Artykuł metodologiczny

Osadzanie wysp trzustkowych w skrawkach parafinowych

DOI:

10.3791/57931

⸱

29 czerwca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Diabetes Center of Excellence, UMass Medical School, 2Department of Medicine, Saint Vincent Hospital, 3Department of Pathology, Morphology Core, UMass Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania ex vivo wysp trzustkowych są ważne dla badań nad cukrzycą. Istniejące techniki badania hodowanych wysepek w ich natywnej architekturze trójwymiarowej są czasochłonne, nieefektywne i rzadko stosowane. W pracy opisano nową, prostą i wydajną metodę generowania wysokiej jakości skrawków parafinowych całych hodowanych wysepek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty z użyciem izolowanych wysp trzustkowych są ważne dla badań nad cukrzycą, ale wyspy trzustkowe są drogie i mają ograniczoną obfitość. Wysepki zawierają mieszaną populację komórek w ustrukturyzowanej architekturze, która wpływa na funkcję, a ludzkie wyspy trzustkowe są bardzo zróżnicowane pod względem składu typu komórki. Obecnie często stosowane metody badania hodowanych wysp trzustkowych obejmują badania molekularne wykonywane na całych wyspach, wrzucanie do jednego worka różnych typów komórek wysp trzustkowych lub badania mikroskopowe lub badania molekularne na rozproszonych komórkach wysp trzustkowych, zaburzające architekturę wysp trzustkowych. W przypadku badań wysp trzustkowych in vivo cięcie trzustki zatopionej w parafinie jest potężną techniką oceny wyników specyficznych dla komórek w natywnym środowisku trzustki. Badanie wysepek po hodowli przez cięcie parafiny przyniosłoby kilka korzyści: wykrywanie wielu wyników na tych samych wysepkach (potencjalnie nawet na dokładnie tych samych wysepkach, przy użyciu odcinków seryjnych), pomiary specyficzne dla typu komórki oraz utrzymanie natywnych interakcji komórka-komórka wyspa trzustkowa i komórka-podłoże zarówno podczas ekspozycji eksperymentalnej, jak i do analizy. Jednak istniejące techniki osadzania izolowanych wysepek po kulturze są nieefektywne, czasochłonne, podatne na straty materiału i na ogół wytwarzają sekcje z nieodpowiednią liczbą wysepek, aby były przydatne do ilościowego określania wyników. Laboratoria patologii klinicznej są niedostępne i niepraktyczne dla laboratoriów badań podstawowych. Opracowaliśmy ulepszoną, uproszczoną metodę laboratoryjną, która generuje sekcje o solidnym plonie i rozmieszczeniu wysepek. Stałe wysepki są ponownie zawieszane w ciepłym histologicznym żelu agarozowym i pipetowane do płaskiego krążka na standardowym szkiełku podstawowym, tak aby wysepki były rozmieszczone w płaszczyźnie. Po standardowym odwodnieniu i zatopieniu, z tego samego bloku wysepki można wyciąć wiele (10+) odcinków 4 - 5 μm. Za pomocą tej metody można przeprowadzić analizy histologiczne i immunofluorescencyjne na wyspach trzustkowych myszy, szczurów i ludzi. Jest to skuteczne, niedrogie i oszczędzające czas podejście do oceny wyników specyficznych dla typu komórki i nienaruszonej architektury z hodowanych wysepek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wysepki trzustkowe Langerhansa, jedyne źródło krążącej insuliny, są kluczową tkanką dla badaczy zajmujących się cukrzycą. Z dowolnego organizmu, wysepki mają różną wielkość, częstotliwość typów komórek i architekturę1,2,3. Konwencjonalną strategią badania in vivo struktury i składu komórek endokrynnych wysp trzustkowych jest cięcie tkanki trzustki4,5. Ponieważ wyspy trzustkowe stanowią tylko niewielką część całkowitej zawartości komórkowej trzustki, badania molekularne przeprowadza się na izolowanych wyspach. Eksperymenty z hodowlą wysp trzustkowych ex vivo badające reakcję na składniki odżywcze, modulację genów (transfekcję, transdukcję) lub eksperymentalne zabiegi dostarczają ważnych informacji na temat mechanizmów modulujących przeżycie, proliferację i funkcję komórek endokrynnych5,6.

