Artykuł metodologiczny

Różnica potencjału nosowego w celu ilościowego określenia transnabłonkowego transportu jonów u myszy

DOI:

10.3791/57934

⸱

4 lipca 2018

 , 
1Louvain Center for Toxicology and Applied Pharmacology (LTAP), Institut de Recherche Expérimentale et Clinique (IREC), Université Catholique de Louvain

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru różnicy potencjału nosowego u myszy. Test określa ilościowo funkcję transbłonowych transporterów jonów, takich jak mukowiscydoza, transbłonowy regulator przewodnictwa i nabłonkowy kanał sodowy. Cenna jest ocena skuteczności nowych terapii mukowiscydozy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Test różnicy potencjału nosa jest używany od prawie trzech dekad do pomocy w diagnozowaniu mukowiscydozy (CF). Okazał się pomocny w przypadkach osłabionych, oligo- lub jednoobjawowych postaci mukowiscydozy, zwykle diagnozowanych w późniejszym okresie życia, oraz zaburzeń związanych z mukowiscydozą, takich jak wrodzony obustronny brak nasieniowodów, idiopatyczne przewlekłe zapalenie trzustki, alergiczna aspergiloza oskrzelowo-płucna i rozstrzenie oskrzeli. Zarówno w warunkach klinicznych, jak i przedklinicznych test został wykorzystany jako biomarker do ilościowego określenia odpowiedzi na ukierunkowane strategie terapeutyczne w mukowiscydozie. Dostosowanie testu do myszy jest trudne i może wiązać się ze śmiertelnością. W artykule opisano odpowiednią głębokość znieczulenia wymaganą do utrzymania cewnika do nosa in situ w celu ciągłej perfuzji. Wymieniono w nim środki mające na celu uniknięcie aspiracji oskrzeli roztworów perfundowanych w nosie. Opisano w nim również opiekę nad zwierzętami na końcu testu, w tym podanie kombinacji antidotum leków znieczulających, prowadzące do szybkiego odwrócenia znieczulenia i pełnego wyzdrowienia zwierząt. Reprezentatywne dane uzyskane od myszy z mukowiscydozą i myszą typu dzikiego pokazują, że test rozróżnia mukowiscydozę i niemukowiscydozę. Ogólnie rzecz biorąc, opisany tutaj protokół pozwala na wiarygodne pomiary stanu funkcjonalnego transnabłonkowych transporterów chlorków i sodu u spontanicznie oddychających myszy, a także wielokrotne testy na tym samym zwierzęciu, przy jednoczesnym zmniejszeniu śmiertelności związanej z testem.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przez prawie trzy dekady, pomiary różnicy potencjału elektrycznego (PD) były używane do oceny stanu funkcjonalnego transbłonowych transporterów jonów wyrażonych na błonie śluzowej nosa, jako reprezentatywnych dla dystalnych dróg oddechowych1. Jako wieloetapowy test dynamiczny2,3, PD nosa umożliwia funkcjonalną dyssekcję transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy (CFTR) i aktywności nabłonkowego kanału sodowego (ENaC), które są zlokalizowane na błonach wierzchołkowych komórek nabłonka i odgrywają kluczową rolę w nawodnieniu powierzchni dróg oddechowych. Głównym zastosowaniem klinicznym nosowego testu PD jest pomoc w diagnozowaniu mukowiscydozy, najczęstszej śmiertelnej choroby genetycznej w populacjach rasy kaukaskiej, której średnia częstość występowania wynosi 1 na 2500 żywych urodzeń w krajach europejskich. Test od dawna okazuje się pomocny w diagnostyce osłabionych, oligo- lub monoobjawowych postaci mukowiscydozy, zwykle diagnozowanych w późniejszym okresie życia, oraz zaburzeń związanych z mukowiscydozą, takich jak wrodzony obustronny brak nasieniowodów, idiopatyczne przewlekłe zapalenie trzustki, alergiczna aspergiloza oskrzelowo-płucna i rozstrzenie oskrzeli4. Ostatnio klinometryczna ocena modulacji terapeutycznej podstawowej wady CFTR 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16 wykorzystał PD nosa w badaniach klinicznych nowych terapii mukowiscydozy. W warunkach przedklinicznych test został dostosowany do mouse17, aby umożliwić badanie bioaktywności nowych terapii ukierunkowanych na mukowiscydozę18,19,20,21. U myszy technika ta jest delikatna, opiera się na związanych z gatunkami różnicach anatomicznych w wielkości okolicy nosowej między gryzoniami a ludźmi, a głównie na istotnej roli bodźców sensorycznych z okolicy nosotwarznej u gryzoni. Wymaga przeszkolonych i wykwalifikowanych operatorów, dedykowanego sprzętu i materiałów.

