Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Produkcja i wizualizacja bakteryjnych sferoplastów i protoplastów w celu scharakteryzowania lokalizacji peptydów przeciwdrobnoustrojowych

12.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57904

⸱

11 sierpnia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Biochemistry Program, Wellesley College, 2Department of Chemistry, Wellesley College, 3Department of Biological Sciences, Wellesley College

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół produkcji gram-ujemnych sferoplastów Escherichia coli (E. coli) i Gram-dodatnich protoplastów Bacillus megaterium (B. megaterium), aby wyraźnie zwizualizować i szybko scharakteryzować interakcje peptyd-bakteria. Zapewnia to systematyczną metodę definiowania peptydów lokalizujących i translokujących błonę.

Streszczenie

Użycie mikroskopii konfokalnej jako metody oceny wzorców lokalizacji peptydów w bakteriach jest często hamowane przez limity rozdzielczości konwencjonalnych mikroskopów świetlnych. Ponieważ rozdzielczość dla danego mikroskopu nie może być łatwo zwiększona, przedstawiamy protokoły przekształcania małych Gram-ujemnych Escherichia coli (E. coli) w kształcie pałeczek i Gram-dodatnich Bacillus megaterium (B. megaterium) w większe, łatwe do zobrazowania formy sferyczne zwane sferoplastami lub protoplastami. Ta transformacja pozwala obserwatorom szybko i wyraźnie określić, czy peptydy osadzają się w błonie bakteryjnej (tj. lokalizują błonę), czy też przechodzą przez błonę, aby dostać się do komórki (tj. przemieszczają się). Dzięki takiemu podejściu przedstawiamy również systematyczną metodę charakteryzowania peptydów jako lokalizujących lub przemieszczających błonę. Chociaż metoda ta może być stosowana do różnych peptydów aktywnych błonowo i szczepów bakteryjnych, wykazujemy użyteczność tego protokołu, obserwując interakcję Buforin II P11A (BF2 P11A), peptydu przeciwdrobnoustrojowego (AMP), ze sferoplastami E. coli i protoplastami B. megaterium.

Wprowadzenie

Peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMP) zyskały uwagę ze względu na ich potencjalne zastosowanie jako alternatywa dla konwencjonalnych antybiotyków1,2,3,4,5. AMP zabijają bakterie poprzez przemieszczanie się przez błonę komórkową i interakcję ze składnikami wewnątrzkomórkowymi, takimi jak kwasy nukleinowe, lub poprzez przenikanie błony, powodując wyciek zawartości komórki6. Oprócz stosowania jako antybiotyki, translokujące AMP mogą być przystosowane do zastosowań związanych z dostarczaniem leków, ponieważ mogą bez zakłóceń przenikać przez nieprzepuszczalną błonę komórkową7,8. W związku z tym staramy się zrozumieć podstawowe mechanizmy działania AMP, aby położyć podwaliny pod ich zastosowanie w projektowaniu leków.

Mikroskopia konfokalna umożliwia ocenę wzorców lokalizacji znakowanych fluorescencyjnie AMP w komórkach bakteryjnych, dostarczając wglądu w ich mechanizm działania9,10,11,12,13,14. Znakując błonę bakterii, można określić, czy znakowany fluorescencyjnie peptyd lokalizuje się w błonie lub przestrzeni wewnątrzkomórkowej komórki bakteryjnej. Jednak technika ta jest ograniczona przez mały rozmiar i kształt pręcika bakterii, co może utrudniać obrazowanie ze względu na ograniczenia rozdzielczości konwencjonalnych mikroskopów świetlnych i zmienną orientację bakterii na szkiełku15.

