Method Article

Eksperymentalny protokół badania profili reakcji behawioralnych u larw ryb: zastosowanie do neurostymulantu kofeiny

DOI:

10.3791/57938

⸱

July 24th, 2018

 ,  , 
1Department of Environmental Science, Center for Reservoir and Aquatic Systems Research, Baylor University, 2Institute of Biomedical Studies, Baylor University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do badania aktywności lokomotorycznej larw danio pręgowanego i strzebli grubogłowych oraz reakcji fotomotorycznych (PMR) za pomocą automatycznego oprogramowania śledzącego. Po włączeniu do powszechnych testów biologicznych toksykologicznych, analizy tych zachowań stanowią narzędzie diagnostyczne do badania bioaktywności chemicznej. Protokół ten jest opisany przy użyciu kofeiny, modelowego neurostymulantu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele i zachowania ryb są coraz częściej używane w naukach biomedycznych; jednak ryby od dawna są przedmiotem badań ekologicznych, fizjologicznych i toksykologicznych. Korzystając ze zautomatyzowanych cyfrowych platform śledzących, najnowsze wysiłki w dziedzinie neurofarmakologii wykorzystują zachowania lokomotoryczne larw ryb do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych dla nowych małych cząsteczek. Podobnie jak te wysiłki, badania z zakresu nauk o środowisku oraz farmakologii porównawczej i toksykologii analizują różne zachowania modeli ryb jako narzędzia diagnostyczne w wielopoziomowej ocenie zanieczyszczeń i monitorowaniu wód powierzchniowych w czasie rzeczywistym pod kątem zagrożeń związanych z zanieczyszczeniami. Podczas gdy danio pręgowany jest popularnym modelem larwy ryby w naukach biomedycznych, strzebla grubogłowa jest powszechnym modelem larw ryb w ekotoksykologii. Niestety, larwy strzebli grubogłowych otrzymały znacznie mniej uwagi w badaniach behawioralnych. W tym miejscu opracowujemy i demonstrujemy protokół profilu behawioralnego wykorzystujący kofeinę jako modelowy neurostymulant. Chociaż reakcje fotomotoryczne rybek grubogłowych były czasami zakłócane przez kofeinę, danio pręgowany był znacznie bardziej wrażliwy na fotomotoryczne i lokomotoryczne punkty końcowe, które reagowały na poziomach istotnych dla środowiska. Potrzebne są przyszłe badania, aby zrozumieć porównawcze różnice wrażliwości behawioralnej między rybami w zależności od wieku i pory dnia oraz ustalić, czy podobne efekty behawioralne wystąpią w naturze i będą wskazywać na niekorzystne wyniki na poziomie indywidualnym lub populacyjnym organizacji biologicznej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż modele ryb są coraz częściej wykorzystywane do badań biomedycznych, ryby są rutynowo wykorzystywane do badań ekologii i fizjologii, do badania skażenia wód powierzchniowych i do zrozumienia progów toksykologicznych chemikaliów. Takie działania są ważne, ponieważ zanieczyszczenie chemiczne może zaszkodzić ekosystemom wodnym i zagrozić jakości źródeł zaopatrzenia w wodę1,2. Jednak większość chemikaliów w handlu nie ma nawet podstawowych informacji toksykologicznych3.

Testy na modelach zwierzęcych tradycyjnie używane w regulacyjnych testach toksyczności są zasobożerne i nie mogą zapewnić wysokiej przepustowości, wczesnego poziomu badań przesiewowych potrzebnych do testowania toksyczności w XXI wieku4. W związku z tym rośnie impuls do przyjęcia i wykorzystania modeli in vitro, które mogą szybciej i skuteczniej badać związki pod kątem aktywności biologicznej3,5. Chociaż modele komórkowe oferują wiele możliwości, często brakuje im złożoności biologicznej, a tym samym nie uwzględniają wielu ważnych procesów zachodzących w całym organizmie, w tym metabolizmu6.

Danio pręgowany to powszechny biomedyczny model zwierzęcy, który zyskuje na popularności jako alternatywny model w toksykologii wodnej i ekotoksykologii7,8. Biorąc pod uwagę ich niewielkie rozmiary, szybki rozwój i wysoką płodność, modele ryb mogą być używane do szybkiego i skutecznego badania substancji chemicznych pod kątem bioaktywności i toksyczności w skali całego organizmu9. Dzięki zautomatyzowanemu oprogramowaniu śledzącemu, zachowania larw danio pręgowanego zapewniają zwiększoną użyteczność diagnostyczną w badaniach przesiewowych zanieczyszczeń pod kątem toksyczności10,11. Badania w naukach farmaceutycznych wykazały, że lokomotoryczne punkty końcowe informują o chemicznych mechanizmach działania, mogą być wykorzystywane do fenotypowania zachowań, a następnie mogą wstępnie identyfikować subkomórkowe cele dla nowych cząsteczek12,13. Podczas gdy danio pręgowany jest popularnym modelem larwalnym ryb w naukach biomedycznych, strzebla grubogłowa jest powszechnym, ważnym ekologicznie modelem ryby, który jest wykorzystywany do badań ekotoksykologicznych oraz podczas prospektywnych (np. nowe oceny chemiczne) i retrospektywnych (np. monitorowanie wód powierzchniowych lub ścieków) ocen środowiskowych. Niestety, reakcjom behawioralnym larw rybek grubogłowych poświęcono znacznie mniej uwagi niż danio pręgowanemu. Nasze trwające badania z dwoma powszechnymi modelami larw ryb, danio pręgowanym i strzeblą grubogłowych, sugerują, że wzorce pływania larw ryb wydają się unikalne dla przewidywanych trybów lub mechanizmów działania różnych substancji chemicznych. W związku z tym behawioralne punkty końcowe dają możliwość szybkiego i wrażliwego badania substancji chemicznych pod kątem toksyczności oraz identyfikacji celów subkomórkowych dla przemysłowych zanieczyszczeń chemicznych i innych, szczególnie podczas ocen na wczesnym poziomie.

