Artykuł metodologiczny

Produkcja i wizualizacja bakteryjnych sferoplastów i protoplastów w celu scharakteryzowania lokalizacji peptydów przeciwdrobnoustrojowych

DOI:

10.3791/57904

⸱

11 sierpnia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Biochemistry Program, Wellesley College, 2Department of Chemistry, Wellesley College, 3Department of Biological Sciences, Wellesley College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół produkcji gram-ujemnych sferoplastów Escherichia coli (E. coli) i Gram-dodatnich protoplastów Bacillus megaterium (B. megaterium), aby wyraźnie zwizualizować i szybko scharakteryzować interakcje peptyd-bakteria. Zapewnia to systematyczną metodę definiowania peptydów lokalizujących i translokujących błonę.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Użycie mikroskopii konfokalnej jako metody oceny wzorców lokalizacji peptydów w bakteriach jest często hamowane przez limity rozdzielczości konwencjonalnych mikroskopów świetlnych. Ponieważ rozdzielczość dla danego mikroskopu nie może być łatwo zwiększona, przedstawiamy protokoły przekształcania małych Gram-ujemnych Escherichia coli (E. coli) w kształcie pałeczek i Gram-dodatnich Bacillus megaterium (B. megaterium) w większe, łatwe do zobrazowania formy sferyczne zwane sferoplastami lub protoplastami. Ta transformacja pozwala obserwatorom szybko i wyraźnie określić, czy peptydy osadzają się w błonie bakteryjnej (tj. lokalizują błonę), czy też przechodzą przez błonę, aby dostać się do komórki (tj. przemieszczają się). Dzięki takiemu podejściu przedstawiamy również systematyczną metodę charakteryzowania peptydów jako lokalizujących lub przemieszczających błonę. Chociaż metoda ta może być stosowana do różnych peptydów aktywnych błonowo i szczepów bakteryjnych, wykazujemy użyteczność tego protokołu, obserwując interakcję Buforin II P11A (BF2 P11A), peptydu przeciwdrobnoustrojowego (AMP), ze sferoplastami E. coli i protoplastami B. megaterium.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMP) zyskały uwagę ze względu na ich potencjalne zastosowanie jako alternatywa dla konwencjonalnych antybiotyków1,2,3,4,5. AMP zabijają bakterie poprzez przemieszczanie się przez błonę komórkową i interakcję ze składnikami wewnątrzkomórkowymi, takimi jak kwasy nukleinowe, lub poprzez przenikanie błony, powodując wyciek zawartości komórki6. Oprócz stosowania jako antybiotyki, translokujące AMP mogą być przystosowane do zastosowań związanych z dostarczaniem leków, ponieważ mogą bez zakłóceń przenikać przez nieprzepuszczalną błonę komórkową7,8. W związku z tym staramy się zrozumieć podstawowe mechanizmy działania AMP, aby położyć podwaliny pod ich zastosowanie w projektowaniu leków.

Mikroskopia konfokalna umożliwia ocenę wzorców lokalizacji znakowanych fluorescencyjnie AMP w komórkach bakteryjnych, dostarczając wglądu w ich mechanizm działania9,10,11,12,13,14. Znakując błonę bakterii, można określić, czy znakowany fluorescencyjnie peptyd lokalizuje się w błonie lub przestrzeni wewnątrzkomórkowej komórki bakteryjnej. Jednak technika ta jest ograniczona przez mały rozmiar i kształt pręcika bakterii, co może utrudniać obrazowanie ze względu na ograniczenia rozdzielczości konwencjonalnych mikroskopów świetlnych i zmienną orientację bakterii na szkiełku15.