mukowiscydoza jest wieloukładowym zaburzeniem gruczołów zewnątrzwydzielniczych, w którym przewlekła choroba układu oddechowego dominuje w obrazie klinicznym. Choroba jest spowodowana mutacjami w genie kodującym cykliczny kanał chlorkowy CFTR regulowany przez cykliczny monofosforan adenozyny (cAMP)22. Do tej pory zidentyfikowano ponad 2 000 mutacji CFTR 23. Najczęstsza mutacja24,25, występująca w prawie 90% alleli mukowiscydozy, odpowiada delecji fenyloalaniny w pozycji 508 łańcucha polipeptydowego białka (F508del-CFTR). Białko CFTR jest czysto omowym kanałem chlorkowym o małej przewodności. Istnieje również wiele dowodów na to, że CFTR reguluje inne mechanizmy transportu, w szczególności ENaC26,27. Wadliwy transport elektrolitu, w tym zmniejszona przewodność chlorków zależna od CFTR i zwiększona przewodność sodu zależna od ENaC, jest cechą charakterystyczną nabłonka mukowiscydozy. Ten pierwszy defekt znajduje odzwierciedlenie w zmniejszonej lub zniesionej repolaryzacji w odpowiedzi zarówno na gradient elektrochemiczny sprzyjający wypływowi chlorków, jak i dodanie izoprenaliny (agonisty β-adrenergicznego, który zwiększa wewnątrzkomórkowy cAMP) lub forskoliny (agonista cyklazy adenylanowej, niezatwierdzony do użytku klinicznego). Ta ostatnia wada znajduje odzwierciedlenie w podstawowej hiperpolaryzacji błony śluzowej nosa (bardziej ujemne PD) i zwiększonej odpowiedzi na amiloryd, lek moczopędny, który blokuje ENaC28.

modele myszy mukowiscydozy były często wykorzystywane w badaniach nad mukowiscydozą i były nieocenione w analizie patologii mukowiscydozy. Obecnie opisano co najmniej piętnaście modeli29, z których trzy są homozygotyczne pod względem najbardziej klinicznie istotnej mutacji F508del30,31,32. Jeden z tych trzech szczepów30, opracowany na Uniwersytecie Erazma w Rotterdamie, jest używany od prawie 20 lat w laboratorium Université catholique de Louvain (UCL). Model Cftrtm1Eur30 okazał się bardzo przydatny do badania wielonarządowej patofizjologii choroby mukowiscydozy i testowania skuteczności nowych strategii terapeutycznych18,19,20,21. Liczne problemy mogą wystąpić podczas lub wcześnie po (<24 h) nosowym teście PD u myszy. W niniejszej pracy opisano odpowiednią głębokość znieczulenia wymaganą do utrzymania cewnika donosowego in situ w celu ciągłej perfuzji oraz środki zapobiegające aspiracji oskrzeli roztworów perfundowanych w nosie. Opisano również opiekę nad zwierzętami na końcu badania, w tym podawanie kombinacji antidotum leków znieczulających, prowadzące do szybkiego odwrócenia znieczulenia i całkowitego wyzdrowienia zwierząt. W sumie procedury te pozwalają na wiarygodne pomiary u myszy oddychających spontanicznie, zmniejszenie śmiertelności związanej z testem i powtórzenie testu na tym samym zwierzęciu. Przedstawiono i omówiono reprezentatywne dane uzyskane z nosowego testu PD u myszy z mukowiscydozą i myszy typu dzikiego.

Protokół testu PD u myszy jest raportowany w trzech sesjach: ocena i postępowanie przed, w trakcie i po teście. W ocenie i postępowaniu przed badaniem szczegółowo opisano protokół przygotowania dwukanałowego cewnika do nosa oraz roztworów stosowanych do ciągłej perfuzji nosa. Podczas części testu poświęconej ocenie i zarządzaniu, konfiguracja eksperymentalna i obchodzenie się z myszą są szczegółowo analizowane. Na koniec opisano postępowanie ze zwierzęciem na koniec badania w celu poprawy pełnego powrotu do zdrowia zwierzęcia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania i procedury zostały zatwierdzone przez komisję etyki ds. badań na zwierzętach UCL (2017/UCL/MD/015) oraz zgodnie z przepisami Wspólnoty Europejskiej dotyczącymi wykorzystywania zwierząt w badaniach (CEE nr 86/609). Badacze posiadają kwalifikacje do prowadzenia doświadczeń na zwierzętach zgodnie z Dyrektywą Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE z dnia 22 września 2010 r. w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych.