Tutaj przedstawiamy protokół badania profili reakcji behawioralnych u larw ryb. Demonstrujemy te metody przy użyciu kofeiny, modelowego neurostymulantu i powszechnego zanieczyszczenia wodnego, które jest wprowadzane do systemów wodnych poprzez zrzut z oczyszczalni ścieków po spożyciu przez ludzi żywności, napojów i farmaceutyków zawierających kofeinę14. Badamy reakcje behawioralne na kofeinę zarówno u larw danio pręgowanego, jak i strzebla grubogłowych, w tym na nagłą zmianę warunków oświetleniowych, która jest często określana jako reakcja fotomotoryczna (PMR) podczas badań farmaceutycznych z embrionalnymi i larwalnymi danio pręgowanym13,15. Następnie identyfikujemy wpływ kofeiny na kilka lokomotorycznych punktów końcowych, aby opracować profile odpowiedzi chemicznej dla każdego modelu ryby. Poziomy leczenia kofeiną użyte w tym badaniu reprezentują górne centyle rozkładu ekspozycji w oparciu o zmierzone wartości środowiskowe caffeine16. Uwzględniamy również leczenie odnoszące się do wartości LC50 larw ryb oraz wartości zagrożenia terapeutycznego (THV), stężenia farmaceutycznego w wodzie, które zgodnie z przewidywaniami spowoduje stężenie w osoczu ryb zgodne z terapeutyczną dawką w osoczu dla ludzi.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania w tym protokole zazwyczaj opierają się na standardowym projekcie eksperymentalnym i zalecanych wytycznych analizy statystycznej od Amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska (EPA nr 2000.0) dla ryb grubogłowych i Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD nr 236) dla danio pręgowanego. Te eksperymentalne projekty (np., zwiększając replikację) mogą być modyfikowane w ramach obecnego protokołu na potrzeby przyszłych badań. Warunki hodowli ryb są zgodne z wcześniej opublikowaną literaturą17. Wszystkie procedury eksperymentalne i protokoły hodowli ryb były zgodne z protokołami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania zatwierdzonymi na Uniwersytecie Baylor.

1. Narażanie ryb na obróbkę chemiczną

  1. Przygotuj roztwory ekspozycyjne na kofeinę, rozpuszczając kofeinę w odtworzonej twardej wodzie. Wykonaj odpowiednie seryjne rozcieńczenia, rozcieńczając wyższe dawki kofeiny twardą wodą, aby uzyskać niższe poziomy kofeiny.
    UWAGA: Tabela 1 podsumowuje każdy z poziomów leczenia zastosowanych w tym eksperymencie.
pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. ) ) pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.
Danio pręgowanyGrubogłowa Ryba
leczenieNominalne stężenie kofeiny (mg/l)Zmierzone stężenie kofeiny (mg/l)leczenieNominalne stężenie kofeiny (mg/l)Zmierzone stężenie kofeiny (mg/l)
kontrola0< Szczegółowośćkontrola0< Szczegółowość
75. centyl*0,0010,00175. centyl*0,0010,001
95. centyl*0,0390,01395. centyl*0,0390,009
99. centyl*0,4120,36199. centyl*0,4120,310
THV (Wieża NarodowaGodzina 4.07Pytanie 3,81THV (Wieża NarodowaGodzina 4.07Rozdział 4.12
10% LC50Z numerem 48,46Z dnia 46,6610% LC50Rozdział 14,1Pytanie 14,7
40% PO50193,82186,6740% PO5056,3853,91

Tabela 1: Eksperymentalne terapie kofeiną dla eksperymentów z danio pręgowanym i strzeblą grubogłową. Podaje się nominalne i zmierzone wartości kofeiny dla każdego zabiegu. *Terapie kofeiną zastosowane w tym badaniu reprezentują górne centyle rozkładu ekspozycji w oparciu o zmierzone wartości środowiskowe kofeiny16. THV: Terapeutyczna wartość zagrożenia. LOD: Granica wykrywalności

  1. Wlej przygotowany roztwór do indywidualnych szpachli ekspozycyjnych. Do komór ekspozycyjnych dla danio pręgowanego należy stosować szklane zlewki o pojemności 100 ml wypełnione 20 ml roztworu ekspozycyjnego, a do komór ekspozycyjnych dla ryb danio pręgowanych zlewki o pojemności 500 ml z 200 ml roztworu ekspozycyjnego.
  2. Za pomocą pipety transferowej umieść 10 zarodków danio pręgowanego w wieku 4–6 godzin po zapłodnieniu (hpf) w każdej z czterech powtórzonych komór ekspozycyjnych na zabieg.
  3. Umieścić 10 larw strzebli grubogłowych dojrzewających w ciągu 24 godzin od wyklucia w każdej z trzech powtórzonych komór ekspozycyjnych na zabieg. Aby pomieścić większe larwy strzebli grubogłowych, przed przeniesieniem odetnij końcówkę pipety transferowej.
  4. Utrzymuj doświadczenia z danio pręgowanym w czasie 16:8 godzin światło-ciemność i stałą temperaturę 28 ± 1 °C. Zastosuj ten sam reżim fotoperiodyczny do badań nad rybką grubogłową, ale w temperaturze 25 ± 1 °C.
  5. Po 96 godzinach ekspozycji chemicznej załaduj poszczególne ryby do oddzielnych dołków z 48 (w przypadku danio pręgowanego) i 24 (w przypadku rybki grubogłowej) płytek studzienkowych.
    1. Aby upewnić się, że każda studzienka zawiera równą objętość roztworu, należy przenieść larwy dania pręgowanego do 48 dołków za pomocą autopipety o pojemności 5 000 μl, co daje objętość 1 000 μl na studzienkę. Za pomocą pipety automatycznej należy jednocześnie pobrać i przenieść zarówno larwy danio pręgowanego, jak i roztwór ekspozycyjny.
    2. Ze względu na ich większy rozmiar, larwy strzebli grubogłowych należy przenieść za pomocą pipety transferowej z odciętą końcówką. Przed przeniesieniem larw strzebli grubogłowych do poszczególnych studzienek, należy napełnić każdą studzienkę do 2 000 μl za pomocą pipety automatycznej. Podczas przenoszenia pojedynczych larw grubogłowych do studzienek, należy umieścić końcówkę pipety transferowej w roztworze studzienki i pozwolić rybie przepłynąć z końcówki pipety do studzienki.