Eksperymenty ex vivo z wyspami trzustkowymi często są analizowane za pomocą badań molekularnych całych wysp trzustkowych lub badań histologicznych lub molekularnych rozproszonych komórek wysp trzustkowych hodowanych w monowarstwie5,6. Analiza molekularna całych wysp trzustkowych wprowadza poważne zastrzeżenie dotyczące mieszania typów komórek, które mogą dawać wyniki fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie po ekstrapolacji na dowolny pojedynczy typ komórek. Dyspersja komórek na szkiełkach nakrywkowych do mikroskopii po hodowli umożliwia pomiar wyników specyficznych dla typu komórki, ale zaburza architekturę wysp trzustkowych, co może zmienić odpowiedź na interwencję i uniemożliwia identyfikację wyników związanych z architekturą. Ponadto na ogół można zmierzyć tylko jeden wynik; Na przykład, aby zmierzyć proliferację komórek beta i śmierć komórek beta w tych samych warunkach, należy przeprowadzić dwa oddzielne eksperymenty. Podejścia te są również ślepe na zmienność między wysepkami, która jest obszarem rosnącego zainteresowania w tej dziedzinie. Sortowanie komórek wysp trzustkowych za pomocą cytometrii przepływowej w badaniach molekularnych specyficznych dla typu komórki lub badań RNA pojedynczej komórki jest eleganckie, ale kosztowne, czasochłonne, ograniczone przez obfitość tkanek, eliminujące architekturę i niezbyt dobrze nadające się do rutynowych analiz hodowli komórkowych5,7. Obrazowanie konfokalne całych wysepek wysepkowych barwionych immunologicznie dostarcza wysokiej jakości danych o nienaruszonej architekturze, ale jest pracochłonne, a dane uzyskane z każdej próbki są ograniczone do wyników możliwych do zidentyfikowania w jednym immunostainingu8.

Możliwość generowania wysokiej jakości sekcji parafiny na całych wysepkach postkulturowych rozwiązałaby wiele z tych problemów. Cenne są kosztowne tkanki wysp trzustkowych o niskiej liczebności pochodzące z unikalnych modeli genetycznych lub od dawców narządów ludzkich, a także status wysp trzustkowych po eksperymentalnych manipulacjach in vivo lub in vitro. Uzyskanie wielu skrawków parafiny z tych samych wysepek pozwoliłoby na przeprowadzenie wielu analiz specyficznych dla typu komórki i nienaruszonej architektury w tym samym eksperymencie.

Istniejące techniki generowania granulek wysepek do podziału są niedoskonałe. Zoptymalizowana histologicznie agaroza to wodny żel o niskiej temperaturze topnienia, który jest szeroko stosowany w przetwarzaniu próbek histologicznych i cytologicznych, w tym małych lub rozdrobnionych próbek tkanek, które są trudne do przetworzenia9. Jednym ze sposobów osadzania wysepek jest zawieszenie wysepek w agarozie w probówce mikrowirówkowej, odwirowanie w celu osadzenia materiału, pobranie korka agarowego, a następnie przetworzenie i osadzenie w celu podziału10,11. Ekstrakcja zestalonej próbki z dna probówki jest czasochłonna i trudna, co prowadzi do sporadycznego rozdrobnienia próbki i ryzyka obrażeń ciała. Wysepki są skoncentrowane w końcówce korka, co prowadzi do nieodpowiedniego rozmieszczenia wysepek w odcinkach uzyskanych tą metodą. Okrągłe dno wtyczki komplikuje osadzanie w taki sposób, że do przekrojenia może zostać przedstawiony obszar ubogi w wysepki. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta prowadzi do niskiego plonu i rozmieszczenia zbitych wysepek w powstałych sekcjach.

