mM PDEA (2-(2-pirydynyloditionio)etanoaminie) rozpuszczonym w 0,1 M buforze boranowym (pH 8,5) na 5 minut, aby wytworzyć aktywowaną powierzchnię reagującą z tiolem.
   6. Zanurzyć aktywowany bioczujnik reagujący z tiolami w 250 μl roztworu zawierającego 100 nM E126C LF_N w 10 mM octanie sodu o pH 5,0, 100 mM NaCl, buforować przez 5 minut.
   7. Zanurz końcówkę LF_N w 50 mM L-cysteinie, 1 M NaCl, 0,1 M octanie sodu, pH 5,0 na 4 minuty, aby ugasić wszelkie pozostałe reaktywne wolne grupy tiolowe.
   8. Zanurz wygaszoną końcówkę LF_N w 50 mM Tris, 50 mM NaCl na 2 minuty, aby ustalić linię bazową buforu.
   9. Zanurz wygaszoną końcówkę LF_N w 0,5 μM ochronnym antygenowym preporze (_{PA prepore}), 50 mM Tris, 50mM NaCl na 5 minut, aby utworzyć kompleks_preporowy LF_N-PA.
   10. Po skojarzeniu_preporu PA wyjmij końcówkę z roztworu_wstępnego PA i zanurz końcówkę w 50 mM Tris, 50 mM NaCl na 30 sekund, aby zmyć wszelkie niespecyficznie związane_prepory PA.
   11. Zanurz kompleks_wstępny LF_N-PA w 0,5 μM receptorze CMG2 (bez domeny transbłonowej), 50 mM Tris, 50 mM NaCl, na 5 minut.
   12. Zanurz kompleks LF_{N-PA prepore-CMG2} w 50 mM Tris, 50 mM NaCl na 30 sekund, aby zmyć niezwiązany CMG2 w celu utworzenia kompleksu preendosomalnego.
   13. W celu analizy EM uwolnij kompleks LF_{N-PA prepore-CMG2} z końcówki biosensora, zanurzając końcówkę w 5 μl 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, wewnątrz probówki PCR.
   14. W przypadku tandemowej analizy MS peptydów z kompleksu, uwolnij kompleks LF_{N-PA prepore-CMG2} z końcówki bioczujnika, zanurzając bioczujnik w 5 μL 50 mM DTT, 6 M GuHCl (bez keratyny), 25 mM wodorowęglanu amonu o pH 8,0 w probówce do PCR. Odbywa się to na innym biosensorze niż ten, który jest używany do analizy EM.
2. Montaż kompleksu porowej toksyny wąglika na powierzchni biosensora amino-reaktywnego modyfikowanego PDEA
   1. Aby wyświetlić kompleks po zmianie pH, wykonaj kroki 1.1.1-1.1.12 w poprzedniej sekcji, aby wygenerować kompleks LF_{N-PA prepore-CMG2}.
   2. Zanurz końcówkę biosensora w octanie 10 mM o pH 5,0 na 5 minut, aby zainicjować przejście_preporów PA do przejść porów PA. Przejście to jest wskazane przez wzrost amplitudy (około 0,2 nm), po którym następuje większy spadek amplitudy, który przypuszczalnie jest znaczną lub całkowitą dysocjacją receptora z powodu zmniejszonego powinowactwa wiązania.
   3. Zanurz końcówkę_porów LF_N-PA w 50 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 8,0, na 30 sekund, aby zmyć kwaśny bufor.
   4. W przypadku próbki do analizy EM zanurz końcówkę biosensora w roztworze zawierającym 1,25 mM miceli (2,5 mM MSP1D1, 25 mM Na-cholan, 162,5 mM POPC) na 5 minut, aby zapobiec agregacji w roztworze po uwolnieniu dwusiarczku.
   5. W celu analizy EM uwolnij kompleks_{porowo-micelowy} LF_N-PA z końcówki bioczujnika, zanurzając końcówkę w 5 μl 50 mM DTT, 50 mM Tris, 50 mM NaCl w probówce PCR.
   6. W przypadku tandemowej analizy MS peptydów z kompleksu, uwolnij kompleks LF_{N-PA poore} (bez miceli) z końcówki bioczujnika, zanurzając bioczujnik w 5 μL 50 mM DTT, 6 M GuHCl (bez keratyny), 25 mM wodorowęglanu amonu o pH 8,0 wewnątrz probówki PCR. Odbywa się to na innym biosensorze niż ten, który jest używany do analizy EM.

