Artykuł metodologiczny

Charakterystyka podzbiorów ludzkich monocytów za pomocą analizy cytometrii przepływu krwi pełnej

DOI:

10.3791/57941

⸱

17 października 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Vascular Biology Research Centre, Westmead Hospital, 2Westmead Clinical School, Department of Surgery, The University of Sydney, 3Westmead Research Hub, Westmead Institute for Medical Research, 4Institute for Clinical Pathology and Medical Research, Westmead Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzowania podzbiorów monocytów za pomocą cytometrii przepływu krwi pełnej. Obejmuje to nakreślenie, w jaki sposób bramkować podzbiory i oceniać ich ekspresję markerów powierzchniowych oraz podanie przykładu oceny ekspresji markerów M1 (zapalnych) i M2 (przeciwzapalnych).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monocyty są kluczowymi czynnikami przyczyniającymi się do różnych zaburzeń zapalnych i zmian w tych komórkach, w tym ich proporcji i funkcji w podzbiorach, co może mieć patologiczne znaczenie. Idealną metodą badania zmian w monocytach jest cytometria pełnego przepływu krwi, ponieważ minimalne obchodzenie się z próbkami tą metodą ogranicza sztuczną aktywację komórek. Jednak stosuje się wiele różnych podejść do bramkowania podzbiorów monocytów, co prowadzi do niespójnej identyfikacji podzbiorów między badaniami. Tutaj demonstrujemy metodę wykorzystującą cytometrię pełnego przepływu krwi do identyfikacji i scharakteryzowania podzbiorów ludzkich monocytów (klasycznych, pośrednich i nieklasycznych). Opisujemy, jak przygotować próbki krwi do cytometrii przepływowej, bramkować podzbiory (upewnić się, że komórki zanieczyszczające zostały usunięte) i określać ekspresję podzbioru monocytów markerów powierzchniowych - w tym przykładzie markerów M1 i M2. Protokół ten można rozszerzyć na inne badania, które wymagają standardowej metody bramkowania do oceny proporcji podzbioru monocytów i ekspresji innych markerów funkcjonalnych w podzbiorze monocytów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monocyty to rodzaj białych krwinek, które odgrywają główną rolę w promowaniu i rozwiązywaniu stanów zapalnych. Rozpoznawane są trzy główne podzbiory monocytów: monocyty klasyczne (~85%), pośrednie (~5%) i nieklasyczne (~10%), które charakteryzują się poziomem klastra różnicowania (CD)14 i ekspresją CD161. Proporcje podzbiorów monocytów mogą się różnić w zależności od występowania choroby, np. zwiększony odsetek produktów pośrednich w różnych stanach zapalnych2,3 w tym choroby sercowo-naczyniowe, gdzie poziom produktów pośrednich jest związany ze zdarzeniami klinicznymi4,5. Co więcej, w stanach chorobowych monocyty mogą również ulegać zmianom funkcjonalnym, przy czym wiele zmian można wykryć za pomocą różnicy w wyrażeniu markera powierzchniowego6,7. Jednym z takich przykładów jest pochylenie monocytów M1, wzrost markerów związanych z makrofagami M1, który zaobserwowano w chorobach układu krążenia, cukrzycy, otyłości i zespole metabolicznym7,8,9,10.

