Artykuł metodologiczny

Chemiczna rewersja konwencjonalnych ludzkich komórek pluripotentnych do stanu naiwnego z poprawioną wieloliniową zdolnością do różnicowania

9.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57921

⸱

10 czerwca 2018

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół do wydajnej, masowej i szybkiej chemicznej rewersji konwencjonalnych linii komórek ludzkich o uprzywilejowanej linii pluripotentnych komórek macierzystych (hPSC) w epigenomicznie stabilny naiwny stan pluripotentny przypominający epiblast preimplantacyjny. Metoda ta powoduje zmniejszenie ekspresji genów o uprzywilejowanej linii i znaczną poprawę kierowanej różnicowania wieloliniowego w szerokim zakresie konwencjonalnych linii hPSC.

Streszczenie

Naïwe komórki macierzyste ludzkie wielopotencjalne (N-hPSC) o poprawionej funkcjonalności mogą mieć szeroki wpływ w medycynie regeneracyjnej. Celem tego protokołu jest efektywne przywrócenie komórkom macierzystym ludzkim wielopotencjalnym (hPSC) utrzymywanym w warunkach bez pokarmu lub zależnych od pokarmu, stanu podobnego do naïwego z poprawioną funkcjonalnością. Ta chemiczna metoda przywracania do stanu naïwego stosuje klasyczny czynnik hamujący białaczkę (LIF), GSK3β oraz koktajl hamujący MEK/ERK (LIF-2i), uzupełniony tylko o inhibitor tankyrazy XAV939 (LIF-3i). LIF-3i przywraca konwencjonalne hPSC do stabilnego wielopotencjalnego stanu przyjmując biochemiczne, transkrypcyjne i epigenetyczne cechy ludzkiego epiblastu przed implantacją. Metoda LIF-3i wymaga minimalnej manipulacji kulturą komórek i jest wysoce reproduktyjna w szerokim repertuarze ludzkich komórek macierzystych zarodkowych (hESC) i wolnych od transgenów komórek macierzystych wielopotencjalnych indukowanych u ludzi (hiPSC). Metoda LIF-3i nie wymaga kroku re-prime'owania przed różnicowaniem; N-hPSC mogą być różnicowane bezpośrednio z niezwykle wysoką wydajnością i utrzymywać stabilność kariotypowo-epigenomiczną (w tym na loci wyciszonych). Aby zwiększyć uniwersalność metody, konwencjonalne hPSC są najpierw hodowane w koktajlu LIF-3i uzupełnionym o dwie dodatkowe małe cząsteczki, które potencjuje sygnalizację białkowej kinazy A (forskolin) i sonic hedgehog (sHH) (purmorphaminę) (LIF-5i). Ten krótki krok adaptacji LIF-5i znacznie zwiększa początkową ekspansję klonalną konwencjonalnych hPSC i pozwala na późniejsze przywrócenie do stanu naïwego z LIF-3i w ilościach masowych, eliminując potrzebę późniejszego wybierania/subklonowania rzadkich kolonii N-hPSC. Stabilizowane LIF-5i hPSC są następnie utrzymywane tylko w LIF-3i bez potrzeby molekuł przeciw apoptotycznych. Co najważniejsze, rewersja LIF-3i znacząco poprawia funkcjonalną wielopotencjalność szerokiego repertuaru konwencjonalnych hPSC poprzez zmniejszenie ich ekspresji genów zorientowanych na linię komórkową i wymazanie zmienności międzyliniowej kierowanego różnicowania, często obserwowanego między niezależnymi liniami hPSC. Podano reprezentatywne charakterystyki N-hPSC przywróconych LIF-3i, a także zarysowano strategie eksperymentalne do porównania funkcjonalnego izogenicznych hPSC w stanach zorientowanych na linię komórkową vs. podobnych do naïwego.

