Model osteogenezy rozpraszającej uwagę myszy

Summary

Prezentujemy model osteogenezy rozproszenia kości piszczelowej myszy opracowany przy użyciu specjalnie wykonanego dystraktora. Wykorzystanie myszy jako celu analizy jest korzystne dla postępu badań.

Abstract

Osteogeneza rozproszenia (DO) to zabieg chirurgiczny, który polega na regeneracji tkanki szkieletowej bez przeszczepu komórek. Model DO składa się z następujących trzech faz: fazy utajenia po osteotomii i umiejscowienia dystraktora zewnętrznego; faza rozproszenia, w której oddzielone końce kości są stopniowo i w sposób ciągły rozpraszane; oraz etap konsolidacji. Ten wykonany na zamówienie dystraktor używany do DO składa się z dwóch niekompletnych pierścieni z żywicy akrylowej i rozporowej. Proces został zainicjowany od wykonania formy z silikonowego materiału wyciskowego, a następnie stworzenia dystraktora na zamówienie. Żywicę dentystyczną wlano do szalunku wykonanego z silikonowego materiału wyciskowego i dopuszczono do polimeryzacji w celu wytworzenia niekompletnych pierścieni żywicznych wymaganych dla dystraktora wykonanego na zamówienie. Pierścienie te zostały przymocowane za pomocą rozporowej za pomocą przezroczystej żywicy. Wykonany na zamówienie dystraktor stworzony w ten sposób został przymocowany do kości piszczelowej myszy. Piszczel została przymocowana do urządzenia za pomocą jednej pary igieł 25 G proksymalnie, jednej pary igieł 27 G dystalnie i żywicy akrylowej. Po okresie opóźnienia wynoszącym 5 dni rozproszenie uwagi zostało zainicjowane z szybkością 0,2 mm/12 h. Wydłużanie kontynuowano przez 8 dni, w wyniku czego uzyskano łączną przerwę wynoszącą 3,2 mm. Myszy zostały złożone w ofierze 4 tygodnie po odwróceniu uwagi. Tworzenie się kości w szczelinie dywersyjnej potwierdzono zarówno za pomocą radiografii, jak i histologii.

Introduction

Osteogeneza rozproszenia (DO) jest uznaną metodą leczenia różnych zaburzeń szkieletowych, takich jak rozbieżności w długości kończyn, wady kostne i deformacje kończyn¹. Ta unikalna strategia leczenia opiera się na "zasadzie napięcia-stresu" zaproponowanej przez Ilizarowa. Metoda wymaga kilku dni na opóźnienie, kilku tygodni na aktywne rozproszenie i kilka miesięcy na konsolidację, aż dojrzała kość zostanie uformowana².

Miejscowe niedotlenienie spowodowane zablokowaniem przepływu krwi^3,4 i stymulacja mechaniczna5^,6 są szczególnie ważne w procesie gojenia DO. Angiogeneza wywołana niedotlenieniem przenosi tlen, składniki odżywcze, czynniki rozpuszczalne i komórki niezbędne do naprawy tkanek lokalnie poprzez przepływ krwi. Stymulacja mechaniczna przez operację przedłużającą powoduje reakcje biologiczne, takie jak różnicowanie mezenchymalnych komórek macierzystych, tworzenie kości, zwapnienie i przebudowę. Seryjne leczenie DO pozwala na tworzenie nie tylko tkanek twardych, ale także tkanek miękkich, w tym nerwów, mięśni, naczyń krwionośnych i tkanek skóry, bez konieczności przeszczepu komórek macierzystych. Dlatego model DO jest uważany za doskonały model do analizy regeneracji różnych tkanek.

Króliki i psy są najczęściej wykorzystywanymi zwierzętami w podstawowych badaniach dla DO; jednak dostępnych jest niewiele narzędzi analitycznych dla tych zwierząt. Wykorzystanie mysiego modelu DO ułatwia bardziej szczegółową analizę. Szczególnie nadaje się do eksperymentów z wykorzystaniem myszy z nokautem. Jednak w przypadku używania myszy jako zwierzęcia doświadczalnego należy stworzyć urządzenie przedłużające. Tutaj prezentujemy model DO piszczelowej myszy opracowany przy użyciu niestandardowego dystraktora stworzonego przy użyciu narzędzia i techniki laboratorium dentystycznego, która została wykorzystana w poprzednim badaniu.