Celem prezentowanej metody jest umożliwienie lepszej wizualizacji wzorców lokalizacji peptydów znakowanych fluorescencyjnie za pomocą mikroskopii konfokalnej. Wizualizacja jest wzbogacona o przekształcenie małych, cienkich, pałeczkowatych bakterii Gram-ujemnych Escherichia coli (E. coli) i Gram-dodatnich bakterii Bacillus megaterium (B. megaterium) w powiększone, kuliste formy określane jako sferoplasty (dla szczepów Gram-ujemnych) i protoplasty (dla szczepów Gram-dodatnich)16,17,18,19,20,21. Feroplasty i protoplasty są łatwiejsze do zobrazowania zarówno ze względu na ich zwiększony rozmiar, jak i symetryczny kształt, co sprawia, że orientacja bakterii na szkiełku nie ma znaczenia dla jej obrazowania. Ponadto przedstawiamy systematyczne podejście do ilościowej analizy danych z mikroskopii konfokalnej w celu scharakteryzowania AMP jako lokalizujących lub translokujących błonę. Zastosowanie tych metod ułatwia rozróżnienie wzorców lokalizacji peptydów znakowanych fluorescencyjnie. Przedstawione tutaj protokoły można wykorzystać do oceny lokalizacji różnych środków błonowo czynnych innych niż AMP, w tym peptydów penetrujących komórki.

Niewątpliwą zaletą tej techniki jest to, że dostarcza ona wglądu w mechanizm działania AMPs na poziomie pojedynczej komórki, co może ujawnić niejednorodność między komórkami15, w przeciwieństwie do innych testów fluorescencyjnych powszechnie używanych do identyfikacji mechanizmów działania AMPs, które dostarczają tylko masowych szacunków9,22,23,24,25. Wykorzystanie sferoplastów i protoplastów do oceny wejścia komórek AMP jest szczególnie przydatne26, ponieważ są one bardziej fizjologicznie istotne15 niż inne modele używane do oceny wejścia do komórek, takie jak pęcherzyki lipidowe24.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie roztworu

UWAGA: Przygotuj roztwory opisane w krokach 1.1–1.9 i 1.8–1.11, aby wytworzyć odpowiednio sferoplasty E. coli i protoplasty B. megaterium.