2. Wizualizacja i walidacja uwolnionych zespołów makromolekularnych z biosensorów BLI za pomocą mikroskopii elektronów z ujemnym zabarwieniem

1. Wyładowanie jarzeniowe na siatce Cu 300 pokrytej węglem. Typowe ustawienia wyładowania jarzeniowego to stabilne ciśnienie atmosfery 0,38 mBar, ujemne 15 mAmps, 20 sekund, a następnie wentylacja powietrzem.
2. Zabezpiecz siatkę między parą czystych pęset.
3. Pobrać pipetą 4 μl uwolnionej złożonej próbki w probówce do PCR na siatkę i pozostawić na adsorpcję przez 60 sekund.
4. Odchować pozostały płyn za pomocą klina bibuły filtracyjnej.
5. Zabarwić siatkę, pipetując 5 μl 0,75% 0,02 mikronowego przefiltrowanego mrówczanu uranylu i usuwając nadmiar plamy po 5 sekundach. Pozostaw ruszt do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
6. Wyświetlanie barwionych siatek próbek za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego.

3. Identyfikacja kompletnego kompleksu toksyn wąglika preendosomalnego (LF_{N-Pa prepore-CMG2}) i kompleksu przejściowego (_{pory LF N-Pa} bez CMG2) przy użyciu spektrometrii mas.

1. Rozcieńczyć uwolnione próbki do 20 μl i inkubować przez 1 godzinę.
2. Dodać 2 μl 55 mM jodoacetamidu, 25 mM wodorowęglanu amonu o pH 8,0 i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności (przykrytej folią aluminiową).
3. Rozcieńczyć próbkę 100 μl 25 mM wodorowęglanu amonu o pH 8,0, aby zmniejszyć stężenie chlorowodorku guanidyny poniżej 1 M.
4. Dodać 5 μl zmodyfikowanej trypsyny do sekwencjonowania o stężeniu 20 ng/μl i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
5. Dodać lodowaty kwas octowy do końcowego stężenia 5%, aby obniżyć pH do <3, a następnie zmniejszyć objętość do 10 μl w koncentratorze próżniowym.
6. Przenieść roztwór peptydu na płytkę z próbką na automatycznym podajniku próbek uHPLC nLC 1200
.
7. Załadować 5 μl roztworu peptydu na kolumnę uHPLC z odwróconymi fazami zamontowaną na etapie jonizacji MS.
8. Przepłukać kolumnę 15 μl 0,1% kwasu mrówkowego o maksymalnej szybkości 5 μl/min i/lub maksymalnym ciśnieniu 800 psi.
9. Eluować peptydy z kolumny C18 z odwróconymi fazami przy natężeniu przepływu 350 nL/min przez okres 90 minut, stosując gradient liniowy od 5% do 40% rozpuszczalnika B w A+B (rozpuszczalnik A: 0,1% kwas mrówkowy; rozpuszczalnik B: 95% acetonitrylu z 0,1% kwasem mrówkowym).
10. Analizuj peptydy eluujące on-line przy użyciu tandemowego MS.
    1. Ustaw źródło jonizacji na 2500 woltów i temperaturę wymiany jonów na 250 °C.
    2. Uruchom spektrometr mas pod kontrolą automatyczną, aby wykonać w sposób ciągły jeden skan MS, a następnie jak najwięcej tandemowych MSMS w okresie 3 sekund, używając CID i znormalizowanej energii zderzenia 35.
11. Zidentyfikuj składniki peptydów i białek przy użyciu standardowych metod. W tej pracy przeprowadzono dwa zestawy analiz peptydów i białek.

Wyniki

Zdolność do monitorowania i walidacji składania dużych kompleksów makromolekularnych jest kluczowym krokiem w stronę zrozumienia specyficzności i funkcjonalności dużych zgrupowań biomolekularnych. Wyniki przedstawionych tutaj metod demonstrują łatwość, z jaką można składać duże kompleksy białkowe (masa >150 kDa) przy użyciu interferometrii warstwy biologicznej, monitorując jednocześnie kinetykę i amplitudę procesu składania. Unikalna, zwarta natura powierzchni biosensora umożliwia rozszerzenie analizy składania poprzez uwalnianie złożonych kompleksów do małych mikrobioobjętości. Mikrobioobjętości te mogą być wykorzystane do wizualizacji początkowej struktury fizycznej kompleksów za pomocą EM oraz do weryfikacji tożsamości komponentów kompleksu za pomocą MS. Schematyczny przegląd całego tego procesu przedstawiono na Rysunku 1.

