Artykuł metodologiczny

Specyficzne tkankowo profilowanie ekspresji miRNA w wycinkach serca myszy przy użyciu hybrydyzacji in situ

DOI:

10.3791/57920

⸱

15 września 2018

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mikro-RNA (miRNA) to krótkie i wysoce homologiczne sekwencje RNA, służące jako posttranskrypcyjne regulatory informacyjnych RNA (mRNA). Obecne metody wykrywania miRNA różnią się czułością i swoistością. Opisujemy protokół, który łączy hybrydyzację in situ i barwienie immunologiczne w celu jednoczesnego wykrywania cząsteczek miRNA i białka na odcinkach tkanki serca myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mikro-RNA (miRNA) to jednoniciowe transkrypty RNA, które wiążą się z informacyjnymi RNA (mRNA) i hamują ich translację lub sprzyjają ich degradacji. Do tej pory miRNA były zaangażowane w wiele procesów biologicznych i chorobowych, co oznaczało potrzebę niezawodnych metod wykrywania transkryptów miRNA. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół wykrywania miRNA opartego na sondie znakowanego digoksygeniną (DIG) zablokowanego kwasu nukleinowego (LNA) w połączeniu z barwieniem immunologicznym białek na odcinkach serca myszy. Po pierwsze, przeprowadziliśmy technikę hybrydyzacji in situ przy użyciu sondy w celu identyfikacji ekspresji miRNA-182 w odcinkach serca myszy kontrolnych i myszy z przerostem serca. Następnie przeprowadziliśmy barwienie immunologiczne białka troponiny T serca (cTnT) na tych samych odcinkach, aby kolokalizować miRNA-182 z komórkami kardiomiocytów. Korzystając z tego protokołu, byliśmy w stanie wykryć miRNA-182 za pomocą testu kolorymetrycznego opartego na fosfatazie alkalicznej, a cTnT za pomocą barwienia fluorescencyjnego. Protokół ten może być wykorzystany do wykrywania ekspresji dowolnego interesującego miRNA za pomocą sond LNA znakowanych DIG oraz odpowiedniej ekspresji białka na odcinkach tkanki serca myszy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mikro-RNA (miRNA) to krótkie (18–25 nukleotydów), jednoniciowe, niekodujące RNA, które działają jako negatywne regulatory ekspresji genów na poziomie posttranskrypcyjnym poprzez hamowanie translacji informacyjnego RNA (mRNA) i/lub promowanie degradacji mRNA1. miRNA są transkrybowane z intronów lub eksonów genów kodujących lub niekodujących i są rozszczepiane w jądrze przez DROSHA, do prekursorowych miRNA (pre-miRNA), które są krótkimi strukturami pętli macierzystych składającymi się z 70 nukleotydów2. Po eksporcie cytoplazmatycznym pre-miRNA są dalej przetwarzane przez DICER na dojrzałe miRNA, które obejmują 18–25 nukleotydów3,4. Następnie indukowany RNA kompleks wyciszający (RISC) włącza te miRNA jako jednoniciowe RNA, co pozwala na ich wiązanie się z nieulegającym translacji regionem 3' (3'-UTR) docelowych mRNA w celu stłumienia ich ekspresji3,5.

W ciągu ostatnich trzech dekad, od kiedy po raz pierwszy zidentyfikowano, pojawiły się miRNA, które opanowały regulatory ekspresji genów, których własne poziomy ekspresji są ściśle kontrolowane6. Role dla miRNA zostały opisane w rozwoju narządów7,8,9,10,11,12, utrzymanie homeostazy13,14, a także konteksty chorobowe, które obejmują neurological15,16,17,18,19, sercowo-naczyniowy20, choroby autoimmunologiczne21,22, cancers23,24, and others25. Rosnące uznanie dla znaczenia wzorców ekspresji miRNA spowodowało zapotrzebowanie na niezawodne metody wykrywania transkryptów miRNA. Takie metody obejmują Real Time PCR, mikromacierze, Northern Blotting, hybrydyzację in situ i inne, które różnią się czułością, swoistością i mocą ilościową, głównie ze względu na fakt, że transkrypty miRNA składają się z krótkich i wysoce homologicznych sekwencji6.