Wprowadzenie

System kultury 2i (inhibitor MEK/ERK i GSK3β) został pierwotnie opracowany w celu uszlachetnienia heterogenicznych kultur komórek macierzystych zarodkowych myszy (mESC) opartych na surowicy do jednolitego stanu podstawowego pluripotencji podobnego do mysiego epiblastu przedimplantacyjnego1. Jednak 2i nie wspiera stabilnego utrzymania ludzkich linii komórek macierzystych wielopotencjalnych (hPSC)2. Różne złożone małe cząsteczki, czynniki wzrostu uzupełnione i podejścia transgeniczne zostały niedawno zgłoszone jako zdobycie podobnych ludzkich stanów pluripotencjalnych przypominających stan naiwny2. Jednak wiele z "naiwnych" stanów stworzonych tymi metodami wykazywało również niestabilność kariotypów, wady epigenomowe (np. globalna utrata rodzicowskiego imprintingu genomowego) lub upośledzone potencjały różnicowania.

Natomiast koktajl potrójnej chemicznej inhibicji sygnałowania GSK3β, ERK i tankyrazy oraz czynnik hamujący białaczki (LIF-3i) był wystarczający do stabilnej naiwnej rewersji szerokiego repertuaru konwencjonalnych linii hPSC3. Nawrócone na LIF-3i naiwne hPSC (N-hPSC) utrzymywały normalne kariotyp i zwiększały ekspresję genów epiblastu przedimplantacyjnego specyficznych dla stanu naiwnego u ludzi (np. NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17, TFCP2L1). Rewersja LIF-3i nadała również hPSC szereg cech molekularnych i biochemicznych unikalnych dla wielopotencjalności naiwnej podobnej do mESC, w tym zwiększone fosforylowane sygnałowanie STAT3, zmniejszone fosforylację ERK, globalną hipometylację 5-metylocytozyny CpG, genomową demetylację CpG w promotorach genów komórek macierzystych zarodkowych (ESC) i dominujące odległe użycie enhancera OCT4. Co więcej, w porównaniu z innymi metodami rewersji naiwnej, które prowadziły do nieprawidłowo hipometylowanych genomowych locus imprintowanych, nawrócone na LIF-3i N-hPSC nie wykazywały systematycznej utraty imprintowanych wzorców CpG lub utraty ekspresji metylotransferazy DNA (np. DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.

Bezpośrednia kultura LIF-3i szerokiego wachlarza konwencjonalnych ludzkich komórek macierzystych zarodkowych (hESC) i ludzkich komórek macierzystych wielopotencjalnych indukowanych (hiPSC) hodowane na feederach lub warunkach bez feederów E8 osiągnęła szybkie i masowe odwrócenie do stanu naiwnego przypominającego epiblast. Jednak bezpośrednia naiwna rewersja LIF-3i może być nieefektywna w niektórych niestabilnych konwencjonalnych liniach hPSC z powodu wrodzonych różnic genomowych i związanych z linią plemienną zmienności wynikających z genetycznie zróżnicowanego pochodzenia donorów.

Dlatego, aby poszerzyć przydatność metody LIF-3i, opracowano i przedstawiono tutaj stopniową optymalizację, która pozwala na uniwersalną naiwną rewersję z prawie każdą konwencjonalną linią hESC lub wolną od transgenów linią hiPSC hodowanych na feederach. Ta uniwersalna metoda naiwnej rewersji stosuje początkowy tymczasowy krok kultury w konwencjonalnych hPSC, która uzupełnia koktajl LIF-3i o dwa dodatkowe małe cząsteczki (LIF-5i), które wzmacniają sygnałowanie kinazy białkowej A (forskolin) i sonic hedgehog (sHH) (purmorphaminę). Jeden początkowy przebieg konwencjonalnych hPSC w LIF-5i przystosowuje je do kolejnej stabilnej rewersji LIF-3i w dużych ilościach. Początkowa adaptacja LIF-5i znacząco zwiększa początkową klonalną proliferację jednokomórkowych konwencjonalnych hPSC hodowanych na E8 lub feederach (przed ich kolejnym stabilnym, ciągłym przebiegom w LIF-3i). Konwencjonalne linie hPSC zaadaptowane najpierw do jednego przebiegu w LIF-5i tolerują następnie masowe klonalne przebiegową naiwnie odwróconych komórek w warunkach LIF-3i, co eliminuje konieczność wybierania i subklonowania rzadkich stabilnych kolonii lub rutynowego stosowania anty-apoptotycznych cząsteczek lub inhibitorów Rho-skojarzonej białkowej kinazy (ROCK).