Celem prezentowanej metody jest umożliwienie lepszej wizualizacji wzorców lokalizacji peptydów znakowanych fluorescencyjnie za pomocą mikroskopii konfokalnej. Wizualizacja jest wzbogacona o przekształcenie małych, cienkich, pałeczkowatych bakterii Gram-ujemnych Escherichia coli (E. coli) i Gram-dodatnich bakterii Bacillus megaterium (B. megaterium) w powiększone, kuliste formy określane jako sferoplasty (dla szczepów Gram-ujemnych) i protoplasty (dla szczepów Gram-dodatnich)16,17,18,19,20,21. Feroplasty i protoplasty są łatwiejsze do zobrazowania zarówno ze względu na ich zwiększony rozmiar, jak i symetryczny kształt, co sprawia, że orientacja bakterii na szkiełku nie ma znaczenia dla jej obrazowania. Ponadto przedstawiamy systematyczne podejście do ilościowej analizy danych z mikroskopii konfokalnej w celu scharakteryzowania AMP jako lokalizujących lub translokujących błonę. Zastosowanie tych metod ułatwia rozróżnienie wzorców lokalizacji peptydów znakowanych fluorescencyjnie. Przedstawione tutaj protokoły można wykorzystać do oceny lokalizacji różnych środków błonowo czynnych innych niż AMP, w tym peptydów penetrujących komórki.

Niewątpliwą zaletą tej techniki jest to, że dostarcza ona wglądu w mechanizm działania AMPs na poziomie pojedynczej komórki, co może ujawnić niejednorodność między komórkami15, w przeciwieństwie do innych testów fluorescencyjnych powszechnie używanych do identyfikacji mechanizmów działania AMPs, które dostarczają tylko masowych szacunków9,22,23,24,25. Wykorzystanie sferoplastów i protoplastów do oceny wejścia komórek AMP jest szczególnie przydatne26, ponieważ są one bardziej fizjologicznie istotne15 niż inne modele używane do oceny wejścia do komórek, takie jak pęcherzyki lipidowe24.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów

UWAGA: Przygotuj roztwory opisane w krokach 1.1–1.9 oraz 1.8–1.11 w celu otrzymania odpowiednio sferoplastów E. coli oraz protoplastów B. megaterium.