Kluczowym elementem dla skutecznego montażu i weryfikacji kompleksu makrocząsteczkowego na powierzchni biosensora jest prawidłowa orientacja białka inicjującego. Zapewnia to dostępność miejsc oddziaływań białko-białko, zapobiega ich blokowaniu sterycznemu i optymalnie pozycjonuje je z dala od powierzchni biosensora. Jak pokazano na Rysunku 2, prawidłowa orientacja kompleksu toksyny wąglika jest osiągana poprzez zastosowanie specjalnie zaprojektowanego fragmentu N-końcowego czynnika letalnego (LF_N), dzięki czemu miejsce wiązania LF_N-PA_prepore jest zawsze zorientowane przeciwnie do miejsca kowalencyjnego przyczepienia do biosensora^6,7. Następująca budowa kompleksu poprzez wiązanie PA do biosensora BLI z LF_N, a następnie wiązanie rozpuszczalnego CMG2 do PA, prowadzi ostatecznie do powstania kompleksu toksyny wąglika zdolnego do translokacji.

Krzywa sensogramu BLI stanowi odczyt w czasie rzeczywistym zmian amplitudy wynikających ze specyficznego dodawania komponentów toksyny wąglika na biosensor. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywną krzywą wraz z modelem kompleksu, którego powstanie przewidywano na tym etapie procesu. Pierwszy wzrost wynika z obciążenia końcówki LF_N. Po wygaszeniu i ustaleniu linii bazowej PA_prepore wiąże się z LF_N, a następnie po dodaniu rozpuszczalnego receptora CMG2 powstaje zmontowany kompleks przedendosomalny LF_N-PA_prepore-CMG2. Aby przejść do warunków odpowiadających późnemu endosomowi, cały kompleks poddawany jest impulsowi niskiego pH (pH 5.0), który osłabia wiązanie receptora, umożliwiając preporowi przejście w rozciągniętą konformację poru wbudowanego w błonę.⁶ Krzywe sensogramu dla etapu zakwaszania przedstawiono na Rysunku 4. Początkowy wzrost lub „skok” amplitudy jest prawdopodobnie wynikiem rozciągania poru⁶, które musi nastąpić przed spadkiem wiązania receptora CMG2. Większy spadek amplitudy wynika najprawdopodobniej ze znacznej lub całkowitej dysocjacji receptora z powodu zmniejszenia powinowactwa wiązania. Wcześniejsze prace w tym laboratorium wskazały, że wiązanie CMG2 do w pełni rozciągniętego PA_pore jest pomijalne w porównaniu z oddziaływaniem CMG2-PA_prepore⁶. Ponadto kinetyczna krzywa sensogramu, obserwowana we wszystkich sensogramach przejść z LF_N-PA_prepore-CMG2 do LF_N-PA_pore przy spadku pH, jest powtarzalna w wielu pomiarach.

Przed i po zakwaszeniu kompleksy przyłączone do biosensora są łatwo uwalniane w celu wizualizacji za pomocą EM z barwieniem negatywowym oraz identyfikacji za pomocą MS (Rysunek 5). Reprezentatywne kompleksy z wyników EM przedstawiono na Rysunku 6). Siatki z próbkami przedendosomalnymi wykazują gęstości zgodne z nienaruszonymi kompleksami trójskładnikowymi składającymi się z LF_N-PA_prepore-CMG2. Siatki z kompleksami po zakwaszeniu wykazują przejście PA w formę pory oraz solubilizację poprzez włączenie w micelę, bez wyraźnej gęstości CMG2.