1. Ocena i zarządzanie przed testem

  1. Przygotować dwukanałowy cewnik do nosa.
    UWAGA: Cewnik donosowy jest wykonany jako rurka kapilarna o podwójnym prześwietleniu, przy czym jeden kanał służy do ciągłej perfuzji roztworów, a drugi jako kanał pomiarowy.
    1. Podgrzej środkową część kawałka rurki polietylenowej o długości około 20 cm (średnica wewnętrzna 2,0 mm; średnica zewnętrzna 3,0 mm; Rysunek 1a) w płomieniu palnika gazowego, aż stanie się wystarczająco miękki do ciągnięcia (10 - 15 s).
    2. Rozsuń oba końce, aby uzyskać bardzo cienką rurkę kapilarną o odpowiedniej długości (~15 cm) i średnicy zewnętrznej (~0,1 mm) dla sondy nosowej (Rysunek 1b).
    3. Oczyść i odtłuść dwie takie kapilary czystym etanolem, połącz je taśmą (Rysunek 1c) i sklej je ze sobą za pomocą kleju cyjanoakrylowego.
    4. Odetnij nadmiar długości sond za pomocą żyletki lub skalpela, aby uzyskać optymalną długość cewnika o podwójnym świetle około 8 cm (Rysunek 1d).
    5. Wstrzyknąć wodę przez oba lumeny, aby sprawdzić, czy są przepuszczalne.
    6. Nanieś znacznik w odległości 5 mm od końcówki.
      UWAGA: Sondę wkłada się do nozdrza do oznaczenia, tak aby wszystkie pomiary były wykonywane w tym samym miejscu wewnątrz jamy nosowej.
    7. Przechowuj cewnik o podwójnym prześwicie w suchym pudełku.
      UWAGA: Można go użyć 6 - 10 razy, jeśli zostanie odpowiednio wyczyszczony bezpośrednio po teście.
  2. Przygotuj śmietanę.
    1. Delikatnie wymieszać krem elektrolitowy i nasycony roztwór 3 M KCl w stosunku 1:1 (objętość/objętość), unikając tworzenia się drobnych pęcherzyków powietrza.
      UWAGA: Mieszanka śmietany służy do budowy mostków elektrod do pomiaru i referencyjnych elektrod Ag/AgCl, jak pokazano na rysunku Rysunek 1.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Sondy z elektrodami i mostkami. Rysunek przedstawia rurkę polietylenową przed (a) i po podgrzaniu i pociągnięciu (b), taśmę łączącą dwie części kapilarne (c) cewnika o podwójnym świetle (d), łączniki rurki silikonowej (e) i elektrody (f). Dla jasności obrazu złącza nie zostały wypełnione mieszanką śmietany. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Etykieta rozwiązania Opis rozwiązania ZA Podstawowy buforowy roztwór soli W Bezchlorkowy buforowany roztwór soli Z 10-2 M roztwór podstawowy amilorydu D 10-3 M roztwór podstawowy forskoliny

Tabela 1: Roztwór podstawowy do testu PD w nosie u myszy.

sól Mm Masa cząsteczkowa g/L Chlorek sodu (NaCl) 135 Rozdział 135 Klasa 58,44 pkt. 7 889 osób Chlorek wapnia dwuwodny (CaCl 2,2H2O) Godzina 2,25 Rozdział 147 0,331 Chlorek magnezu sześciowodny (MgCl 2,6H2O) Rozdział 1.2 203,3 pkt. 0,244 pkt. Fosforan dipotasowy (K2HPO4) 2.4 174,2 pkt. 0,418 pkt. Fosforan monopotasowy (KH2PO4) 0,4 136,1 pkt. 0,054 pkt.

Tabela 2: Skład podstawowego buforowanego roztworu soli (roztwór podstawowy A).

