Łatwy protokół syntezy samoorganizujących się amfifilów peptydowych na bazie poliaminy (PPA) i pokrewnych biomateriałów

Summary

Synteza amfifilów peptydowych na bazie poliaminy (PPA) jest znaczącym wyzwaniem ze względu na obecność wielu azotów aminowych, co wymaga rozsądnego użycia grup ochronnych w celu zamaskowania tych reaktywnych funkcji. W tym artykule opisujemy łatwą metodę otrzymywania tych nowych klas cząsteczek samoorganizujących się.

Abstract

Amfifile peptydowe na bazie poliaminy (PPA) to nowa klasa samoorganizujących się amfifilowych biomateriałów związanych z amfifilami peptydowymi (PA). Tradycyjne PA posiadają naładowane aminokwasy w postaci grup rozpuszczających (lizyna, arginina), które są bezpośrednio połączone z segmentem lipidowym lub mogą zawierać region łącznikowy zbudowany z obojętnych aminokwasów. Dostrojenie sekwencji peptydowej PA może dać różne morfologie. Podobnie PPA posiadają segment hydrofobowy i aminokwasy obojętne, ale zawierają również cząsteczki poliaminy w postaci grup rozpuszczalnych w wodzie (hydrofilowych). Podobnie jak w przypadku PA, PPA mogą również samoorganizować się w różne morfologie, w tym małe pręciki, skręcone nanowstążki i stopione nano-arkusze, po rozpuszczeniu w wodzie. Jednak obecność zarówno amin pierwszorzędowych, jak i drugorzędowych w pojedynczej cząsteczce poliaminy stanowi poważne wyzwanie podczas syntezy PPA. W tym artykule przedstawiono prosty protokół, oparty na precedensach literaturowych, w celu osiągnięcia łatwej syntezy PPA przy użyciu syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS). Protokół ten można rozszerzyć na syntezę PA i innych podobnych systemów. Ilustrujemy również kroki, które są potrzebne do rozszczepienia z żywicy, identyfikacji i oczyszczenia.

Introduction

Samoorganizujące się amfifile peptydowe (PA) to klasa biomateriałów, zazwyczaj składająca się z następujących segmentów: (a) hydrofilowa głowa, (b) obszar łącznika i (c) hydrofobowy ogon. Większość PA opisanych w literaturze posiada hydrofilową głowę składającą się z naładowanych lub polarnych reszt aminokwasowych^1,2,3,4. PA znalazły szeroki zakres zastosowań w biomedycynie, w tym w dostarczaniu leków, diagnostyce chorób, medycynie regeneracyjnej itp.⁵. W oparciu o sekwencję aminokwasów, PA mogą tworzyć szeroką gamę nanostruktur, w tym sferyczne micele i nanofilamenty. Niedawno informowaliśmy o klasie hybrydowych amfifilów peptydowych na bazie poliaminy, określanych jako PPAs⁶. Stwierdzono, że morfologie, kinetyka samoorganizacji i degradacja metaboliczna tych biomateriałów są związane z ich solubilizującą grupą główną. Ponadto nanostruktury PPA nie wykazały toksyczności w stosunku do komórek ssaków (linie komórkowe MiaPaCa2 i HeLa) w badanych stężeniach. Nanonośniki oparte na PPA są atrakcyjnymi nośnikami leków, ponieważ: (1) wykazano, że wychwyt i metabolizm poliaminy są zwiększone w komórkach nowotworowych, (2) nanostruktury kationowe mogą osiągnąć ucieczkę endosomalną^7,8, co prowadzi do większego krążenia i pobytu w komórce, oraz (3) powinny mieć odrębny profil metaboliczny w porównaniu z PA; Na przykład będą bardziej stabilne w stosunku do proteaz znajdujących się w ludzkim ciele (chociaż mogą być wrażliwe na inne enzymy, takie jak oksydazy aminowe)^9,10. Stwierdzono również, że PPA mają różne morfologie, właściwości fizykochemiczne, sztywność nanocząstek i kinetykę montażu w zależności od długości i ładunku poszczególnych cząsteczek PPA⁶. W niniejszym artykule opisujemy szczegółowy protokół syntezy, identyfikacji i oczyszczania PPA, który można również zastosować do przygotowania PA lub podobnych hybrydowych cząsteczek peptydowych.