Tożsamość kompleksów przed i po zakwaszeniu zweryfikowano za pomocą MS. Stworzono bazę danych, w której sekwencje PA (P13423), LF_N (P15917) oraz CMG2 (P58335) zawarto w tle bazy białek mysich pochodzącej z repozytorium NCBInr. W pierwszym przeszukiwaniu bazy uzyskano jedynie białka będące przedmiotem zainteresowania, przy następującym pokryciu aminokwasowym dla kompleksów trójcząsteczkowych i dwucząsteczkowych: odpowiednio 54% i 22% dla PA, 36% i 6% dla LF oraz 43% dla CMG2 (CMG2 nie wykryto w kompleksie dwucząsteczkowym). Aby zmaksymalizować pokrycie aminokwasowe białek, przeprowadzono drugą identyfikację peptydów/białek przy użyciu bazy białek zawierającej wyłącznie trzy interesujące nas białka. Próbki MS z etapu przedendosomalnego zawierały peptydy wszystkich trzech komponentów toksyny z pokryciem wynoszącym odpowiednio 60,46%, 67,97% i 54,15% dla LF_N, PA i CMG2 (Rysunek 7). Wyniki z etapu poendosomalnego, przedstawione na Rysunku 8, zawierały jedynie peptydy LF_N i PA (odpowiednio 57,41% i 67,79% pokrycia). Brak CMG2 w próbkach poendosomalnych jest zgodny z obserwowanym spadkiem sygnału BLI nm podczas tworzenia porów.

Rycina 1. Schematyczny przegląd analizy kompleksów białkowych składanych na biosensorze BLI i izolowanych z niego przy użyciu EM i MS. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 2. Aktywacja biosensora: Pierwszy etap montażu specyficznego pod względem orientacji na biosensorze BLI. Domena N-końcowa czynnika letalnego E126C (LF_N) jest połączona poprzez wiązanie tioeterowe, co tworzy prawidłowo zorientowany interfejs wiązania PA_prepore. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Monitorowanie montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą BLI: Sensogram pokazuje zmiany amplitudy w funkcji czasu wynikające ze specyficznego dodawania składników toksyny wąglika do biosensora, rozpoczynając od ładowania LF_N (krok 4 w Tabeli 1). Następnie na powierzchnię ładowany jest PA_prepore, po czym dodawany jest rozpuszczalny receptor CMG2. Zmontowany kompleks przedendosomalny składa się z LF-PA_prepore- CMG2. Aby przejść do warunków odpowiadających późnemu endosomowi, cały zmontowany, funkcjonalny kompleks toksyny wąglika poddawany jest impulsowi niskiego pH (pH 5.0), który osłabia wiązanie receptora, umożliwiając preporowi przejście w rozszerzoną konformację poru wbudowanego w błonę. Ekspozycja poru przebiegającego przez błonę zostaje potwierdzona i solubilizowana poprzez dodanie miceli. Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Rycina 4. Sensogram BLI uwalniania CMG2: Ślady etapu zakwaszania wykazują początkowy wzrost lub „skok” amplitudy, po którym następuje spadek o większej amplitudzie, co prawdopodobnie odpowiada odpowiednio tworzeniu się porów i dysocjacji receptora. Pionowe czerwone linie przerywane oznaczają początek nowego etapu. Sensogramy są wyrównane do pogrubionej czerwonej linii przerywanej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 5. Analiza kompleksów białkowych zmontowanych na biosensorze BLI i wyizolowanych z niego za pomocą EM i MS: Kompleksy przytwierdzone do biosensora są łatwo uwalniane do 5 µL buforu zawierającego DTT w celu wizualizacji za pomocą EM z barwieniem negatywowym oraz identyfikacji za pomocą MS. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 6. Wizualizacja kompleksów białkowych za pomocą EM: siatki z próbkami przedendosomalnymi wykazują gęstości zgodne z nienaruszonymi kompleksami trójskładnikowymi składającymi się z LF_N-PA_prepore-CMG2. Siatki z kompleksami poendosomalnymi pokazują przejście PA w por i solubilizację przez micelę, bez wyraźnej gęstości CMG2. Modele przewidywanych kompleksów (po lewej stronie) są w tej samej skali co pokazane pojedyncze cząsteczki. Poniżej każdej cząsteczki przedstawiono cząsteczki pokolorowane zgodnie z przewidywanym białkiem (na podstawie wielkości gęstości EM). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 7. Weryfikacja kompleksów białkowych za pomocą MS: próbki MS z etapu przedendosomalnego zawierały peptydy wszystkich trzech komponentów toksyny, z pokryciem wynoszącym odpowiednio 60,46%, 67,97% i 54,15% dla LF_N, PA i CMG2. Peptydy wykryte przy współczynniku fałszywych odkryć (FDR) równym lub wyższym niż 5% zaznaczono na żółto, a FDR równym lub wyższym niż 1% zaznaczono na zielono. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 8. Weryfikacja kompleksów białkowych za pomocą MS: Próbki poendosomalne zawierały peptydy z LF_N i PA (pokrycie odpowiednio 57,41% i 67,79%), ale nie z CMG2. FDR równy lub wyższy niż 5% zaznaczono na żółto, FDR równy lub wyższy niż 1% zaznaczono na zielono. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Krok	Czas (s)	Opis
1	30	Wstępna wartość bazowa
2	420	Aktywacja
3	300	Aktywacja
4	300	LFN ładowanie
5	240	Wygaszanie cysteiną
6	120	Poziom bazowy
7	300	PAPrzygotuj powiązanie
8	30	Poziom wyjściowy
9	300	asocjacja CMG2
10	30	Poziom bazowy
11	300	Przejście kwasowe
12	30	Poziom wyjściowy
13	300	Asocjacja micelarna