Pomimo popularności cytometrii przepływowej do oceny proporcji i funkcji podzbioru monocytów, istnieje znaczna zmienność w przygotowaniu próbek i bramkowaniu podzbiorów między badaniami, co utrudnia porównywanie wyników między takimi badaniami. Co ważne, nie ma konsensusu co do rozgraniczenia podzbiorów monocytów, jednak ustandaryzowane podejście jest niezbędne, biorąc pod uwagę kliniczne znaczenie zmian proporcji podzbiorów w kilku chorobach. Część trudności w bramkowaniu wynika z faktu, że monocyty różnicują się od klasycznych przez pośrednie do nieklasycznych podzbiorów11 i jako takie, monocyty istnieją jako ciągłe spektrum, a nie odrębne populacje12. Co ciekawe, Zawada i wsp. wykazali, że użycie bramkowania prostokątnego lub trapezowego podzbioru pośredniego, oba skutkowały wyższym podzbiorem pośrednim, który przewidywał punkt końcowy układu sercowo-naczyniowego13. Podkreśla to, że przynajmniej przy obliczaniu proporcji kluczową kwestią jest zastosowanie spójnej strategii bramkowania między różnymi próbkami (i badaniami), a nie próba ostatecznego rozróżnienia podzbiorów. Podczas gdy ostateczne bramkowanie może być ważniejsze przy ocenie funkcji, zmiana w wyrażeniu znacznika między podzbiorami jest przyrostowa12,14, a zatem ponownie, spójność w bramkowaniu jest być może kluczowa. W związku z tym potrzebna jest obiektywna metoda bramkowania, która w sposób powtarzalny rozdziela podzbiory monocytów między różne próbki. Celem przedstawionej tutaj metody jest bramkowanie podzbiorów monocytów z jasnym wyjaśnieniem i uzasadnieniem zastosowanej techniki bramkowania oraz ocena podzbiorów pod kątem ekspresji markerów powierzchniowych, zapewniając w ten sposób metodę, która pozwala badaczom mieć pewność co do stosowania tej techniki podczas oceny różnych próbek.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań Naukowych na Ludziach (HREC) WSLHD (zatwierdzenie AU RED HREC/15/WMEAD/289).

1. Przygotowanie próbki do cytometrii przepływu krwi pełnej

UWAGA: Ponieważ ludzka krew jest potencjalnie zakaźna, próbka powinna być wykonana w kapturze chroniącym przed zagrożeniem biologicznym.

  1. Zbierz próbki krwi od uczestników do 3 ml probówek z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA).
  2. Określ liczbę białych krwinek (WBC) za pomocą analizatora hematologicznego lub hemocytometru.
  3. Rozcieńczyć solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) (pH ~7,4) w celu dostosowania stężenia do ~5 x 106 WBC/ml.
  4. Przygotuj wystarczającą ilość mieszanki wzorcowej dla liczby probówek (np. dla 14 probówek przygotuj 16 razy mieszankę główną), łącząc 16 razy objętości 50 μl krwi, 0,75 μl anty CD14-V450, 0,5 μl anty CD16-APC i 0,625 μL anty HLA-DR-PerCP. Odwirować i odpipetować 51,9 μl mieszanki do każdej probówki (Tabela 1).
    UWAGA: Przeciwciała należy miareczkować w celu określenia optymalnych stężeń barwienia dla zastosowanych przeciwciał fluorescencyjnych.
  5. Dodać markery powierzchniowe (M1 i M2 lub kontrola izotypu, znakowane fikoerytryną (PE)) (przykład zgodnie z tabelą 2) i markery znakowane PE dla limfocytów T (CD3), limfocytów B (CD19), neutrofili (CD66b) i komórek NK (CD56) (Tabela 3). Wirować i inkubować przez 30 minut, 4 °C w ciemności.
    UWAGA: Markery dla limfocytów, neutrofili i komórek NK są uwzględniane tylko w celu walidacji metody bramkowania.
  6. Dodać 250 μl połączonego roztworu do lizy czerwonych krwinek/utrwalania krwinek czerwonych, natychmiast delikatnie przetrząsnąć i inkubować przez 10 minut w ciemności w temperaturze 4 °C.
  7. Dodaj 250 μl PBS i odwiruj komórki w temperaturze 260 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  8. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić komórki w 300 μl 1% formaldehydu.
    UWAGA: Formaldehyd jest toksyczny. Używaj rękawic nitrylowych i używaj w dygestorium.
  9. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem do czasu przeprowadzenia analizy.
    UWAGA: Zaleca się wykonanie analizy przepływu w ciągu 48 godzin od przygotowania próbki.