  1. Przygotować 1 M Tris-Cl o pH 7,8, rozpuszczając 10,34 g Tris HCl i 4,17 g Tris OH w 50 ml dH2O w kolbie o pojemności 125 ml. Sterylizować przez filtrowanie przez filtr strzykawkowy 25 mm z membraną 0,2 μm i przechowywać w stożkowej probówce w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotować roztwór A (20 mM MgCl2, 0,7 M sacharozy, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) rozpuszczając 0,10 g MgCl2 (95,2 g/mol) i 11,98 g sacharozy (342,3 g/mol) w 25 ml dH2O w kolbie o pojemności 125 ml. Dodać 500 μl 1 M Tris-Cl (pH 7,8) i dostosować objętość do 50 ml. Sterylizować przez filtrowanie przez filtr strzykawkowy 25 mm z membraną 0,2 μm i przechowywać w stożkowej probówce w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotować roztwór B (10 mM MgCl2, 0,8 M sacharozy, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) rozpuszczając 0,05 g MgCl2 (95,2 g/mol) i 13,69 g sacharozy (342,3 g/mol) w 25 ml dH2O w kolbie o pojemności 125 ml. Dodać 500 μl 1 M Tris-Cl (pH 7,8) i dostosować objętość do 50 ml. Sterylizować przez filtrowanie przez filtr strzykawkowy 25 mm z membraną 0,2 μm i przechowywać w stożkowej probówce w temperaturze pokojowej.
  4. Przygotować 0,8 M sacharozy, rozpuszczając 13,69 g sacharozy (342,3 g/mol) w 50 ml dH2O w kolbie o pojemności 125 ml. Sterylizować przez filtrowanie przez filtr strzykawkowy 25 mm z membraną 0,2 μm i przechowywać w stożkowej probówce w temperaturze pokojowej.
  5. Przygotować 5 mg/ml dezoksyrybonukleazy I (DNazy I), rozpuszczając 0,015 g DNazy I w 3 mldH2O w kolbie o pojemności 50 ml. Sterylizować przez filtrowanie przez filtr strzykawkowy 25 mm z membraną 0,2 μm. Podwielokrotny roztwór rozlać do probówek do mikrofug i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  6. Przygotować 0,125 M kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) o pH 8,0, rozpuszczając 0,698 g dehydratacji disodowej EDTA (372,2 g/mol) w 15 ml dH2O w kolbie o pojemności 125 ml. Sterylizować przez filtrowanie przez filtr strzykawkowy 25 mm z membraną 0,2 μm i przechowywać w stożkowej probówce w temperaturze pokojowej.
  7. Przygotować 600 μg/ml cefaleksyny, rozpuszczając 0,03 g hydratu cefaleksyny (365,404 g/mol) w 50 ml dH2O w kolbie o pojemności 125 ml. Sterylizować przez filtrowanie przez filtr strzykawkowy 25 mm z membraną 0,2 μm i przechowywać w stożkowej probówce w temperaturze 4 °C.
  8. Przygotować 5 mg/ml lizozymu, rozpuszczając 0,015 g lizozymu w 3 mldH2O w kolbie o pojemności 50 ml. Sterylizować przez filtrowanie przez filtr strzykawkowy 25 mm z membraną 0,2 μm. Podwielokrotny roztwór rozlać do probówek do mikrofug i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  9. Przygotować 3% w/v bulionu sojowego z tryptykazą (TSB), rozpuszczając 30 g TSB w 1 ldH2Ow kolbie o pojemności 2 l. Podwielokrotność roztworu rozlać do kolb zawierających 25 ml lub 100 ml TSB, które mają być użyte do przygotowania odpowiednio sferoplastów E. coli lub protoplastów B. megaterium. Kolby autoklawe do sterylizacji ciekłego podłoża. Sterylny TSB może być przechowywany w temperaturze pokojowej lub 4 °C.
  10. Przygotować roztwór C (1 M sacharozy, 0,04 M maleinianu, 0,04 M MgCl2, pH 6,5) rozpuszczając 34,23 g sacharozy (342,3 g/mol), 0,46 g kwasu maleinowego (116,07 g/mol) i 0,38 g MgCl2 (95,21 g/mol) w 100 mldH2O w kolbie o pojemności 250 ml. Dostosuj pH do 6,5. Sterylizować przez filtrowanie przez filtr strzykawkowy 25 mm z membraną 0,2 μm i przechowywać w stożkowej probówce w temperaturze pokojowej.
  11. Przygotować 200 ml pożywki protoplastowej, mieszając 100 ml 3% w/v TSB i 100 ml roztworu C w szklanej butelce o pojemności 1 l. Autoklaw do sterylizacji roztworu i przechowywania w temperaturze pokojowej.

2. Przygotowanie nocnej hodowli

UWAGA: Wykonaj sekcje 2-4 używając odpowiednich technik sterylnych. W razie potrzeby szczep bakteryjny może zawierać plazmid zwiększający oporność na antybiotyki, aby zmniejszyć potencjalne zanieczyszczenie. Jeśli używasz szczepu z opornością na antybiotyki, dodaj niezbędne antybiotyki w krokach 2.1, 3.1–3.2 i 4.1–4.4.

  1. Przygotuj posiew na noc, wybierając pojedynczą kolonię bakterii za pomocą sterylnej końcówki pipety i umieszczając ją w probówce hodowlanej o pojemności 14 ml zawierającej 2-3 ml 3% w/v TSB. Inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając przez 16–21 godzin.

3. Przygotowanie Gram-ujemnych sferoplastów E. coli

  1. W kolbie o pojemności 250 ml rozcieńczyć nocną kulturę w stosunku 1:100 w objętości 25 ml 3% w/v TSB i inkubować roztwór bakteryjny w temperaturze 37 °C, wytrząsając przez około 2,5 godziny, aż roztwór osiągnie gęstość optyczną 0,5–0,8 przy 600 nm. Zmierz gęstość optyczną za pomocą spektrofotometru.
  2. W kolbie o pojemności 250 ml rozcieńczyć tę kulturę w stosunku 1:10 w 30 ml 3% w/v TSB i inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając przez 2,5 godziny w obecności 60 μg/ml cefaleksyny (347,4 g/mol), aby uzyskać jednokomórkowe włókna o długości około 50–150 μm, które można obserwować w powiększeniu 1000X za pomocą mikroskopu świetlnego (Ryc. 1B).
  3. Zebrać włókna przez odwirowanie roztworu bakteryjnego o sile 1 500 x g, 4 °C przez 4 minuty. Zdekantować i wyrzucić supernatant, zachowując osad.
  4. Umyj włókna, delikatnie dodając 1 ml 0,8 M sacharozy, uważając, aby nie naruszyć granulki. Inkubować przez 1 minutę, a następnie odrzucić supernatant bez naruszania osadu.
  5. Dodać 150 μl 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 μl 5 mg/ml lizozymu, 30 μl 5 mg/ml DNazy I i 120 μl 0,125 M EDTA w odpowiedniej kolejności do osadu i inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 10 min.
  6. Dodawać 1 ml roztworu A stopniowo przez 1 minutę do roztworu przygotowanego w 3,5 minuty za pomocą mikropipety, delikatnie obracając roztwór ręcznie. Inkubować roztwór przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
  7. Umieścić 7 ml roztworu B o temperaturze 4 °C do dwóch stożkowych probówek o objętości 15 ml. Dodać równe ilości roztworu przygotowanego w 3.6 do każdej z tych dwóch probówek. Odwirować roztwór w temperaturze 1 500 x g, 4 °C przez 4 min.
  8. Za pomocą pipety serologicznej ostrożnie usunąć wszystkie oprócz 1-2 ml supernatantu, nie naruszając osadu. Zawiesić osad, delikatnie pipetując w górę i w dół za pomocą mikropipety P1000. Sprawdź wzrokowo, aby zobaczyć tworzenie się sferoplastów, obserwując próbkę w powiększeniu 1,000X za pomocą mikroskopu świetlnego (Rysunek 1C).
  9. Przechowuj sferoplasty w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia lub do momentu, gdy przejdą przez 3 cykle zamrażania i rozmrażania.

4. Przygotowanie Gram-dodatnich protoplastów B. megaterium

  1. W kolbie o pojemności 250 ml rozcieńczyć nocną kulturę w stosunku 1:1000 w 100 ml 3% w/v TSB i inkubować roztwór bakteryjny w temperaturze 37 °C, wytrząsając przez około 4,5 godziny, aż roztwór osiągnie gęstość optyczną 0,9-1,0 przy 600 nm. Zmierz gęstość optyczną za pomocą spektrofotometru.
  2. Wlać płynną kulturę do dwóch stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować przy 2 000 x g, 4 °C przez 10 minut.
  3. Za pomocą pipety serologicznej wyrzucić supernatant z obu stożkowych probówek. Ponownie zawiesić każdą osadkę w 2,5 ml pożywki protoplastowej i połączyć zawieszone roztwory w jedną stożkową probówkę. Odpipetować połączony roztwór zawieszony w kolbie o pojemności 125 ml.
  4. Dodać 1 ml lizozymu o stężeniu 5 mg/ml i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, wstrząsając.
  5. Monitoruj wzrost protoplastów w powiększeniu 1000x za pomocą mikroskopu świetlnego, zwracając uwagę na wszelkie nieprawidłowości, takie jak bakterie, które pojawiają się jako spuchnięte pręciki zamiast kulek (Rysunek 2). Za pomocą pipety serologicznej przenieść roztwór do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 2 000 x g, 4 °C przez 10 minut.
  6. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml pożywki protoplastowej. Protoplasty należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do tygodnia lub do momentu, gdy przejdą przez 3 cykle zamrażania i rozmrażania.