  1. Przygotuj roztwory.
    1. Przygotować cztery roztwory podstawowe wymagane w protokole doświadczalnym (Tabela 1).
      1. Przygotować podstawowy roztwór buforowy (roztwór podstawowy A; Tabela 2) i bezchlorkowym roztworem buforowym (roztwór podstawowy B; Tabela 3) przez zmieszanie soli w czystej wodzie o temperaturze pokojowej. Dostosuj pH do 7,4 (zakres 7,0 - 7,6) za pomocą 1 N NaOH w celu podniesienia pH, 1 N HCl w celu obniżenia pH. Sprawdź osmolarność roztworu (275 mOsm/L).
      2. Przechowywać w oznakowanych szklanych butelkach w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy lub zamrożone w plastikowych butelkach do 6 miesięcy.
      3. Przygotować 10-2 M roztwór amilorydu (roztwór podstawowy C), dodając 26,6 mg chlorowodorku amilorydu do 10 ml czystej wody. Podgrzewać mieszaninę przez 5 do 10 minut w temperaturze 70 °C. Ponieważ amiloryd jest wrażliwy na światło, roztwór C należy przechowywać w ciemnym pojemniku. Oznaczyć pojemnik i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.
      4. Przygotuj 10-3 M roztwór forskoliny (roztwór podstawowy D), dodając 10 mg forskoliny do 24,36 ml czystej wody. Oznaczyć 0,1 ml porcji roztworu podstawowego forskoliny i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.
  2. Przygotować świeże roztwory A1, B1 i B2 (tabela 4).
    1. Przygotować świeży roztwór A1 (podstawowy buforowany roztwór soli plus 10-4 M amiloryd), otrzymując 10 ml podstawowego roztworu soli (roztwór podstawowy A) i dodając 0,1 ml 10-2 M roztworu amilorydu (roztwór podstawowy C). Oznaczyć pojemnik i zużyć w ciągu 24 godzin od przygotowania.
    2. Przygotować świeży roztwór B1 (roztwór buforowany chlorkiem plus 10-4 M amiloryd), otrzymując 10 ml bezchlorkowego buforowanego roztworu soli (roztwór podstawowy B) i dodając 0,1 ml 10-2 M roztworu amilorydu (roztwór podstawowy C). Oznacz pojemnik i zużyj w ciągu 24 godzin od przygotowania.
    3. Przygotować świeży roztwór B2 (bezchlorkowy buforowany roztwór soli plus 10-4 M amiloryd i 10-5 M forskoliny), otrzymując 10 ml bezchlorkowego buforowego roztworu soli (roztwór podstawowy B) i dodając 0,1 ml 10-2 M roztworu amilorydu (roztwór podstawowy C) i 0,1 ml 10-3 M roztworu forskoliny (roztwór podstawowy D). Oznacz pojemnik i zużyj w ciągu 2 godzin od przygotowania.
sól Mm Masa cząsteczkowa g/L Glukonian sodu (sól monosodowa) 135 Rozdział 135 218,1 szt. 29 444 TGL Glukonian wapnia (bezwodny proszek) 2.2 430,4 pkt. 0,947 pkt. Siarczan magnezu siedmiowodny (MgCl 2,6H2O) Rozdział 1.2 246,5 pkt. 0,296 Fosforan dipotasowy (K2HPO4) 2.4 174,2 pkt. 0,418 pkt. Fosforan monopotasowy (KH2PO4) 0,4 136,1 pkt. 0,054 pkt.

Tabela 3: Skład bezchlorkowego roztworu buforowego (roztwór podstawowy B).

figure-protocol-2
Rysunek 2: Pozycja myszy podczas perfuzji błony śluzowej nosa. Rysunek przedstawia poduszkę grzewczą (a), woltomierz (b), elektrodę referencyjną umieszczoną w przestrzeni podskórnej w kończynie tylnej (c), bliższe (d) i dystalne (e) wyloty pompy perystaltycznej, poduszkę (f) i prześcieradło (g). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Ocena i zarządzanie podczas testu