Ponieważ poliaminy nie są powszechnie dostępne na rynku w swoich chronionych formach, a ochrona pierwszorzędowych i drugorzędowych amin poliamin jest niezwykle ważna dla ich koniugacji z aminokwasami i innymi cząsteczkami, przedstawiliśmy syntetyczne kroki, aby osiągnąć ich ochronę. Ogólnym celem tego protokołu jest zapewnienie prostej metody koniugacji poliamin z aminokwasami. Poliaminy nie mają grupy karboksylowej; w związku z tym nie można ich łączyć z żywicami Rink Amide lub Wang. Zamiast tego do protokołu syntetycznego zalecane są żywice, takie jak chlorek 2-chlorotrytylu. Głównym wyzwaniem dla syntezy PPA jest obecność pierwszorzędowych i drugorzędowych aminowych grup funkcyjnych. Dla naszych celów zabezpieczyliśmy wszystkie aminy drugorzędowe w poliaminie, jednocześnie utrzymując pierwszorzędową grupę aminową na poliaminie wolną, aby umożliwić reakcję sprzęgania. Reakcja została przeprowadzona na solidnym podłożu zgodnie z zasadami syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS), aby ułatwić pracę po każdym etapie sprzęgania i deprotekcji. Poniższy protokół dotyczy zarówno ręcznej, jak i automatycznej syntezy umów PPA (chociaż weryfikacja niektórych kroków będzie trudna w systemie automatycznym). Synteza tych cząsteczek może być również przeprowadzona na automatycznym syntezatorze lub za pomocą reaktora mikrofalowego (zautomatyzowanego lub półautomatycznego). Schemat reakcji został podsumowany w Rysunek 1.

Rysunek 1: (A) Ogólny schemat reakcji dla syntezy PPA. (B) Reprezentatywne poliaminy, które mogą być użyte do syntezy PPA opisanych tutaj. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