2. Kalibracja parametrów śledzenia wideo

  1. Przed podjęciem działań behawioralnych należy ustawić parametry obserwacji i kalibracji w oprogramowaniu do śledzenia wideo (patrz Tabela materiałów).
    1. Umieścić płytkę studzienkową w komorze rejestracyjnej z co najmniej 1 larwą ryby w osobnej studzience. Użyj płytki i skojarzonych ryb jako reprezentacji, aby ustawić parametry kalibracji.
    2. W oprogramowaniu do śledzenia wideo kliknij "Plik | Generuj protokół", co otworzy okno dialogowe "kreator tworzenia protokołu". W polu "Liczba lokalizacji" wprowadź liczbę osobników w studni płytki, a następnie kliknij "OK".
    3. U góry ekranu kliknij "Widok | Pełny ekran", co spowoduje wyświetlenie przez system widoku z kamery nad płytą studzienki.
    4. Kliknij ikonę "Rysuj obszary", która pojawia się jako trzy wielokolorowe kształty. Po prawej stronie obszaru wyświetlania płytki studzienki wybierz ikonę koła w polu oznaczonym "Obszary".
    5. Użyj kursora, aby wyznaczyć okrągły obszar śledzenia wideo w lewym górnym rogu płytki studzienki. Wybierz "Znak w prawym górnym rogu", a następnie obrysuj obszar wyświetlania w prawym górnym rogu. Następnie wybierz "Dolny znak", aby dobrze obrysować prawy dolny róg.
      UWAGA: Po narysowaniu okrągłego konturu prawdopodobnie konieczne będzie dostosowanie jego położenia. Aby dostosować położenie konturu, kliknij "wybierz", a następnie użyj kursora, aby przesunąć zarysowany obszar. Konspekty można również powielać, klikając "Kopiuj", a następnie "Wklej".
    6. Po zdefiniowaniu obszarów śledzenia studni w lewym górnym, prawym górnym i prawym dolnym rogu, kliknij "Buduj", aby wyświetlić monit o automatyczne wyznaczenie obszarów wyświetlania pozostałych studni.
    7. W obszarze oznaczonym "Kalibracja" kliknij "Narysuj skalę". Użyj kursora, aby narysować poziomą linię w poprzek płyty. Po narysowaniu linii pojawi się okno dialogowe oznaczone "Pomiar kalibracji". Wprowadź długość płytki studzienki i kliknij "OK".
    8. Wyjdź z menedżera rysunków, klikając ikonę "Rysuj obszary".
    9. Kliknij ikonę "Kafelki". Za pomocą kursora zaznacz wszystkie pola, które pojawiają się na ekranie wyświetlania, tak aby każde pole było zielone.
      UWAGA: Ikona Kafelków pojawia się jako grupa sześciu pojedynczych małych kwadratów
    10. "Kliknij Widok| Pełny ekran". Po prawej stronie obszaru wyświetlania płyty kliknij "Bkg" w polu oznaczonym "Próg wykrywalności". Użyj paska regulacji progu, aby ustawić próg wykrywania pikseli. Po wybraniu odpowiedniego progu wykrywania pikseli kliknij "Zastosuj do grupy".
      UWAGA: Ten protokół ustawia próg wykrywania na 13 w trybie czarnym dla obserwacji danio pręgowanego i na 110 w trybie przezroczystym dla obserwacji ryb grubogłowych.
    11. W polu oznaczonym "Próg ruchu" wprowadź żądane parametry śledzenia prędkości ruchu. Po ustawieniu parametrów prędkości kliknij "Zastosuj do grupy".
      UWAGA: Ten protokół ustawia małe/duże ruchy na 20 mm/s, a nieaktywne/małe ruchy na 5 mm/s. Selekcje te programują oprogramowanie do śledzenia ruchu larw ryb na trzech różnych poziomach prędkości: nieaktywny (zamarzanie) = <5 mm/s, mały (przelotowy) = 5–20 mm/s i duży (pękający) = >20 mm/s.
    12. Kliknij "Parametry | Parametry protokołu" z menu rozwijanego. W oknie dialogowym wybierz zakładkę "Czas". Wprowadź czas obserwacji i czas integracji. Po wprowadzeniu parametrów kliknij "OK".
    13. Aby ustawić czasy jasnego/ciemnego fotoperiodu i intensywność światła dla każdego fotoperiodu, otwórz okno dialogowe ustawień sterownika światła, wybierając "Lekka jazda" z menu rozwijanego "Parametry".
      UWAGA: Zobacz film z protokołem, aby uzyskać informacje na temat ustawiania wielu jasnych i ciemnych fotoperiodów.
    14. Po ustawieniu parametrów śledzenia wideo zapisz protokół obserwacji.
      UWAGA: Ten protokół obserwuje zachowanie ryb w okresie 50 minut, który obejmuje 10-minutową fazę aklimatyzacji, po której następują 4 zmieniające się fazy światła/ciemności, składające się z dwóch 10-minutowych okresów światła i dwóch 10-minutowych okresów ciemności. Czas integracji jest ustawiany tak, aby mierzyć zachowanie dla każdej minuty 50-minutowej próby behawioralnej.

3. Obserwacja zachowań lokomotorycznych i fotomotorycznych larw ryb

  1. Umieścić płytkę studzienkową zawierającą ryby doświadczalne w komorze zapisu behawioralnego.
  2. W oprogramowaniu do śledzenia wideo otwórz protokół śledzenia opracowany w kroku 3.
  3. W przeglądarce śledzenia wideo sprawdź, czy wszystkie larwy są widoczne na ekranie komputera, czy w każdej studzience znajduje się tylko jedna larwa oraz czy poszczególne studzienki są wyrównane w obszarach obserwacji, które zostały zdefiniowane w krokach 2.1.5 i 2.1.6.
  4. Kliknij "Eksperyment | Wykonaj".
    UWAGA: System poprosi użytkownika o podanie nazwy i lokalizacji w celu zapisania danych obserwacji.
  5. Po określeniu nazwy i miejsca zapisu danych obserwacyjnych kliknij ikonę "Kilka obrazów na żywo", aby podświetlić wszystkie predefiniowane obszary wyświetlania
    UWAGA: Ta ikona znajduje się w górnej części ekranu komputera i pojawia się jako pole podzielone na cztery mniejsze kwadraty. Kliknięcie tej ikony podświetli wszystkie predefiniowane obszary wyświetlania.
  6. Zamknij panel komory nagrywania i kliknij "Tło | Start" na monitorze komputera.