Metoda LIF-3i została pomyślnie zastosowana do stabilnego ekspandowania i utrzymywania szerokiego repertuaru ponad 30 niezależnych, genetycznie zróżnicowanych konwencjonalnych linii hPSC przez ponad 10-30 przebiegów za pomocą metod nieswoistych enzymatycznych lub enzymatycznych, bez występowania indukcji chromosomalnych lub epigenomowych anomalii, w tym anomalii w locus genów imprintowanych. Dodatkowo, sekwencyjna kultura LIF-5i/LIF-3i jest jedyną metodą naiwnej rewersji, która dotychczas została zgłoszona, która poprawia funkcjonalną pluripotencję szerokiego repertuaru konwencjonalnych linii hPSC, zmniejszając ich ekspresję genów związanych z linią i dramatycznie poprawiając ich wielopotacyjną potencjał różnicowania. Metoda naiwnej rewersji LIF-3i eliminuje wrodzoną zmienność międzyliniową różnicowania konwencjonalnych linii hPSC związanych z linią i będzie miała dużą przydatność w zastosowaniach medycyny regeneracyjnej i terapii komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt przeprowadzano zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami oraz protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Użytkowania (IACUC) Szkoły Medycznej Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa.

1. Przygotowanie komórek fibroblastów zarodkowych myszy (MEF) do kultury konwencjonalnej komórek macierzystych ludzkich (hPSC) zależnej od podłoża (medium hESC/MEF) lub naiwnej-powrotnej (medium LIF-3i/MEF)

  1. Zakupu lub przygotowanie w warunkach domowych dostaw MEF podłoża z niską liczbą pokoleń z embrionów myszy CF1 lub hybryd CF1 x DR4 E13.5 zgodnie z opublikowanymi protokołami4.
    1. Kriokonserwacja MEF nisko pokoleniowych (p1-p2) przed (dla długotrwałego przechowywania) lub po (na okres do 6 miesięcy) napromienieniu i przechowywanie w ciekłym azocie jak opisano wcześniej4.
    2. Napromienianie (5000 rad) MEF w masie podstawowym poniżej p5 za pomocą promieniowania γ lub X i przygotowanie alikwotów po 1,5 x 106 komórek na fiolkę na krótkoterminowe przechowywanie (mniej niż 6 miesięcy) w temperaturze -80 °C w zamrażarce ultraniskiej temperatury.
    3. Wysiew od 1,2 x 106 (świeżo napromieniowanych niekriokonserwowanych) do 1,5 x 106 (naporamieniowane kriokonserwowane) MEF na jednej żelatynizowanej płytce 6-dołkowej do przygotowania kultur podłoża, jak opisano poniżej.
  2. Przygotowanie żelatynizowanej 6-dołkowej sterylnej płytki tkankowej z traktowaniem kulturowym poprzez dodanie 1,5 mL sterylnego 0,1% roztworu żelatyny do każdego dołka w biologicznej szafie bezpieczeństwa.
  3. Inkubacja żelatynizowanej płytki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 h lub przez całą noc w laboratoryjnym inkubatorze CO2.
  4. Na następny dzień, rozmrażanie nisko pokoleniowych (np. P2 do P4) MEF zamrożonych w DMSO i napromieniowanych (5000 rad) zgodnie z krokami wskazanymi poniżej.
    UWAGA: MEF nie napromieniowany należy również rozmrozić, rozwinąć i napromieniować bezpośrednio przed użyciem.
  5. Umieszczenie zamrożonego alikwotu MEF w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Po rozmrożeniu, sterylizacja tuby za pomocą etanolu i natychmiastowe rozcieńczenie kryoprotektora DMSO co najmniej 10-krotnie za pomocą medium MEF (Tabela 1) w szafie bezpieczeństwa biologicznego (np. przeniesienie 1 mL alikwotu DMSO-MEF do 9 mL medium MEF w sterylnej 15 mL stożkowej fiolce).
  6. Centrifugowanie rozcieńczonych komórek MEF z siłą 200 x g przez 5 min w sterylnych 15 mL stożkowych fiolkach.
  7. W szafie bezpieczeństwa biologicznego, aspiracja i odrzucenie nadkomórkowego surowiczego płynu, i ponowne zawieszenie pelletu komórek w 1-2 mL świeżego medium MEF.
  8. Delikatne odrzucenie roztworu żelatyny i dodanie 2 mL MEF zawieszonego w medium MEF do każdego dołka żelatynizowanej 6-dołkowej płytki, jak wskazano powyżej. Liczenie komórek MEF i wysiew 1,2 x 106 (świeżo napromieniowanych niekriokonserwowanych) lub 1,5 x 106 (naporamieniowane kriokonserwowane) MEF na jednej żelatynizowanej 6-dołkowej płytce.
    UWAGA: Wszystkie płytki do hodowli komórek, które są przenoszone z inkubatora CO2 do szafy bezpieczeństwa biologicznego, mogą być delikatnie przetarcia za pomocą papieru spryskiwanego etanolem, ale nie należy bezpośrednio spryskiwać 70% roztworem etanolu, aby uniknąć rozprzestrzeniania się etanolu w dołkach.
  9. Inkubacja płytek MEF w temperaturze 37 °C przez noc w laboratoryjnym inkubatorze CO2 (5% CO2, wilgotna atmosfera) w celu umożliwienia adhezji, przed użyciem.