Tabela 1. Czasy poszczególnych etapów pojedynczego pomiaru BLI w celu montażu kompleksu toksyny wąglika. Należy pamiętać, że linie bazowe są wykorzystywane do wypłukania niezwiązanego białka z poprzedniego etapu i/lub do ustanowienia nowej linii bazowej buforu.

Dyskusja

Demonstracja ta ilustruje, w jaki sposób tworzenie się kompleksów makromolekularnych można łatwo monitorować za pomocą interferometrii biowarstw, wizualizować za pomocą EM i weryfikować za pomocą MS, a wszystko to z mikroobjętościami w krótkim czasie. Montaż strukturalny i obserwowane kompleksy są zgodne z biologicznie istotnymi przewidywaniami, co dodatkowo potwierdza tę połączoną metodologię. Jak wspomniano w sekcji wyników, kluczowy element powodzenia montażu wymaga racjonalnie zaprojektowanej mutagenezy cysteiny, aby zapewnić, że złożone interfejsy białko-białko są prawidłowo zorientowane z dala od powierzchni biosensora.

Poprzednie systemy wykorzystywały techniki BLI i MS do oceny wiązania białek w układach dwu- i trzyskładnikowych, a także integralności wiązania z receptorem eksprymowanego białka, ale w obu przypadkach metody te nie zostały opracowane z myślą o wykorzystaniu podejścia tandemowego EM/MS ^8,9. Jedynym innym systemem interferometrycznym, który łączył analizę MS w celu scharakteryzowania oddziaływań, była interferometria o podwójnej polaryzacji¹⁰. Niestety, ten system nie jest już dostępny do ogólnego użytku. Jak wspomniano we wstępie, przeprowadzono szereg badań, w których próbki zostały utworzone na powierzchniach biosensorów podobnych do SPR i usunięte z analizy SM. Żaden z tych przykładów nie skutkował powstaniem kompleksów zwizualizowanych za pomocą EM.

Ograniczenia tej metody sekwencyjnej mogą być liczne, ale można je rozwiązać. W przypadku początkowego unieruchomienia, a tym samym etapu fundamentowego montażu, brak wiedzy na temat powierzchni interakcji konstrukcyjnych z pewnością utrudniłby postęp związany z monitorowaniem początkowych faz montażu. Brak informacji o strukturze można rozwiązać, projektując inżynieryjną konstrukcję fundamentową, w której substancje chemiczne przyłączania (np. ugrupowanie sulfhydrylowe dla wiązań dwusiarczkowych / pozycjonowanie oznaczone przez Hisa) mogą być przenoszone do różnych regionów w systemie montażu rdzenia. W przypadku kompleksu toksyny wąglika na szczęście dostępna jest struktura LF_N związana z_preporem PA¹¹. Racjonalne umieszczenie zmodyfikowanej cysteiny zlokalizowano w regionach oddalonych od_{powierzchni wiążącej} PA. W przypadku związków chemicznych wiązań cysteinowych zaleca się, aby na powierzchni białka nie było żadnych innych reaktywnych cystein.