  1. Przygotuj 1 M Tris-Cl o pH 7,8, rozpuszczając 10,34 g Tris HCl i 4,17 g Tris OH w 50 ml dH2O.2O w kolbie o pojemności 125 ml. Sterylizować poprzez filtrowanie przez 25 mm filtr strzykawkowy z 0.2 µm membranę i przechowywać w probówce stożkowej w temperaturze pokojowej.
  2. Przygotuj roztwór A (20 mM MgCl22, 0,7 M sacharozy, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) poprzez rozpuszczenie 0,10 g MgCl2 (95,2 g/mol) oraz 11,98 g sacharozy (342,3 g/mol) w 25 ml dH2O2O w kolbie o pojemności 125 ml. Dodać 500 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8) i doprowadzić objętość do 50 ml. Sterylizować poprzez filtrowanie przez filtr strzykawkowy o średnicy 25 mm z 0.2 µm membranę i przechowywać w probówce stożkowej w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotuj roztwór B (10 mM MgCl2)2, 0,8 M sacharozy, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) poprzez rozpuszczenie 0,05 g MgCl2 (95,2 g/mol) oraz 13,69 g sacharozy (342,3 g/mol) w 25 ml dH2O2O do kolby o pojemności 125 ml. Dodać 500 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8), a następnie uzupełnić objętość do 50 ml. Sterylizować poprzez filtrowanie przez 25-mm filtr strzykawkowy z 0.2 µm membranę i przechowywać w probówce stożkowej w temperaturze pokojowej.
  4. Przygotuj 0,8 M sacharozę, rozpuszczając 13,69 g sacharozy (342,3 g/mol) w 50 ml dH2O.2O w kolbie o pojemności 125 ml. Sterylizować poprzez filtrowanie przez 25-milimetrowy filtr strzykawkowy z 0.2 µm membranę i przechowywać w probówce stożkowej w temperaturze pokojowej.
  5. Przygotuj roztwór doksyrybonukleazy I (DNase I) o stężeniu 5 mg/ml, rozpuszczając 0,015 g DNase I w 3 ml dH2O.2O w kolbie o pojemności 50 ml. Sterylizować poprzez filtrowanie za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 25 mm z 0.2 µm membranę. Rozdzielić roztwór do probówek do wirówki i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  6. Przygotować 0,125 M kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) o pH 8,0, rozpuszczając 0,698 g dwuwodnego EDTA disodowego (372,2 g/mol) w 15 ml dH2O.2O w kolbie o pojemności 125 ml. Sterylizować poprzez filtrowanie przez filtr strzykawkowy o średnicy 25 mm z 0.2 µm membranę i przechowywać w probówce stożkowej w temperaturze pokojowej.
  7. Przygotuj 600 µg/mL cefaleksynę poprzez rozpuszczenie 0,03 g cefaleksyny hydratu (365,404 g/mol) w 50 ml dH2O2O w kolbie o pojemności 125 ml. Sterylizować poprzez filtrowanie przez 25 mm filtr strzykawkowy z 0.2 µm membranę i przechowywać w probówce stożkowej w temperaturze 4 °C.
  8. Przygotować lizozym o stężeniu 5 mg/ml, rozpuszczając 0,015 g lizozymu w 3 ml dH2O.2O w kolbie o objętości 50 mL. Sterylizować poprzez filtrowanie przez filtr strzykawkowy o średnicy 25 mm z 0.2 µm membranę. Rozdzielić roztwór do probówek do wirówki i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  9. Przygotować 3% (m/v) bulion sojowo-kazeinowy (TSB), rozpuszczając 30 g TSB w 1 l dH2O.2O w kolbie o pojemności 2 L. Przenieś odpowiednie objętości roztworu do kolb zawierających 25 ml lub 100 ml TSB, które zostaną wykorzystane do przygotowania E. coli sferoplasty lub B. megaterium protoplasty, odpowiednio. Autoklawować kolby w celu wysterylizowania podłoża płynnego. Sterylny TSB można przechowywać w temperaturze pokojowej lub 4 °C.
  10. Przygotować roztwór C (1 M sacharozy, 0,04 M maleinianu, 0,04 M MgCl2)2, pH 6,5) poprzez rozpuszczenie 34,23 g sacharozy (342,3 g/mol), 0,46 g kwasu maleinowego (116,07 g/mol) oraz 0,38 g MgCl2 (95,21 g/mol) w 100 ml dH2O2O w kolbie o pojemności 250 mL. Dostosować pH do wartości 6,5. Sterylizować poprzez filtrowanie przez filtr strzykawkowy o średnicy 25 mm z 0.2 µm membranę i przechowywać w probówce stożkowej w temperaturze pokojowej.
  11. Przygotuj 200 ml pożywki do protoplastów, mieszając 100 ml 3% (w/v) TSB oraz 100 ml roztworu C w szklanej butelce o pojemności 1 l. Sterylizuj roztwór w autoklawie i przechowuj w temperaturze pokojowej.

2. Przygotowanie hodowli nocnej

UWAGA: Sekcje 2–4 należy przeprowadzić z zastosowaniem odpowiednich technik sterylnych. W celu zmniejszenia ryzyka kontaminacji można zastosować szczep bakteryjny zawierający plazmid oporności na antybiotyki. W przypadku użycia szczepu z opornością na antybiotyki, należy dodać niezbędne antybiotyki w krokach 2.1, 3.1–3.2 oraz 4.1–4.4.

  1. Przygotuj kulturę nocną, pobierając pojedynczą kolonię bakterii za pomocą sterylnego końcówki do pipety i przenosząc ją do probówki do hodowli o pojemności 14 mL zawierającej 2–3 mL 3% w/v TSB. Inkubuj w temperaturze 37 °C przy ciągłym wstrząsaniu przez 16–21 h.