2. Cytometria przepływowa

  1. Sprawdź dziennik cytometru przepływowego, aby upewnić się, że personel obiektu przeprowadził kontrolę jakości.
    UWAGA: Aby zapewnić spójność między analizami, zaleca się kontrolę jakości przyrządu i utrzymanie stałych docelowych intensywności fluorescencji za pomocą kulek kontrolnych.
  2. Aby skonfigurować eksperyment cytometrii przepływowej, kliknij "Nowy eksperyment", a następnie "nowa próbka" i "nowa probówka", aby dodać probówki. Wybierz wykresy dwuwymiarowe, klikając ikonę i użyj menu rozwijanych, aby wybrać parametry osi. Upewnij się, że zawiera wykres CD16/CD14 i wykres wyświetlający detektor wraz z czasem do monitorowania akwizycji.
  3. Włóż rurkę i kliknij "Pobierz". Sprawdź napięcie przyrządutagustawienia upewnienia się, że sygnały detektora nie są poza skalą.
  4. Obserwuj komórki wpadające do bramki monocytów na wykresie CD14/CD16. Ustaw próg nagrywania na 5 000 zdarzeń dla klasycznej bramki monocytów i kliknij "Nagraj".
  5. Kontynuuj rejestrowanie danych dla pozostałych probówek. Po zarejestrowaniu danych dla wszystkich rur należy wyeksportować dane o przepływie jako pliki .fcs do analizy.
    UWAGA: Aby zapewnić dokładność, należy nagrywać pojedyncze elementy sterujące kompensacją kolorów. Macierz kompensacji można obliczyć i zastosować do danych przed analizą, aby uwzględnić rozlanie widmowe15,16.

