Method Article

Specyficzne tkankowo profilowanie ekspresji miRNA w wycinkach serca myszy przy użyciu hybrydyzacji in situ

DOI:

10.3791/57920

⸱

September 15th, 2018

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mikro-RNA (miRNA) to krótkie i wysoce homologiczne sekwencje RNA, służące jako posttranskrypcyjne regulatory informacyjnych RNA (mRNA). Obecne metody wykrywania miRNA różnią się czułością i swoistością. Opisujemy protokół, który łączy hybrydyzację in situ i barwienie immunologiczne w celu jednoczesnego wykrywania cząsteczek miRNA i białka na odcinkach tkanki serca myszy.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mikro-RNA (miRNA) to jednoniciowe transkrypty RNA, które wiążą się z informacyjnymi RNA (mRNA) i hamują ich translację lub sprzyjają ich degradacji. Do tej pory miRNA były zaangażowane w wiele procesów biologicznych i chorobowych, co oznaczało potrzebę niezawodnych metod wykrywania transkryptów miRNA. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół wykrywania miRNA opartego na sondie znakowanego digoksygeniną (DIG) zablokowanego kwasu nukleinowego (LNA) w połączeniu z barwieniem immunologicznym białek na odcinkach serca myszy. Po pierwsze, przeprowadziliśmy technikę hybrydyzacji in situ przy użyciu sondy w celu identyfikacji ekspresji miRNA-182 w odcinkach serca myszy kontrolnych i myszy z przerostem serca. Następnie przeprowadziliśmy barwienie immunologiczne białka troponiny T serca (cTnT) na tych samych odcinkach, aby kolokalizować miRNA-182 z komórkami kardiomiocytów. Korzystając z tego protokołu, byliśmy w stanie wykryć miRNA-182 za pomocą testu kolorymetrycznego opartego na fosfatazie alkalicznej, a cTnT za pomocą barwienia fluorescencyjnego. Protokół ten może być wykorzystany do wykrywania ekspresji dowolnego interesującego miRNA za pomocą sond LNA znakowanych DIG oraz odpowiedniej ekspresji białka na odcinkach tkanki serca myszy.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mikro-RNA (miRNA) to krótkie (18–25 nukleotydów), jednoniciowe, niekodujące RNA, które działają jako negatywne regulatory ekspresji genów na poziomie posttranskrypcyjnym poprzez hamowanie translacji informacyjnego RNA (mRNA) i/lub promowanie degradacji mRNA1. miRNA są transkrybowane z intronów lub eksonów genów kodujących lub niekodujących i są rozszczepiane w jądrze przez DROSHA, do prekursorowych miRNA (pre-miRNA), które są krótkimi strukturami pętli macierzystych składającymi się z 70 nukleotydów2. Po eksporcie cytoplazmatycznym pre-miRNA są dalej przetwarzane przez DICER na dojrzałe miRNA, które obejmują 18–25 nukle....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki tkanek serca myszy do tego badania zostały uzyskane zgodnie z odpowiednimi przepisami i wytycznymi instytucjonalnymi i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Yale.