1. Ogólny protokół syntezy umów PPA

1. Oblicz skalę syntezy (zwykle mmol). Skala ta opiera się na masie docelowej kwoty PPA. Należy pamiętać, że wydajność reakcji SPPS stopniowo spada wraz ze wzrostem sekwencji aminokwasów. Dlatego dokładna wydajność reakcji jest trudna do obliczenia.
2. Oblicz masę żywicy, która ma być użyta, w zależności od obciążenia żywicy. Obciążenie znajduje się na pojemniku lub w protokole analizy żywicy i jest wyrażone w mmol/g. Do obliczenia masy żywicy można użyć następującego wzoru:
3. Ostrożnie odważ żywicę chlorku 2-chlorotrytylu (w naszym przypadku obciążenie wynosi ~0,85 mmol)
4. Umieść żywicę w spiekanym naczyniu do syntezy o następujących specyfikacjach: Pojemność – 50 ml, Smażony krążek – 25 mm, Porowatość – Średnia.
5. Dodać 15 ml dichlorometanu (DCM) do żywicy.
6. Umieścić naczynie syntezy na mechanicznej wytrząsarce o zmiennej prędkości (wytrząsarka kolb/mieszadło) i obrócić naczynia pod kątem 45° (lub poziomo), aby zmaksymalizować mieszanie.
7. Pozwól kulkom żywicy pęcznieć przez 15 minut. Pęcznienie zwiększa wydajność reakcji, ponieważ ułatwia dyfuzję molekularną i dostęp do miejsca aktywnego, zwiększając wydajność sprzężenia.
8. Dodaj 8 odpowiedników (2 mmol w skali 0,25 mmol) żądanej poliaminy (sperminy, spermidyny, dietyelenetriaminy, 1,3-diaminopropanu itp.) do żywicy i pozwól jej reagować przez 5 godzin
   Uwaga: Krótszy okres reakcji zmniejszyłby wydajność.
9. Wykonaj test Kaisera (patrz Tabela materiałów), aby potwierdzić pomyślne sprzężenie poliaminy z żywicą. Pomyślne sprzężenie amin pierwszorzędowych daje fioletowo-niebieski kolor, który odpowiada wolnej aminie.
10. Chronić pierwszorzędową grupę aminową za pomocą 4 równoważników 1-(4,4-dimetylo-2,6-dioksocykloheks-1-ylideno)etylu (Dde), rozpuszczonych w bezwodnym metanolu (15 ml), wytrząsając mieszaninę reakcyjną przez noc¹¹.
    Uwaga: Krótszy czas reakcji zmniejsza wydajność.
11. Wykonaj test Kaisera. Brak niebieskiego koloru na koraliku żywicy potwierdza skuteczną ochronę. W przypadku nieskutecznej ochrony aminy pierwszorzędowej należy powtórzyć poprzedni krok.
12. Opróżnij DCM i dwukrotnie umyj żywice mieszaniną DCM i DMF (2:1, 15 ml).
13. Rozpuścić 20 równoważników (5 mmol) di-tert butylu (Boc) w DCM (20 ml) i pozostawić reakcję do przebiegu przez 3 godziny.
14. Wykonaj test chloranilu (patrz Tabela materiałów), aby potwierdzić pełną ochronę aminy drugorzędowej. Pozytywny wynik testu (ochrony) daje bezbarwny lub jasnożółty kolor. Wolne aminy drugorzędowe dają kolor ciemnozielony/niebieski, podczas gdy aminy pierwszorzędowe dają kolor czerwony.
15. Odcedzić mieszaninę rozpuszczalnika i przemyć dwukrotnie mieszaniną DCM i DMF (2:1, 15 ml).
16. Dodaj 2% roztwór hydrazyny do DMF (10 ml) i wstrząsaj przez 1 godzinę.
17. Wykonaj test Kaisera, aby potwierdzić udaną deprotekcję aminy pierwszorzędowej.
18. Dodaj pożądane aminokwasy w odwrotnej kolejności, w jakiej byś je napisał/narysował. Peptydy są pobierane od końców N do końców C, ale są syntetyzowane w przeciwnym kierunku, od C do N. Na przykład, w przypadku PPA wymagającego następującego rdzenia peptydowego -GLFD-, dodaj kwas asparaginowy (D), a następnie fenyloalaninę (F), leucynę (L), a na końcu glicynę (G).
    UWAGA: W przypadku większości aminokwasów następujący koktajl sprzęgający jest odpowiedni do przyłączenia do żywic zawierających poliaminę.
    1. Zmieszać 4 równoważniki (1 mmol) aminokwasu chronionego przez Fmoc, 3,95 równoważników 2-(1H-benzotriazol-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametylofluorofosforanu (HBTU) i 15 równoważników diizopropyloetyloaminy (DIPEA).
    2. Rozpuść je w mieszaninie DCM i DMF (1:1, 15 ml) i poddaj sonikacji koktajlu przez 2 minuty (aż do całkowitego rozpuszczenia).
    3. Odczekaj dodatkowe 3-5 minut, aby zapewnić aktywację kwasu karboksylowego na aminokwasie.
    4. Dodać mieszaninę reakcyjną do naczynia. Reakcję przeprowadzać przez 2-4 godziny w temperaturze otoczenia.
       UWAGA: Znaleźliśmy następujące skuteczne alternatywy dla HBTU (zwykle wymagające mniejszej ilości aminokwasów i czynnika sprzęgającego): COMU, PyBOP, HATU, DIC/Oxima.
    5. Wykonaj test Kaisera, aby potwierdzić udane sprzężenie.
    6. Odchroń grupę Fmoc przed aminokwasem, dodając 20% roztwór 4-metylopipiperydyny (10 ml) do DMF. Zrób to dwukrotnie, za każdym razem potrząsając mieszaniną reakcyjną przez 15 min.
       UWAGA: Skuteczną alternatywą dla usuwania Fmoc jest piperazyna/DBU¹².
       1. Wykonaj płukanie DCM (15 ml) między dodawaniami.
    7. Wykonaj test Kaisera, aby potwierdzić pomyślną deprotekcję aminokwasu.
    8. Dokładnie umyj żywicę, aby usunąć wszelkie ślady 4-metylu. Żywicę należy przemyć dwukrotnie DMF (10 ml), przy czym każde pranie trwa 5 minut, a na koniec DCM (10 ml) przez 10 minut.
    9. Dodaj wszystkie pozostałe aminokwasy, kolejno powtarzając kroki sprzęgania i usuwania ochrony.
19. Na koniec, po sprzężeniu wszystkich wymaganych aminokwasów, sprzęgnij ogon hydrofobowy z ostatnim aminokwasem konstruktu poliaminowo-peptydowego:
    1. Dodać 10 równoważników pożądanej funkcyjności kwasu karboksylowego do 9,5 równoważników HBTU i 12 równoważników DIPEA rozpuszczonych w mieszaninie DCM i DMF (1:1, 20 ml).
       Uwaga: Należy pamiętać, że niektóre ogonki mogą wymagać innej proporcji rozpuszczalnika (zwykle większego % DCM) lub dodatku lub innego rozpuszczalnika, takiego jak N-metylopirolidon (NMP).
    2. Sonikuj koktajl przez 5-10 minut, aż do rozpuszczenia (widzieliśmy, że całkowite rozpuszczenie ogona trwa dłużej) i dodaj do naczynia.
       Uwaga: W przypadku ogonów zawierających wiele miejsc reaktywnych, będą one musiały być chronione przed ich sprzężeniem.
    3. Przeprowadzaj tę reakcję (sprzęganie hydrofobowego ogona) przez co najmniej 5 godzin, chociaż zaleca się przeprowadzenie jej przez noc, aby uzyskać najwyższą wydajność.