4. Analiza danych behawioralnych

  1. Aby pobrać dane o aktywności larw ryb, otwórz arkusz kalkulacyjny, który jest automatycznie kompilowany przez oprogramowanie śledzące i znajduje się w folderze określonym przez użytkownika przed rozpoczęciem prób behawioralnych (krok 3.4).
  2. Zapoznaj się z Rysunki 1A i 1B dla reprezentatywnych pomiarów naiwnej aktywności lokomotorycznej odpowiednio nienarażonych larw danio pręgowanego i strzebli grubogłowych. Zapoznaj się z Rysunki 1C i 1D dla obliczeń PMR, które skutecznie badają wielkość różnicy ruchu między przejściami światła do ciemności lub od ciemności do światła.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przykład wyjściowej aktywności nienarażonej danio pręgowanego (A i B) oraz strzebli grubogłowej (C i D). Średni (± SEM) dystans przepłynięty dla danio pręgowanego (A) i strzebla grubogłowego (C) jest wyrażony za pomocą kropek, z których każda reprezentuje jednominutowe interwały aktywności. Mierzone są dwa ciemne i dwa jasne okresy reakcji fotomotorycznych. Ostatnia (a, c, e i g) i pierwsza (b, d, f i h) minuta każdego fotoperiodu jest wykorzystywana do obliczania PMR. Reakcje fotomotoryczne danio pręgowanego (B) i strzebli grubogłowej (D) są mierzone jako zmiana średniej (±SEM) odległości przebytej między ostatnią minutą początkowego fotoperiodu a pierwszą minutą następnego okresu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poziomy leczenia kofeiną nie zmieniły się znacząco podczas 96-godzinnych eksperymentów z danio pręgowanym i rybkami grubogłowymi. Na przykład w tabeli 1 przedstawiono zweryfikowane analitycznie stężenia każdego poziomu uzdatniania dla każdego z nich. W protokole tym zweryfikowano próbki wody pod kątem poziomów traktowania kofeiną za pomocą tandemowej spektrometrii mas chromatografii cieczowej rozcieńczającej izotopy (LC-MS/MS), ogólnie zgodnie z wcześniej opisanymi metodami28. Określono również ilościowo tworzenie paraksantyny, głównego metabolitu kofeiny. Opis tych procedur analitycznych znajduje się w uzupełniających informacjach analitycznych. Ze względu na podobieństwa między nominalną a analityczną weryfikacją zabiegów, nominalne poziomy leczenia są przedstawione w pozostałej części tego manuskryptu. Kofeina znacząco zmieniła zachowania danio pręgowanego i strzebli grubogłowych. Jednak reakcje lokomotoryczne danio pręgowanego były konsekwentnie bardziej wrażliwe na kofeinę niż strzebla grubogłowa. Najbardziej wrażliwe behawioralne punkty końcowe dla larw danio pręgowanego i strzebli grubogłowych były pod wpływem kofeiny w stężeniu 0,039 mg/L. Tabela 2 podsumowuje najniższe obserwowane stężenia powodujące skutki (LOEC) i stężenia bez obserwowanych skutków (NOEC) dla każdego behawioralnego punktu końcowego w obu modelach ryb.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.
Danio pręgowany Strzebla grubogłowa
punkt końcowy LOEC (mg/L)NOEC (mg/l)punkt końcowy LOEC (mg/L)NOEC (mg/l)
Całkowita odległość: Ciemny0,4120,039Całkowita odległość: Ciemny−56,38
Całkowita odległość światłaZ numerem 48,46Godzina 4.07Całkowita odległość światła−56,38
Suma zliczeń Ciemny0,4120,039Suma zliczeń Ciemny−56,38
Suma zlicza światłoZ numerem 48,46Godzina 4.07Suma zlicza światło−56,38
Odległość pękania Ciemny−193,82Odległość pękania Ciemny−56,38
Światło odległości pękania193,82Z numerem 48,46Światło odległości pękania−56,38
Pękanie liczy ciemne193,82Z numerem 48,46Pękanie liczy ciemne−56,38
Pękanie liczy światło193,82Z numerem 48,46Pękanie liczy światło−56,38
Czas trwania eksplozji Ciemny193,82Z numerem 48,46Czas trwania eksplozji Ciemny−56,38
Lampka czasu trwania bursting−193,82Lampka czasu trwania bursting−56,38
Odległość przelotowa Ciemna0,4120,039Odległość przelotowa Ciemna−56,38
Światło dystansu przelotowegoZ numerem 48,46Godzina 4.07Światło dystansu przelotowego−56,38
Rejs liczy się ciemno0,4120,039Rejs liczy się ciemno−56,38
Rejs liczy się światłoZ numerem 48,46Godzina 4.07Rejs liczy się światło−56,38
Czas trwania rejsu Ciemny0,4120,039Czas trwania rejsu Ciemny−56,38
Czas trwania rejsu ŚwiatłoZ numerem 48,46Godzina 4.07Czas trwania rejsu Światło−56,38
Zamrażanie Odległość Ciemny0,4120,039Zamrażanie Odległość Ciemny0,0390,001
Światło odległości zamarzania0,0390,001Światło odległości zamarzania−56,38
Zamrożenie liczy się ciemno0,4120,039Zamrożenie liczy się ciemno−56,38
Zamrożenie liczy światłoZ numerem 48,46Godzina 4.07Zamrożenie liczy światło−56,38
Czas zamrażania Ciemny−193,82Czas zamrażania Ciemny56,38Godziny 14.10
Czas trwania zamrażania ŚwiatłoZ numerem 48,46Godzina 4.07Czas trwania zamrażania Światło−56,38
Ciemny 1 PMRZ numerem 48,46Godzina 4.07Ciemny 1 PMR0,0390,001
Lekki 1 PMRZ numerem 48,46Godzina 4.07Lekki 1 PMR−56,38
Ciemny 2 PMRZ numerem 48,46Godzina 4.07Ciemny 2 PMR−56,38
Jasny 2 PMRZ numerem 48,46Godzina 4.07Jasny 2 PMR−56,38
Niesamowita ciemność 1 PMR−193,82Niesamowita ciemność 1 PMR−56,38
Światło zrywające 1 PMR−193,82Światło zrywające 1 PMR−56,38
Niesamowita ciemność 2 PMR193,82Z numerem 48,46Niesamowita ciemność 2 PMR−56,38
Światło impulsowe 2 PMR−193,82Światło impulsowe 2 PMR−56,38
Rejs ciemny 1 PMRZ numerem 48,46Godzina 4.07Rejs ciemny 1 PMR−56,38
Światło rejsowe 1 PMRZ numerem 48,46Godzina 4.07Światło rejsowe 1 PMR−56,38
Rejs po zmroku 2 PMRZ numerem 48,46Godzina 4.07Rejs po zmroku 2 PMR−56,38
Światło rejsowe 2 PMR193,82Z numerem 48,46Światło rejsowe 2 PMR56,38Godziny 14.10
Mroźna ciemność 1 PMRZ numerem 48,46Godzina 4.07Mroźna ciemność 1 PMR−56,38
Mroźne światło 1 PMR193,82Z numerem 48,46Mroźne światło 1 PMR−56,38
Mroźna ciemność 2 PMRZ numerem 48,46Godzina 4.07Mroźna ciemność 2 PMR−56,38
Mroźne światło 2 PMR193,82Z numerem 48,46Mroźne światło 2 PMR−56,38