Istnieją różne substancje chemiczne przyłączania, które można wykorzystać do zaprojektowania określonego miejsca przyłączenia na powierzchni białka. Jednym z najpopularniejszych specyficznych przystawek jest umieszczenie ugrupowania biotyny w ściśle określonym miejscu na powierzchni białka¹². Niestety, wiązanie biotyny z powierzchniami pokrytymi streptawidyną lub awidyną jest dość ścisłe. Odwrócenie interakcji wiązania nie jest proste. Zastosowanie zaprojektowanego znacznika His na końcu N lub C i wynikająca z tego łatwość mocowania do powierzchni Ni-NTA jest bardziej uniwersalnym zastosowaniem unieruchomienia powinowactwa. Oczywiście, jednym z zastrzeżeń dotyczących miejsc mocowania montażu inżynieryjnego z systemami oznaczonymi przez Hisa jest wymóg, aby końce N i C białka zespołu rdzenia pozostały odsłonięte i oddzielone, aby mocowanie było łatwe. Podobnie jak w przypadku wszystkich procesów składania, interfejs interakcji białka składania rdzenia musi pozostać dostępny w miarę postępu złożonego składania.

Być może najczęstszym problemem związanym ze stosowaniem chemii powierzchni biosensorów jest niespecyficzne wiązanie. Końcówki streptawidyny są często źródłem znaczących, niespecyficznych efektów wiązania. Biotyna związana z dwusiarczkiem może być stosowana do uwalniania bardzo specyficznych kompleksów, pozostawiając zredukowane wiązanie S-biotyny ściśle związane z unieruchomionymi biosensorami streptawidyny¹³. Dostępne są inne odwracalne substancje chemiczne, takie jak iminoboroniany i w mniejszym stopniu ketoamid¹⁴. Dziedzina ta jest obecnie słabo rozwinięta, ale istnieje duże zainteresowanie dalszym opracowywaniem odwracalnych protokołów kowalencyjnych w celu uniknięcia skutków toksyczności leków poza celem, które często towarzyszą stosowaniu kowalencyjnego opracowywania leków celowanych.

Ograniczeniem stosowania EM do wizualizacji kompleksów jest interpretacja, zwłaszcza w przypadkach, gdy struktury złożonych kompleksów nie są początkowo znane. Przestrzenną lokalizację składników w niezdefiniowanym złożonym kompleksie makromolekularnym można zidentyfikować za pomocą przeciwciał monoklonalnych (mAb) jako specyficznych markerów kinetycznych i strukturalnych. Na przykład po utworzeniu kompleksu można dodać przeciwciała monoklonalne, które wiążą się z określonymi składnikami. Ta metoda jest często stosowana w EM do identyfikacji określonych komponentów w dużych zespołach¹⁵. Kolejne ograniczenie jest związane z rozmiarem kompleksu, chociaż zdarzały się przypadki, w których zdefiniowane symetryczne zespoły o wielkości zaledwie 70 kDa (heptamer GroES) można łatwo rozwiązać za pomocą ujemnego barwienia EM. Złożone kompleksy, które są analizowane przez EM, mają zwykle średnicę w zakresie ~100 A lub większą. Ostatnio jednak udało się rozpuścić białka o masie zaledwie 20 kDa i uzyskać struktury o niskiej rozdzielczości przy użyciu lepszych metod barwienia¹⁶.

W przypadku analizy stwardnienia rozsianego zwiększona czułość obecnego oprzyrządowania SM aż do poziomu femtomolowego (attomolowego) może w niektórych przypadkach zwiększyć czułość wykrywania BLI. Jest wysoce prawdopodobne, że sygnały białkowe, które wykazują minimalny, ale powtarzalny wzrost amplitudy, spowodują identyfikację danego białka. Ponadto sondowanie interakcji białko-białko z jednym z partnerów podłączonych do biosensora, a drugim w środowisku komórkowym, w efekcie doprowadzi do oczyszczenia, a następnie łatwiejszego wykrycia nowo powstałego kompleksu. Jednym z ograniczeń, które można zaobserwować w obecnych bardzo czułych systemach stwardnienia rozsianego, jest to, że białko będące przedmiotem zainteresowania może nie znajdować się w bazie danych, ale ta obserwacja jest rzadka (np . proteomy rzadkich gatunków). Jeśli sekwencje białek będących przedmiotem zainteresowania są znane, problem ten można łatwo rozwiązać, włączając sekwencję aminokwasów białka (białek) do bazy danych białek tła (jak opisano w tej pracy w sekcji protokołu). Innym potencjalnym ograniczeniem metodyki jest oporność białka na trypsynolizę. Trawienie trypsyny jest zazwyczaj domyślną metodą oddolnej identyfikacji białek. Jednak białka mogą być oporne na trypsynę, jeśli brakuje im reszt Arg i Lys lub dostęp do tych reszt jest ograniczony przez pofałdowaną strukturę. Ograniczenia te są rozwiązywane, odpowiednio, poprzez zastosowanie alternatywy lub kombinacji proteaz lub włączenie odczynnika rozwijającego się (mocznik lub HCl guanidyny, jak wskazano w 1.1.14 i 1.2.6) przed trawieniem enzymatycznym.