5. Przygotowanie roztworu peptydu i barwnika błonowego do obrazowania

  1. Roztwór peptydowy
    1. W probówce do mikrofuge owiniętej folią aluminiową rozpuścić 2 mg FITC oznaczonego BF2 P11A w 800 μl dH2O. W celu przeprowadzenia pomiarów stężenia białka należy użyć peptydu zawierającego co najmniej jedną resztę tryptofanu.
    2. Spektrofotometrycznie zmierzyć absorbancję roztworu peptydu przy długości fali 280 nm w trzech powtórzeniach. Obliczyć stężenie peptydu za pomocą współczynnika ekstynkcji molowej tryptofanu (5,700/Mcm).
    3. Rozcieńczyć stężenie peptydu w dH2O do końcowego stężenia 100–200 μM. Przechowywać w probówce do mikrofuge w temperaturze -20 °C, owiniętej folią aluminiową w celu ochrony przed światłem.
  2. Barwnik membranowy
    1. W probówce do mikrofuge przygotuj 10 mM zapas di-8-ANEPPS (592,9 g/mol), rozpuszczając 5 mg di-8-ANEPPS w 843,3 μl DMSO. Przechowywać w temperaturze 4 °C zawinięty w folię aluminiową w celu ochrony przed światłem.
    2. W probówce do mikrofuge przygotuj 1 ml 0,03 mM di-8-ANEPPS, dodając 3 μL 10 mM di-8-ANEPPS do 997 μL DMSO. Przechowywać w probówce do mikrofuge w temperaturze 4 °C, owinięta folią aluminiową w celu ochrony przed światłem.

6. Wizualizacja sferoplastów E. coli i protoplastów B. megaterium za pomocą mikroskopii konfokalnej

  1. Odpipetować 5 μl sferoplastów lub protoplastów na szkiełko podstawowe pokryte poli-L-lizyną. Dodać 2 μl AMP z oznaczeniem FITC (100-200 μM) do szkiełka i inkubować przez 3 minuty, chroniąc przed światłem.
  2. Dodać 1 μl barwnika membranowego di-8-ANEPPS (0,03 mM) do szkiełka i inkubować przez 3 minuty, chroniąc przed światłem. Przykryj szklanym szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij lakierem do paznokci.
  3. Włącz mikroskop konfokalny i laser argonowy. Dostosuj laser argonowy do 20% mocy wyjściowej i 20% transmisji.
  4. Ustaw zakresy długości fal emisji odpowiednio 499–532 nm i 670–745 nm dla kanału emisyjnego peptydów znakowanego FITC i kanału emisji barwnika membranowego znakowanego di-8-ANEPPS.
  5. Obraz protoplastów lub sferoplastów ( Rysunek 1 i Rysunek 2) z obiektywem 63X. Użyj oprogramowania do obrazowania, aby uzyskać 8-bitowe, kompozytowe obrazy stosu z 512 x 512 składające się z wycinków 0,5 μm całego sferoplastu lub protoplastu.
    UWAGA: Należy zwrócić szczególną uwagę na zmniejszenie krwawienia emisji podczas obrazowania sferoplastów i protoplastów. Zobacz dyskusję, aby uzyskać szczegółowe informacje.