Ta nowa metoda jest uproszczonym i ulepszonym podejściem do przygotowania odcinków wysepek. Wysepki są skoncentrowane w małej objętości, a następnie umieszczane na gładkiej powierzchni szkiełka mikroskopowego, tworząc mały dysk, z wysepkami w jednej płaszczyźnie. Krążek Histogel-wyspa trzustkowa jest następnie przetwarzany w celu zatopienia parafiny w skróconym protokole odwadniania i infiltracji ksylenu. Poprzednie podejście, które koncentruje wysepki na dnie rurki do mikrofuge, jest również przeprowadzane jako porównanie. Ta nowa technika poprawia wydajność wysepek na sekcję, rozmieszczenie wysepek w każdej sekcji i zajmuje mniej czasu na przeniesienie bloków wysepek do kaset. Technika ta jest przydatna dla biologów wysp trzustkowych lub innych naukowców badających małe fragmenty tkanki, którzy chcą zmaksymalizować produktywne wykorzystanie tkanki o niskiej liczebności poprzez pomiar wielu wyników na jednej próbce w jej natywnej architekturze tkankowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt UMass Medical School. Badania nad ludzkimi wyspami trzustkowymi zostały uznane przez UMass Institutional Review Board za niekwalifikujące się do przeglądu IRB lub zwolnienia, ponieważ nie obejmują wykorzystania ludzi.

1. Izolacja i kultura wysepek

  1. Odizoluj wyspy trzustkowe i oddziel je od zanieczyszczonej tkanki zewnątrzwydzielniczej i przewodowej wybraną metodą.
    UWAGA: Ta metoda została zoptymalizowana przy użyciu wysepek wyizolowanych przez insuflację przewodową kolagenazy i separację Ficoll12 (gryzoń) lub wysepek po wysyłce ze Zintegrowanego Programu Dystrybucji Wysepek (IIDP13; człowiek). Wysepki zostały ręcznie pobrane za pomocą mikropipety P200.
  2. Aby zoptymalizować morfologię wysp trzustkowych, pozwól im zregenerować się przez noc w 10 ml kompletnej pożywki dla wysp trzustkowych (RPMI z 10% FBS, penicyliną/streptomycyną i 5,5 mmol/l glukozy) w wilgotnej komorze zawierającej 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Chociaż ten krok nie jest wymagany do uzyskania sekcji, wysepki są bardziej nienaruszone po okresie rekonwalescencji (patrz Rysunek 2).

2. Fiksacja wysepek

  1. Używając końcówki P200 o niskim poziomie wiązania, ręcznie wybierz około 250 odpowiedników wysepek (IEQ)13 za pomocą skalibrowanej siatki pod mikroskopem stereoskopowym do 1,5 ml nisko wiążącej probówki mikrofuge. Słabo wiążące końcówki i rurki zmniejszają utratę wysp trzustkowych.
  2. Pozwól, aby wysepki osiadły na dnie rurki do mikrofuge. Usunąć większość supernatantu za pomocą końcówki pipety P200, uważając, aby nie usunąć żadnych wysepek.
  3. Dodaj 1 ml PBS. Odwirować probówkę w wahadłowym wiadrze, odwirować, aż prędkość osiągnie 200 x g, a następnie zatrzymać wirowanie. Usunąć supernatant. Powtórz pranie PBS, w sumie dwa prania.
  4. Dodaj 500 μl 10% roztworu formaliny lub 4% świeżo przygotowanego paraformaldehydu. Ustaw w temperaturze pokojowej przez 30 minut. W przypadku wyników testowanych w tej metodzie te metody fiksacji były nie do odróżnienia. Możliwe może być również krótsze mocowanie; Zaleca się optymalizację czasu fiksacji w celu uzyskania pożądanego rezultatu.
  5. Usuń utrwalacz za pomocą końcówki P200.
  6. Dodaj 1 ml PBS. Odwirować probówkę, aż prędkość osiągnie 200 x g, a następnie zatrzymać wirowanie. Usunąć supernatant. Powtórz pranie PBS, w sumie dwa prania.
  7. Przejdź od razu do następnego kroku.