Możliwe rozszerzenia tej metodologii obejmują umożliwienie użytkownikowi śledzenia i identyfikowania kompleksów składania komórkowego z surowych lizatów komórkowych. Okazuje się, że testowanie składników montażowych w skoncentrowanych ekstraktach komórkowych jest łatwe do przeprowadzenia przy użyciu procedur interferometrii biowarstw. W przeciwieństwie do powszechnie stosowanych metodologii opartych na mikroprzepływach, które są podatne na zapychanie i wrażliwe na agregację, podejście BLI można wykorzystać do bezpośredniego zanurzania końcówek czujników biowarstw w surowych ekstraktach w celu potencjalnego złożenia określonych kompleksów bezpośrednio z tych skoncentrowanych zanieczyszczonych próbek. Po zmontowaniu całkowicie możliwe jest użycie specyficznych sond przeciwciał jako kontynuacji systemu BLI w celu dalszej identyfikacji, a nawet ilościowego określenia podejrzanych składników w ekstraktach komórkowych, które zostały zidentyfikowane za pomocą metody mikroobjętości MS. Ponownie, kluczem jest tutaj użycie zdefiniowanych, odpowiednio zorientowanych białek rdzeniowych jako specyficznych sond powinowactwa.

Możliwość kinetycznego spojrzenia na proces przejścia od pory do porów za pomocą BLI będzie bardzo przydatna w identyfikacji potencjalnych "anty-toksynowych" małocząsteczkowych inhibitorów przemian białkowych, które specyficznie działają w późnych warunkach endosomalnych o niskim pH (5,0). To indukowane pH przejście od prepora do pora jest hamowane w obecności stabilizatora fałdowania (osmolitów), takiego jak glicerol lub sacharoza, a tym samym stanowi silne wsparcie dla opracowania specyficznych ukierunkowanych stabilizatorów fałdowania, które zapobiegają tworzeniu_{się porów} PA. To specyficzne podejście pozwala uniknąć i zastąpić prymitywne testy oparte na agregacji, w których spadki pH prowadzą do wytrącania się białek. Ta ostatnia metoda, choć dobra w przypadku pierwotnych metod wstępnych badań przesiewowych, często prowadzi do wyników fałszywie dodatnich, w których określone związki hamują agregację, a nie rzeczywiste przejścia molekularne.

Dalsze obserwacje struktury i identyfikacja poszczególnych zmontowanych składników w małych próbkach mikroobjętościowych mogą być również przydatne w walidacji potencjalnych związków ołowiu. Można to zastosować w przypadkach, gdy docelowym wynikiem jest albo określona stabilizacja zespołu, albo destabilizacja. To równoległe podejście kinetyczne/struktura/identyfikacja jest przydatne do bezpośredniego potwierdzania ważności podejrzewanych efektorów montażu związków ołowiu i służy jako rozsądny wtórny etap przesiewowy lub podejście o średniej przepustowości.

Cryo-EM jest przydatną techniką do badania szczegółów atomowych kompleksów makromolekuł w różnych stanach składania. Przed przygotowaniem próbek kriogenicznych należy najpierw sprawdzić, czy preparat zawiera w miarę czyste jednorodne kompleksy o ujemnym zabarwieniu EM. Prezentowana praca przedstawia składanie kompleksów białkowych na powierzchniach biosensorów BLI, uwalnianie tych kompleksów do wizualizacji EM oraz identyfikację tych składników za pomocą MS. Ta szczególna metodologia kontrolowanego montażu i uwalniania może być przydatna w generowaniu bardzo specyficznych protokołów, które usprawniają jednorodne sekwencyjne przygotowanie próbki do ujemnego barwienia EM, co jest niezbędnym krokiem, który należy wykazać przed przejściem do krio-EM. Aby uzyskać strukturę 3D o niskiej rozdzielczości, do wykonania serii nachylenia stożkowego (70 różnych widoków obrazu 2D na cząstkę) potrzeba tylko 30-50 cząstek kompleksu, pod warunkiem, że istnieje różnorodność orientacji (wiele różnych widoków).