  1. Przygotuj konfigurację eksperymentalną.
    1. Aby zapobiec hipotermii w trakcie i po badaniu, należy użyć dwóch poduszek grzewczych utrzymywanych w temperaturach fizjologicznych, jedna do zestawu pomiarowego (18,8 x 37,5 cm; Rysunek 2a), a druga (15,5 x 15,5 cm) dla pudełka, w którym zwierzę zostanie umieszczone do odzyskania po zakończeniu testu.
    2. Włącz komputer z załadowanym oprogramowaniem do przechwytywania danych podłączonym do pamięci danych woltomierz o wysokiej impedancji wejściowej (>10 12Ω) i wysokiej rozdzielczości (0,1 mV) (Rysunek 2b).
    3. Podłącz elektrody do woltomierza. Podłącz dodatnią elektrodę pomiarową do cewnika nosowego, a ujemną elektrodę referencyjną do cewnika wprowadzonego w przestrzeń podskórną kończyny tylnej, jak pokazano na Rysunek 2c.
    4. Zanurz końcówki elektrod razem w mieszance śmietany. Sprawdź początkową wartość przesunięcia elektrody. Odrzuć elektrody, jeśli wartość jest większa niż (±) 2 mV (najlepiej 0 mV).
    5. Włącz pompę perystaltyczną i włóż rurkę pompy na miejsce, jak pokazano na rysunku Rysunek 2.
    6. Podłączyć proksymalny wylot rurki pompy do fiolki zawierającej wybrany roztwór do perfuzji donosowej (Rysunek 2d). Podłącz dystalny wylot rurki pompy do światła perfuzyjnego cewnika nosowego (Rysunek 2e).
    7. Napełnij jeden prześwit cewnika do nosa mieszanką kremów elektrolitowych przez końcówkę pipety o pojemności 10 μl. Dostosuj cewnik do łącznika rurki silikonowej ( Rysunek 1e), napełnij łącznik mieszanką kremu i włóż elektrodę dodatnią do łącznika (Rysunek 1f). Sprawdź wartość przesunięcia mostka elektrody pomiarowej. Odrzuć mostki, jeśli wartość jest większa niż (±) 2 mV (najlepiej 0 mV).
    8. Napełnij drugie światło cewnika do nosa świeżym roztworem A1. Zanurz końcówkę cewnika donosowego w fiolce zawierającej roztwór A. Odwróć kierunek pompy perystaltycznej, aby napełnić cewnik nosowy o długości odpowiadającej 10 s perfuzji.
      UWAGA: Pozwala to na rejestrowanie podstawowych wartości PD przez 10 s przed zastosowaniem amilorydu. Zanurz końcówkę cewnika nosowego w mieszance kremów wewnątrz złącza elektrody referencyjnej (Rysunek 1).
  2. Rozpocznij obsługę myszy.
    1. Zapisz wagę myszy, aby obliczyć dokładną dawkę środków znieczulających, które mają być wstrzykiwane drogą dootrzewnową (ip)17.
    2. Za pomocą igły 26 g (0,45 x 10 mm) wstrzyknąć premedykację dootrzewnowo, aby przyspieszyć indukcję znieczulenia: ustaloną dawkę 50 μl 5 mg/ml midazolamu. Poczekaj 5 minut.
    3. Przygotować mieszaninę znieczulenia (fentanyl, medetomidyna, droperydol w końcowych stężeniach odpowiednio 0,05, 0,40 i 20 mg/kg masy ciała oraz klonidyna w ustalonej dawce 0,375 μg) umożliwiającą optymalną i stabilną głębokość znieczulenia (etap III, płaszczyzna 2)17. Wstrzyknąć objętość mieszanki znieczulonej dootrzewnowo, a następnie wstrzyknąć objętość klonidyny.
      UWAGA: Po 15 minutach mysz powinna zasnąć, a znieczulenie może trwać co najmniej 30 minut.
    4. Złóż arkusz chusteczki chłonnej, aby utworzyć "poduszkę" o szerokości 3 cm (Rysunek 2f), która pokryje górną część poduszki grzewczej (Rysunek 2a) jako podparcie dla głowy myszy.