3. Przygotowanie dysku wysepek (Rysunek 1)

  1. Przy pierwszym użyciu stopić żel (np. Histogel) w temperaturze 70 °C i przygotować porcje w probówkach do mikrofug o pojemności 1,5 ml do długotrwałego przechowywania. Objętość podwielokrotności nie jest krytyczna, ponieważ podwielokrotności można ponownie wykorzystać.
  2. Ogrzać żel (około 100 μl na próbkę) w temperaturze 70 °C, umieszczając probówkę z mikrofugą zawierającą podwielokrotność żelu w bloku grzewczym ustawionym na 70 °C.
  3. Przenieś niebieskie kulki agarozy (10 μl na każdą próbkę) do 1,5 ml czystej probówki do mikrofuge. Dokładnie zawiesić kulki przed pipetowaniem.
    UWAGA: Niebieskie kulki są mieszane z wysepkami, aby pomóc w wizualnej identyfikacji materiału osadzonego w guziku agarozowym i bloku parafiny. Liczba użytych niebieskich koralików nie ma decydującego znaczenia dla wyniku, ale unikaj nadmiernej liczby koralików (>5 razy więcej wysepek), aby umożliwić optymalne rozmieszczenie wysepek w sekcjach.
  4. Umyj niebieskie koraliki dwukrotnie 1 ml PBS. Przy każdym praniu wiruj koraliki przez 1 minutę przy 800 x g. Po drugim przemyciu ponownie zawiesić kulki w (n+2) x 10 μl PBS, gdzie n jest liczbą probówek z próbką; na przykład dla 2 probówek na próbkę objętość PBS do dodania do kulek wyniesie 40 μl.
  5. Odwirować probówkę do mikrodmuchowania zawierającą wysepki (krótkie wirowanie do 200 x g) i usunąć większość supernatantu. Odciąć końcówkę końcówki mikropipety o pojemności 10 μl nożyczkami lub ostrzem i dodać 10 μl kulek do każdej probówki z wysepką, używając czystej końcówki do każdej próbki. Nie mieszać (aby uniknąć zgubienia wysepek).
  6. Odwirować wysepki i kulki (krótkie wirowanie do 200 x g). Usuń jak najwięcej PBS za pomocą nieobciętej końcówki do mikropipet o pojemności 10 μl.
  7. Oznacz szkiełka mikroskopowe w celu identyfikacji próbki. Na każdym szkiełku można przygotować od dwóch do trzech próbek. Umieść szkiełko na ławce w pobliżu bloku grzewczego z podgrzanym żelem. Odetnij końcówki od trzech do pięciu końcówek mikropipet o niskim poziomie wiązania 20 μl na próbkę za pomocą żyletki lub nożyczek. Załaduj dwie mikropipety P20 z odciętymi końcówkami, aby umożliwić szybkie przełączanie z jednej na drugą.
  8. Za pomocą pierwszej mikropipety dodaj 15 - 20 μl ciepłego żelu do rurki z mikrofugami wysepek/kulek; natychmiast wymieszaj, unikając pęcherzyków; i nałóż płynną mieszaninę agaru/wysepek/kulek na szkiełko, aby utworzyć krążek o średnicy <1 cm. Umieść krążek w pobliżu krawędzi szkiełka, pozostawiając miejsce na zewnętrzny pierścień żelowy (następny krok). Stuknij delikatnie w zjeżdżalnię kilka razy, aby osadzić wysepki i koraliki.
  9. Za pomocą drugiej mikropipety dodać 20 μl ciepłego żelu do probówki z próbką. Za pomocą pierwszej mikropipety wymieszaj nowy żel z pozostałymi wysepkami/kulkami, ponownie rozgrzej w bloku grzewczym, jeśli zacznie krzepnąć, a następnie nałóż tę mieszaninę na szkiełko, otaczając oryginalny krążek. Powtarzaj w razie potrzeby, używając dodatkowych wstępnie przyciętych końcówek, aż tarcza osiągnie pożądany rozmiar i grubość.
    UWAGA: Obsługa żelowanej tarczy jest łatwiejsza, jeśli pierścień zewnętrzny jest nieco grubszy. Zazwyczaj wystarczają 3 x 20 μL żelu. Ten krok minimalizuje utratę wysepek przez płukanie rurek i dodaje agarozę ubogą w wysepki na zewnątrz tarczy, aby ułatwić obsługę tarczy.
  10. Przygotuj każdą płytę indywidualnie i uważnie śledź kolejność próbek, jeśli umieszczasz wiele płyt na każdym slajdzie.
  11. Umieść szkiełka na płaskiej powierzchni mokrego lodu, przykrywając, na 10 minut lub do momentu, gdy żel zastygnie. Trudniej jest zsunąć dysk ze szkła, jeśli wyschnie.
  12. Oznacz kasety z tkankami do przetwarzania/osadzania biopsji ołówkiem, po jednej na próbkę. Osusz tylną część szkiełka, aby uniknąć zamoczenia niebieskiego papieru.
  13. Używając krawędzi żyletki, delikatnie popchnij krążek w każdym kierunku, aby uwolnić go od szkła. Gdy łatwo się przesuwa, powoli wepchnij krążek ze szkiełka mikroskopowego na niebieską bibułkę. Umieść dysk płaską stroną do dołu, bezpośrednio na papierze.
  14. Trzymając dysk płasko, złóż papier wokół dysku, aby zapobiec jego przesuwaniu się, umieść dysk w złożonym papierze w kasecie i zamknij kasetę. Jeśli krążek nie zsunie się czysto ze szkła, dodaj więcej żelu i/lub umieść szkiełko z lodem na kilka minut.
  15. Zanurz kasetę w PBS w zlewce. Proces zatapiania parafiny tego samego dnia w celu uzyskania optymalnej morfologii.

