Artykuł metodologiczny
* These authors contributed equally
Przedstawiamy protokół do wydajnej, masowej i szybkiej chemicznej rewersji konwencjonalnych linii komórek ludzkich o uprzywilejowanej linii pluripotentnych komórek macierzystych (hPSC) w epigenomicznie stabilny naiwny stan pluripotentny przypominający epiblast preimplantacyjny. Metoda ta powoduje zmniejszenie ekspresji genów o uprzywilejowanej linii i znaczną poprawę kierowanej różnicowania wieloliniowego w szerokim zakresie konwencjonalnych linii hPSC.
Naïwe komórki macierzyste ludzkie wielopotencjalne (N-hPSC) o poprawionej funkcjonalności mogą mieć szeroki wpływ w medycynie regeneracyjnej. Celem tego protokołu jest efektywne przywrócenie komórkom macierzystym ludzkim wielopotencjalnym (hPSC) utrzymywanym w warunkach bez pokarmu lub zależnych od pokarmu, stanu podobnego do naïwego z poprawioną funkcjonalnością. Ta chemiczna metoda przywracania do stanu naïwego stosuje klasyczny czynnik hamujący białaczkę (LIF), GSK3β oraz koktajl hamujący MEK/ERK (LIF-2i), uzupełniony tylko o inhibitor tankyrazy XAV939 (LIF-3i). LIF-3i przywraca konwencjonalne hPSC do stabilnego wielopotencjalnego stanu przyjmując biochemiczne, transkrypcyjne i epigenetyczne cechy ludzkiego epiblastu przed implantacją. Metoda LIF-3i wymaga minimalnej manipulacji kulturą komórek i jest wysoce reproduktyjna w szerokim repertuarze ludzkich komórek macierzystych zarodkowych (hESC) i wolnych od transgenów komórek macierzystych wielopotencjalnych indukowanych u ludzi (hiPSC). Metoda LIF-3i nie wymaga kroku re-prime'owania przed różnicowaniem; N-hPSC mogą być różnicowane bezpośrednio z niezwykle wysoką wydajnością i utrzymywać stabilność kariotypowo-epigenomiczną (w tym na loci wyciszonych). Aby zwiększyć uniwersalność metody, konwencjonalne hPSC są najpierw hodowane w koktajlu LIF-3i uzupełnionym o dwie dodatkowe małe cząsteczki, które potencjuje sygnalizację białkowej kinazy A (forskolin) i sonic hedgehog (sHH) (purmorphaminę) (LIF-5i). Ten krótki krok adaptacji LIF-5i znacznie zwiększa początkową ekspansję klonalną konwencjonalnych hPSC i pozwala na późniejsze przywrócenie do stanu naïwego z LIF-3i w ilościach masowych, eliminując potrzebę późniejszego wybierania/subklonowania rzadkich kolonii N-hPSC. Stabilizowane LIF-5i hPSC są następnie utrzymywane tylko w LIF-3i bez potrzeby molekuł przeciw apoptotycznych. Co najważniejsze, rewersja LIF-3i znacząco poprawia funkcjonalną wielopotencjalność szerokiego repertuaru konwencjonalnych hPSC poprzez zmniejszenie ich ekspresji genów zorientowanych na linię komórkową i wymazanie zmienności międzyliniowej kierowanego różnicowania, często obserwowanego między niezależnymi liniami hPSC. Podano reprezentatywne charakterystyki N-hPSC przywróconych LIF-3i, a także zarysowano strategie eksperymentalne do porównania funkcjonalnego izogenicznych hPSC w stanach zorientowanych na linię komórkową vs. podobnych do naïwego.
System kultury 2i (inhibitor MEK/ERK i GSK3β) został pierwotnie opracowany w celu uszlachetnienia heterogenicznych kultur komórek macierzystych zarodkowych myszy (mESC) opartych na surowicy do jednolitego stanu podstawowego pluripotencji podobnego do mysiego epiblastu przedimplantacyjnego1. Jednak 2i nie wspiera stabilnego utrzymania ludzkich linii komórek macierzystych wielopotencjalnych (hPSC)2. Różne złożone małe cząsteczki, czynniki wzrostu uzupełnione i podejścia transgeniczne zostały niedawno zgłoszone jako zdobycie podobnych ludzkich stanów pluripotencjalnych przypominających stan naiwny
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie procedury dotyczące zwierząt przeprowadzano zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami oraz protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Użytkowania (IACUC) Szkoły Medycznej Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.