Tabela 2: Behawioralne NOEC i LOEC dla kofeiny u danio pręgowanego i strzebli grubogłowych. Wartości stężenia, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian (NOEC) i najniższych stężeń powodujących obserwowane zmiany (LOEC) (mg/l) dla każdego z punktów końcowych aktywności pływania w ciemności i reakcji fotomotorycznych dla danio pręgowanego i strzebli grubogłowych narażonych na działanie kofeiny. Myślniki oznaczają, że nie zaobserwowano żadnych skutków w określonym punkcie końcowym na wszystkich poziomach leczenia.

Rysunek 2 przedstawia całkowitą aktywność lokomotoryczną i PMR danio pręgowanego i strzebla grubogłowego po 96 godzinach ekspozycji na kofeinę. PMR larw strzebli grubogłowych były zmienione przez kofeinę przy niższych poziomach leczenia (0,038 mg/l) niż danio pręgowany, ale znacznie większa liczba punktów końcowych fotomotorycznych była zaburzona u danio pręgowanego. Najwyższy poziom kofeiny (193,82 mg/l) zmienił PMR u danio pręgowanego, u którego reakcje te były dokładnie odwrotne niż w grupie kontrolnej. Jednak przy tym podwyższonym poziomie leczenia PMR zmniejszyły się w ciemności i wzrosły w warunkach jasnych.

figure-results-1
Rysunek 2: Aktywność pływacka i reakcje fotomotoryczne danio pręgowanego (A i B) oraz strzebli grubogłowej (C i D) po 96 godzinach ekspozycji na kofeinę. Średni (± SEM) dystans przepłynięty dla danio pręgowanego (A) i strzebli grubogłowej (C) jest podawany za pomocą kropek, z których każda reprezentuje 1-minutowe interwały aktywności. Reakcje fotomotoryczne danio pręgowanego (B) i strzebli grubogłowej (D) mierzy się jako zmianę średniej (± SE) całkowitej odległości przebytej między ostatnimi minutami początkowego fotoperiodu a pierwszą minutą następnego okresu. Zmierzono dwie ciemne i dwie jasne reakcje fotomotoryczne. Do obserwacji behawioralnej wykorzystano łącznie 24 (po 4 powtórzenia po 6 larw) danio pręgowanego i 12 (po 3 powtórzenia po 4 larwy) rybek grubogłowych. *p <0,10; ** p <0,05; p <0,01. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Oprócz pomiaru PMR larw, analizowano jasną i ciemną aktywność lokomotoryczną w trzech progach prędkości dla przebytej odległości, liczby ruchów i czasu trwania ruchów. Dane te są wykorzystywane do opracowania profili reakcji behawioralnych dla kofeiny (Rysunek 3, Uzupełniający Rysunek 1). W obu modelach ryb kofeina hamowała aktywność w ogóle istotnie wpływając na lokomotoryczne punkty końcowe. Oba modele ryb wykazały zwiększoną aktywność przy progach prędkości pękania po ekspozycji na kofeinę, choć nie znacząco. Podobnie jak w przypadku wyników obserwacji PMR, kofeina wpływała na większą liczbę lokomotorycznych punktów końcowych danio pręgowanego. W rzeczywistości kofeina znacząco zmieniła kilka reakcji lokomotorycznych w ciemnych warunkach na realistycznych dla środowiska poziomach poniżej THV. Jednak żaden poziom leczenia nie miał znaczącego wpływu na aktywność lokomotoryczną rybki grubogłowej w warunkach oświetleniowych.

figure-results-2
Rycina 3: Profile reakcji larw danio pręgowanego i strzebli grubogłowych po 96 godzinach ekspozycji na kofeinę. Średnia aktywność pływacka danio pręgowanego w ciemności (A) i jasność (B) w porównaniu ze średnią aktywnością strzebli grubogłowych, ciemną (C) i jasną (D) po 96 godzinach ekspozycji na kofeinę. Wykreślone dane reprezentują aktywność w dwóch 10-minutowych ciemnych fotoperiodach i dwóch 10-minutowych fotoperiodach światła dla każdego modelu ryb. Dane są znormalizowane do formantu, który jest reprezentowany na osi 0 na każdej ilustracji. Parametry behawioralne obejmują przebyty dystans, liczbę ruchów (zliczenia) i czas trwania każdego ruchu na 3 poziomach prędkości, pękanie (>20 mm/s), rejs (5–20 mm/s) i zamrażanie (<5 mm/s). Oprócz wzorców ruchu przy każdym z progów prędkości, reprezentowany jest całkowity przebyty dystans i całkowita liczba ruchów. ↑ oznacza znaczny wzrost aktywności w porównaniu z kontrolą, a ↓ oznacza znaczny spadek aktywności w porównaniu z kontrolą. W sumie 24 (po 4 repliki po 6 larw) danio pręgowanego i 12 (po 3 repliki po 4 larwy) rybki grubogłowej zostały wykorzystane w obserwacjach behawioralnych dla każdej grupy. *p <0,10; ** p <0,05; p <0,01. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Reakcje fotomotoryczne danio pręgowanego (A i B) oraz rybki grubogłowej (C i D) na trzech progach prędkości. Reakcje fotomotoryczne danio pręgowanego (A, B i C) i larw strzebli grubogłowej (D, E i F) w trzech progach prędkości (zamrażanie: 20 mm / s) po 96 godzinach ekspozycji na kofeinę. Reakcje fotomotoryczne danio pręgowanego i strzebli grubogłowej są mierzone jako zmiana średniej (±SE) całkowitej odległości przebytej między ostatnimi minutami początkowego fotoperiodu a pierwszą minutą następnego okresu. Zmierzono dwie ciemne i dwie jasne reakcje fotomotoryczne. Do obserwacji behawioralnej wykorzystano łącznie 24 (po 4 powtórzenia po 6 larw) danio pręgowanego i 12 (3 powtórzenia po 4 larwy) rybek grubogłowych. *p <0.01 Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przy wyborze poziomów leczenia chemicznego do badań toksykologii behawioralnej należy wziąć pod uwagę kilka czynników. Poziomy uzdatniania kofeiną w niniejszym badaniu zostały wybrane na podstawie wartości górnego centyla dla przewidywanych scenariuszy narażenia środowiskowego ze ścieków16. Tam, gdzie to możliwe, rutynowo dobieramy poziomy uzdatniania dla badań toksykologicznych w środowisku wodnym, stosując probabilistyczne oceny narażenia w ramach obserwacji środowiskowych 19,20,21. THV, który można obliczyć dla leków, został również uwzględniony jako poziom leczenia w niniejszym badaniu. Wartości THV (Równanie 1)22,23 są definiowane jako przewidywane stężenia wody prowadzące do dawek terapeutycznych (Cmax) dla ludzi (Cmax) farmaceutyków u ryb23, są inspirowane wstępnymi wysiłkami modelowania osocza24 i są obliczane na podstawie współczynników podziału chemicznego krew – woda (Równanie 2)25.

THV = Cmax / log PBW (równanie 1)

log PBW = log [(100,73 . log Kow · 0,16)+0,84] (Równanie 2)

W tym miejscu wybieramy również poziomy leczenia subletalnego w stosunku do wartości LC50 danio pręgowanego i strzebli grubogłowych. Uważamy to podejście za przydatną procedurę porównawczą dla reakcji behawioralnych, szczególnie podczas porównywania progów określonych zachowań z modelem ryb w wielu substancjach chemicznych. Ułatwia to również obliczanie stosunków ostrych do przewlekłych, co może być diagnostycznie przydatne w toksykologii wodnej do badań i ocen mechanistycznych. Wartości LC50 uzyskano ze wstępnych testów biologicznych toksyczności zgodnie ze znormalizowanymi wytycznymi podanymi w kroku 2.1.

W niniejszym protokole stosujemy powszechne projekty eksperymentalne i techniki statystyczne zalecane przez amerykańską EPA i znormalizowane metody OECD do badań toksykologicznych na modelach ryb. Chociaż podajemy wartości p (np. <0,01, <0,05, <0,10), znaczące różnice (α = 0,10) w poziomach aktywności są identyfikowane między zabiegami za pomocą analizy wariancji (ANOVA), jeśli spełnione są założenia normalności i równoważności wariancji. Testy post hoc HSD Dunnetta lub Tukeya są wykonywane w celu zidentyfikowania różnic w poziomie leczenia. Wybieramy tę wartość alfa (α = 0,10), aby zmniejszyć błędy typu II, szczególnie w przypadku testów wczesnego poziomu i gdy zrozumienie biologicznie ważnej wielkości efektu jest ograniczone dla niedostatecznie badanych behawioralnych punktów końcowych i organizmów modelowych26, zamiast stosować procedury bardziej powszechne w naukach biomedycznych do wielokrotnych porównań (np. poprawka Bonferroniego dla danych RNA-Seq)27. Potrzebne są przyszłe badania, aby zrozumieć zmienność tych reakcji behawioralnych i potencjalnie odpowiednio zmodyfikować projekty eksperymentalne (np. zwiększyć replikację).

Oprócz narażenia na chemikalia na zachowanie larw ryb może wpływać wiele czynników. Na przykład pora dnia, wiek, wielkość studni, temperatura, warunki oświetleniowe i objętość roztworu ekspozycyjnego w każdej studzience stanowią ważne czynniki11,30. Z tych powodów należy podjąć środki ostrożności w celu zminimalizowania wpływu czynników zewnętrznych, które mogłyby wpływać na zachowanie lokomotoryczne larw ryb podczas eksperymentów. Obserwacje behawioralne powinny być prowadzone w wąskich oknach czasowych (od 3 do 4 godzin) i w różnych okresach, w których oczekuje się, że wpływ pory dnia będzie miał minimalny wpływ na zachowanie lokomotoryczne larw11. Ponadto larwy ryb powinny być utrzymywane w stałej temperaturze (28 ± 1 °C w przypadku danio pręgowanego i 24 ± 1 °C w przypadku FHM) oraz w określonym cyklu światło/ciemność w inkubatorach o kontrolowanej temperaturze przez cały okres narażenia. Ponadto temperatura w laboratorium, w którym rejestrowane są zachowania, powinna być utrzymywana na poziomie zbliżonym do warunków eksperymentalnych, aby uniknąć wpływu temperatury na zachowania. Co więcej, studnie używane podczas obserwacji behawioralnych powinny być utrzymywane na stałym poziomie głośności dla każdej pojedynczej ryby.

Larwy i zarodki danio pręgowanego były wcześniej wykorzystywane w naukach biomedycznych do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych dla nowych związków12,13. Protokół ten rozszerza wcześniejsze badania behawioralne z danio pręgowanym, wykorzystując 38 punktów końcowych do zbadania bioaktywności chemicznej zanieczyszczeń środowiska. Chociaż kofeina jest powszechnym zanieczyszczeniem wodnym o znanym mechanizmie działania (MoA), wielu związkom w handlu brakuje ważnych danych mechanistycznych. W związku z tym protokół ten można wykorzystać do uzyskania wglądu w MoA dla związków, które nie mają danych o toksyczności, w tym komercyjnych chemikaliów39. Ponadto protokół zawiera metody dla dwóch najczęściej używanych modeli ryb. Jak wspomniano wcześniej, podczas gdy danio pręgowany jest powszechnym modelem ryb biomedycznych, który staje się coraz bardziej popularny w ekotoksykologii, strzebla grubogłowa jest powszechnie stosowana jako model ekologiczny do zastosowań oceny środowiska, ale w badaniach behawioralnych z użyciem zautomatyzowanych systemów poświęcono jej stosunkowo mniej uwagi w porównaniu z danio pręgowanym. Chociaż nadal nie ma znormalizowanych metod regulacyjnych dla badań toksykologii behawioralnej ryb, Protokół ten stanowi podejście wspierające przyszłe wysiłki.

Kofeina wywołała reakcje behawioralne w każdym z modeli ryb na poziomach, które zostały wykryte w środowisku wodnym16. Rodriguez-Gil i in. 2018 opracowali globalny rozkład narażenia środowiskowego w systemach wodnych na podstawie zmierzonych wartości kofeiny16. W szczególności 95% przewidywanych stężeń ścieków w ściekach spadłoby poniżej LOEC dla najbardziej wrażliwych behawioralnych punktów końcowych danio pręgowanego i strzebli grubogłowych w niniejszym badaniu (Tabela 2). Chociaż zaobserwowano kilka behawioralnych skutków kofeiny u danio pręgowanego (szczególnie w ciemnych warunkach) na poziomach istotnych dla środowiska, nie jest jasne, czy te modyfikacje behawioralne mogą wystąpić w naturalnych populacjach ryb, czy też skutkować istotnymi dla środowiska niekorzystnymi skutkami. Chociaż są przydatne do wrażliwych, diagnostycznych badań przesiewowych, progi behawioralne larw ryb mogą nie być reprezentatywne dla innych etapów historii życia lub ryb w naturalnych populacjach. Dalsze badania są uzasadnione w celu ustalenia, czy podobne progi reakcji behawioralnej występowałyby w naturze i wskazywałyby na niekorzystne wyniki na poziomie indywidualnym lub populacyjnym organizacji biologicznej.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wsparcie dla tego badania zostało zapewnione przez U.S. National Science Foundation (Projekt #: CHE-1339637) z dodatkowym wsparciem ze strony Amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska. Dziękujemy dr Jone Corrales, dr Lauren Kristofco, Gavinowi Saariemu, Samuelowi Haddadowi, Bekah Burket i Bridgett Hill za ogólne wsparcie laboratoryjne.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ViewPoint ZebraboxViewPointPlatforma ZebraLab i ZebraLab do zautomatyzowanych obserwacji behawioralnych
KofeinaSigma-AldrichC0750-100GStudy
InkubatorVWR9110589Utrzymuje cykl jasny/ciemny i temperaturę w eksperymentach z rybką grubogłową
InkubatorThermo Fisher Scientific35824-636Utrzymuje cykl światła/ciemności i temperaturę w eksperymentach z danio pręgowanym
Szklane zlewki 100 mlVWR89000-200Komory ekspozycyjne danio pręgowanego 
Zlewki szklane 500 ml PyrexEW-34502-03Komory ekspozycyjne dla rybki grubogłowej
5,000 &mikro; L autopipetaEppendorfResearch 5000Służy do napełniania pojedynczych studzienek w płytkach studzienkowych
Pippettes transferoweVWR414-004-004Służy do przenoszenia badanych organizmów 
Płytki 48-dołkoweFisher Scientific08-772-52Komory do rejestracji behawioralnej larw danio pręgowanego Płytki
24-dołkoweVWR10062-896Komory do rejestracji behawioralnej larw rybki grubogłowej
Dwuwodny siarczan wapniaSigma-AldrichC3771Do odtworzonej twardej wody
Siarczan magnezuSigma-AldrichM7506Do odtworzonej twardej wody
Wodorowęglan sodu Sigma-AldrichS5761Do odtworzonej twardej wody
Chlorek potasuSigma-AldrichP9333Do odtworzonego
systemu recyrkulacyjnego z-modMorskie systemySystem recyrkulacyjny do hodowli kultur danio pręgowanego
Oprogramowanie do analizy statystycznejSigma Plot Wersja 13.0Służy do analizy danych beahvioral i tworzenia liczb
Oprogramowanie do analizy statystycznejGraphpad PrismPrism 5Służy do tworzenia figurek 
Autosampler/system pompowania czwartorzędowegoAgilent TechnologiesInfinity 1260 Analityczna weryfikacja poziomów leczenia kofeiną
Gradient termiczny strumienia cieplnego źródło jonizacji elektrorozpylaniaAgilent TechnologiesAnalityczna weryfikacja poziomów leczenia kofeiną
Potrójny kwadrupolowy analizator masy Agilent TechnologiesModel 6420Analityczna weryfikacja poziomów leczenia kofeiną
10  cm  &czasy;   2.1  mm Kolumna Poroshell 120 SB-AQ (120Å, 2.7) Agilent Technologies685775-914TChromatografia kafliwa 
Oprogramowanie optymalizatora MassHunter Agilent TechnologiesOkreśl tryb jonizacji, monitorowane przejścia i parametry instrumentalne dla kofeiny/kofeiny-d9 i paraksantyny/paraksantyny-d6
chemiczny z twardą wodą biotechnologiczne