Jeśli chodzi o ulepszanie metod leczenia stwardnienia rozsianego, postęp w zakresie czułości i zmniejszania objętości próbki jest nadal poprawiany. Nanoprzepływy i ultrawysokociśnieniowa chromatografia cieczowa wraz z opracowaniem spektrometrów masowych o szybkim cyklu pracy, zwiększonej czułości i zdolności rozdzielczej. Niedawne wprowadzenie spektrometru mas orbitrap, a w szczególności jego najnowszej wersji (orbitrap Fusion Lumos i jego oczekiwanego następcy Orbitrap Fusion Lumos 1M), a także algorytmów wyszukiwania znacznie ułatwia ten proces.

Obecna metodologia monitoruje kinetyczny montaż i demontaż składników toksyny wąglika przy użyciu metodologii BLI bez znaczników oraz ocenia strukturę i tożsamość tych składników za pomocą odpowiednio EM i MS. Zastosowanie prostego, jednokanałowego systemu BLI w połączeniu z rutynową analizą EM barwienia ujemnego i podstawowymi technikami MS jest więcej niż wystarczające do scharakteryzowania procesu montażu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
(1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiiimid)) (EDC)	Thermo Scientific	22980
(2-(2-pirydynylo)etanoamina) (PDEA)	GE Lifesciences	BR100058
0,5 ml czarne mikroprobówki	Sigma-Aldrich	Z688304-500EA
1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glycero-3-fosfocholina (POPC)	Avanti	850457C-25mg
Uznanie PepMap 50 μ m x 150mm, C18, 2 μ m, 100 i Aring;	ThermoFisher Scientific	164561
Kwas octowy lodowaty	Fisher	A38SL-212
Acetonitryl	Fisher	A955-4
Aminowe reaktywne końcówki 2. generacji (AR2G)	Forte Bio	18-5092
Wodorowęglan amonu	Fisher	A643-500
Filtr strzykawkowy Anotop 10, 0,02um	GE Lifesciences	6809-1002
BLItz System	Pall Forte Bio	45-5000
Kwas borowy	Fisher Scientific	10043-35-3
Kapilarne Morfogenne Gen-2			Białko produkowane i oczyszczane we własnym zakresie
Powlekane węglem Cu 300 siatka	Nauki o Mikroskopii Elektronowej	CF300-CU-50
Ditiotreitol (DTT)	GoldBio	DTT25
Kwasy mrówkowe	JT Baker	0129-01
Chlorowodorek guanidyny (GuHCl)	Sigma-Aldrich	G4505-100G
Jodoacetamid	MP-BioMedicals, LLC	100-351
JEM-1400 Transmisyjny mikroskop elektronowy	JEOL
Hydrat chlorowodorku L-cystienu	Sigma-Aldrich	C121800-5G
Czynnik śmiertelny Domena			N-końcowa Białko produkowane i oczyszczane we własnym
oprogramowaniu MS w wersji 2.2	ThermoFisher Scientific
N-hydroksysukcynimid (NHS)	Sigma-Aldrich	090M14531V
Probówki PCR Orbitrap Fusion Lumos	ThermoFisher ThermoFisher
	Scientific	AB-0620
System czyszczenia wyładowań jarzeniowych Pelco easiGlow	Ted Pella, Inc	91000
Ochronny prepor			Białko produkowane i oczyszczane we własnym zakresie
Jakościowe kręgi bibuły filtracyjnej	Fisher Scientific	09-795C 5
Zmodyfikowana trypsyna klasy sekwencjonowania	Promega	V5111
Sequest HT wyszukiwarka	ThermoFisher Scientific
Octan sodu trójwodny	Fisher Scientific	BP334-500
Chlorek sodu	Fisher Scientific	S271-10
Cholan sodu	Sigma-Aldrich	C1254-100G
Baza Tris	Fisher Scientific	BP152-10
Mrówczan uranylu (UF)	Mikroskopia elektronowa Nauki	22450
Xcalibur	ThermoFisher Scientific	OPTON-30487

antygenowy