Niedawno informowaliśmy o ważnej roli miRNA-182 w rozwoju przerostu mięśnia sercowego26, stan opisujący adaptację strukturalną serca w odpowiedzi na podwyższone wymagania hemodynamiczne27,28. Przerost mięśnia sercowego charakteryzuje się wzrostem masy mięśnia sercowego, który, jeśli jest związany z nieadaptacyjną przebudową29, może prowadzić do zwiększonego ryzyka niewydolności serca, stanu odpowiadającego za 8,5% wszystkich zgonów przypisywanych chorobom sercowo-naczyniowym30.

Tutaj opisujemy nasz protokół, który łączy hybrydyzację in situ z sondą LNA (Locked Nucleic Acid) znakowaną digoksygeniną (DIG) i barwieniem immunologicznym w celu jednoczesnego wykrywania miRNA i cząsteczek białka na wycinkach tkanki serca myszy, w naszym modelu przerostu mięśnia sercowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki tkanek serca myszy do tego badania zostały uzyskane zgodnie z odpowiednimi przepisami i wytycznymi instytucjonalnymi i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Yale.

1. Przygotowanie roztworu

  1. Przygotuj ddH2O wolne od RNaz, traktując 5 l ddH2O 5 ml 0,1% dietylowęglanu (DEPC) przez noc (O/N), w temperaturze pokojowej (RT). Autoklaw (121 °C), aby dezaktywować DEPC. Użyć ddH2O poddanego działaniu DEPC do przygotowania dalszych roztworów, jak wskazano.
    UWAGA: DEPC jest znanym czynnikiem rakotwórczym, należy go używać tylko w dygestorium.
  2. Przygotować 1x roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS), rozpuszczając 5 tabletek PBS w 1 l autoklawu ddH2O. poddanego działaniu DEPC (121 °C).
  3. Przygotuj 0,1% niejonowego detergentu/PBS (PBST), rozcieńczając 1 ml niejonowego detergentu na 1 l 1x PBS.
  4. Przygotować 90%, 70%, 50% i 30% etanol w ddH2O poddanym działaniu DEPC.
  5. Przygotować roztwór podstawowy 10 mg/ml proteinazy K (ProK) w ddH2O. poddanym działaniu DEPC Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować roztwór roboczy ProK o stężeniu 20 μg/ml, rozcieńczając 100 μl roztworu podstawowego ProK w 50 ml ddH2O. Przed użyciem przygotować świeże.
  6. Przygotować 4% paraformaldehydu (PFA), dodając 2 g PFA do 50 ml 1x PBS. Ogrzewać w temperaturze 65 °C, od czasu do czasu wstrząsając, aż do rozpuszczenia. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    Uwaga: PFA jest znanym czynnikiem rakotwórczym, należy go wytrzymać tylko w dygestorium.
  7. Przygotować 3 M roztwór NaCl, dodając 87,8 g do 500 ml ddH2O. Autoklaw (121 °C).
  8. Przygotować 1 M roztwór MgCl2 dodając 20,3 g do 100 ml ddH2O. Autoklaw (121 °C).
  9. Przygotować 1 M Tris pH 8,0 rozpuszczając 121,1 g w 800 ml ddH2O. Doprowadzić pH do 8,0 za pomocą kilku kropli 1 N HCl, doprowadzić objętość do 1 l i przelać do autoklawu (121 °C). Przygotować roztwór roboczy o stężeniu 50 mM Tris pH 8,0, rozcieńczając 2,5 ml 1 M Tris pH 8,0 w 47,5 ml ddH2O.
  10. Przygotować 1 M Tris pH 9,5, rozpuszczając 60,6 g w 400 ml ddH2O. Dostosować pH do 9,5 za pomocą kilku kropli 1 N HCl, doprowadzić objętość do 500 ml i autoklawować (121 °C).