    5. Przykryj poduszkę grzewczą arkuszem chusteczki absorpcyjnej ("prześcieradło"; Rysunek 2g). Połóż mysz na plecach na poduszce grzewczej. Zaklej taśmą kończyny i ogon (Rysunek 2).
    6. Wprowadzić referencyjny cewnik dożylny (Rysunek 1g) w przestrzeń podskórną kończyny tylnej. Wyjmij igłę i dostosuj silikonowe złącze rurki (Rysunek 1e, 2c).
    7. Napełnij cewnik i łącznik mieszanką kremu i włóż elektrodę ujemną do złącza (Rysunek 1f).
    8. W razie potrzeby przymocuj cewnik i elektrodę taśmą, aby zapobiec przemieszczeniu. Po umieszczeniu elektrody referencyjnej i mostków ponownie sprawdź wartość przesunięcia mostka elektrody pomiarowej, zanurzając końcówkę cewnika nosowego w mieszance kremu z elektrodą wewnątrz łącznika cewnika dożylnego. Zapisać stabilną końcową wartość przesunięcia (najlepiej mniejszą niż (±) 2 mV).
    9. Przymocuj uszy myszy za pomocą "delikatnej" taśmy do poduszki grzewczej w wolnej przestrzeni między dwoma kawałkami tkanki absorbującej ("poduszka" (Rysunek 2f) i "prześcieradło"; (Rysunek 2g)). Napraw wibrysy (sztywne włoski rosnące w pobliżu nozdrzy) bez dotykania oczu.
    10. Aby wchłonąć płyn z jamy ustnej, przesuń język na boki (Rysunek 3a) i włóż spiczasty z bibuły filtracyjnej ("rura"; Rysunek 3b) około 1 cm w głąb pyska. Aby wchłonąć płyn wypływający z perfundowanego nozdrza, umieść drugi kawałek bibuły filtracyjnej ("chusteczkę do nosa"; Rysunek 3c) trzymany na czubku nosa.
    11. Sprawdzić dodatnią wartość kontrolną potencjału nabłonkowego, umieszczając końcówkę cewnika nosowego w kontakcie z wnętrzem jamy ustnej.
      UWAGA: Odczyt powinien być stabilny i mieścić się w zakresie od -10 mV do -20 mV.
    12. Trzymając go cienkimi kleszczami i przy dobrym bezpośrednim oświetleniu, delikatnie wprowadź cewnik nosowy do jednego nozdrza w odległości do 4 - 6 mm od czubka nosa.
      UWAGA: Cewnik do nosa PD znajduje się w środkowej małżowinie nosowej w pozycji, która daje maksymalną stabilną wartość wyjściową PD17,20.
    13. 5 minut po wstrzyknięciu leków znieczulających delikatnie przechylić poduszkę grzewczą o około 30°, kierując głowę zwierzęcia w dół. Monitoruj maksymalną wartość podstawowego PD.
    14. Gdy ustabilizuje się przez okres około 30 s, rozpocznij perfuzję błony śluzowej nosa ze stałą szybkością 10 μl / min, z kolejno 4 buforowanymi roztworami (A, A1, B1, B2). Utrwalaj pierwszy roztwór (krok 1.3.1.1) przez 10 sekund, a następnie każdy następny roztwór (krok 1.4) przez 5 minut lub do momentu osiągnięcia stabilnej wartości. Przestań perfuzjować forskolinę (B2), gdy przejściowa odpowiedź forskolina zaczyna spadać.
    15. Wybierz interwał 1 s do rejestrowania danych. Rozpocznij rejestrowanie danych w momencie rozpoczęcia perfuzji. Wyświetlanie danych w funkcji czasu na ekranie komputera.
    16. Zatrzymaj przechwytywanie danych po zakończeniu perfuzji za pomocą roztworu B2. Zapisz dane jako plik arkusza kalkulacyjnego.
    17. Popraw dane, odejmując końcową wartość przesunięcia.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Pozycja myszy na poduszce grzewczej z założonym cewnikiem nosowym i bibułami filtracyjnymi. Rysunek ilustruje język ułożony bokiem (a), fajkę (b) i chusteczkę do nosa (c). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Ocena i zarządzanie po teście