Protocol

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania naszej instytucji. Wysterylizuj wszystkie narzędzia przed zabiegiem.

1. Przygotowanie formy do stworzenia dystraktora na zamówienie

1. Wykonaj dwa niekompletne pierścienie (średnica zewnętrzna, 20 mm; średnica wewnętrzna, 10 mm), które są częścią dystraktora, z jednym arkuszem wosku parafinowego (145 mm x 74 mm) za pomocą rzeźbiarki Evans.
   1. Zrób 4 takie same kawałki. Użyj szpatułki do wosku podgrzanej palnikiem gazowym. Ułóż cztery pierścienie w stos na grubość 5 mm. Zapewnij miejsce na rozporową i igłę, odpowiednio 8 mm x 2 mm i 5 mm x 2 mm za pomocą rzeźbiarki do wosku Evans (rysunki 1A, 1B).
2. Osadź wzory wosku w silikonowym materiale wyciskowym i utwórz formę dla pierścieni z żywicy (Rysunek 1C).
3. Po utwardzeniu silikonowego materiału wyciskowego (około 5 minut w temperaturze pokojowej) należy usunąć wzory wosku.

2. Produkcja dystraktora na zamówienie

1. Nałóż wazelinę cienko i równomiernie na silikonową formę. Wymieszaj 3 g polimeryzacyjnej żywicy dentystycznej i natychmiast wlej ją do silikonowej formy. Ustaw na 5 minut w temperaturze pokojowej (RT).
2. Wyjmij pierścień z żywicy spolimeryzowanej z formy i wypoleruj go za pomocą pręta z węglika spiekanego i mikrosilnika dentystycznego, aby usunąć zadziory (około 1 min). Do każdego dystraktora wykonanego na zamówienie wymagane są dwa pierścienie żywiczne.
   1. Powtórz procedurę, aby utworzyć wymaganą liczbę pierścieni z żywicy (Rysunek 1D).
3. Pozostaw odstęp około 2 mm, aby przymocować pierścienie żywiczne woskiem użytkowym i całkowicie zabezpiecz zewnętrzną część rozporowej przezroczystą żywicą. Ustaw żywicę na 5 minut w temperaturze RT. Po zakończeniu polimeryzacji wyjmij pokrętło rozporowej (Rysunek 1E).

3. Protokół chirurgiczny

1. Użyj 8 tygodniowych samców myszy.
2. Znieczulenie należy wywołać wstrzyknięciem dootrzewnowym chlorowodorku medetomidyny w dawce 0,3 mg/g, midazolamu w dawce 4 mg/kg mc. i winianu butorfanolu w dawce 5 mg/kg masy ciała.
   1. Ostrożnie ogolić i zdezynfekować obszar operacyjny 10% roztworem jodu, a następnie podać 0,5% chlorowodorek lidokainy na prawą kończynę dolną.
3. Wykonaj podłużne nacięcie skóry (o długości około 15 mm) w prawym podudziu za pomocą skalpela nr 15. Dosadnie oddziel leżące poniżej mięśnie, uważając, aby nie usunąć całej okostnej. Podejdź od zewnątrz, aby łatwo dotrzeć do kości strzałkowej. Przetnij kość strzałkową nożyczkami.
4. Chwyć kostkę wąskimi, cienkimi, sterylnymi kleszczami i za pomocą sterylnej igły 27 G wykonaj otwór w kości około 5 mm od pięty. Igła powinna wnikać w skórę, kość i skórę w tej kolejności. Gdy igła wbije się w głąb, odetnij końcówkę i korzeń szczypcami tak, aby igła miała około 15 mm.
   1. Wykonaj kolejny otwór w ten sam sposób, około 2–3 mm proksymalnie. Przytrzymaj wokół kostki i w ten sam sposób przełóż dwie igły 25 G pod kolanem. Po wbiciu igieł odetnij końcówki i korzenie szczypcami (Rysunek 1F).
5. Umieść wykonany na zamówienie dystraktor tak, aby był równoległy do kierunku wysuwania. Przymocuj igły i urządzenie za pomocą wystarczającej ilości żywicy dentystycznej do polimeryzacji, aby wypełnić rowki urządzenia. Poczekaj na zakończenie polimeryzacji (około 5 minut) (Rysunek 1G).
6. Uważaj, aby nie uszkodzić otaczających tkanek. Przeciąć środek trzonu kości piszczelowej za pomocą bardzo cienkiej tarczy tnącej, nakładając roztwór soli fizjologicznej (1–2 ml).
7. Zamknij ranę nylonowym szwem 4-0.
8. Natychmiast po operacji należy podać podskórnie wstrzyknięcia buprenorfiny (0,1 mg/kg) w celu znieczulenia. Buprenorfinę należy kontynuować co 12 godzin do 7. dnia po operacji i w razie potrzeby.