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Malaj, E., et al. Organic chemicals jeopardize the health of freshwater ecosystems on the continental scale. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (26), 9549-9554 (2014).
  2. Schäfer, R. B., Kühn, B., Malaj, E., König, A., Gergs, R. Contribution of organic toxicants to multiple stress in river ecosystems. Freshwater Biology. 61 (12), 2116-2128 (2016).
  3. Andersen, M. E., Krewski, D. Toxicity testing in the 21st century: bringing the vision to life. Toxicological Sciences. 107 (2), 324-330 (2008).
  4. Rovida, C., Hartung, T. Re-evaluation of animal numbers and costs for in vivo tests to accomplish REACH legislation requirements for chemicals-a report by the transatlantic think tank for toxicology (t (4)). Altex. 26 (3), 187-208 (2009).
  5. Council, N. R. Toxicity testing in the 21st century: a vision and a strategy. , National Academies Press. (2007).
  6. Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. Journal of Controlled Release. 164 (2), 192-204 (2012).
  7. Scholz, S., Fischer, S., Gündel, U., Küster, E., Luckenbach, T., Voelker, D. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment-applications beyond acute toxicity testing. Environmental Science and Pollution Research. 15 (5), 394-404 (2008).
  8. Fraysse, B., Mons, R., Garric, J. Development of a zebrafish 4-day embryo-larval bioassay to assess toxicity of chemicals. Ecotoxicology and Environmental Safety. 63 (2), 253-267 (2006).
  9. Noyes, P. D., Haggard, D. E., Gonnerman, G. D., Tanguay, R. L. Advanced morphological-behavioral test platform reveals neurodevelopmental defects in embryonic zebrafish exposed to comprehensive suite of halogenated and organophosphate flame retardants. Toxicological Sciences. 145 (1), 177-195 (2015).
  10. Colón-Cruz, L., et al. Alterations of larval photo-dependent swimming responses (PDR): New endpoints for rapid and diagnostic screening of aquatic contamination. Ecotoxicology and Environmental Safety. 147, 670-680 (2018).
  11. Kristofco, L. A., et al. Age matters: developmental stage of Danio rerio larvae influences photomotor response thresholds to diazinion or diphenhydramine. Aquatic Toxicology. 170, 344-354 (2016).
  12. Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science. 327 (5963), 348-351 (2010).
  13. Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nature Chemical Biology. 6 (3), 231-237 (2010).
  14. Bruton, T., Alboloushi, A., DeL a Garza, B., Kim, B. -O., Halden, R. U. Contaminants of Emerging Concern in the Environment: Ecological and Human Health Considerations. , ACS Publications. 257-273 (2010).
  15. Woudenberg, A. B., et al. Zebrafish embryotoxicity test for developmental (neuro) toxicity: Demo case of an integrated screening approach system using anti-epileptic drugs. Reproductive Toxicology. 49, 101-116 (2014).
  16. Rodríguez-Gil, J., Cáceres, N., Dafouz, R., Valcárcel, Y. Caffeine and paraxanthine in aquatic systems: Global exposure distributions and probabilistic risk assessment. Science of the Total Environment. 612, 1058-1071 (2018).
  17. Corrales, J., et al. Toward the Design of Less Hazardous Chemicals: Exploring Comparative Oxidative Stress in Two Common Animal Models. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 893-904 (2017).
  18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  19. Kristofco, L. A., Brooks, B. W. Global scanning of antihistamines in the environment: Analysis of occurrence and hazards in aquatic systems. Science of the Total Environment. 592, 477-487 (2017).
  20. Saari, G. N., Scott, W. C., Brooks, B. W. Global assessment of calcium channel blockers in the environment: Review and analysis of occurrence, ecotoxicology and hazards in aquatic systems. Chemosphere. , (2017).
  21. Corrales, J., et al. Toward the Design of Less Hazardous Chemicals: Exploring Comparative Oxidative Stress in Two Common Animal Models. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 893-904 (2017).
  22. Berninger, J. P., et al. Effects of the antihistamine diphenhydramine on selected aquatic organisms. Environmental Toxicology and Chemistry. 30 (9), 2065-2072 (2011).
  23. Brooks, B. W. Fish on Prozac (and Zoloft): ten years later. Aquatic Toxicology. 151, 61-67 (2014).
  24. Huggett, D., Cook, J., Ericson, J., Williams, R. A theoretical model for utilizing mammalian pharmacology and safety data to prioritize potential impacts of human pharmaceuticals to fish. Human and Ecological Risk Assessment. 9 (7), 1789-1799 (2003).
  25. Fitzsimmons, P. N., Fernandez, J. D., Hoffman, A. D., Butterworth, B. C., Nichols, J. W. Branchial elimination of superhydrophobic organic compounds by rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquatic Toxicology. 55 (1-2), 23-34 (2001).
  26. Scheiner, S. M., Gurevitch, J. Design and Analysis of Ecological Experiments. , Oxford University Press. (2001).
  27. Nakagawa, S. A farewell to Bonferroni: the problems of low statistical power and publication bias. Behavioral Ecology. 15 (6), 1044-1045 (2004).
  28. Bean, T. G., et al. Pharmaceuticals in water, fish and osprey nestlings in Delaware River and Bay. Environmental Pollution. 232, 533-545 (2018).
  29. Richendrfer, H., Pelkowski, S., Colwill, R., Creton, R. On the edge: pharmacological evidence for anxiety-related behavior in zebrafish larvae. Behavioural Brain Research. 228 (1), 99-106 (2012).
  30. Padilla, S., Hunter, D., Padnos, B., Frady, S., MacPhail, R. Assessing locomotor activity in larval zebrafish: Influence of extrinsic and intrinsic variables. Neurotoxicology and Teratology. 33 (6), 624-630 (2011).
  31. Sukardi, H., Chng, H. T., Chan, E. C. Y., Gong, Z., Lam, S. H. Zebrafish for drug toxicity screening: bridging the in vitro cell-based models and in vivo mammalian models. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 7 (5), 579-589 (2011).
  32. Ankley, G. T., Villeneuve, D. L. The fathead minnow in aquatic toxicology: past, present and future. Aquatic Toxicology. 78 (1), 91-102 (2006).
  33. Hutson, L. D., Liang, J. O. Making an impact: zebrafish in education. Zebrafish. 6, 119(2009).
  34. Hutson, L. D., Liang, J. O., Pickart, M. A., Pierret, C., Tomasciewicz, H. G. Making a difference: education at the 10th international conference on zebrafish development and genetics. Zebrafish. 9 (4), 151-154 (2012).
  35. Kane, A., Salierno, J., Brewer, S. Fish models in behavioral toxicology: automated techniques, updates and perspectives. Methods in Aquatic Toxicology. 2, 559-590 (2005).
  36. Rodriguez, A., et al. ToxTrac: a fast and robust software for tracking organisms. Methods in Ecology and Evolution. 9 (3), 460-464 (2018).
  37. Hamm, J., Wilson, B., Hinton, D. Increasing uptake and bioactivation with development positively modulate diazinon toxicity in early life stage medaka (Oryzias latipes). Toxicological Sciences. 61 (2), 304-313 (2001).
  38. Kristofco, L. A., Haddad, S. P., Chambliss, C. K., Brooks, B. W. Differential uptake of and sensitivity to diphenhydramine in embryonic and larval zebrafish. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 1175-1181 (2018).
  39. Steele, W. B., Kristofco, L. A., Corrales, J., Saari, G. N., Haddad, S. P., Gallagher, E. P., Kavanagh, T. J., Kostal, J., Zimmerman, J. B., Voutchkova-Kostal, A., Anastas, P. T., Brooks, B. W. Comparative behavioral toxicology of two common larval fish models: exploring relationships between modes of action and locomotor responses. Science of the Total Environment. 460-461, 1587-1600 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Larval Fish BehaviorPhotomotor ResponseCaffeine ExposureZebrafish ModelFathead MinnowAutomated TrackingLight Dark CycleLocomotor ActivityToxicity BioassayEnvironmental Pharmacology

Related Articles