2. Masowa stabilizacja konwencjonalnych kultur hPSC do późniejszej rewersji naiwnej z krótkim etapem adaptacji LIF-5i

  1. Walidacja wszystkich konwencjonalnych linii hPSC pod kątem posiadania normalnego kariotyp z wykorzystaniem metody G-banding, przed rozpoczęciem rewersji LIF-5i/LIF-3i.
    UWAGA: Rewersja LIF-3i konwencjonalnych linii hPSC z wysokim pokoleniem (np. P>40-50) powinna być unikaną, ponieważ te kultury mogą już zawierać aberracje genomowe, które mogą negatywnie wpłynąć na stabilną, wydajną i masową rewersję LIF-3i pobudzonych, konwencjonalnych linii hPSC.
  2. Utrzymywanie i rozwijanie konwencjonalnych kultur hPSC z zweryfikowanymi normalnymi kariotypami w systemie kultur opartym na MEF (jak opisano w Sekcji 1), lub systemie kultur bez podłoża (zgodnie z preferencjami badacza).
    UWAGA: Zarówno kultury współzależne hPSC/MEF (np. medium hESC (Tabela 1</

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ten protokół optymalizuje efektywną rewersję naiwną z LIF-3i zarówno w zależnych od podłoża, jak i niezależnych od podłoża liniach konwencjonalnych komórek pluripotentnych komórek macierzystych człowieka (Rycina 1). Szczegółowy protokół, opisany w niniejszym dokumencie, opisuje sekwencyjną adaptację do LIF-3i, zaczynając od konwencjonalnych warunków komórek pluripotentnych komórek macierzystych człowieka zależnych od podłoża lub niezależnych od podłoża (n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

System LIF-3i stosuje zmodyfikowaną wersję klasycznego koktajlu do rewersji naiwnych komórek macierzystych mysich 2i1 do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Samoregulacja hPSC (które nie mogą się rozwijać tylko w 2i) jest stabilizowana w LIF-2i poprzez uzupełnienie tego koktajlu inhibitorem tankyrazy XAV939. Hodowla LIF-3i pozwala na masową i efektywną rewersję konwencjonalnych hPSC do stanu pluripotencjalnego przypominającego ludzki epiblast przedimplantacyjny