  11. Przygotować 0,13 M 1-metyloimidazol o pH 8,0, rozcieńczając 1,6 ml 1-metyloimidazolu do 130 ml ddH2O poddanego działaniu DEPC. Dostosować pH do 8,0 za pomocą około 450 μl 12 N HCl. Dodać 16 ml 3 M NaCl i doprowadzić objętość do 160 ml. Przygotuj świeże przed użyciem.
    Uwaga: 1-metyloimidazol jest szkodliwy dla błon śluzowych, oczu i skóry, należy obchodzić się tylko w okapie.
  12. Przygotować 0,16 M chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N′-etylokarbodimidu (EDC), rozcieńczając 176 μl EDC do 10 ml 0,13 M 1-metyloimidazolu. Doprowadzić pH do 8,0 za pomocą około 100 μl 12 N HCl. Przed użyciem przygotować świeże.
    UWAGA: EDC jest szkodliwy dla błon śluzowych, oczu i skóry, należy go używać wyłącznie w wyciągu.
  13. Przygotować 1% H2O2 rozcieńczając 1,5 ml 30% H2O2 w 50 ml 1x PBS. Przygotuj świeże przed użyciem.
  14. Przygotować 20x SSC pH 7,0 rozpuszczając 175,3 g NaCl i 88,2 g cytrynianu sodu (Na3C6H5O7) w 800 ml ddH2O. Dostosować pH do 7,0 za pomocą kilku kropli 1 N HCl, doprowadzić objętość do 1 l i autoklawować (121 °C).
    1. Przygotować roztwór roboczy o pH 7,0 2x SSC, rozcieńczając 20 ml 20x SSC pH 7,0 w 180 ml ddH2O.
    2. Przygotować roztwór roboczy 1x SSC pH 7,0, rozcieńczając 2,5 ml 20x SSC pH 7,0 w 47,5 ml ddH2O.
    3. Przygotować roztwór roboczy o wartości 0,2 x SSC pH 7,0, rozcieńczając 5 ml 2 x SSC pH 7,0 w 45 ml ddH2O.
  15. Przygotuj 1x roztwór hybrydyzacyjny, rozcieńczając 0,5 ml buforu 2x microRNA ISH w 0,5 ml ddH2O, którym poddaje się działaniu DEPC. Przygotuj świeży przed użyciem.
  16. Przygotować 200 mM roztwór podstawowy lewamizolu, dodając 250 mg do 5 ml ddH2O. Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  17. Przygotować roztwór blokujący dla kroku 5 (10% surowica owcza/1% BSA/0,2 mM lewamizolu), rozcieńczając 1 ml surowicy owczej w 9 ml PBST i dodając 0,1 g BSA. Przed użyciem dodać 10 μl lewamizolu. Przygotuj świeże przed użyciem.
  18. Przygotować roztwór blokujący dla kroku 6 (10% surowica kozia/1% BSA), rozcieńczając 1 ml surowicy koziej w 9 ml PBST i dodając 0,1 g BSA. Przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu tygodnia.
  19. Przygotować roztwór do barwienia wstępnego, rozcieńczając 3,3 ml 3 M NaCl, 5 ml 1 M MgCl, 2,10 ml 1 M Tris pH 9,5, 100 μl Tween-20, 100 μl lewamizolu w 81,5 ml ddH2O. Przygotować świeże przed użyciem.
  20. Użyj tabletek nitroniebieskiego tetrazolu (NBT)/fosforanu 5-bromo-4-chloro-3-indolowego (BCIP), aby przygotować 20 ml roztworu substratu fosfatazy alkalicznej (AP) zgodnie z instrukcjami producenta. Dodać 20 μl lewamizolu. Przygotuj świeżość przed użyciem i chroń przed światłem.
  21. Przygotować roztwór KTBT, dodając 4 g Tris, 4,4 g NaCl i 375 mg KCl w 500 ml ddH2O. Autoklaw (121 °C).
  22. Opcjonalnie: Przygotuj roztwór roboczy DAPI (1 μg/ml), rozcieńczając 50 μl roztworu podstawowego DAPI (1 mg/ml) w 50 ml 1x PBS.
    UWAGA: Alternatywnie można zakupić roztwory wzorcowe, takie jak 3 M NaCl, 1 M MgCl2, 1 M Tris-HCl, ddH2O bez nukleaz, 1x PBS i 20x SSC. Do tego protokołu użyto szklanych słoików Coplin o pojemności 50 ml lub słoików kopertowych z polipropylenu o pojemności 20 ml.