3. Przygotowanie sferoplastów Gram-ujemnych E. coli

  1. W kolbie o pojemności 250 mL rozcieńczyć kulturę nocną w stosunku 1:100 w 25 mL 3% w/v TSB i inkubować roztwór bakteryjny w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu przez około 2,5 h, aż roztwór osiągnie gęstość optyczną 0,5–0,8 przy 600 nm. Gęstość optyczną zmierzyć za pomocą spektrofotometru.
  2. W kolbie o pojemności 250 mL rozcieńczyć tę kulturę 1:10 w 30 mL 3% w/v TSB i inkubować w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu przez 2,5 h w obecności 60 µg/mL cefaleksyny (347,4 g/mol), aby wytworzyć pojedyncze włókna komórkowe o długości około 50–150 µm, które są widoczne przy powiększeniu 1 000X za pomocą mikroskopu świetlnego (Rysunek 1B).
  3. Włókna zebrać poprzez wirowanie roztworu bakteryjnego przy 1 500 x g w temperaturze 4 °C przez 4 min. Odlać i usunąć nadsącz, zachowując osad.
  4. Włókna przemyć, ostrożnie dodając 1 mL 0,8 M sacharozy, dbając o to, aby nie naruszyć osadu. Inkubować przez 1 min, a następnie usunąć nadsącz bez naruszania osadu.
  5. Do osadu dodać w podanej kolejności: 150 µL 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 µL lizozymu o stężeniu 5 mg/mL, 30 µL DNazy I o stężeniu 5 mg/mL oraz 120 µL 0,125 M EDTA i inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 10 min.
  6. Do roztworu przygotowanego w punkcie 3.5 stopniowo dodawać przez 1 min 1 mL roztworu A za pomocą mikropipety, delikatnie mieszając roztwór ręcznie przez wirowanie. Inkubować roztwór przez 4 min w temperaturze pokojowej.
  7. Do dwóch stożkowych probówek o pojemności 15 mL wlać po 7 mL roztworu B w temperaturze 4 °C. Do każdej z tych dwóch probówek dodać równe ilości roztworu przygotowanego w punkcie 3.6. Wirować roztwór przy 1 500 x g w temperaturze 4 °C przez 4 min.
  8. Za pomocą pipety serologicznej ostrożnie usunąć nadsącz, pozostawiając jedynie 1-2 mL, aby nie naruszyć osadu. Resuspendować osad, delikatnie pipetując go w górę i w dół za pomocą mikropipety P1000. Wizualnie sprawdzić powstanie sferoplastów, obserwując próbkę przy powiększeniu 1 000X za pomocą mikroskopu świetlnego (Rysunek 1C).
  9. Sferoplasty przechowywać w temperaturze -20 °C do tygodnia lub do momentu przejścia przez 3 cykle zamrażania i rozmrażania.

4. Przygotowanie protoplastów Gram-dodatnich B. megaterium

  1. W kolbie o pojemności 250 mL rozcieńczyć kulturę nocną w stosunku 1:1 000 w 100 mL 3% w/v TSB i inkubować roztwór bakteryjny w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu przez około 4,5 h, aż roztwór osiągnie gęstość optyczną 0,9-1,0 przy 600 nm. Gęstość optyczną zmierzyć za pomocą spektrofotometru.
  2. Przelać kulturę płynną do dwóch probówek stożkowych o pojemności 50 mL i wirować przy 2 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min.
  3. Za pomocą pipety serologicznej odpiwetować nadsącz z obu probówek stożkowych. Każdy osad resuspender w 2,5 mL pożywki do protoplastów, a następnie połączyć resuspenderowane roztwory w jednej probówce stożkowej. Połączony roztwór przenieść pipetą do kolby o pojemności 125 mL.
  4. Dodać 1 mL lizozymu o stężeniu 5 mg/mL i inkubować przez 1 h w 37 °C przy wytrząsaniu.
  5. Monitorować wzrost protoplastów pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 1 000x, zwracając uwagę na wszelkie nieprawidłowości, takie jak bakterie przypominające opuchnięte pałeczki zamiast sfer (Rycina 2). Za pomocą pipety serologicznej przenieść roztwór do probówki stożkowej o pojemności 15 mL i wirować przy 2 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min.
  6. Odlać nadsącz i resuspender osad w 5 mL pożywki do protoplastów. Przechowywać protoplasty w temperaturze -20 °C do tygodnia lub do momentu przejścia przez 3 cykle zamrażania i rozmrażania.