2. Rozszczepienie PPA z solidnego wsparcia

Celem tego kroku jest rozszczepienie PPA z żywicy i usunięcie grup ochronnych Boc z aminokwasów i reszt poliaminowych.

1. Przemyj żywicę DMF (8 ml przez 2 min) i dwukrotnie DCM (8 ml, za każdym razem przez 5 min). Przed każdym dodaniem należy spuścić rozpuszczalnik z naczynia. Po wykonaniu ostatniego prania wysusz żywicę w próżni przez 15 minut.
2. Przygotować roztwór do rozszczepienia, stosując mieszaninę w następujących proporcjach: 28:1:1 kwas trifluorooctowy (TFA):_H2O: Triizopropylosilan (TIPS). Aby przygotować 15 ml koktajlu rozszczepienia, dodaj 14 ml TFA do 0,5 ml H₂O i 0,5 ml TIPS.
3. Dodaj ten roztwór do rozszczepienia do żywicy i wstrząsaj przez 2-4 godziny w temperaturze pokojowej.
4. Zebrać roztwór do kolby okrągłodennej o pojemności 25 lub 50 ml.
5. Zagęścić TFA w próżni do 1–2 ml za pomocą wyparki obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem, ogrzewając mieszaninę w temperaturze 40 °C (nie przekraczać 55 °C, aby uniknąć rozkładu PPA).
6. Po odparowaniu dodać otrzymany roztwór TFA (kroplami) do kolby okrągłodennej zawierającej bezwodny zimny eter (15 ml). Spowoduje to natychmiastowe zawarcie umowy PPA.
7. Ponadto dodać bezwodny zimny eter (5 ml) do oryginalnej kolby, w której zagęszczono tłuszcz tłuszczowy.
8. Sonikować tę kolbę w celu odzyskania dodatkowych ciał stałych i połączyć z roztworem eteru z kroku 2.6.
   Uwaga: Pipetę transferową można umyć niewielką ilością DCM. Unikaj wprowadzania DMF podczas procesu, ponieważ ma on tendencję do tworzenia substancji podobnej do żelu.
9. Umieść kolbę (pod przykryciem) w lodówce i odstaw na noc, aby zmaksymalizować opady.
10. Zebrać wytrącony materiał przez filtrację próżniową za pomocą spiekanego lejka filtra tarczowego. Idealne rozmiary porów to drobne lub średnie.
11. Przemyć osad dwukrotnie zimnym eterem (5–10 ml) w celu usunięcia wszelkich pozostałości substancji organicznych.