2. Przygotowanie tkanek

UWAGA: Użyte tutaj fragmenty serca myszy zostały przygotowane przez Yale Pathology Tissue Services, z tkanki utrwalonej w formalinie/parafinie, przecięte na 5 μm i umieszczone na naładowanych szkiełkach.

  1. Uwodnienie tkanek.
    1. Podgrzewać szkiełka w temperaturze 60 °C przez 10 minut w piecu do hybrydyzacji, aż parafina zacznie się widocznie topić.
    2. Inkubować szkiełka w szklanym słoiku z kopliny zawierającym 50 ml dostępnego w handlu środka czyszczącego (patrz tabela materiałów) przez 10 minut, dwukrotnie.
    3. Inkubować szkiełka w szklanym słoiku Coplin zawierającym 50 ml 100% etanolu przez 2 minuty, dwa razy, następnie 90% etanolu przez 2 minuty, 70% etanolu przez 2 minuty, dwa razy, 50% etanolu przez 2 minuty i 30% etanolu przez 2 minuty.
    4. Inkubować szkiełka w szklanym słoiku z kopliny zawierającym 50 ml ddH2O poddanego działaniu DEPC przez 5 minut.
    5. Inkubować szkiełka w szklanym słoiku Coplin zawierającym 50 ml 1x PBS przez 5 minut.
  2. Odtłuszczanie tkanek.
    1. Inkubować szkiełka w szklanym słoiku Coplin zawierającym 50 ml roztworu roboczego ProK o stężeniu 20 μg/mL w temperaturze 37 °C przez 15 minut w piecu do hybrydyzacji.
      UWAGA: Niedostateczne trawienie może skutkować słabym rozwojem sygnału lub jego brakiem, podczas gdy nadmierne trawienie może powodować degradację tkanek i rozwój barwienia tła. Na tym etapie może być wymagana optymalizacja (1–20 μg/ml ProK, 5–20 min inkubacji, RT-37 °C).
    2. Umyj szkiełka w szklanym słoiku Coplin zawierającym 50 ml 1x PBS przez 5 minut, w temperaturze pokojowej, dwukrotnie.
  3. Utrwalenie tkanki.
    1. Użyj hydrofobowego pisaka, aby narysować wodoodporny okrąg wokół tkanki na każdym szkiełku.
    2. Nałożyć 500 μl 4% roztworu PFA na długość każdego szkiełka i inkubować szkiełka poziomo przez 10 minut, w temperaturze pokojowej.
    3. Umyj szkiełka w szklanym słoiku Coplin zawierającym 50 ml 1x PBS przez 5 minut, w temperaturze pokojowej, dwukrotnie.
    4. Umyć szkiełka w szklanym słoiku Coplin zawierającym 50 ml 0,13 M 1-metyloimidazolu przez 10 minut, w temperaturze pokojowej, dwukrotnie.
    5. Nałożyć 500 μl 0,16 M roztworu EDC na długość każdego szkiełka i inkubować szkiełka poziomo przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, w wilgotnej komorze.
    6. Opłucz szkiełka w szklanym słoiku Coplin zawierającym 50 ml 50 mM Tris pH 8,0 w temperaturze pokojowej.
    7. Opłucz szkiełka w szklanym słoiku Coplin zawierającym 50 ml 1x PBS w temperaturze pokojowej, dwukrotnie.
      UWAGA: Do sieciowania miRNA wymagane są zarówno etapy utrwalania PFA, jak i EDC i nie należy ich pomijać. 31
  4. Endogenny blok peroksydazy.
    1. Szkiełka inkubować w szklanym słoiku z kopliny zawierającym 50 ml 1% H2O2 przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Opłucz szkiełka w szklanym słoiku Coplin zawierającym 50 ml 1x PBS w temperaturze pokojowej, dwukrotnie.