1. Przygotowanie komórek fibroblastów zarodkowych myszy (MEF) do kultury konwencjonalnej komórek macierzystych ludzkich (hPSC) zależnej od podłoża (medium hESC/MEF) lub naiwnej-powrotnej (medium LIF-3i/MEF)
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ten protokół optymalizuje efektywną rewersję naiwną z LIF-3i zarówno w zależnych od podłoża, jak i niezależnych od podłoża liniach konwencjonalnych komórek pluripotentnych komórek macierzystych człowieka (Rycina 1). Szczegółowy protokół, opisany w niniejszym dokumencie, opisuje sekwencyjną adaptację do LIF-3i, zaczynając od konwencjonalnych warunków komórek pluripotentnych komórek macierzystych człowieka zależnych od podłoża lub niezależnych od podłoża (n.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
System LIF-3i stosuje zmodyfikowaną wersję klasycznego koktajlu do rewersji naiwnych komórek macierzystych mysich 2i1 do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Samoregulacja hPSC (które nie mogą się rozwijać tylko w 2i) jest stabilizowana w LIF-2i poprzez uzupełnienie tego koktajlu inhibitorem tankyrazy XAV939. Hodowla LIF-3i pozwala na masową i efektywną rewersję konwencjonalnych hPSC do stanu pluripotencjalnego przypominającego ludzki epiblast przedimplantacyjny
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Na mocy umowy licencyjnej między Life Technologies a Johns Hopkins University (JHU), Dr. Zambidis ma prawo do udziału w tantiemi odbieranych przez Uniwersytet za licencjonowanie komórek macierzystych. Warunki tej umowy są zarządzane przez JHU zgodnie z jego politykami dotyczącymi konfliktu interesów. Nie zmienia to przestrzegania przez autorów zasad czasopisma dotyczących udostępniania danych i materiałów.
Praca ta była wspierana przez granty od NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein Innovation Award, The Maryland Stem Cell Research Fund (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk Science Forum Award oraz The Moseley Foundation.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugated | BD Biosciences | 561716 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti- TFCP2L1 antibody | Sigma Aldrich | HPA029708 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-beta-Actin antibody | Abcam | ab6276 | use at 1:5000 (Western blot) |
| anti-CD146 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 550315 | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 antibody, APC conjugated | eBioscience | 17-0319-42 | use 2µL per assay (FACS) |
| anti-CD31 microbead kit | Miltenyi Biotec | 130-091-935 | |
| anti-NANOG antibody | Abcam | ab109250 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-NR5A2 antibody | Sigma Aldrich | HPA005455 | use at a 1:100 dilution (immunostainings) |
| anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibody | Cell Signaling | 4695 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibody | Cell Signaling | 4370 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibody | Cell Signaling | 9145 | use at 1:1000 (Western blot) |
| anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylated | Agilent | E0432 | use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings) |
| anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated | R&D System | FAB1435A | use 5µL per assay (FACS) |
| anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugated | R&D System | NLLC1435G | use at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-STAT3 antibody | Cell Signaling | 9139 | use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein |
| anti-STELLA/DPPA3 antibody | Millipore | MAB4388 | use at a 1:50 dilution (immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated | R&D System | NLLC4770R | use at a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0068 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugated | Stemgent | 09-0069 | use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings) |
| anti-TRA1-60 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560193 | use 10µL per assay (FACS) |
| anti-TRA1-81 antibody, PE conjugated | BD Biosciences | 560161 | use 10µL per assay (FACS) |
| APEL2-Li | StemCell Technologies | 5271 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3311 | |
| CellAdhere dilution buffer | StemCell Technologies | 7183 | dilutent for Vitronectin XF™ matrix |
| CF1 mouse | Charles river | 023 | |
| CHIR99021 | R&D System | L5283 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| confocal microscope system | Zeiss | LSM 510 | |
| cord blood CD34+ derived iPSC line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | also referred as 6.2 line |
| Corning Costar tissue culture-treated 6-well plates | Corning | 3506 | |
| Countess cell counting chamber slide | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Countess automated cell counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| DMSO (dimethyl sulfoxide) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| DR4 mouse | The Jackson Laboratory | 3208 | |
| Essential 8 (E8) medium | StemCell Technologies | 5940 | |
| Fetal bovin serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | SH30071.03 | |
| Forskolin | Stemgent | 04-0025 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Gelatin (porcine) | Sigma Aldrich | G1890-100G | resuspend in water and sterilize with an autoclave |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828-028 | |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| mTeSR1 medium | StemCell Technologies | 85850 | |
| Nalgene cryogenic vials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Fisher Scientific | 154534 | |
| Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% in PBS | USB Corporation | 19943 | |
| PD0325901 | Sigma Aldrich | PZ0162 | reconstitute at 100mM in DMSO |
| Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Biological Industries | 02-023-1A | |
| Purmorphamine | Stemgent | 04-0009 | reconstitute at 10mM in DMSO |
| recombinant human Activin A | Peprotech | AF-120-14E | |
| recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4 | Peprotech | 120-05ET | resupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS |
| recombinant human FGF-basic (bFGF) | Peprotech | 1 |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie