Artykuł metodologiczny

Eksperymentalny protokół badania profili reakcji behawioralnych u larw ryb: zastosowanie do neurostymulantu kofeiny

14.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57938

⸱

24 lipca 2018

 ,  , 
1Department of Environmental Science, Center for Reservoir and Aquatic Systems Research, Baylor University, 2Institute of Biomedical Studies, Baylor University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do badania aktywności lokomotorycznej larw danio pręgowanego i strzebli grubogłowych oraz reakcji fotomotorycznych (PMR) za pomocą automatycznego oprogramowania śledzącego. Po włączeniu do powszechnych testów biologicznych toksykologicznych, analizy tych zachowań stanowią narzędzie diagnostyczne do badania bioaktywności chemicznej. Protokół ten jest opisany przy użyciu kofeiny, modelowego neurostymulantu.

Streszczenie

Modele i zachowania ryb są coraz częściej używane w naukach biomedycznych; jednak ryby od dawna są przedmiotem badań ekologicznych, fizjologicznych i toksykologicznych. Korzystając ze zautomatyzowanych cyfrowych platform śledzących, najnowsze wysiłki w dziedzinie neurofarmakologii wykorzystują zachowania lokomotoryczne larw ryb do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych dla nowych małych cząsteczek. Podobnie jak te wysiłki, badania z zakresu nauk o środowisku oraz farmakologii porównawczej i toksykologii analizują różne zachowania modeli ryb jako narzędzia diagnostyczne w wielopoziomowej ocenie zanieczyszczeń i monitorowaniu wód powierzchniowych w czasie rzeczywistym pod kątem zagrożeń związanych z zanieczyszczeniami. Podczas gdy danio pręgowany jest popularnym modelem larwy ryby w naukach biomedycznych, strzebla grubogłowa jest powszechnym modelem larw ryb w ekotoksykologii. Niestety, larwy strzebli grubogłowych otrzymały znacznie mniej uwagi w badaniach behawioralnych. W tym miejscu opracowujemy i demonstrujemy protokół profilu behawioralnego wykorzystujący kofeinę jako modelowy neurostymulant. Chociaż reakcje fotomotoryczne rybek grubogłowych były czasami zakłócane przez kofeinę, danio pręgowany był znacznie bardziej wrażliwy na fotomotoryczne i lokomotoryczne punkty końcowe, które reagowały na poziomach istotnych dla środowiska. Potrzebne są przyszłe badania, aby zrozumieć porównawcze różnice wrażliwości behawioralnej między rybami w zależności od wieku i pory dnia oraz ustalić, czy podobne efekty behawioralne wystąpią w naturze i będą wskazywać na niekorzystne wyniki na poziomie indywidualnym lub populacyjnym organizacji biologicznej.

Wprowadzenie

Chociaż modele ryb są coraz częściej wykorzystywane do badań biomedycznych, ryby są rutynowo wykorzystywane do badań ekologii i fizjologii, do badania skażenia wód powierzchniowych i do zrozumienia progów toksykologicznych chemikaliów. Takie działania są ważne, ponieważ zanieczyszczenie chemiczne może zaszkodzić ekosystemom wodnym i zagrozić jakości źródeł zaopatrzenia w wodę1,2. Jednak większość chemikaliów w handlu nie ma nawet podstawowych informacji toksykologicznych3.

Testy na modelach zwierzęcych tradycyjnie używane w regulacyjnych testach toksyczności są zasobożerne i nie mogą zapewnić wysokiej przepustowości, wczesnego poziomu badań przesiewowych potrzebnych do testowania toksyczności w XXI wieku4. W związku z tym rośnie impuls do przyjęcia i wykorzystania modeli in vitro, które mogą szybciej i skuteczniej badać związki pod kątem aktywności biologicznej3,5. Chociaż modele komórkowe oferują wiele możliwości, często brakuje im złożoności biologicznej, a tym samym nie uwzględniają wielu ważnych procesów zachodzących w całym organizmie, w tym metabolizmu6.

Danio pręgowany to powszechny biomedyczny model zwierzęcy, który zyskuje na popularności jako alternatywny model w toksykologii wodnej i ekotoksykologii7,8. Biorąc pod uwagę ich niewielkie rozmiary, szybki rozwój i wysoką płodność, modele ryb mogą być używane do szybkiego i skutecznego badania substancji chemicznych pod kątem bioaktywności i toksyczności w skali całego organizmu9. Dzięki zautomatyzowanemu oprogramowaniu śledzącemu, zachowania larw danio pręgowanego zapewniają zwiększoną użyteczność diagnostyczną w badaniach przesiewowych zanieczyszczeń pod kątem toksyczności10,11. Badania w naukach farmaceutycznych wykazały, że lokomotoryczne punkty końcowe informują o chemicznych mechanizmach działania, mogą być wykorzystywane do fenotypowania zachowań, a następnie mogą wstępnie identyfikować subkomórkowe cele dla nowych cząsteczek12,13. Podczas gdy danio pręgowany jest popularnym modelem larwalnym ryb w naukach biomedycznych, strzebla grubogłowa jest powszechnym, ważnym ekologicznie modelem ryby, który jest wykorzystywany do badań ekotoksykologicznych oraz podczas prospektywnych (np. nowe oceny chemiczne) i retrospektywnych (np. monitorowanie wód powierzchniowych lub ścieków) ocen środowiskowych. Niestety, reakcjom behawioralnym larw rybek grubogłowych poświęcono znacznie mniej uwagi niż danio pręgowanemu. Nasze trwające badania z dwoma powszechnymi modelami larw ryb, danio pręgowanym i strzeblą grubogłowych, sugerują, że wzorce pływania larw ryb wydają się unikalne dla przewidywanych trybów lub mechanizmów działania różnych substancji chemicznych. W związku z tym behawioralne punkty końcowe dają możliwość szybkiego i wrażliwego badania substancji chemicznych pod kątem toksyczności oraz identyfikacji celów subkomórkowych dla przemysłowych zanieczyszczeń chemicznych i innych, szczególnie podczas ocen na wczesnym poziomie.

Tutaj przedstawiamy protokół badania profili reakcji behawioralnych u larw ryb. Demonstrujemy te metody przy użyciu kofeiny, modelowego neurostymulantu i powszechnego zanieczyszczenia wodnego, które jest wprowadzane do systemów wodnych poprzez zrzut z oczyszczalni ścieków po spożyciu przez ludzi żywności, napojów i farmaceutyków zawierających kofeinę14. Badamy reakcje behawioralne na kofeinę zarówno u larw danio pręgowanego, jak i strzebla grubogłowych, w tym na nagłą zmianę warunków oświetleniowych, która jest często określana jako reakcja fotomotoryczna (PMR) podczas badań farmaceutycznych z embrionalnymi i larwalnymi danio pręgowanym13,15. Następnie identyfikujemy wpływ kofeiny na kilka lokomotorycznych punktów końcowych, aby opracować profile odpowiedzi chemicznej dla każdego modelu ryby. Poziomy leczenia kofeiną użyte w tym badaniu reprezentują górne centyle rozkładu ekspozycji w oparciu o zmierzone wartości środowiskowe caffeine16. Uwzględniamy również leczenie odnoszące się do wartości LC50 larw ryb oraz wartości zagrożenia terapeutycznego (THV), stężenia farmaceutycznego w wodzie, które zgodnie z przewidywaniami spowoduje stężenie w osoczu ryb zgodne z terapeutyczną dawką w osoczu dla ludzi.

Protokół

Badania w niniejszym protokole są zazwyczaj prowadzone zgodnie ze zstandaryzowanym planem eksperymentalnym oraz zalecanymi wytycznymi analizy statystycznej Agencji Ochrony Środowiska USA (EPA nr 2000.0) dla golianek oraz Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD nr 236) dla danio pręgowanych. Plany te (np. zwiększenie liczby powtórzeń) mogą zostać zmodyfikowane w ramach obecnego protokołu w przyszłych badaniach. Warunki hodowli ryb są zgodne z wcześniej opublikowaną literaturą17. Wszystkie procedury eksperymentalne i protokoły hodowli ryb były zgodne z protokołami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt zatwierdzonymi na Uniwersytecie Baylor.

1. Poddawanie ryb działaniu preparatu chemicznego

  1. Przygotować roztwory do ekspozycji na kofeinę poprzez rozpuszczenie kofeiny w zrekonstytuowanej wodzie twardej. Przeprowadzić odpowiednie rozcieńczenia szeregowe, rozcieńczając roztwory o wyższym stężeniu kofeiny wodą twardą, aby uzyskać niższe poziomy stężeń kofeiny.
    UWAGA: Tabela 1 podsumowuje poszczególne poziomy stężeń zastosowane w tym eksperymencie.
Danio pręgowanyGłowacz gładki
LeczenieNominalne stężenie kofeiny (mg/L)Zmierzony stężenie kofeiny (mg/L)LeczenieNominalne stężenie kofeiny (mg/L)Zmierzone stężenie kofeiny (mg/L)
Kontrola0 Kontrola0
75. percentyl*0.0010.00175. percentyl*0.0010.001
95. centyl*0.0390.01395. percentyl*0.0390.009
99. percentyl*0.4120.36199. centyl*0.4120.310
THV4.073.81TTV4.074.12
10% LC5048.4646.6610% LC5014.114.7
LC50 dla 40%193.82186.67LC50 dla 40%56.3853.91

Tabela 1: Eksperymentalne traktowanie kofeiną w badaniach nad danio pręgowanym i głowicą twardogłową. Podano nominalne i zmierzone wartości kofeiny dla każdego traktowania. *Zastosowane w niniejszym badaniu dawki kofeiny reprezentują górne centyle rozkładów ekspozycji opartych na zmierzonych wartościach kofeiny w środowisku16. THV: Therapeutic Hazard Value (terapeutyczna wartość zagrożenia). LOD: Limit of Detection (granica wykrywalności)

  1. Nalać przygotowany roztwór do poszczególnych komór ekspozycyjnych. W przypadku komór ekspozycyjnych dla danio pręgowanego należy użyć zlewków szklanych o pojemności 100 mL wypełnionych 20 mL roztworu ekspozycyjnego, a dla golca amerykańskiego zlewków 500 mL z 200 mL roztworu ekspozycyjnego.
  2. Za pomocą pipety transferowej umieścić 10 embrionów danio pręgowanego w wieku 4–6 h po zapłodnieniu (hpf) w każdej z czterech powtórzonych komór ekspozycyjnych dla danej grupy badawczej.
  3. Umieścić 10 larw golca amerykańskiego w wieku do 24 h od wyklucia w każdej z trzech powtórzonych komór ekspozycyjnych dla danej grupy badawczej. Aby dostosować się do większego rozmiaru larw golca amerykańskiego, przed transferem należy odciąć końcówkę pipety transferowej.
  4. Doświadczenia z danio pręgowanym prowadzić przy fotoperiodzie 16:8 h (światło:ciemność) i stałej temperaturze 28 ± 1 °C. W badaniach nad golcem amerykańskim zastosować ten sam reżim fotoperiodu, ale w temperaturze 25 ± 1 °C.
  5. Po 96 h ekspozycji na substancję chemiczną przenieść poszczególne ryby do oddzielnych dołków płytek 48-dołkowych (dla danio pręgowanego) i 24-dołkowych (dla golca amerykańskiego).
    1. Aby zapewnić taką samą objętość roztworu w każdym dołku, larwy danio pręgowanego należy przenieść do płytek 48-dołkowych za pomocą autopipety 5 000 µL, zachowując objętość 1 000 µL na dołek. Użyć autopipety do jednoczesnego pobrania i przeniesienia larw danio pręgowanego wraz z roztworem ekspozycyjnym.
    2. Ze względu na większy rozmiar, larwy golca amerykańskiego przenieść za pomocą pipety transferowej z odciętą końcówką. Przed przeniesieniem larw golca amerykańskiego do poszczególnych dołków, należy napełnić każdy dołek do poziomu 2 000 µL za pomocą autopipety. Podczas przenoszenia pojedynczych larw golca do dołków, umieścić końcówkę pipety transferowej w roztworze w dołku i pozwolić rybie wypłynąć z końcówki pipety do dołka.

2. Kalibracja parametrów śledzenia wideo

  1. Przed przeprowadzeniem pomiarów behawioralnych należy ustawić parametry obserwacji i kalibracji w oprogramowaniu do śledzenia wideo (patrz Tabela materiałów).
    1. Umieść w komorze rejestracyjnej płytkę wielodołkową z co najmniej jedną larwą ryby w oddzielnym dołku. Wykorzystaj płytkę i ryby jako punkty odniesienia do ustawienia parametrów kalibracji.
    2. W oprogramowaniu do śledzenia wideo kliknij „File | Generate Protocol”, co otworzy okno dialogowe „kreatora tworzenia protokołu”. W polu „Location Count” wpisz liczbę pojedynczych dołków w płytce, a następnie kliknij „OK”.
    3. Na górze ekranu kliknij „View | Full Screen”, co spowoduje wyświetlenie przez system widoku z kamery zamontowanej nad płytką.
    4. Kliknij ikonę „Draw Areas”, która przedstawia trzy wielokolorowe kształty. Po prawej stronie obszaru podglądu płytki wybierz ikonę koła w polu opisanym jako „Areas”.
    5. Używając kursora, wyznacz okrągły obszar śledzenia wideo w lewym górnym dołku płytki. Wybierz „Top-Right Mark”, a następnie obrysuj obszar widoku prawego górnego dołka. Następnie wybierz „Bottom Mark”, aby obrysować prawy dolny dołek.
      UWAGA: Po narysowaniu okręgu jego pozycja prawdopodobnie będzie wymagała korekty. Aby dostosować położenie obrysu, kliknij „select”, a następnie użyj kursora, aby przesunąć zaznaczony obszar. Ponadto obrysy można powielać, klikając „Copy”, a następnie „Paste”.
    6. Po zdefiniowaniu obszarów śledzenia dla dołków lewego górnego, prawego górnego i prawego dolnego, kliknij „Build”, aby oprogramowanie automatycznie wyznaczyło obszary widoku dla pozostałych dołków.
    7. W sekcji oznaczonej jako „Calibration” kliknij „Draw Scale”. Używając kursora, narysuj poziomą linię w poprzek płytki. Po narysowaniu linii pojawi się okno dialogowe „Calibration measurement”. Wpisz długość płytki i kliknij „OK”.
    8. Wyjdź z menedżera rysowania, klikając ikonę „Draw Areas”.
    9. Kliknij ikonę „Tiles”. Za pomocą kursora zaznacz wszystkie pola pojawiające się na ekranie podglądu tak, aby każde z nich stało się zielone.
      UWAGA: Ikona Tiles przedstawia grupę sześciu pojedynczych małych kwadratów.
    10. Kliknij „View | Full Screen”. Po prawej stronie obszaru podglądu płytki kliknij „Bkg” w polu opisanym jako „Detection Threshold”. Użyj paska regulacji progu, aby ustawić próg wykrywania pikseli. Po wybraniu odpowiedniego progu wykrywania pikseli kliknij „Apply to Group”.
      UWAGA: W tym protokole próg wykrywania jest ustawiony na 13 w trybie czarnym dla obserwacji danio pręgowanego oraz na 110 w trybie przezroczystym dla obserwacji golca białego.
    11. W polu opisanym jako „Movement Threshold” wpisz pożądane parametry śledzenia prędkości ruchu. Po ustawieniu parametrów prędkości kliknij „Apply to Group”.
      UWAGA: W tym protokole ruchy małe/duże ustawiono na 20 mm/s, a ruchy nieaktywne/małe na 5 mm/s. Wybory te programują oprogramowanie do śledzenia ruchu larw ryb na trzech różnych poziomach prędkości: nieaktywny (zastyganie) = <5 mm/s, mały (pływanie spokojne) = 5–20 mm/s oraz duży (gwałtowny) = >20 mm/s.
    12. Z menu rozwijanego wybierz „Parameters | Protocol Parameters”. W oknie dialogowym wybierz zakładkę „Time”. Wpisz czas obserwacji oraz czas integracji. Po wprowadzeniu parametrów kliknij „Ok”.
    13. Aby ustawić czasy fotoperiodu światło/ciemność oraz natężenie światła dla każdego fotoperiodu, otwórz okno ustawień sterownika oświetlenia, wybierając „Light Driving” z menu rozwijanego „Parameters”.
      UWAGA: Sposób ustawiania wielu fotoperiodów światło-ciemność przedstawiono w filmie z protokołem.
    14. Po ustawieniu parametrów śledzenia wideo zapisz protokół obserwacji.
      UWAGA: W tym protokole obserwuje się zachowanie ryb przez okres 50 min, który obejmuje 10 min fazy aklimatyzacji, a następnie 4 naprzemienne fazy światła/ciemności, składające się z dwóch 10 min okresów oświetlenia i dwóch 10 min okresów ciemności. Czas integracji jest ustawiony tak, aby mierzyć zachowanie dla każdej minuty 50 min testu behawioralnego.

3. Obserwacja zachowań lokomotorycznych i fotomotorycznych larw ryb

  1. Umieść płytkę wielodołkową zawierającą ryby doświadczalne w komorze do rejestracji behawioralnej.
  2. W oprogramowaniu do śledzenia wideo otwórz protokół śledzenia opracowany w kroku 3.
  3. W podglądzie programu do śledzenia wideo sprawdź, czy wszystkie larwy są widoczne na ekranie komputera, czy w każdym dołku znajduje się tylko jedna larwa oraz czy poszczególne dołki są wyrównane w obrębie obszarów obserwacyjnych zdefiniowanych w krokach 2.1.5 i 2.1.6.
  4. Kliknij „Experiment | Execute”.
    UWAGA: System poprosi użytkownika o podanie nazwy i lokalizacji zapisu danych obserwacyjnych.
  5. Po określeniu nazwy i lokalizacji zapisu danych obserwacyjnych kliknij ikonę „Several Live Images”, aby zaznaczyć wszystkie predefiniowane obszary widoku.
    UWAGA: Ikona ta znajduje się w górnej części ekranu komputera i wygląda jak prostokąt podzielony na cztery mniejsze kwadraty. Kliknięcie tej ikony podświetli wszystkie predefiniowane obszary widoku.
  6. Zamknij panel komory rejestrującej i kliknij „Background | Start” na monitorze komputera.

4. Analiza danych behawioralnych

  1. Aby pobrać dane dotyczące aktywności larw ryb, należy otworzyć arkusz kalkulacyjny, który jest automatycznie generowany przez oprogramowanie do śledzenia i znajduje się w folderze wskazanym przez użytkownika przed rozpoczęciem prób behawioralnych (Krok 3.4).
  2. Przykładowe pomiary naiwnej aktywności lokomocyjnej larw danio pręgowanego oraz głowicy amerykańskiej, które nie były poddane ekspozycji, przedstawiono odpowiednio na Rysunku 1A oraz 1B. Obliczenia PMR, które skutecznie badają wielkość różnicy w ruchu podczas przejść z jasności do ciemności lub z ciemności do jasności, przedstawiono na Rysunkach 1C i 1D.

Aktywność pływacka danio pręgowanego i głowca; eksperyment z fotoperiodem światło/ciemność, wykresy odpowiedzi.
Rysunek 1: Przykład bazowej aktywności nieeksponowanych ryb z gatunku danio pręgowany (A i B) oraz głowiec (C i D). Średnia (± SEM) odległość przepłynięta przez danio pręgowanego (A) i głowca (C) jest przedstawiona za pomocą kropek, z których każda reprezentuje jednominutowe odstępy aktywności. Pomiarom poddano odpowiedzi fotomotorowe w dwóch okresach ciemności i dwóch okresach światła. Do obliczenia PMR wykorzystano ostatnią (a, c, e i g) oraz pierwszą (b, d, f i h) minutę każdego fotoperiodu. Odpowiedzi fotomotorowe danio pręgowanego (B) i głowca (D) zmierzono jako zmianę średniej (±SEM) przebytej odległości między ostatnią minutą początkowego fotoperiodu a pierwszą minutą okresu następnego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki

Poziomy ekspozycji na kofeinę nie ulegały znaczącym zmianom podczas 96 h eksperymentów z danio pręgowanym i głowicą amerykańską. Na przykład w Tabeli 1 przedstawiono analitycznie zweryfikowane stężenia dla każdego poziomu traktowania. W niniejszym protokole próbki wody pod kątem poziomów kofeiny zweryfikowano za pomocą cieczowej chromatografii tandemowej spektrometrii mas z rozcieńczeniem izotopowym (LC-MS/MS), opierając się generalnie na wcześniej opisanych metodach28. Ilościowo określono również tworzenie się paraksantyny, głównego metabolitu kofeiny. Opis tych procedur analitycznych znajduje się w dodatkowych informacjach analitycznych. Ze względu na podobieństwo między wartościami nominalnymi a analityczną weryfikacją traktowania, w dalszej części niniejszego opracowania prezentowane są nominalne poziomy traktowania. Kofeina znacząco zmieniła zachowanie danio pręgowanego i głowicy amerykańskiej. Jednakże reakcje lokomocyjne danio pręgowanego były konsekwentnie bardziej wrażliwe na kofeinę niż w przypadku głowicy amerykańskiej. Najbardziej wrażliwe punkty końcowe zachowania u larw danio pręgowanego i głowicy amerykańskiej uległy zmianie pod wpływem kofeiny w stężeniu 0,039 mg/L. Tabela 2 podsumowuje najniższe obserwowane stężenia wywołujące efekt (LOEC) oraz najwyższe stężenia niepowodujące efektu (NOEC) dla każdego punktu końcowego zachowania w obu modelach ryb.

Danio pręgowany  Głowacz wielkogłowy  
Punkt końcowy LOEC (mg/L)NOEC (mg/l)Punkt końcowy LOEC (mg/l)NOEC (mg/l)
Całkowity dystans w ciemności0.4120.039Całkowity dystans w ciemności−56.38
Całkowita droga światła48.464.07Całkowity dystans światła−56.38
Całkowita liczba zliczeń w ciemności0.4120.039Całkowita liczba zliczeń w ciemności−56.38
Całkowita liczba mikroorganizmów (metoda świetlna)48.464.07Całkowita liczba komórek w świetle widzialnym−56.38
Odległość przebicia w ciemności−193.82Odległość przebicia w ciemności−56.38
Odległość rozrywania światła193.8248.46Odległość przebicia światła−56.38
Liczba impulsów w ciemności193.8248.46Liczba zdarzeń burst ciemnego−56.38
Liczba impulsów światła193.8248.46Liczba rozbłysków światła−56.38
Czas trwania wybuchu w ciemności193.8248.46Czas trwania impulsu w ciemności−56.38
Czas trwania impulsu świetlnego−193.82Czas trwania impulsu świetlnego−56.38
Dystans przelotowy w ciemności0.4120.039Dystans przelotowy w ciemności−56.38
Światło dystansowe przelotowego48.464.07Kontrolka dystansu przelotowego−56.38
Liczenie komórek w ciemności0.4120.039Liczenie ciemnych prądów−56.38
Licznik impulsów Cruising Counts Light48.464.07Liczniki Cruising Counts Light−56.38
Czas trwania rejsu w ciemności0.4120.039Czas trwania rejsu w ciemności−56.38
Światło czasu trwania przelotu48.464.07Światło czasu trwania przelotu−56.38
Odległość zamrażania w ciemności0.4120.039Odległość zamrażania w ciemności0.0390.001
Światło odległości zamrażania0.0390.001Dystans zamrażania światła−56.38
Zamrażanie zliczeń w ciemności0.4120.039Zliczanie ciemne w zamrożeniu−56.38
Zamrażanie liczników światła48.464.07Zamrażanie zliczeń światła−56.38
Czas zamrażania w ciemności−193.82Czas mrożenia w ciemności56.3814.10
Czas trwania zamrażania w świetle48.464.07Czas trwania zamrażania w świetle−56.38
Ciemny 1 PMR48.464.07Dark 1 PMR0.0390.001
Lekki 1 PMR48.464.07Lekka 1 PMR−56.38
Dark 2 PMR48.464.07Dark 2 PMR−56.38
Lekki 2 PMR48.464.07Lekkie 2 PMR−56.38
Bursting Dark 1 PMR−193.82PMR Bursting Dark 1−56.38
Bursting Light 1 PMR−193.82Błyskowy rozbłysk światła 1 PMR−56.38
Bursting Dark 2 PMR193.8248.46Bursting Dark 2 PMR−56.38
Bursting Light 2 PMR−193.82Bursting Light 2 PMR−56.38
Cruising Dark 1 PMR48.464.07Cruising Dark 1 PMR−56.38
Cruising Light 1 PMR48.464.07Cruising Light 1 PMR−56.38
Cruising Dark 2 PMR48.464.07Cruising Dark 2 PMR−56.38
Cruising Light 2 PMR193.8248.46Cruising Light 2 PMR56.3814.10
Zamrażanie w ciemności 1 PMR48.464.07Zamrażanie w ciemności 1 PMR−56.38
Zamrażanie światła 1 PMR193.8248.46Zamrażanie światła 1 PMR−56.38
Zamrażanie Dark 2 PMR48.464.07Zamrażanie Dark 2 PMR−56.38
Zamrażanie światła 2 PMR193.8248.46Zamrażanie światła 2 PMR−56.38

Tabela 2: Behawioralne wartości NOEC i LOEC dla kofeiny u danio prążkowanego i głowca amerykańskiego. Wartości stężenia braku obserwowanego efektu (NOEC) oraz najniższego stężenia z obserwowanym efektem (LOEC) (mg/L) dla każdego z punktów końcowych aktywności pływackiej w cyklu światło/ciemność oraz reakcji fotomotorycznych u danio prążkowanego i głowca amerykańskiego eksponowanych na kofeinę. Myślniki oznaczają, że nie zaobserwowano efektów w danym punkcie końcowym przy wszystkich poziomach traktowania.

Rysunek 2 przedstawia całkowitą aktywność lokomotoryczną oraz PMR danio pręgowanego iゴーbia białopławka po 96 h ekspozycji na kofeinę. PMR larwゴーbia białopławka uległy zmianie pod wpływem kofeiny przy niższych stężeniach (0,038 mg/L) niż u danio pręgowanego, jednak w przypadku danio pręgowanego zmiany objęły znacznie większą liczbę punktów końcowych fotomotorycznych. Najwyższe stężenie kofeiny (193,82 mg/L) zmieniło PMR u danio pręgowanego, przy czym reakcje te były dokładnie odwrotne w stosunku do grup kontrolnych. Przy tym podwyższonym poziomie stężenia PMR zmalały w warunkach ciemności i wzrosły w warunkach oświetlenia.

Wpływ kofeiny na lokomocję danio pręgowanego: wykresy liniowe A, C; wykresy słupkowe B, D; analiza fotoperiodowa.
Rycina 2: Aktywność pływacka i reakcje fotomotoryczne danio pręgowanego (A i B) oraz minnow głowiastego (C i D) po 96 h ekspozycji na kofeinę. Średnią (± SEM) odległość przepłyniętą przez danio pręgowanego (A) i minnow głowiastego (C) przedstawiono za pomocą punktów, z których każdy reprezentuje 1-minutowe odstępy aktywności. Reakcje fotomotoryczne danio pręgowanego (B) i minnow głowiastego (D) zmierzono jako zmianę średniej (± SE) całkowitej przebytej odległości między ostatnimi minutami początkowego fotoperiodu a pierwszą minutą okresu następnego. Zmierzono reakcje fotomotoryczne dla dwóch okresów ciemnych i dwóch okresów jasnych. Do obserwacji behawioralnych wykorzystano łącznie 24 (4 powtórzenia po 6 larw) sztuki danio pręgowanego i 12 (3 powtórzenia po 4 larwy) sztuk minnow głowiastego. *p <0.10; ** p <0.05; *** p <0.01. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Oprócz pomiaru PMR larw, przeanalizowano aktywność lokomotoryczną w warunkach oświetlenia oraz ciemności w obrębie trzech progów prędkości dla przebytej odległości, liczby ruchów oraz czasu trwania ruchów. Dane te zostały wykorzystane do opracowania profili odpowiedzi behawioralnych na kofeinę (Rysunek 3, Dodatkowy Rysunek 1). W obu modelach ryb kofeina hamowała aktywność we wszystkich istotnie zmienionych punktach końcowych lokomocji. Oba modele ryb wykazały zwiększoną aktywność przy progach prędkości gwałtownych ruchów (bursting) po ekspozycji na kofeinę, choć nie było to istotne statystycznie. Podobnie jak w wynikach obserwacji PMR, kofeina wpłynęła na większą liczbę punktów końcowych lokomocji u danio pręgowanego. W rzeczywistości kofeina istotnie zmieniła kilka odpowiedzi lokomotorycznych w warunkach ciemności przy poziomach realistycznych środowiskowo, poniżej THV. Jednakże aktywność lokomotoryczna głowca minnow nie była istotnie zmieniona w warunkach oświetlenia przy żadnym poziomie traktowania.

Wykresy radarowe zachowania danio pręgowanego; wpływ kofeiny na aktywność; wyniki analizy danych, tabela statystyczna.
Rycina 3: Profile odpowiedzi larw danio pręgowanego i gorzkopławika głowiasza po 96 h ekspozycji na kofeinę. Średnia aktywność pływacka danio pręgowanego w ciemności (A) i w świetle (B) w porównaniu do średniej aktywności gorzkopławika głowiasza w ciemności (C) i w świetle (D) po 96 h ekspozycji na kofeinę. Przedstawione dane obrazują aktywność podczas dwóch 10 min fotoperiodów ciemnych i dwóch 10 min fotoperiodów jasnych dla każdego modelu ryb. Dane zostały znormalizowane względem grupy kontrolnej, która jest reprezentowana przez oś 0 na każdym wykresie. Parametry behawioralne obejmują przebyty dystans, liczbę ruchów (liczniki) oraz czas trwania każdego ruchu w trzech zakresach prędkości: gwałtownych (>20 mm/s), przelotowych (5–20 mm/s) i zastygnięć (<5 mm/s). Oprócz wzorców ruchów dla każdego progu prędkości, przedstawiono całkowity przebyty dystans oraz całkowitą liczbę ruchów. ↑ oznacza istotny wzrost aktywności w porównaniu z grupą kontrolną, a ↓ oznacza istotny spadek aktywności w porównaniu z grupą kontrolną. W obserwacjach behawioralnych dla każdej grupy wykorzystano łącznie 24 (4 powtórzenia po 6 larw) osobników danio pręgowanego oraz 12 (3 powtórzenia po 4 larwy) osobników gorzkopławika głowiasza. *p <0,10; ** p <0,05; *** p <0,01. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina dodatkowa 1: Reakcje fotomotoryczne danio pręgowanego (A i B) oraz gorzkawicy (C i D) w trzech progach prędkości. Reakcje fotomotoryczne larw danio pręgowanego (A, B i C) oraz gorzkawicy (D, E i F) w trzech progach prędkości (Zatrzymanie: 20 mm/s) po 96-godzinnej ekspozycji na kofeinę. Reakcje fotomotoryczne danio pręgowanego i gorzkawicy mierzone są jako zmiana średniego (±SE) całkowitego przebytego dystansu między ostatnimi minutami początkowego fotoperiodu a pierwszą minutą następnego okresu. Zmierzono reakcje fotomotoryczne w dwóch okresach ciemnych i dwóch okresach jasnych. Do obserwacji behawioralnych wykorzystano łącznie 24 (4 powtórzenia po 6 larw) osobniki danio pręgowanego i 12 (3 powtórzenia po 4 larwy) osobników gorzkawicy. *p <0.01 Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Przy wyborze poziomów leczenia chemicznego do badań toksykologii behawioralnej należy wziąć pod uwagę kilka czynników. Poziomy uzdatniania kofeiną w niniejszym badaniu zostały wybrane na podstawie wartości górnego centyla dla przewidywanych scenariuszy narażenia środowiskowego ze ścieków16. Tam, gdzie to możliwe, rutynowo dobieramy poziomy uzdatniania dla badań toksykologicznych w środowisku wodnym, stosując probabilistyczne oceny narażenia w ramach obserwacji środowiskowych 19,20,21. THV, który można obliczyć dla leków, został również uwzględniony jako poziom leczenia w niniejszym badaniu. Wartości THV (Równanie 1)22,23 są definiowane jako przewidywane stężenia wody prowadzące do dawek terapeutycznych (Cmax) dla ludzi (Cmax) farmaceutyków u ryb23, są inspirowane wstępnymi wysiłkami modelowania osocza24 i są obliczane na podstawie współczynników podziału chemicznego krew – woda (Równanie 2)25.

THV = Cmax / log PBW (równanie 1)

log PBW = log [(100,73 . log Kow · 0,16)+0,84] (Równanie 2)

W tym miejscu wybieramy również poziomy leczenia subletalnego w stosunku do wartości LC50 danio pręgowanego i strzebli grubogłowych. Uważamy to podejście za przydatną procedurę porównawczą dla reakcji behawioralnych, szczególnie podczas porównywania progów określonych zachowań z modelem ryb w wielu substancjach chemicznych. Ułatwia to również obliczanie stosunków ostrych do przewlekłych, co może być diagnostycznie przydatne w toksykologii wodnej do badań i ocen mechanistycznych. Wartości LC50 uzyskano ze wstępnych testów biologicznych toksyczności zgodnie ze znormalizowanymi wytycznymi podanymi w kroku 2.1.

W niniejszym protokole stosujemy powszechne projekty eksperymentalne i techniki statystyczne zalecane przez amerykańską EPA i znormalizowane metody OECD do badań toksykologicznych na modelach ryb. Chociaż podajemy wartości p (np. <0,01, <0,05, <0,10), znaczące różnice (α = 0,10) w poziomach aktywności są identyfikowane między zabiegami za pomocą analizy wariancji (ANOVA), jeśli spełnione są założenia normalności i równoważności wariancji. Testy post hoc HSD Dunnetta lub Tukeya są wykonywane w celu zidentyfikowania różnic w poziomie leczenia. Wybieramy tę wartość alfa (α = 0,10), aby zmniejszyć błędy typu II, szczególnie w przypadku testów wczesnego poziomu i gdy zrozumienie biologicznie ważnej wielkości efektu jest ograniczone dla niedostatecznie badanych behawioralnych punktów końcowych i organizmów modelowych26, zamiast stosować procedury bardziej powszechne w naukach biomedycznych do wielokrotnych porównań (np. poprawka Bonferroniego dla danych RNA-Seq)27. Potrzebne są przyszłe badania, aby zrozumieć zmienność tych reakcji behawioralnych i potencjalnie odpowiednio zmodyfikować projekty eksperymentalne (np. zwiększyć replikację).

Oprócz narażenia na chemikalia na zachowanie larw ryb może wpływać wiele czynników. Na przykład pora dnia, wiek, wielkość studni, temperatura, warunki oświetleniowe i objętość roztworu ekspozycyjnego w każdej studzience stanowią ważne czynniki11,30. Z tych powodów należy podjąć środki ostrożności w celu zminimalizowania wpływu czynników zewnętrznych, które mogłyby wpływać na zachowanie lokomotoryczne larw ryb podczas eksperymentów. Obserwacje behawioralne powinny być prowadzone w wąskich oknach czasowych (od 3 do 4 godzin) i w różnych okresach, w których oczekuje się, że wpływ pory dnia będzie miał minimalny wpływ na zachowanie lokomotoryczne larw11. Ponadto larwy ryb powinny być utrzymywane w stałej temperaturze (28 ± 1 °C w przypadku danio pręgowanego i 24 ± 1 °C w przypadku FHM) oraz w określonym cyklu światło/ciemność w inkubatorach o kontrolowanej temperaturze przez cały okres narażenia. Ponadto temperatura w laboratorium, w którym rejestrowane są zachowania, powinna być utrzymywana na poziomie zbliżonym do warunków eksperymentalnych, aby uniknąć wpływu temperatury na zachowania. Co więcej, studnie używane podczas obserwacji behawioralnych powinny być utrzymywane na stałym poziomie głośności dla każdej pojedynczej ryby.

Larwy i zarodki danio pręgowanego były wcześniej wykorzystywane w naukach biomedycznych do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych dla nowych związków12,13. Protokół ten rozszerza wcześniejsze badania behawioralne z danio pręgowanym, wykorzystując 38 punktów końcowych do zbadania bioaktywności chemicznej zanieczyszczeń środowiska. Chociaż kofeina jest powszechnym zanieczyszczeniem wodnym o znanym mechanizmie działania (MoA), wielu związkom w handlu brakuje ważnych danych mechanistycznych. W związku z tym protokół ten można wykorzystać do uzyskania wglądu w MoA dla związków, które nie mają danych o toksyczności, w tym komercyjnych chemikaliów39. Ponadto protokół zawiera metody dla dwóch najczęściej używanych modeli ryb. Jak wspomniano wcześniej, podczas gdy danio pręgowany jest powszechnym modelem ryb biomedycznych, który staje się coraz bardziej popularny w ekotoksykologii, strzebla grubogłowa jest powszechnie stosowana jako model ekologiczny do zastosowań oceny środowiska, ale w badaniach behawioralnych z użyciem zautomatyzowanych systemów poświęcono jej stosunkowo mniej uwagi w porównaniu z danio pręgowanym. Chociaż nadal nie ma znormalizowanych metod regulacyjnych dla badań toksykologii behawioralnej ryb, Protokół ten stanowi podejście wspierające przyszłe wysiłki.

Kofeina wywołała reakcje behawioralne w każdym z modeli ryb na poziomach, które zostały wykryte w środowisku wodnym16. Rodriguez-Gil i in. 2018 opracowali globalny rozkład narażenia środowiskowego w systemach wodnych na podstawie zmierzonych wartości kofeiny16. W szczególności 95% przewidywanych stężeń ścieków w ściekach spadłoby poniżej LOEC dla najbardziej wrażliwych behawioralnych punktów końcowych danio pręgowanego i strzebli grubogłowych w niniejszym badaniu (Tabela 2). Chociaż zaobserwowano kilka behawioralnych skutków kofeiny u danio pręgowanego (szczególnie w ciemnych warunkach) na poziomach istotnych dla środowiska, nie jest jasne, czy te modyfikacje behawioralne mogą wystąpić w naturalnych populacjach ryb, czy też skutkować istotnymi dla środowiska niekorzystnymi skutkami. Chociaż są przydatne do wrażliwych, diagnostycznych badań przesiewowych, progi behawioralne larw ryb mogą nie być reprezentatywne dla innych etapów historii życia lub ryb w naturalnych populacjach. Dalsze badania są uzasadnione w celu ustalenia, czy podobne progi reakcji behawioralnej występowałyby w naturze i wskazywałyby na niekorzystne wyniki na poziomie indywidualnym lub populacyjnym organizacji biologicznej.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Wsparcie dla tego badania zostało zapewnione przez U.S. National Science Foundation (Projekt #: CHE-1339637) z dodatkowym wsparciem ze strony Amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska. Dziękujemy dr Jone Corrales, dr Lauren Kristofco, Gavinowi Saariemu, Samuelowi Haddadowi, Bekah Burket i Bridgett Hill za ogólne wsparcie laboratoryjne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ViewPoint ZebraboxViewPointPlatforma ZebraLab i ZebraLab do zautomatyzowanych obserwacji behawioralnych
KofeinaSigma-AldrichC0750-100GStudy
InkubatorVWR9110589Utrzymuje cykl jasny/ciemny i temperaturę w eksperymentach z rybką grubogłową
InkubatorThermo Fisher Scientific35824-636Utrzymuje cykl światła/ciemności i temperaturę w eksperymentach z danio pręgowanym
Szklane zlewki 100 mlVWR89000-200Komory ekspozycyjne danio pręgowanego 
Zlewki szklane 500 ml PyrexEW-34502-03Komory ekspozycyjne dla rybki grubogłowej
5,000 &mikro; L autopipetaEppendorfResearch 5000Służy do napełniania pojedynczych studzienek w płytkach studzienkowych
Pippettes transferoweVWR414-004-004Służy do przenoszenia badanych organizmów 
Płytki 48-dołkoweFisher Scientific08-772-52Komory do rejestracji behawioralnej larw danio pręgowanego Płytki
24-dołkoweVWR10062-896Komory do rejestracji behawioralnej larw rybki grubogłowej
Dwuwodny siarczan wapniaSigma-AldrichC3771Do odtworzonej twardej wody
Siarczan magnezuSigma-AldrichM7506Do odtworzonej twardej wody
Wodorowęglan sodu Sigma-AldrichS5761Do odtworzonej twardej wody
Chlorek potasuSigma-AldrichP9333Do odtworzonego
systemu recyrkulacyjnego z-modMorskie systemySystem recyrkulacyjny do hodowli kultur danio pręgowanego
Oprogramowanie do analizy statystycznejSigma Plot Wersja 13.0Służy do analizy danych beahvioral i tworzenia liczb
Oprogramowanie do analizy statystycznejGraphpad PrismPrism 5Służy do tworzenia figurek 
Autosampler/system pompowania czwartorzędowegoAgilent TechnologiesInfinity 1260 Analityczna weryfikacja poziomów leczenia kofeiną
Gradient termiczny strumienia cieplnego źródło jonizacji elektrorozpylaniaAgilent TechnologiesAnalityczna weryfikacja poziomów leczenia kofeiną
Potrójny kwadrupolowy analizator masy Agilent TechnologiesModel 6420Analityczna weryfikacja poziomów leczenia kofeiną
10  cm  &czasy;   2.1  mm Kolumna Poroshell 120 SB-AQ (120Å, 2.7) Agilent Technologies685775-914TChromatografia kafliwa 
Oprogramowanie optymalizatora MassHunter Agilent TechnologiesOkreśl tryb jonizacji, monitorowane przejścia i parametry instrumentalne dla kofeiny/kofeiny-d9 i paraksantyny/paraksantyny-d6
chemiczny z twardą wodą biotechnologiczne

Bibliografia

  1. Malaj, E., et al. Organic chemicals jeopardize the health of freshwater ecosystems on the continental scale. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9549-9554 (2014).
  2. Schäfer, R. B., Kühn, B., Malaj, E., König, A., Gergs, R. Contribution of organic toxicants to multiple stress in river ecosystems. Freshwater Biology. 61 (12), 2116-2128 (2016).
  3. Andersen, M. E., Krewski, D. Toxicity testing in the 21st century: bringing the vision to life. Toxicological Sciences. 107 (2), 324-330 (2008).
  4. Rovida, C., Hartung, T. Re-evaluation of animal numbers and costs for in vivo tests to accomplish REACH legislation requirements for chemicals-a report by the transatlantic think tank for toxicology (t (4)). Altex. 26 (3), 187-208 (2009).
  5. Council, N. R. Toxicity testing in the 21st century: a vision and a strategy. , National Academies Press. (2007).
  6. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release. 164 (2), 192-204 (2012).
  7. Scholz, S., Fischer, S., Gündel, U., Küster, E., Luckenbach, T., Voelker, D. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment-applications beyond acute toxicity testing. Environmental Science and Pollution Research. 15 (5), 394-404 (2008).
  8. Fraysse, B., Mons, R., Garric, J. Development of a zebrafish 4-day embryo-larval bioassay to assess toxicity of chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 63 (2), 253-267 (2006).
  9. Noyes, P. D., Haggard, D. E., Gonnerman, G. D., Tanguay, R. L. Advanced morphological-behavioral test platform reveals neurodevelopmental defects in embryonic zebrafish exposed to comprehensive suite of halogenated and organophosphate flame retardants. Toxicological Sciences. 145 (1), 177-195 (2015).
  10. Colón-Cruz, L., et al. Alterations of larval photo-dependent swimming responses (PDR): New endpoints for rapid and diagnostic screening of aquatic contamination. Ecotoxicology and Environmental Safety. 147, 670-680 (2018).
  11. Kristofco, L. A., et al. Age matters: developmental stage of Danio rerio larvae influences photomotor response thresholds to diazinion or diphenhydramine. Aquatic Toxicology. 170, 344-354 (2016).
  12. Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science. 327 (5963), 348-351 (2010).
  13. Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nature Chemical Biology. 6 (3), 231-237 (2010).
  14. Bruton, T., Alboloushi, A., DeL a Garza, B., Kim, B. -O., Halden, R. U. Contaminants of Emerging Concern in the Environment: Ecological and Human Health Considerations. , ACS Publications. 257-273 (2010).
  15. Woudenberg, A. B., et al. Zebrafish embryotoxicity test for developmental (neuro) toxicity: Demo case of an integrated screening approach system using anti-epileptic drugs. Reproductive Toxicology. 49, 101-116 (2014).
  16. Rodríguez-Gil, J., Cáceres, N., Dafouz, R., Valcárcel, Y. Caffeine and paraxanthine in aquatic systems: Global exposure distributions and probabilistic risk assessment. Science of the Total Environment. 612, 1058-1071 (2018).
  17. Corrales, J., et al. Toward the Design of Less Hazardous Chemicals: Exploring Comparative Oxidative Stress in Two Common Animal Models. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 893-904 (2017).
  18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  19. Kristofco, L. A., Brooks, B. W. Global scanning of antihistamines in the environment: Analysis of occurrence and hazards in aquatic systems. Science of the Total Environment. 592, 477-487 (2017).
  20. Saari, G. N., Scott, W. C., Brooks, B. W. Global assessment of calcium channel blockers in the environment: Review and analysis of occurrence, ecotoxicology and hazards in aquatic systems. Chemosphere. , (2017).
  21. Corrales, J., et al. Toward the Design of Less Hazardous Chemicals: Exploring Comparative Oxidative Stress in Two Common Animal Models. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 893-904 (2017).
  22. Berninger, J. P., et al. Effects of the antihistamine diphenhydramine on selected aquatic organisms. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (9), 2065-2072 (2011).
  23. Brooks, B. W. Fish on Prozac (and Zoloft): ten years later. Aquatic Toxicology. 151, 61-67 (2014).
  24. Huggett, D., Cook, J., Ericson, J., Williams, R. A theoretical model for utilizing mammalian pharmacology and safety data to prioritize potential impacts of human pharmaceuticals to fish. Human and Ecological Risk Assessment. 9 (7), 1789-1799 (2003).
  25. Fitzsimmons, P. N., Fernandez, J. D., Hoffman, A. D., Butterworth, B. C., Nichols, J. W. Branchial elimination of superhydrophobic organic compounds by rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquatic Toxicology. 55 (1-2), 23-34 (2001).
  26. Scheiner, S. M., Gurevitch, J. Design and Analysis of Ecological Experiments. , Oxford University Press. (2001).
  27. Nakagawa, S. A farewell to Bonferroni: the problems of low statistical power and publication bias. Behavioral Ecology. 15 (6), 1044-1045 (2004).
  28. Bean, T. G., et al. Pharmaceuticals in water, fish and osprey nestlings in Delaware River and Bay. Environmental Pollution. 232, 533-545 (2018).
  29. Richendrfer, H., Pelkowski, S., Colwill, R., Creton, R. On the edge: pharmacological evidence for anxiety-related behavior in zebrafish larvae. Behavioural Brain Research. 228 (1), 99-106 (2012).
  30. Padilla, S., Hunter, D., Padnos, B., Frady, S., MacPhail, R. Assessing locomotor activity in larval zebrafish: Influence of extrinsic and intrinsic variables. Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 624-630 (2011).
  31. Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
  32. Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
  33. Hutson, L. D., Liang, J. O. Making an impact: zebrafish in education. Zebrafish. 6, 119(2009).
  34. Hutson, L. D., Liang, J. O., Pickart, M. A., Pierret, C., Tomasciewicz, H. G. Making a difference: education at the 10th international conference on zebrafish development and genetics. Zebrafish. 9 (4), 151-154 (2012).
  35. Kane, A., Salierno, J., Brewer, S. Fish models in behavioral toxicology: automated techniques, updates and perspectives. Methods in Aquatic Toxicology. 2, 559-590 (2005).
  36. Rodriguez, A., et al. ToxTrac: a fast and robust software for tracking organisms. Methods in Ecology and Evolution. 9 (3), 460-464 (2018).
  37. Hamm, J., Wilson, B., Hinton, D. Increasing uptake and bioactivation with development positively modulate diazinon toxicity in early life stage medaka (Oryzias latipes). Toxicological Sciences. 61 (2), 304-313 (2001).
  38. Kristofco, L. A., Haddad, S. P., Chambliss, C. K., Brooks, B. W. Differential uptake of and sensitivity to diphenhydramine in embryonic and larval zebrafish. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 1175-1181 (2018).
  39. Steele, W. B., Kristofco, L. A., Corrales, J., Saari, G. N., Haddad, S. P., Gallagher, E. P., Kavanagh, T. J., Kostal, J., Zimmerman, J. B., Voutchkova-Kostal, A., Anastas, P. T., Brooks, B. W. Comparative behavioral toxicology of two common larval fish models: exploring relationships between modes of action and locomotor responses. Science of the Total Environment. 460-461, 1587-1600 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Zachowanie larw rybodpowied fotomotorycznaekspozycja na kofeinmodel zebrafishg owionek ameryka skizautomatyzowany trackingcykl wiat o ciemnoaktywno lokomotorycznabioanaliza toksyczno cifarmakologia rodowiskowa
Eksperymentalny protokół badania profili reakcji behawioralnych u larw ryb: zastosowanie do neurostymulantu kofeiny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.