3. Hybrydyzacja

  1. Podgrzej roztwór do hybrydyzacji (500 μl na szkiełko) w temperaturze 50 °C w piecu do hybrydyzacji, aż do osiągnięcia temperatury docelowej (10–15 min).
  2. Przygotować komorę hybrydyzacyjną, umieszczając 2 kawałki bibuły filtracyjnej lub bibuły na dnie komory i zwilżając bibułę 50% formamidem/1x SSC.
    Uwaga: Formamid jest szkodliwy dla błon śluzowych, oczu i skóry, należy go przechowywać wyłącznie w dygestorium.
  3. Nanieść 200 μl roztworu hybrydyzacyjnego na długość każdego szkiełka. Inkubować szkiełka poziome przez 1–3 godziny w temperaturze 50 °C, w wilgotnej komorze.
  4. Przygotować roztwór sondy, mieszając 0,5 μl sondy podstawowej (25 μM) z 250 μl roztworu hybrydyzacyjnego (stężenie końcowe 50 nM) w probówce o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Różne miRNA ulegają ekspresji na różnych poziomach, więc na tym etapie może być wymagana optymalizacja dotycząca stężenia sondy (1–50 nM), aby uniknąć braku sygnału lub wysokiego rozwoju tła.
  5. Nałóż 250 μl roztworu sondy na długość każdego szkiełka i umieść na nim szkiełko nakrywkowe wolne od RNaz. Unikaj tworzenia się pęcherzyków.
  6. Ostrożnie uszczelnić komorę hybrydyzacyjną parafilmem i inkubować O/N w temperaturze 50 °C.
    UWAGA: Temperaturę hybrydyzacji należy ustawić około 30 °C poniżej temperatury topnienia RNA (Tm) każdej sondy. Może być wymagana optymalizacja. W tym przypadku 50 °C jest używana jako temperatura hybrydyzacji/płukania dla miRNA-182, dostosuj odpowiednio dla różnych sond.

4. Rygorystyczne pranie

  1. Podgrzej 200 ml 2x SSC w temperaturze 50 °C w piecu do hybrydyzacji, aż do osiągnięcia temperatury docelowej (20–40 min).
  2. Myć szkiełka w szklanym słoiku Coplin zawierającym 50 ml 2x SSC w temperaturze 50 °C przez 5 minut lub do momentu, gdy szkiełka nakrywkowe się poluzują.
  3. Umyj szkiełka w szklanym słoiku Coplin zawierającym 50 ml 2x SSC w temperaturze pokojowej przez 5 minut, dwukrotnie.
  4. Myć szkiełka w szklanym słoiku Coplin zawierającym 50 ml 0,2x SSC w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  5. Myć szkiełka w szklanym słoiku Coplin zawierającym 50 ml PBST w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  6. Umyj szkiełka w szklanym słoiku Coplin zawierającym 50 ml 1x PBS w temperaturze RT przez 5 min.
    UWAGA: Stosowanie warunków wolnych od RNaz nie jest już konieczne, ponieważ hybrydy RNA-RNA są uważane za stabilne.

5. Wykrywanie przeciwciał DIG

  1. W razie potrzeby użyj pisaka hydrofobowego, aby ponownie narysować wodoodporny okrąg wokół tkanki na każdym szkiełku.
  2. Nanieść 500 μl roztworu blokującego na długość każdego szkiełka. Inkubować szkiełka poziome przez 30 minut w temperaturze pokojowej, w wilgotnej komorze.
  3. Przygotować roztwór przeciwciała DIG (1:1 000), rozcieńczając 0,5 μl przeciwciała DIG w 500 μl roztworu blokującego w probówce o pojemności 1,5 ml.
    UWAGA: Na tym etapie może być wymagana optymalizacja (1:500–1:2 000).
  4. Nanieść 500 μl roztworu przeciwciała DIG na długość każdego szkiełka. Inkubować szkiełka poziomo przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, w wilgotnej komorze.
  5. Umyj szkiełka w szklanym słoiku Coplin zawierającym 50 ml PBST w temperaturze pokojowej przez 5 minut, trzykrotnie.
  6. Umyj szkiełka w szklanym słoiku Coplin zawierającym 50 ml roztworu do wstępnego barwienia w temperaturze pokojowej przez 5 minut, dwukrotnie.
  7. Szkiełka należy inkubować w polipropylenowym słoiku pocztowym zawierającym 20 ml roztworu substratu AP w temperaturze 37 °C, przez 6–24 godziny, chroniąc przed światłem.
    Uwaga: Rozwój koloru należy sprawdzać co 2 godziny. Na tym etapie może być wymagana optymalizacja.
  8. Umyj szkiełka w szklanym słoiku Coplin zawierającym 50 ml roztworu KTBT w temperaturze pokojowej przez 5 minut, dwukrotnie.
  9. Myj szkiełka w szklanym słoiku Coplin zawierającym 50 ml 1x PBS w temperaturze RT przez 5 minut.

6. Wykrywanie przeciwciał cTnT

  1. W razie potrzeby użyj pisaka hydrofobowego, aby ponownie narysować wodoodporny okrąg wokół tkanki na każdym szkiełku.
  2. Nanieść 500 μl roztworu blokującego na długość każdego szkiełka. Inkubować szkiełka poziomo przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, w wilgotnej komorze.
  3. Przygotować roztwór przeciwciała cTnT (1:100), rozcieńczając 2 μl przeciwciała cTnT w 200 μl roztworu blokującego w probówce o pojemności 1,5 ml.
  4. Nałożyć 200 μl roztworu przeciwciała cTnT na długość każdego szkiełka. Inkubować szkiełka poziome O/N w temperaturze 4 °C, w wilgotnej komorze.
  5. Umyj szkiełka w szklanym słoiku Coplin zawierającym 50 ml 1x PBS w temperaturze RT przez 5 minut, trzykrotnie.
  6. Przygotować roztwór przeciwciała anty-króliczego-568 (1:500), rozcieńczając 0,5 μl przeciwciała anty-królika-568 w 250 μl roztworu blokującego w probówce o pojemności 1,5 ml.
  7. Nałożyć 250 μl roztworu przeciwciała anty-króliczego-568 na długość każdego szkiełka. Inkubować szkiełka poziomo przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, w wilgotnej komorze.
  8. Umyj szkiełka w szklanym słoiku Coplin zawierającym 50 ml 1x PBS w temperaturze RT przez 5 minut, trzykrotnie.
  9. Opcjonalnie: Nanieść 250 μl roztworu roboczego DAPI na długość każdego szkiełka i inkubować szkiełka poziomo przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.
  10. Umyj szkiełka w szklanym słoiku Coplin zawierającym 50 ml 1x PBS w temperaturze RT przez 5 minut, dwukrotnie.