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Na mocy umowy licencyjnej między Life Technologies a Johns Hopkins University (JHU), Dr. Zambidis ma prawo do udziału w tantiemi odbieranych przez Uniwersytet za licencjonowanie komórek macierzystych. Warunki tej umowy są zarządzane przez JHU zgodnie z jego politykami dotyczącymi konfliktu interesów. Nie zmienia to przestrzegania przez autorów zasad czasopisma dotyczących udostępniania danych i materiałów.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez granty od NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein Innovation Award, The Maryland Stem Cell Research Fund (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk Science Forum Award oraz The Moseley Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugatedBD Biosciences561716use 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibodySigma AldrichHPA029708use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibodyAbcamab6276use at 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated BD Biosciences550315use 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugatedeBioscience17-0319-42use 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kitMiltenyi Biotec130-091-935
anti-NANOG antibodyAbcamab109250use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibodySigma AldrichHPA005455use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibodyCell Signaling4695use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibodyCell Signaling4370use at 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibodyCell Signaling9145use at 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylatedAgilentE0432use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated R&D SystemFAB1435Ause 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugatedR&D SystemNLLC1435Guse at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibodyCell Signaling9139use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-STELLA/DPPA3 antibodyMilliporeMAB4388use at a 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated R&D SystemNLLC4770Ruse at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugatedStemgent09-0068use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugatedStemgent09-0069use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugatedBD Biosciences560193use 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugatedBD Biosciences560161use 10µL per assay (FACS)
APEL2-LiStemCell Technologies5271
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA3311
CellAdhere dilution bufferStemCell Technologies7183dilutent for Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouseCharles river023
CHIR99021R&D SystemL5283reconstitute at 100mM in DMSO
confocal microscope systemZeissLSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC lineThermo Fisher ScientificA18945also referred as 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well platesCorning3506
Countess  cell counting chamber slideThermo Fisher ScientificC10228
Countess automated cell counterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific11995-065
DMEM-F12Thermo Fisher Scientific11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide)Sigma AldrichD2650
DR4 mouseThe Jackson Laboratory3208
Essential 8 (E8) mediumStemCell Technologies5940
Fetal bovin serum (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30071.03
ForskolinStemgent04-0025reconstitute at 100mM in DMSO
Gelatin (porcine)Sigma AldrichG1890-100Gresuspend in water and sterilize with an autoclave
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828-028
L-Glutamine (100X)Thermo Fisher Scientific25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
mTeSR1 mediumStemCell Technologies85850
Nalgene cryogenic vialsThermo Fisher Scientific5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide SystemFisher Scientific154534
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% in PBSUSB Corporation 19943
PD0325901Sigma AldrichPZ0162reconstitute at 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
Phosphate buffered saline (PBS)Biological Industries02-023-1A
PurmorphamineStemgent04-0009reconstitute at 10mM in DMSO
recombinant human Activin APeprotechAF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4Peprotech120-05ETresupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human FGF-basic (bFGF)Peprotech1

Bibliografia

  1. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  2. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
  3. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
  4. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854(2012).
  5. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  6. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).
  7. Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203(2014).
  8. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293(2011).
  9. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), 42838(2012).
  10. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  11. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).
  12. Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).
  13. Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).
  14. Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
  15. Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
  16. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  17. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
  18. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
  19. Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
  20. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
  21. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
  22. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
  23. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Naiwne pluripotencjalne kom rki macierzystemetoda LIF 3iludzkie embrionalne kom rki macierzysteindukowane pluripotencjalne kom rki macierzystehodowla bez kom rek karmiaj cychpasa owanie kom rekbarwienie immunofluorescencyjneanaliza Western blotr nicowanie w teratoma

Powiązane artykuły