3. Identyfikacja produktu surowego przy użyciu metody suszonej kropli MALDI

1. Przygotowanie matrycy do analizy w trybie pozytywnym:
   1. Aby rozpocząć analizę masy cząsteczkowej za pomocą spektrometrii mas z desorpcją/jonizacją laserową wspomaganą matrycą (MALDI), dodaj 10 do 20 mg kwasu α-cyjano-4-hydroksycynamonowego do probówki mikrowirówkowej.
   2. Dodać roztwór wody/acetonitrylu (1:1, 1,0 ml) z 0,1% kwasem trifluorooctowym (TFA). Dokładnie wymieszać przez wirowanie.
      Uwaga: Ta matryca powinna być używana dla peptydów naładowanych dodatnio. Tryb ujemny MALDI jest podobny, ale wymaga matrycy zawierającej 9-aminoakrydynę z 0,1% amoniaku jako dodatek rozpuszczalnika.
   3. Dodać 1–2 μl próbki do płytki celowniczej ze stali nierdzewnej dla MALDI i wysuszyć próbkę na powietrzu. Dodać 1–2 μl matrycy i ponownie wysuszyć.
      Uwaga: Tabliczki mają okrągłe oznaczenia w siatce wzdłuż tarczy docelowej, aby pomóc zlokalizować konkretne miejsce.
2. Przeanalizuj próbki w instrumencie MALDI, aby zweryfikować ich tożsamość. Jonizacja elektronrozpylacyjna (ESI) jest ważną alternatywą w celu potwierdzenia tożsamości umów PPA.

4. Oczyszczanie PPA za pomocą preparatywnego oczyszczania wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC)

1. Rozpuść osad PPA w minimalnej ilości acetonitrylu i wody.
   1. Z reguły rozpuść 100 mg suchego surowego PPA w mniej niż 5 ml acetonitrylu i wody. Bardziej hydrofobowe umowy PPA mogą wymagać większego procentu acetonitrylu do rozpuszczenia, a także mogą wymagać większej objętości rozpuszczalnika w ogóle, w zależności od ładunku netto umów PPA (tabela 1).
   2. Jeśli całkowite rozpuszczenie nie nastąpi, dodać 1% TFA (ACN lub_H2O). Możliwe jest również dodanie śladowych ilości innych kompatybilnych rozpuszczalników, w tym dimetylosulfotlenku, metanolu lub izopropanolu (ogranicz ich zawartość do 5%).

rozpuszczalnik	Dodatnio naładowane PPA		Ujemnie naładowane umowy PPA
	0.1% TFA w wodzie		0,1% NH3 w wodzie
	0.1% TFA w ACN		0.1% NH3 w ACN

Tabela 1: Systemy rozpuszczalnikowe. Proponowany system rozpuszczalnikowy dla dodatnio i ujemnie naładowanych PPA.

2. Sonikować PPA za pomocą sonikatora klaksonowego przez 20 minut przy 10 impulsach s z Amp1 48% lub przez 2-3 godziny w kąpieli ultradźwiękowej.
3. Następnie przefiltruj za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm, a następnie przefiltruj za pomocą filtra strzykawkowego z politetrafluoroetylenu (PTFE) 0,20 μm. Roztwór PPA powinien być przejrzysty i wolny od wszelkich cząstek stałych.
   1. Jeśli filtracja jest zbyt trudna, należy poddać się sonizacji przez dłuższy czas. Zdecydowanie zaleca się, aby roztwór PPA został oczyszczony natychmiast po filtracji strzykawki, ponieważ długotrwałe przechowywanie może spowodować jego agregację lub żelację, co będzie wymagało ponownej sonikacji i być może ponownej filtracji.
4. Podczas i po oczyszczaniu należy używać rozpuszczalników klasy HPLC lub takich, które są filtrowane przez filtr/membranę strzykawkową 0,25 μm.
   UWAGA: Najczęstszymi warunkami rozpuszczalnika do oczyszczania PPA jest gradient_H2Oi ACN.
5. Do tego protokołu należy użyć standardowego przyrządu HPLC z odwróconymi fazami. Powinien zawierać programator gradientu elucji, binarny system dostarczania rozpuszczalnika, detektor UV zdolny do wykrywania przy 220 i 254 nm oraz programowalny kolektor frakcji. Maksymalne natężenie przepływu powinno wynosić 50 ml/min.
6. Do separacji należy użyć kolumny C-18 z odwróconymi fazami. Kolumny o następujących wymiarach mogą być stosowane w zależności od masy oczyszczanego ciała stałego i ładunku netto PPA (tabela 2).