4. Protokół rozproszenia uwagi

UWAGA: Istnieją różne raporty na temat okresu opóźnienia i wskaźnika rozproszenia, ale tutaj pokazane są reprezentatywne protokoły.

1. Po upływie 5 dni opóźnienia rozpocznij rozpraszanie uwagi z szybkością 0,2 mm/12 godzin. Do przedłużenia użyj kołka dołączonego do szybkozłącznej. Przesuń kołek w kierunku żółtej strzałki przymocowanej do przedłużającej (Rysunek 1E).
2. Znieczulenie nie jest konieczne podczas przedłużania. Przytrzymaj ogon małym palcem i dłonią, a następnie zamocuj urządzenie przedłużające palcem wskazującym i kciukiem.
3. Wykonaj wysunięcie (0,2 mm na 1/4 obrotu). Kontynuuj wydłużanie przez 8 dni, co spowoduje, że całkowita przerwa wyniesie 3,2 mm.

5. Analiza

1. Analiza radiograficzna: Po zakończeniu przedłużania oceń regenerację kości za pomocą tomografii komputerowej w znieczuleniu ogólnym, stosując 2,0% izofluranu.
   UWAGA: Jeśli zwrócono uwagę na położenie urządzenia przedłużającego, możliwa jest jego ocena za pomocą prostej radiografii nawet z założonym urządzeniem.
2. Analiza histologiczna: Ostrożnie wyjąć aparat, aby nie spowodować rozproszenia uwagi złamań podczas pobierania próbek. Utrwalić próbkę w 10% neutralnej buforowanej formalinie na 24 godziny w temperaturze pokojowej. Odwapnić roztworem Morse'a (10% cytrynian sodu, 20% kwas mrówkowy) przez noc w temperaturze 4 °C.

Results

Rysunki 1A i 1B przedstawiają niekompletne pierścienie (średnica zewnętrzna, 20 mm; średnica wewnętrzna, 10 mm; grubość, 5 mm) z woskiem parafinowym. Dwa wzory woskowe zostały zatopione w silikonowym materiale wyciskowym i uformowano formę do pierścieni z żywicy (Rysunek 1C). Spolimeryzowaną żywicę natychmiast wlano do tej formy i uzyskano pierścienie żywiczne (Rysunek 1D). Wykonany...

Discussion

Gdy duże zwierzę jest używane jako model eksperymentalny, można użyć gotowego urządzenia przedłużającego i łatwo jest uzyskać dobre utrwalenie i ocenić samą operację wyprostowania oraz wielkość wyprostu. Jednak, gdy mysz jest używana jako model eksperymentalny, konieczne jest opracowanie części lub całości sprzętu. Isefuku i wsp. oraz Tay i wsp. wykonali urządzenie i stworzyli model myszy ^7,8. Carvahjo i wsp. przyjęli metodę polegającą ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wosk parafinowy	YAMAHACHI DENTAL MFG. CO.	-	Do przygotowania formy do pierścieni żywicznych
Labocone putty	GC	Corporation-Do	przygotowania formy do pierścieni żywicznych
Wosk użytkowy	GC	Corporation-Do	przygotowania formy do pierścieni żywicznych
Śruba rozporowa	Ortho Dentaurum	600-301-30	Element dystraktora
na zamówienie Unifast III	GC Corporation	-	Żywica do natychmiastowej polimeryzacji Składnik dystraktora
na zamówienie Ortho Crystal	NISSIN-Przezroczysta		żywica Składnik dystraktora na zamówienie
Igła 25 G	TERUMO	NN-2516R	Do dystraktora na zamówienie
Igła 27 G	TERUMO	NN-2719S	Do mysz ICR dystraktora na zamówienie
	Chubu Kagaku Shizai Corporation-Experimental		zwierzę
Somnopentyl	Kyoritsu Seiyaku-sól		sodowa pentopirbitalu
Izofluran	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	099-06571	Izofluran roztwór do inhalacji