5. Przygotowanie roztworu peptydów i barwnika do błony do obrazowania

  1. Roztwór peptydowy
    1. W probówce do mikrocentryfugi owiniętej folią aluminiową rozpuścić 2 mg BF2 P11A znakowanego FITC w 800 µL dH2O. W celu przeprowadzenia pomiarów stężenia białka należy zastosować peptyd zawierający co najmniej jedną resztę tryptofanu.
    2. Pomiarem spektrofotometrycznym wyznaczyć absorbancję roztworu peptydowego przy 280 nm w trzech powtórzeniach. Obliczyć stężenie peptydowe, korzystając z molowego współczynnika ekstynkcji dla tryptofanu (5 700/Mcm).
    3. Rozcieńczyć stężenie peptydowe w dH2O do końcowego stężenia 100–200 µM. Przechowywać w probówce do mikrocentryfugi w temperaturze -20 °C, owiniętej folią aluminiową w celu ochrony przed światłem.
  2. Barwnik błonowy
    1. W probówce do mikrocentryfugi przygotować roztwór zapasowy di-8-ANEPPS (592,9 g/mol) o stężeniu 10 mM, rozpuszczając 5 mg di-8-ANEPPS w 843,3 µL DMSO. Przechowywać w temperaturze 4 °C, owinięte folią aluminiową w celu ochrony przed światłem.
    2. W probówce do mikrocentryfugi przygotować 1 mL di-8-ANEPPS o stężeniu 0,03 mM, dodając 3 µL 10 mM di-8-ANEPPS do 997 µL DMSO. Przechowywać w probówce do mikrocentryfugi w temperaturze 4 °C, owiniętej folią aluminiową w celu ochrony przed światłem.

6. Wizualizacja sferoplastów E. coli i protoplastów B. megaterium przy użyciu mikroskopii konfokalnej

  1. Napiperować 5 µL sferoplastów lub protoplastów na szkiełko przedmiotowe powlekone poli-L-lizyną. Dodać na szkiełko 2 µL AMP znakowanego FITC (100-200 µM) i inkubować przez 3 min w ciemności.
  2. Dodać na szkiełko 1 µL barwnika błonowego di-8-ANEPPS (0.03 mM) i inkubować przez 3 min w ciemności. Przykryć szkiełkiem cover-slip i zabezpieczyć lakierem do paznokci.
  3. Włączyć mikroskop konfokalny oraz laser argonowy. Ustawić moc wyjściową lasera argonowego na 20% oraz transmisję na 20%.
  4. Ustawić zakresy długości fal emisji odpowiednio na 499–532 nm dla kanału emisji peptydu znakowanego FITC oraz na 670–745 nm dla kanału emisji barwnika błonowego di-8-ANEPPS.
  5. Wykonać obrazy protoplastów lub sferoplastów (Rysunek 1 i Rysunek 2) przy użyciu obiektywu 63X. Wykorzystać oprogramowanie do obrazowania w celu uzyskania 8-bitowych kompozytowych obrazów z-stack o rozdzielczości 512 x 512, składających się z warstw o grubości 0,5 µm obejmujących cały sferoplast lub protoplast.
    UWAGA: Należy zwrócić szczególną uwagę na ograniczenie przenikania sygnału (bleed-through) podczas obrazowania sferoplastów i protoplastów. Szczegóły znajdują się w dyskusji.

7. Charakterystyka lokalizacji AMP

  1. Otwórz złożony obraz z-stack w oprogramowaniu do analizy obrazów. Zlokalizuj przekrój znajdujący się w centrum sferoplastu lub protoplastu i umieść jeden okrągły obszar zainteresowania (ROI) (o średnicy 0,3 µm) na błonie (ROI 1), jeden w centrum sferoplastu lub protoplastu (ROI 2) oraz jeden poza sferoplastem lub protoplastem w celu pomiaru fluorescencji tła (ROI 3) (Rycina 5). Należy unikać włączania nasyconych pikseli. Intensywność fluorescencji w każdym ROI może zostać obliczona przez oprogramowanie do analizy obrazów.
    UWAGA: W przypadkach, gdy peptyd nie lokalizuje się w całej błonie, wyznacz ROI 1 na obszarze błony, w którym peptyd jest zlokalizowany.
  2. Użyj poniższego równania, aby określić stosunek intensywności fluorescencji peptydu wewnątrzkomórkowego do intensywności fluorescencji peptydu w błonie:
    figure-protocol-1
    UWAGA: Intensywność fluorescencji w ROI 3 jest odejmowana od intensywności fluorescencji w ROI 2 i ROI 1, aby uwzględnić fluorescencję tła.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Poprzez powiększenie bakterii i nadanie im sferycznego kształtu możemy łatwo rozróżnić, czy peptydy lokalizują się w błonie bakteryjnej, czy też swobodnie przenikają przez błonę bakteryjną. Ograniczenia rozdzielczości konwencjonalnych mikroskopów świetlnych sprawiają, że w przypadku zwykłych bakterii trudno jest określić, czy sygnały peptydowe pochodzą z błony, czy z przestrzeni wewnątrzkomórkowej, ponieważ sygnały zlokalizowane w błonie będą wydawać się nakładać na przestrzeń wewnątrzkom...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawione tutaj protokoły umożliwiają naukowcom szybsze uzyskanie większych rozmiarów próbek obrazów bakterii, ponieważ powiększone, kuliste bakterie są znacznie łatwiejsze do zlokalizowania, orientacji i zobrazowania. Ta zwiększona zdolność do gromadzenia danych jest cenna pod kilkoma względami. Po pierwsze, umożliwia bardziej systematyczną analizę ilościową wzorców lokalizacji peptydów. Podczas gdy trendy jakościowe można wykazać na podstawie mniejszych zestawów obrazów, tylko duży zestaw próbek obrazów wysokiej ja...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie zgłasza się konfliktu interesów.

Podziękowania

Badania zostały wsparte przez National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIH-NIAID) award R15AI079685.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Hydrokloryd Trizma (Tris HCl)SigmaT3253
Baza Trizma (Tris OH)SigmaT1503
Chlorek magnezuSigmaM8266
SacharozaSigmaS7903
LizozymSigmaL6876
Deoksyrybonukleaza ISigmaD4527
Kwas etylenodiaminotetraoctowySigma106361Używany Sigma 106361 w pierwotnym rozwoju protokołu; 106361 wycofany z ED2SS jako zamiennik
Hydrat cefaleksynySigmaC4895
AmpicylinaFisher ScientificBP1760
BBL Bulion sojowy z tryptykaząFisher ScientificB11768
BF2 P11A FITCNeoScientificZamówiony
na zamówienie di-8-ANEPPSBiotium61012
DMSOSigma34869Używany Sigma D8779 w oryginalnym rozwoju protokołu; D8779 wycofany z 34869 jako zamiennik
Kwas maleinowySigmaM0375
Acrodisc 25 mm Filtr strzykawkowy z 0,2 i mu; m HT Tuffryn MembranePall Corporation4192
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyLeica MicrosystemsTCS SP5 IIDo akwizycji obrazów
Leica Application Suite, Zaawansowana fluorescencjaLeica MicrosystemsDo przetwarzania obrazów