Opłata PPA	Wielkość cząstek	Rozmiar kolumny	Masa surowego PPA
+ ve naładowany	5 μm	Wymiary: 150 x 30 mm	170 mg tabletki powlekania
- ve Naładowany	5 μm	Wymiary: 150 x 30 mm	170 mg tabletki powlekania
+ ve naładowany	5 μm	Wymiary: 150 x 21,2 mm	90 mg tabletki powlekania
- ve Naładowany	5 μm	Wymiary: 150 x 21,2 mm	90 mg tabletki powlekania

Tabela 2: Sugerowane kolumny: Wymiary kolumny, rozmiary cząstek i maksymalna nośność na wtrysk dla kolumn HPLC z odwróconą fazą C18

7. Wstrzyknąć PPA o objętości określonej zarówno przez pojemność kolumny, jak i przez objętość pętli iniekcyjnej HPLC. Uruchomić metodę gradientu HPLC zgodnie z ustawieniami przedstawionymi w tabeli 3 (czas elucji 40 min).

Rozdział

Godzina	Rozpuszczalnik A (acetonitryl)	Rozpuszczalnik B (woda)	Natężenie przepływu (ml/min)
0	5 proc.	95%	Natężenie przepływu zależy od upakowania kolumny i jej rozmiaru.
cyfra arabska	5 proc.	95%
35	95%	5 proc.
38 Rozdział 38	W 100%	0%
Rozdział 40	5 proc.	95%

Tabela 3: Sugerowany gradient fazy odwrotnej: Sugerowany gradient fazy odwrotnej pokazujący względny skład wody w porównaniu z acetonitrylem w danym okresie czasu. Natężenie przepływu będzie zależeć od specyfikacji kolumny.

8. Przeanalizuj frakcje zebrane na różnych probówkach za pomocą MALDI i określ, która probówka (lub probówki) zawiera PPA. Ocenia się to, badając masę cząsteczkową znajdującą się w każdej probówce.
   1. Sprawdzić czystość frakcji za pomocą analitycznej HPLC. Użyj systemu gradientu HPLC wyposażonego w detektor UV ustawiony na 220 nm.
   2. Jeśli występują zanieczyszczenia, wykonaj dodatkowy cykl oczyszczania za pomocą HPLC. Powyższy gradient używany do preparatywnej HPLC można przeskalować w dół do użycia z analityczną HPLC za pomocą oprogramowania online do konwertera kolumn. Każda frakcja musi mieć czystość ≥95% do charakterystyki fizycznej lub oceny biologicznej.
9. Zebrać frakcje do dużej kolby okrągłodennej lub kolby do odparowywania i usunąć cały acetonitryl i większość wody. Końcowy roztwór PPA nie powinien przekraczać 10 ml.
10. Przenieść ten koncentrat do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Należy pamiętać, że umowy PPA są substancjami podobnymi do detergentów; W ten sposób podczas odparowania rozpuszczalnika powstaną pęcherzyki. Odkryliśmy, że dodatek alkoholu etylowego zmniejsza tworzenie się pęcherzyków.
11. Zagęścić koncentrat próżniowo. Podczas parowania próżniowego duża ilość PPA może przylegać do ścianek pojemnika. Odzyskać to, wielokrotnie przepłukując ściankę kolby wodą z HPLC. Łączna objętość stężonego PPA i płukanki nie powinna przekraczać 30 ml.
12. Umieść roztwór wodny w probówce o pojemności 50 ml.
13. Błyskawiczne zamrożenie tego roztworu PPA w ciekłym azocie:
    UWAGA: Błyskawiczne zamrażanie powoduje powstawanie mniejszych kryształków lodu, które szybciej sublimują w liofilizatorze. Co więcej, wolniejsze zamrażanie może pozwolić na tworzenie się samoorganizujących się struktur supramolekularnych. Inną alternatywą (ale mniej pożądaną) jest stopniowe zamrażanie w zamrażarce o temperaturze -80 °C lub zamrażanie za pomocą mieszanki suchego lodu + acetonu
    1. Przed umieszczeniem probówki wirówkowej w liofilizatorze należy przeperforować lub poluzować nakrętkę probówki, aby wilgoć mogła uciec z próbki i zebrać się w urządzeniu chłodniczym. Ustaw jednostkę liofilizacyjną na -54 °C i 0,016 mbar.
       UWAGA: Inną opcją jest zdjęcie nasadki i umieszczenie chusteczki (z gumką) na wierzchu otworu. Odkryliśmy również, że zamrażanie próbek pod kątem lub rozbijanie lodu na małe porcje pozwala na szybszą i lepszą liofilizację dzięki zwiększeniu powierzchni.
    2. Jeśli ciało stałe zacznie się topić, może to oznaczać, że obecne są śladowe ilości rozpuszczalnika organicznego (zwykle acetonitrylu). Powtórz etap zamrażania i oceń stan liofilizacji.
    3. Jeśli topnienie będzie się utrzymywać, istnieją dwa potencjalne rozwiązania:
       1. Podzielić próbkę na dwie porcje (umieścić w probówkach), rozcieńczyć wodą i ponownie zamrozić. Nie używaj tego roztworu często, ponieważ duże ilości rozpuszczalników organicznych mogą uszkodzić sprzęt.
       2. Alternatywnie, umieścić próbkę w kolbie i dalej odparować rozpuszczalnik organiczny w próżni. Liofilizacja próbki, która jest w postaci płynnej, zwykle prowadzi do uderzenia i utraty związku PPA.