7. Montaż i obrazowanie

  1. Zamontuj szkiełka za pomocą 2–3 kropli podłoża montażowego i szklanego szkiełka nakrywkowego. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia na płasko, O/N, w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.
  2. Przejdź do mikroskopii epifluorescencyjnej lub konfokalnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hybrydyzacja in situ miRNA została zoptymalizowana na mysich odcinkach serca przy użyciu miRNA i U6-snRNA, które służyły odpowiednio jako kontrole negatywne i pozytywne. Barwienie dodatnie jest oznaczone kolorem niebieskim, podczas gdy barwienie ujemne jest wskazywane przez brak rozwoju koloru (Rysunek 1A-1B). Ekspresję miRNA-182 specyficzną dla kardiomiocytów oceniano w odcinkach serca myszy kontrolnych i myszy z nadekspresją PlGF. Myszy z tr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykrywanie transkryptu miRNA można osiągnąć za pomocą różnych technik, które różnią się czułością, swoistością i mocą ilościową. Tutaj demonstrujemy sprzężenie hybrydyzacji miRNA in situ z barwieniem immunologicznym i opisujemy protokół, który pozwala na jednoczesną ocenę poziomów ekspresji miRNA i cząsteczek białka na tych samych odcinkach serca. Najpierw pokazujemy, jak przeprowadzić hybrydyzację in situ sond miRNA LNA znakowanych DIG na odcinkach serca zatopionych w parafinie. Następnie opisujemy, ja...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Athanasiosowi Papangelisowi za krytyczne uwagi na temat rękopisu. FM jest wspierany przez Radę ds. Badań nad Biotechnologią i Naukami Biologicznymi (BBSRC; BB/M009424/1). Własność intelektualna jest wspierana przez American Heart Association Scientist Development Grant (17SDG33060002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pierowęglan dietyluSigma AldrichD5758DEPC
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemSigma AldrichP4417PBS
Tween-20Amerykański bioanalitycznyAB02038niejonowy środek powierzchniowo czynny
HistoclearNational DiagnosticsHS-200
Proteinaza K, rekombinowana, klasa PCRSigma Aldrich3115879001ProK
ParaformaldehydSigma AldrichP6148PFA
Chlorek soduThermoFisherS271NaCl
Sześciowodny chlorek magnezuThermoFisherM33MgCl2
TrisSigma AldrichT6066
Roztwór kwasu solnego, 1 NThermoFisherSA48HCl
Roztwór kwasu solnego, 12 NThermoFisherS25358HCl
1-metyloimidazolSigma Aldrich336092
chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N′-etylokarbodimiduSigma Aldrich39391EDC
Roztwór nadtlenku wodoru H2O2Sigma Aldrich216763H2O2
Dwuwodny cytrynian trisodowySigma AldrichS1804Cytrynian sodu
miRCURY LNA miRNA ISH Zestaw buforowy (FFPE)Qiagen339450mieszanie miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 sonda detekcyjnaQIagenYD006157015'-DIG i 3'-DIG znakowany
chlorowodorek lewamizoluSigma Aldrich31742
Albumina surowicy bydlęcejSigma AldrichA9647BSA
NBT/BCIP TabletkiSigma Aldrich11697471001NBT-BCIP
Chlorek potasuThermoFisherP217KCl
Roztwór DAPI (1 mg / ml)ThermoFisher62248DAPI
Szkiełko nakrywkowe szklaneThermoFisher12-545ESzkiełko nakrywkowe
szklane Szkiełko nakrywkowe z tworzywa sztucznegoGrace Bio-LabsHS40 22mmX40mmX0,25mmSzkiełko nakrywkowe bez RNA
Anty-Digoxigenin-AP, fragmenty Fab PrzeciwciałoSigma Aldrich11093274910DIG
Hydrofobowy długopis barierowyVector LaboratoriesH-4000Pap
pen Przeciwciało przeciw sercowej troponinie T PrzeciwciałoAbcamab92546cTnT
Kozie przeciwciało drugorzędowe anty-królicze IgG (H + L) wchłonięte krzyżowo, Alexa Fluor 568ThermoFisherA-11011przeciwciało anty-królicze-568
Pożywka montażowa fluorescencyjna DakomontażoweDAKOS3023
Surowica owczaSigma AldrichS3772
Surowica koziaSigma AldrichG9023
Dejonizowany formamidamerykański Piec doAB00600
ThermoFisherUVP HB-1000 Hybridizer
Podłoże hybrydyzacji bioanalitycznej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  2. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
  3. Hutvagner, G., Zamore, P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science. 297, 2056-2060 (2002).
  4. Krol, J., et al. Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design. Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).