4. Osadzanie parafiny

UWAGA: Przetwarzaj krążki żelu z wysp trzustkowych na bloki parafinowe, używając skróconej serii odwodnień, jak opisano poniżej. Ta technika została zoptymalizowana przy użyciu automatycznego procesora, ale ręczne przetwarzanie powinno dać podobne wyniki.

  1. Zanurz kasety w 85% etanolu na 15 minut.
  2. Zanurz kasety w 95% etanolu na 15 minut.
  3. Zanurz kasety w 100% etanolu na 15 minut. Powtórz dwa razy, w sumie trzy prania.
  4. Zanurz kasety w ksylenie na 15 minut. Powtórz dwa razy, w sumie trzy prania.
  5. Zanurz kasety w stopionej parafinie na 10 minut.
  6. Przenieś kasety do świeżej stopionej parafiny na 10 - 30 minut.
  7. Ostrożnie otwórz kasetę i rozpakuj niebieski papier. Wyjmij krążek żelu, zwracając uwagę na płaską powierzchnię, która znajdowała się naprzeciwko papieru. Osadź tarczę w małej formie, płaską (zawierającą wysepkę) powierzchnią do dołu, równolegle do powierzchni cięcia. W przypadku wtyczki ostrożnie wyjmij ją z kasety i umieść w małej foremce z końcówką skierowaną w stronę powierzchni cięcia.