1. Przygotowanie roztworu

  1. Przygotuj ddH2O wolne od RNaz, traktując 5 l ddH2O 5 ml 0,1% dietylowęglanu (DEPC) przez noc (O/N), w temperaturze pokojowej (RT). Autoklaw (121 °C), aby dezaktywować DEPC. Użyć ddH2O poddanego działaniu DEPC do przygotowania dalszych roztworów, jak wskazano.
    UWAGA: DEPC jest znanym czynnikiem rakotwórczym, należy go używać tylko w dygest....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hybrydyzacja in situ miRNA została zoptymalizowana na mysich odcinkach serca przy użyciu miRNA i U6-snRNA, które służyły odpowiednio jako kontrole negatywne i pozytywne. Barwienie dodatnie jest oznaczone kolorem niebieskim, podczas gdy barwienie ujemne jest wskazywane przez brak rozwoju koloru (Rysunek 1A-1B). Ekspresję miRNA-182 specyficzną dla kardiomiocytów oceniano w odcinkach serca myszy kontrolnych i myszy z nadekspresją PlGF. Myszy z tr.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykrywanie transkryptu miRNA można osiągnąć za pomocą różnych technik, które różnią się czułością, swoistością i mocą ilościową. Tutaj demonstrujemy sprzężenie hybrydyzacji miRNA in situ z barwieniem immunologicznym i opisujemy protokół, który pozwala na jednoczesną ocenę poziomów ekspresji miRNA i cząsteczek białka na tych samych odcinkach serca. Najpierw pokazujemy, jak przeprowadzić hybrydyzację in situ sond miRNA LNA znakowanych DIG na odcinkach serca zatopionych w parafinie. Następnie opisujemy, ja.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Athanasiosowi Papangelisowi za krytyczne uwagi na temat rękopisu. FM jest wspierany przez Radę ds. Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi (BBSRC; BB/M009424/1). Własność intelektualna jest wspierana przez American Heart Association Scientist Development Grant (17SDG33060002).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Pierowęglan dietyluSigma AldrichD5758DEPC
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemSigma AldrichP4417PBS
Tween-20Amerykański bioanalitycznyAB02038niejonowy środek powierzchniowo czynny
HistoclearNational DiagnosticsHS-200
Proteinaza K, rekombinowana, klasa PCRSigma Aldrich3115879001ProK
ParaformaldehydSigma AldrichP6148PFA
Chlorek soduThermoFisherS271NaCl
Sześciowodny chlorek magnezuThermoFisherM33MgCl2
TrisSigma AldrichT6066
Roztwór kwasu solnego, 1 NThermoFisherSA48HCl
Roztwór kwasu solnego, 12 NThermoFisherS25358HCl
1-metyloimidazolSigma Aldrich336092
chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N′-etylokarbodimiduSigma Aldrich39391EDC
Roztwór nadtlenku wodoru H2O2Sigma Aldrich216763H2O2
Dwuwodny cytrynian trisodowySigma AldrichS1804Cytrynian sodu
miRCURY LNA miRNA ISH Zestaw buforowy (FFPE)Qiagen339450mieszanie miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 sonda detekcyjnaQIagenYD006157015'-DIG i 3'-DIG znakowany
chlorowodorek lewamizoluSigma Aldrich31742
Albumina surowicy bydlęcejSigma AldrichA9647BSA
NBT/BCIP TabletkiSigma Aldrich11697471001NBT-BCIP
Chlorek potasuThermoFisherP217KCl
Roztwór DAPI (1 mg / ml)ThermoFisher62248DAPI
Szkiełko nakrywkowe szklaneThermoFisher12-545ESzkiełko nakrywkowe
szklane Szkiełko nakrywkowe z tworzywa sztucznegoGrace Bio-LabsHS40 22mmX40mmX0,25mmSzkiełko nakrywkowe bez RNA
Anty-Digoxigenin-AP, fragmenty Fab PrzeciwciałoSigma Aldrich11093274910DIG
Hydrofobowy długopis barierowyVector LaboratoriesH-4000Pap
pen Przeciwciało przeciw sercowej troponinie T PrzeciwciałoAbcamab92546cTnT
Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-królicze IgG (H + L) wchłonięte krzyżowo, Alexa Fluor 568ThermoFisherA-11011przeciwciało anty-królicze-568
Pożywka montażowa fluorescencyjna DakomontażoweDAKOS3023
Surowica owczaSigma AldrichS3772
Surowica koziaSigma AldrichG9023
Dejonizowany formamidamerykański Piec doAB00600
ThermoFisherUVP HB-1000 Hybridizer
Podłoże hybrydyzacji bioanalitycznej

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  2. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
  3. Hu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

In Situ HybridizationMicroRNA DetectionMouse Heart SectionsProtein ImmunostainingCardiac Troponin TDigoxigenin Labeled ProbeLocked Nucleic AcidAlkaline Phosphatase AssayFluorescent StainingTissue Section Preparation

Related Articles