5. Przechowywanie umów PPA

1. Przechowuj PPA w temperaturze -20 °C z nakrętkami dokręconymi i uszczelnionymi Parafilmem na tubie z odpowiednią etykietą.
2. Przed użyciem doprowadź PPA z powrotem do temperatury otoczenia w komorze próżniowej, aby uniknąć kondensacji pary wodnej na PPA.

Results

Po syntezie i oczyszczeniu, a przed oceną fizykochemiczną lub biologiczną, zaleca się ponowne sprawdzenie masy PPA i ustalenie czystości za pomocą analitycznej HPLC. Do charakterystyki materiału lub oceny biologicznej umowy PPA muszą mieć czystość >95%. Rysunek 2 pokazuje ślad HPLC (na górze) i widma MALDI (na dole), potwierdzając obecność produktu. Systemy analityczne HPLC będą integrować obszar pod krzywą (AUC), a AUC >95% może być związane z czystośc...

Discussion

Opisane tutaj protokoły mogą być wykorzystywane do syntezy PPA, a także PA i powiązanych cząsteczek na bazie peptydów (takich jak hybrydowe peptoidy PA). Chociaż synteza peptydów za pomocą SPPS jest prostą procedurą, synteza peptydów zawierających biologiczne cząsteczki naprowadzające może być szczególnie trudna. Poliaminy, takie jak spermina, spermidyna, dietylelenetriamina itp., mogą funkcjonować jako cząsteczki naprowadzające do celowania w komórki rakowe¹³. Umowy PPA mogą samoorganizo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Żywica chlorku 2-chlorotrytylu	AappTec	RTZ001
SynthwareTM	Aldrich	SYNP120050M
Dichloromethane	Acros	AC406920250	Fisher Sci. Katalog #
Wytrząsarka do nadgarstków	Boekel Scientific	401000-2
Zestaw testowy	Kaisera Sigma-Aldrich	60017
2-[(4,4-dimetylo-2,6-dioksocykloheks-1-ylideno)etylo-amino]-etanol	Sigma-Aldrich	CDS004772
Bezwodny metanol	Acros	AC610981000	Fisher Sci. Katalog #
Zestaw testowy chloranilu	TCI	TCC1771-KIT	Katalog VWR #
Di-tert di-butyl	Acros	AC194670250	Fisher Sci. Katalog #
Dimethylformamide	Fisher Scientific	BP1160-4
Hydrazine	Acros	AC296815000	FIster Sci. Katalog #
(2-(1H-benzotriazol-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametylouronium heksafluorofosforan)	p3biosystems	31001
4-metylopirydyna	Acros	AC127515000	Katalog naukowy #
Kwas trifluorooctowy	AappTec	CXZ035
Triisopropyl Silane	Sigma-Aldrich	233781
Ether	Fisher Scientific	E138-1
&alfa;-cyjano-4-hydroksycynamonowy kwas	Sigma-Aldrich	C8982
9-aminoakrydyna	Sigma-Aldrich	92817
Marka rybacka  Filtry strzykawkowe: Membrana PTFE	Fisher Scientific	09-730-21