  5. Lim, L. P., Glasner, M. E., Yekta, S., Burge, C. B., Bartel, D. P. Vertebrate microRNA genes. Science. 299, 1540(2003).
  6. Tian, T., Wang, J., Zhou, X. A review: microRNA detection methods. Organic and Biomolecular Chemistry. 13, 2226-2238 (2015).
  7. Fineberg, S. K., Kosik, K. S., Davidson, B. L. MicroRNAs potentiate neural development. Neuron. 64, 303-309 (2009).
  8. Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell stem cell. 2, 219-229 (2008).
  9. Houbaviy, H. B., Murray, M. F., Sharp, P. A. Embryonic stem cell-specific MicroRNAs. Developmental cell. 5, 351-358 (2003).
  10. Kasper, D. M., et al. MicroRNAs Establish Uniform Traits during the Architecture of Vertebrate Embryos. Developmental cell. 40, 552-565 (2017).
  11. Liu, N., Olson, E. N. MicroRNA regulatory networks in cardiovascular development. Developmental cell. 18, 510-525 (2010).
  12. Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
  13. Hartig, S. M., Hamilton, M. P., Bader, D. A., McGuire, S. E. The miRNA Interactome in Metabolic Homeostasis. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 26, 733-745 (2015).
  14. Ying, W., et al. Adipose Tissue Macrophage-Derived Exosomal miRNAs Can Modulate In Vivo and In Vitro Insulin Sensitivity. Cell. 171, 372-384 (2017).
  15. Perkins, D. O., et al. microRNA expression in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia and schizoaffective disorder. Genome biology. 8, R27(2007).
  16. Miller, B. H., et al. MicroRNA-132 dysregulation in schizophrenia has implications for both neurodevelopment and adult brain function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 3125-3130 (2012).
  17. Xu, B., Hsu, P. K., Stark, K. L., Karayiorgou, M., Gogos, J. A. Derepression of a neuronal inhibitor due to miRNA dysregulation in a schizophrenia-related microdeletion. Cell. 152, 262-275 (2013).
  18. Hu, Y., Ehli, E. A., Boomsma, D. I. MicroRNAs as biomarkers for psychiatric disorders with a focus on autism spectrum disorder: Current progress in genetic association studies, expression profiling, and translational research. Autism research : official journal of the International Society for Autism Research. 10, 1184-1203 (2017).
  19. Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates microRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
  20. Ikeda, S., et al. Altered microRNA expression in human heart disease. Physiological genomics. 31, 367-373 (2007).
  21. Mann, M., et al. An NF-kappaB-microRNA regulatory network tunes macrophage inflammatory responses. Nature Communications. 8, 851(2017).
  22. O'Connell, R. M., et al. MicroRNA-155 promotes autoimmune inflammation by enhancing inflammatory T cell development. Immunity. 33, 607-619 (2010).
  23. Chan, E., Prado, D. E., Weidhaas, J. B. Cancer microRNAs: from subtype profiling to predictors of response to therapy. Trends in Molecular Medicine. 17, 235-243 (2011).
  24. He, L., et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature. 447, 1130-1134 (2007).
  25. Kloosterman, W. P., Plasterk, R. H. The diverse functions of microRNAs in animal development and disease. Developmental cell. 11, 441-450 (2006).
  26. Li, N., et al. miR-182 Modulates Myocardial Hypertrophic Response Induced by Angiogenesis in Heart. Science Reports. 6, 21228(2016).
  27. Meerson, F. Z. Compensatory hyperfunction of the heart and cardiac insufficiency. Circulation Research. 10, 250-258 (1962).
  28. Tardiff, J. C. Cardiac hypertrophy: stressing out the heart. Journal of Clinical Investigation. 116, 1467-1470 (2006).
  29. Burchfield, J. S., Xie, M., Hill, J. A. Pathological ventricular remodeling: mechanisms: part 1 of 2. Circulation. 128, 388-400 (2013).
  30. Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 135, e146-e603 (2017).
  31. Pena, J. T., et al. miRNA in situ hybridization in formaldehyde and EDC-fixed tissues. Nature Methods. 6, 139-141 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

MicroRNA DetectionProtein ImmunostainingCardiac Troponin TDigoxigenin Labeled ProbeLocked Nucleic AcidAlkaline Phosphatase AssayFluorescent StainingTissue Section Preparation

Powiązane artykuły