  1. Zdejmij mysz z poduszki grzewczej.
  2. Wytrzyj nos myszy "prześcieradłem" (Rysunek 2g).
  3. Wstrzyknąć dootrzewnowo mieszaninę antagonistów środka znieczulającego składającą się ze stałej dawki (4 μg) naloksonu, kompetycyjnego antagonisty morfiny, i atipamezolu, antidotum swoistego dla medetomidyny (2 mg/kg masy ciała).
  4. Połóż mysz na mniejszej poduszce grzewczej w pudełku do odzyskiwania, aż do pełnego wyzdrowienia, które zwykle obserwuje się po 1 do 2 godzinach
    UWAGA: W laboratorium UCL obserwuje się około 10% śmiertelność, związaną głównie z aspiracją oskrzeli roztworów perfundowanych w jamie nosowej podczas badania, niezależnie od płci czy genotypu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W celu zilustrowania charakterystycznych nieprawidłowości w transporcie jonów w mukowiscydozie, pomiary PD w nosie zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem opisanym powyżej na myszy F508del-CF oraz w grupie kontrolnej typu dzikiego tła genetycznego FVB/129 z brukselskiej kolonii myszyCftr tm1Eur30. Ten klinicznie istotny model, zawierający najpowszechniejszą i jedną z najcięższych mutacji F508del-CFTR23,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem niniejszej pracy jest opisanie odpowiedniego protokołu pomiaru PD w nosie pod ciągłą perfuzją roztworów u spontanicznie oddychających myszy przez czas wymagany do zbadania integralności transporterów jonów, głównie CFTR i ENaC. Wszystkie etapy protokołu zostały starannie zoptymalizowane, aby zapewnić pełne odtworzenie zwierząt oraz dobrą jakość i powtarzalność danych. W szczególności krytycznymi etapami są ocena i postępowanie ze znieczuleniem oraz odpowiednia pozycja i opieka nad zwierzęciem w trakcie i po badaniu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują prof. J. Lebacqowi za krytyczną redakcję manuskryptu. Myszy Cftrtm1Eur (homozygotyczne F508del-CFTR (FVB/129) zostały opracowane przez Erasmus MC w Rotterdamie w Holandii przy wsparciu Europejskiej Wspólnoty Gospodarczej Europejskiej Akcji Koordynacyjnej ds. Badań nad Mukowiscydozą EU FP6 LHHM-CT-2005-018932.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tuba polietylenowa Portex Smiths Medical, Hythe, Kent, Anglia CT21 6JLPortex 800/100/500; 2,0 mm ID, 3,0 mmODdo przygotowania kapilarnych rurek do sondy nosowej
Krem do elektrodParker, Fairfield, NJ, USAKrem Reduxdo budowy mostów elektrodowych
Elektrody Ag/AgClBiomedical, Clinton Township, MI, USA, JNSBNT131-1,0Elektrody pomiarowe i referencyjne
Chlorowodorek amiloryduSigma, St Louis, MI, USAA7410do przygotowania roztworów perfuzyjnych
forskolinSigma, St Louis, MI, USAF6886do przygotowania roztworów perfuzyjnych
Woltomierz Knick PortamessElektronisch Meβ gerä te, Berlin, NiemcyPortavo 904 pHdo pomiaru różnicy potencjałów
Paraly SW 112 Oprogramowanie Elektronisch Meβ gerä te, Berlin, NiemcyOprogramowanie Paraly SW112do przechwytywania danych o różnicach potencjałów
midazolam Mylan, Hoeilaart, BelgiaDormicum 15 mg/3 mldo stosowania jako premedykacja anestezjologiczna
fentanylJanssen Cilag, Berchem, BelgiaFentanyl-Janssen 0,05 mg/mldo stosowania jako lek znieczulający
medetomidynaOrion Pharma, Espoo, FinlandiaDomitor 1 mg / mldo stosowania jako lek znieczulający
droperidol Janssen  Cilag, Berchem, BelgiaDehydrobenzperidol 2,5 mg/mldo stosowania jako lek znieczulający
klonidyna Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, NiemcyCatapressan 0,15 mg/ml,do stosowania jako lek znieczulający
Cewnik dożylnyBecton Dickinson, Sandy, UT, USA24 GA x 0,75 IN, BD Insyte-Wdo budowy mostków elektrodowych
kleszczy Fine science Tools, Heidelberg, NiemcyDumont #5, Fine science Narzędziado zakładania cewnika do nosa
naloksonu Braun Medical, Bruksela, BelgiaNarcan, 0,4 mg/mldo stosowania jako antagonista środka znieczulającego
atipamezol Zoetis, Bloomberg, BelgiaAntisedan, 5 mg/mljako antidotum specyficzne dla medetozyny 
Poduszki grzewcze Aparatura Harvarda, Holliston, MA, USA18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm,aby uniknąć hipotermii w trakcie i po teście
Pompa perystaltyczna P1GE Life Sciences, Uppsala, Szwecja18111091do perfuzji roztworów w nosie myszy
klej cyjanoakrylowyLoctite, Henkel, Dü sseldorf, Niemcy super klej 3do sklejenia ze sobą dwóch rurek kapilarnych  do sondy nosowej
NaClSigma, St Louis, MI, USARES0926S-A7Pharma-Grade, USP
CaCl2.2H2OSigma, St Louis, MI, USAM7304Pharma-Grade, USP
MgCl2.6H2OSigma, St Louis, MI, USA1551128Pharma-Grade, USP
K2HPO4Sigma, St Louis, MI, USA1551139Klasa farmaceutyczna, USP
Na glukonianSigma, St Louis, MI, USAS2054Klasa farmaceutyczna, USP
Ca glukonianSigma, St Louis, MI, USAC8231Farmaceutyczny, USP
MgSO4.7H2OSigma, St Louis, MI, USARES0089M-A7Pharma-Grade, igła USP
BD Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stany ZjednoczoneBD 26G (0,45x10 mm)wstrzyknięcie dootrzewnowe