5. Cięcie i barwienie parafiny

  1. Etykietuj slajdy sekwencyjnie, jeśli wymagane są sekcje seryjne.
  2. Zleć wycięcie skrawków parafiny o grubości 5 μm przez doświadczonego histotechnologa. Aby zmaksymalizować wydajność, zapisz wszystkie sekcje zawierające materiał. Ogólnie rzecz biorąc, zebranie 20 sekcji pozwala na uchwycenie większości materiału.
  3. Przechowywać sekcje w temperaturze pokojowej. Skrawki są podatne na rutynowe barwienie histologiczne (np. H&E) i immunofluorescencję (np. insulina, glukagon i DAPI). W razie potrzeby zoptymalizuj wiązanie dla innych antygenów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilustrowany schemat kroków do przygotowania dysku żelowego jest pokazany w Rysunek 1. Ta metoda żelowego dysku daje w wyniku skrawki parafiny, które zawierają wystarczającą liczbę wysepek rozmieszczonych w jednej płaszczyźnie, aby umożliwić miarodajną kwantyfikację wyników. Rysunek 2 pokazuje obrazy powstałych sekcji w małym powiększeniu, aby zilustrować liczbę wysepek uchwyconych na każdej sekcji. Ogólnie rzecz biorąc, >35 wy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta zmodyfikowana metoda zatapiania oparta na żelowych krążkach zapewnia prosty, niedrogi i wydajny sposób generowania wysokiej wydajności wysepek na sekcję. Konstrukcja tarczy żelowej na płaskiej powierzchni szklanej ułatwia rozprowadzanie wysepek w równomiernym rozkładzie na dobrze zdefiniowanym obszarze. Rozłożenie wysepek w płaskim dysku ma tę zaletę, że wiele wysepek znajduje się w płaszczyźnie przekroju, optymalizując wydajność i umożliwiając wykorzystanie mniejszej liczby wysepek. Grubość tarczy można dostosować do...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serdecznie dziękujemy Grupie Biologii Komórki Beta w Centrum Doskonałości UMass Diabetes za pomocne rady i dyskusje. Ludzkie wyspy trzustkowe zostały dostarczone przez finansowany przez NIDDK Zintegrowany Program Dystrybucji Wysp Trzustkowych (IIDP) w City of Hope. Ta praca została sfinansowana przez NIH/NIDDK: R01-DK114686 (LCA), R01-DK105837 (CY), 2UC4DK098085 (IIDP) oraz przez grant American Diabetes Association #1-15-BS-003 (LCA) we współpracy z Zakonem Amarantusa.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml probówka EppendorfNorgen Bioteck CorpP/N 10113 
Zestaw startowy Ranin ClassicShopRanin17008708
Ranin ClassicPipette PR-2ShopRanin17008648
Końcówka do wiązania niskiego (1000 μ L)Genesee Scientific24-430
Końcówka o niskim wiązaniu (200 μ L)Genesee Scientific24-412
Końcówka o niskim wiązaniu (20 μ L)Genesee Scientific24-404
Końcówka o niskim wiązaniu (10 μ L)Genesee Scientific24-401
10% roztwór formalinySigmaHT501128
ParaformaldehydMikroskopia elektronowa Sciences15710-S
Blok grzewczyVWR949312
HistoGelThermo ScientificHG-4000-012
Niebieskie koraliki agarozowe - Affi-gelBio-Rad153-7301
Dulbecco's PBSLife technologies14190-144
Kaseta do przetwarzania tkanekSimportM492-10
Bio-WrapsProcesor tkanek Leica-Surgipath3801090
Citadel 2000Thermo-Shandon LLC
Etanol 200 proofDecon Laboratories, INC2701
KsylenFisher ChemicalX5SK-4
ParafinaMcCormick Scientific39503002
MicrotomeThermo-Shandon LLCFinezja ME+
Przeciwciało insulinoweDAKOA0564
Przeciwciało glukagonoweSigmaG2654
Fluoroshield z DAPISigmaF6057
Alex fluor 594 przeciwciała drugorzędoweTechnologie życiaA11076
Alex fluor 488 przeciwciała drugorzędoweTechnologie życiaA11001

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. Islet architecture: A comparative study. Islets. 1 (2), 129-136 (2009).
  2. Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition. Islets. 2 (3), 135-145 (2010).
  3. Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. Staining protocols for human pancreatic islets. Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).
  4. Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).
  5. Sharma, R. B., et al. Insulin demand regulates β cell number via the unfolded protein response. The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).
  6. Stamateris, R. E., et al. Glucose Induces Mouse β-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor. Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).
  7. Blodgett, D. M., et al. Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
  8. Brissova, M., et al. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).
  9. Joiner, K. S., Spangler, E. A. Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).
  10. Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1. Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).
  11. La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method. Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).
  12. Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).
  13. Olack, B., Omer, A., Richer, B., Weir, G. Integrated Islet Distribution Program: Islet handling tips. at. , Available from: http://iidp.coh.org/ (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

skrawanie w parafiniezatapianie w elu agarozowymrozk ad wyspanaliza histologicznabarwienie immunofluorescencyjneprzygotowanie blok w kom rkowychskrawanie tkanekarchitektura wyspprob wki o niskim wi zaniu

Powiązane artykuły