7. Charakterystyka lokalizacji AMP

  1. Otwórz obraz kompozytowego stosu z w oprogramowaniu do obrazowania. Zlokalizuj najbardziej środkowy wycinek sferoplastu lub protoplastu i umieść jeden okrągły obszar zainteresowania (ROI) (o średnicy 0,3 μm) na membranie (ROI 1), jeden w środku sferoplastu lub protoplastu (ROI 2) i jeden z dala od sferoplastu lub protoplastu, aby zmierzyć fluorescencję tła (ROI 3) (Rysunek 5). Unikaj dołączania nasyconych pikseli. Intensywność fluorescencji w każdym ROI można obliczyć za pomocą oprogramowania do obrazowania.
    UWAGA: W przypadkach, gdy peptyd nie lokalizuje się na całej błonie, narysuj ROI 1 na obszarze błony, w którym peptyd jest zlokalizowany.
  2. Użyj poniższego równania, aby określić stosunek intensywności fluorescencji peptydu wewnątrzkomórkowego do intensywności fluorescencji peptydu błonowego:
    figure-protocol-1
    UWAGA: Intensywność fluorescencji w ROI 3 jest odejmowana od intensywności fluorescencji w ROI 2 i ROI 1 w celu uwzględnienia fluorescencji tła.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powiększając bakterie i czyniąc je kulistymi, możemy łatwo rozróżnić, czy peptydy lokalizują się w błonie bakteryjnej, czy łatwo przemieszczają się przez błonę bakteryjną. Ograniczenia rozdzielczości konwencjonalnych mikroskopów świetlnych utrudniają rozróżnienie, czy sygnały peptydowe pochodzą z błony, czy z przestrzeni wewnątrzkomórkowej u normalnych bakterii, ponieważ sygnały zlokalizowane na błonie będą wydawać się nakładać na przestrzeń wewnątrzkomórkową (Rysunek ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawione tutaj protokoły umożliwiają naukowcom szybsze uzyskanie większych rozmiarów próbek obrazów bakterii, ponieważ powiększone, kuliste bakterie są znacznie łatwiejsze do zlokalizowania, orientacji i zobrazowania. Ta zwiększona zdolność do gromadzenia danych jest cenna pod kilkoma względami. Po pierwsze, umożliwia bardziej systematyczną analizę ilościową wzorców lokalizacji peptydów. Podczas gdy trendy jakościowe można wykazać na podstawie mniejszych zestawów obrazów, tylko duży zestaw próbek obrazów wysokiej ja...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie zgłasza się konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania zostały wsparte przez National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIH-NIAID) award R15AI079685.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hydrokloryd Trizma (Tris HCl)SigmaT3253
Baza Trizma (Tris OH)SigmaT1503
Chlorek magnezuSigmaM8266
SacharozaSigmaS7903
LizozymSigmaL6876
Deoksyrybonukleaza ISigmaD4527
Kwas etylenodiaminotetraoctowySigma106361Używany Sigma 106361 w pierwotnym rozwoju protokołu; 106361 wycofany z ED2SS jako zamiennik
Hydrat cefaleksynySigmaC4895
AmpicylinaFisher ScientificBP1760
BBL Bulion sojowy z tryptykaząFisher ScientificB11768
BF2 P11A FITCNeoScientificZamówiony
na zamówienie di-8-ANEPPSBiotium61012
DMSOSigma34869Używany Sigma D8779 w oryginalnym rozwoju protokołu; D8779 wycofany z 34869 jako zamiennik
Kwas maleinowySigmaM0375
Acrodisc 25 mm Filtr strzykawkowy z 0,2 i mu; m HT Tuffryn MembranePall Corporation4192
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyLeica MicrosystemsTCS SP5 IIDo akwizycji obrazów
Leica Application Suite, Zaawansowana fluorescencjaLeica MicrosystemsDo przetwarzania obrazów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).
  2. Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24 (12), 1551-1557 (2006).
  3. Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 491-511 (2006).
  4. Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80 (6), 717-735 (2005).
  5. Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8 (1), 123-150 (2015).
  6. Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
  7. Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4 (4), 61-67 (2002).
  8. Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40 (4), 387-397 (2011).
  9. Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838 (9), 2228-2233 (2014).
  10. Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29 (7), 1102-1108 (2008).
  11. Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9 (8), 1892-1901 (2014).
  12. Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 253-257 (1998).
  13. Park, C. B., Yi, K. -S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8245-8250 (2000).
  14. Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818 (3), 869-876 (2012).
  15. Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (10), 6350-6352 (2016).
  16. Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39 (1), 153-158 (1980).
  17. Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4 (3), 257-266 (1958).
  18. Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
  19. Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
  20. Nadeau, J. L. Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. , CRC Press. (2016).
  21. Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107 (9), 2082-2090 (2014).
  22. Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
  23. Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. Biochemistry. 43 (49), 15610-15616 (2004).
  24. Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571(2012).
  25. van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).
  26. Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).
  27. Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).
  28. Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).
  29. Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).
  30. Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).
  31. Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).
  32. Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tworzenie protoplast wmikroskopia konfokalnaoddzia ywanie peptyd w z b onsferoplasty E coliprotoplasty B megateriumledzenie fluorescencyjne peptyd wanaliza b ony kom rkowejtest translokacji peptyd w

Powiązane artykuły