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis. New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).
  2. Middleton, P. G., Geddes, D. M., Alton, E. F. W. Protocols for in vivo measurement of the ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium. European Respiratory Journal. 7 (11), 2050-2056 (1994).
  3. Knowles, M. R., Paradiso, A. M., Boucher, R. C. In vivo nasal potential difference: techniques and protocols for assessing efficacy of gene transfer in cystic fibrosis. Human Gene Therapy. 6 (4), 445-455 (1995).
  4. Paranjape, S. M., Zeitlin, P. L. Atypical cystic fibrosis and CFTR-related disorders. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 35 (3), 116-123 (2008).
  5. Wilschanski, M., et al. A pilot study of the effect of gentamicin on nasal potential difference measurements in CF patients carrying stop mutations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (3), Pt 1 860-865 (2000).
  6. Clancy, J. P., et al. Evidence that systemic gentamicin suppresses premature stop mutations in patients with CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (7), 1683-1692 (2001).
  7. Wilschanski, M., et al. Gentamicin-induced correction of CFTR function in patients with CF and CFTR stop mutations. New England Journal of Medicine. 349 (15), 1433-1441 (2003).
  8. Sermet-Gaudelus, I., et al. In vitro prediction of stop-codon suppression by intravenous gentamicin in patients with CF: a pilot study. BMC Medicine. 5, 5(2007).
  9. Clancy, J. P., et al. No detectable improvements in CF transmembrane conductance regulator by nasal aminoglycosides in patients with CF with stop mutations. American Journal of Respiratory and Cell Molecular Biology. 37 (1), 57-66 (2007).
  10. Kerem, E., et al. Effectiveness of PTC124 treatment of CF caused by nonsensemutations: a prospective phase II trial. Lancet. 372 (9640), 719-727 (2008).
  11. Sermet-Gaudelus, I., et al. Ataluren (PTC124) induces CF transmembrane conductance regulator protein expression and activity in children with nonsense mutation CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (10), 1262-1272 (2010).
  12. Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38 (1), 59-69 (2011).
  13. Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with CF and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363 (21), 1991-2003 (2010).
  14. Clancy, J. P., et al. Results of a phase IIa study of VX-809, an investigational CFTR corrector compound, in subjects with cystic fibrosis homozygous for the F508del-CFTR mutation. Thorax. 67 (1), 12-18 (2012).
  15. Leonard, A., Lebecque, P., Dingemanse, J., Leal, T. A randomized placebo-controlled trial of miglustat in cystic fibrosis based on nasal potential difference. Journal of Cystic Fibrosis. 11 (3), 231-236 (2012).
  16. De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate end-point. European Respiratory Journal. 41, 203-216 (2013).
  17. Leal, T., et al. Successful protocol of anaesthesia for measuring transepithelial nasal potential difference in spontaneously breathing mice. Laboratory Animals. 40 (1), 43-52 (2006).
  18. Lubamba, B., et al. Preclinical evidence that sildenafil and vardenafil activate chloride transport in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (5), 506-515 (2008).
  19. Lubamba, B., et al. Airway delivery of low-dose miglustat normalizes nasal potential difference in F508del cystic fibrosis mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (11), 1022-1028 (2009).
  20. Lubamba, B., et al. Inhaled PDE5 inhibitors restore chloride transport in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 37 (1), 72-78 (2011).
  21. Vidovic, D., et al. rAAV-CFTRΔR Rescues the Cystic Fibrosis Phenotype in Human Intestinal Organoids and Cystic Fibrosis Mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 288-298 (2016).
  22. Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
  23. Lubamba, B., Dhooghe, B., Noel, S., Leal, T. Cystic fibrosis: insight into CFTR pathophysiology and pharmacotherapy. Clinical Biochemistry. 45 (15), 1132-1144 (2012).
  24. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  25. Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4925), 1066-1073 (1989).
  26. Stutts, M. J., Rossier, B. C., Boucher, R. C. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inverts protein kinase A-mediated regulation of epithelial sodium channel single channel kinetics. Journal of Biological Chemistry. 272 (22), 14037-14040 (1997).
  27. Ismailov, I. I., et al. Regulation of epithelial sodium channels by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biological Chemistry. 271 (9), 4725-4732 (1996).
  28. Althaus, M. ENaC inhibitors and airway re-hydration in cystic fibrosis: state of the art. Current Molecular Pharmacology. 6 (1), 3-12 (2013).
  29. Wilke, M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, Suppl 2 152-171 (2011).
  30. Van Doorninck, J. H., et al. A mouse model for the cystic fibrosis delta F508 mutation. The EMBO Journal. 14 (18), 4403-4411 (1995).
  31. Colledge, W. H., et al. Generation and characterization of a delta F508 cystic fibrosis mouse model. Nature Genetics. 10 (4), 445-452 (1995).
  32. Zeiher, B. G., et al. A mouse model for the delta F508 allele of cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 96 (4), 2051-2064 (1995).
  33. Ghosal, S., Taylor, C. J., McGray, J. Modification of the nasal membrane potential difference with inhaled amiloride and loperamide in the cystic fibrosis (CF) mouse. Thorax. 51 (12), 1229-1232 (1996).
  34. Ghosal, S., Taylor, C. J., Colledge, W. H., Ratcliff, R., Evans, M. J. Sodium channel blockers and uridine triphosphate: effects on nasal potential difference in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 15 (1), 146-150 (2000).
  35. Leonard, A., et al. Comparative Variability of Nasal Potential Difference Measurements in Human and Mice. Open Journal of Respiratory Disease. 2, 43-56 (2012).
  36. Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch's 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
  37. Pritchett-Corning, K. R., et al. AALAS/FELASA Working Group on Health Monitoring of rodents for animal transfer. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 633-640 (2014).
  38. Salinas, D. B., et al. CFTR involvement in nasal potential differences in mice and pigs studied using a thiazolidinone CFTR inhibitor. American Journal of Physiology. Lung Cell Molecular Physiology. 287 (5), 936-943 (2004).
  39. Fisher, J. T., et al. Comparative processing and function of human and ferret cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Journal of Biological Chemistry. 287 (26), 21673-21685 (2012).
  40. Kaza, N., et al. Use of ferrets for electrophysiologic monitoring of ion transport. PLoS One. 12 (10), 0186984(2017).
  41. Leal, T., Beka, M., Panin, N., Mall, M. A., Noel, S. Nasal potential difference in βENaC-overexpressing mouse reveals pH-sensitive channel hyperactivity and shift of subunits stoichiometry. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (S1), 72(2017).
  42. Mall, M., Grubb, B. R., Harkema, J. R., O'Neal, W. K., Boucher, R. C. Increased airway epithelial Na+ absorption produces cystic fibrosis-like lung disease in mice. Nature Medicine. 10 (5), 487-493 (2004).
  43. Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mysi model mukowiscydozydwudzielny cewnik nosowyperfuzja pomp perystaltycznpomiar odpowiedzi na amilorydodpowied wolna od chlork wanaliza odpowiedzi na forskolinprotok podawania znieczuleniaprocedura rekonwalescencji zwierz t

Powiązane artykuły