Bibliografia

  1. Baltzer, S. A., Brown, M. H. Antimicrobial peptides: promising alternatives to conventional antibiotics. Journal of Molecular Microbiology Biotechnology. 20 (4), 228-235 (2011).
  2. Hancock, R. E., Sahl, H. G. Antimicrobial and host-defense peptides as new anti-infective therapeutic strategies. Nature Biotechnology. 24 (12), 1551-1557 (2006).
  3. Jenssen, H., Hamill, P., Hancock, R. E. Peptide antimicrobial agents. Clinical Microbiology Reviews. 19 (3), 491-511 (2006).
  4. Toke, O. Antimicrobial peptides: new candidates in the fight against bacterial infections. Biopolymers. 80 (6), 717-735 (2005).
  5. Wang, G., et al. Antimicrobial peptides in 2014. Pharmaceuticals. 8 (1), 123-150 (2015).
  6. Epand, R. M., Vogel, H. J. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462, 11-28 (1999).
  7. Drin, G., Rousselle, C., Scherrmann, J. -M., Rees, A. R., Temsamani, J. Peptide Delivery to the Brain via Adsorptive-Mediated Endocytosis: Advances With SynB Vectors. AAPS PharmSciTech. 4 (4), 61-67 (2002).
  8. Splith, K., Neundorf, I. Antimicrobial peptides with cell-penetrating peptide properties and vice versa. European Biophysics Journal. 40 (4), 387-397 (2011).
  9. Bustillo, M. E., et al. Modular analysis of hipposin, a histone-derived antimicrobial peptide consisting of membrane translocating and membrane permeabilizing fragments. Biochim Biophys Acta. 1838 (9), 2228-2233 (2014).
  10. Koo, Y. S., et al. Structure-activity relations of parasin I, a histone H2A-derived antimicrobial peptide. Peptides. 29 (7), 1102-1108 (2008).
  11. Libardo, M. D., Cervantes, J. L., Salazar, J. C., Angeles-Boza, A. M. Improved bioactivity of antimicrobial peptides by addition of amino-terminal copper and nickel (ATCUN) binding motifs. ChemMedChem. 9 (8), 1892-1901 (2014).
  12. Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of Action of the Antimicrobial Peptide Buforin II: Buforin II Kills Microorganisms by Penetrating the Cell Membrane and Inhibiting Cellular Functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 253-257 (1998).
  13. Park, C. B., Yi, K. -S., Matsuzaki, K., Kim, M. S., Kim, S. C. Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penetrating ability of buforin II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (15), 8245-8250 (2000).
  14. Pavia, K. E., Spinella, S. A., Elmore, D. E. Novel histone-derived antimicrobial peptides use different antimicrobial mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1818 (3), 869-876 (2012).
  15. Wei, L., LaBouyer, M. A., Darling, L. E., Elmore, D. E. Bacterial Spheroplasts as a Model for Visualizing Membrane Translocation of Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (10), 6350-6352 (2016).
  16. Chassy, B. M., Giuffrida, A. Method for the Lysis of Gram-Positive, Asporogenous Bacteria with Lysozyme. Appl. Environ. Microbiol. 39 (1), 153-158 (1980).
  17. Fitz-James, P. C. Cytological and Chemical Studies of the Browth of Protoplasts of Bacillus megaterium. J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 4 (3), 257-266 (1958).
  18. Martinac, B., Buechner, M., Delcour, A. H., Adler, J., Kung, C. Pressure-sensitive ion channel in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 2297-2301 (1986).
  19. Martinac, B., Rohde, P. R., Cranfield, C. G., Nomura, T. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Methods Mol Biol. 966, 367-380 (2013).
  20. Nadeau, J. L. Introduction to Experimental Biophysics: Biological Methods for Physical Scientists. , CRC Press. (2016).
  21. Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Physical properties of Escherichia coli spheroplast membranes. Biophysical Journal. 107 (9), 2082-2090 (2014).
  22. Branco, P., Viana, T., Albergaria, H., Arneborg, N. Antimicrobial peptides (AMPs) produced by Saccharomyces cerevisiae induce alterations in the intracellular pH, membrane permeability and culturability of Hanseniaspora guilliermondii cells. Int J Food Microbiol. 205, 112-118 (2015).
  23. Kobayashi, S., et al. Membrane Translocation Mechanism of the Antimicrobial Peptide Buforin 2. Biochemistry. 43 (49), 15610-15616 (2004).
  24. Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. J Vis Exp. (59), e3571(2012).
  25. van der Kraan, M. I., et al. Lactoferrampin: a novel antimicrobial peptide in the N1-domain of bovine lactoferrin. Peptides. 25 (2), 177-183 (2004).
  26. Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli. Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).
  27. Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II. Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).
  28. Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor. Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).
  29. Decad, G. M., Nikaido, H. Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall. J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).
  30. Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).
  31. Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes. Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).
  32. Ruthe, H. J., Adler, J. Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields. Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tworzenie protoplast wmikroskopia konfokalnaoddzia ywanie peptyd w z b onsferoplasty E coliprotoplasty B megateriumledzenie fluorescencyjne peptyd wanaliza b ony kom rkowejtest translokacji peptyd w
Produkcja i wizualizacja bakteryjnych sferoplastów i protoplastów w celu scharakteryzowania lokalizacji peptydów przeciwdrobnoustrojowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.