3. Bramkowanie monocytów

  1. Otwórz pliki w oprogramowaniu analitycznym. Kliknij dwukrotnie nazwę rury i wybierz parametry z menu rozwijanych, aby wyświetlić komórki na wykresie FSC(A)/FSC(H) z obszarem rozproszenia do przodu. Utwórz bramkę wykluczenia dubletu, klikając ikonę narzędzia bramki wielokątnej i otaczając komórki, jak w (Rysunek 1A).
  2. Wybierz bramkowane komórki (klikając dwukrotnie na obszar bramkowany) i w nowym polu wyświetlania dostosuj parametry menu rozwijanego, aby wyświetlić komórki na wykresie FSC(A)/bocznym rozproszeniem SSC(A). Kliknij ikonę prostokątnej bramki i obficie wybierz populację monocytów na podstawie właściwości rozpraszania do przodu i boku, aby wykluczyć większość limfocytów, komórek NK i granulocytów (Rysunek 1B).
  3. Wybierz bramkowane komórki i ponownie wyświetl je na wykresie CD14/CD16, wybierając parametry za pomocą menu rozwijanych. Kliknij bramkę wielokąta, aby wybrać monocyty na podstawie ich charakterystycznego kształtu "┐" (Rysunek 1C).
  4. Wybierz bramkowane komórki i wyświetl monocyty na wykresie CD16/HLA-DR za pomocą menu rozwijanych w celu wybrania parametrów. Kliknij bramkę wielokąta, aby wybrać komórki dodatnie HLA-DR i wykluczyć wszelkie pozostałe komórki NK i neutrofile17 (Rysunek 1D).
  5. Wybierz bramkowane komórki i wyświetl dodatnie komórki HLA-DR na wykresie CD14/HLA-DR za pomocą menu rozwijanych, aby wybrać parametry. Kliknij bramkę wielokąta i narysuj bramkę, aby wykluczyć wysokie komórki HLA-DR/niskie CD14 (komórki B wyrażają wysokie poziomy HLA-DR, ale nie CD14) (Rysunek 1E).
    UWAGA: Może dojść do zanieczyszczenia limfocytami B i dlatego należy je zbadać. Jeśli populacja nieklasyczna w Rysunek 1C nie różni się od komórek po jej lewej stronie, to prawdopodobne jest zanieczyszczenie. Krok 3.5 można pominąć, jeśli limfocyty B nie nakładają się na nieklasyczne monocyty.
  6. Wybierz bramkowane komórki i użyj menu rozwijanych, aby wyświetlić je na wykresie CD16/CD14. Z opcji wykresu wybierz "Wykres zebry", który umożliwi narysowanie bramek podzbioru monocytów w celu określenia proporcji podzbioru (Rysunek 1F).
    UWAGA: Jeśli wykres zebry nie jest dostępny w oprogramowaniu do analizy, odpowiedni może być wykres pseudokolorowy (gładki) lub konturowy.
  7. Kliknij ikonę prostokątnej bramki i wybierz klasyczne monocyty, rysując przybliżoną prostokątną bramkę wokół CD14 wysokiej/CD16 niskiej, klasycznej populacji monocytów. W sekcji "Wyświetlanie" wybierz "Pokaż mediany", aby wyświetlić medianę intensywności fluorescencji dla klasycznych monocytów. Dostosuj bramkę w taki sposób, aby populacja miała równy rozkład od mediany po lewej i prawej stronie, obejmując wszystkie komórki po lewej stronie.
  8. Wybierz populację pośrednią, rysując prostokątną bramkę, która obejmuje komórki po prawej stronie klasycznej bramki. Dostosuj dolną część bramki, aby wykluczyć nieklasyczne komórki, wyrównując bramkę z dolną częścią koncentrycznych okręgów, które znajdują się całkowicie w klasycznej bramce monocytów, co zapewnia, że podzbiór pośredni ma ekspresję CD14 porównywalną z główną populacją klasyczną zgodną z obecną nomenklaturą.
  9. Bramkuj nieklasyczny podzbiór, rysując prostokątną ramkę w dół od dolnej krawędzi podzbioru pośredniego, zaznaczając wszystkie komórki na dole populacji (Rysunek 1F).
  10. W sekcji "Wyświetlacz" wybierz "Pokaż częstotliwości bramek", aby określić procent każdego podzbioru monocytów.

4. Walidacja metody bramkowania

  1. Aby ustalić, czy potencjalnie zanieczyszczające typy komórek są skutecznie wykluczane, najpierw zidentyfikuj różne populacje komórek z przeciwciałami przeciwko limfocytom T (CD3), komórkom B (CD19), neutrofilom (CD66b) i komórkom NK (CD56) (Rysunek 2).
    UWAGA: Tutaj limfocyty T i neutrofile nie znajdują się blisko kształtu "┐" monocytów i są bramkowane w Rysunek 1C.
  2. Upewnij się, że komórki NK zostały usunięte w kroku 3.4 (Rysunek 1D), a komórki B zostały usunięte w kroku 3.5 (Rysunek 1E), jak pokazano w Rysunek 3. Jeśli komórki NK lub komórki B nie są wyłączone, ponownie wyreguluj bramki.

5. Ekspresja fenotypowego markera monocytowego

  1. Wybierz komórki z każdego podzbioru monocytów. Zmień parametry listy rozwijanej, aby utworzyć histogram dla każdego podzbioru monocytów ( Rysunek 1F) wyświetlający każdy marker i jego pasujący izotyp (Rysunek 4).
  2. Obliczyć stopień ekspresji każdego markera (mediana lub średnia geometryczna) w porównaniu z odpowiednią kontrolą izotypu.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowana tutaj strategia bramkowania monocytów i analiza cytometrii przepływowej (Rysunek 1) z powodzeniem bramkowała podzbiory monocytów i ujawniła ich względne proporcje. Proporcje (dla tej próby) obliczono jako 88,1% klasycznych, 4,33% pośrednich i 7,49% nieklasycznych. Te bramki podzbioru nie były zanieczyszczone limfocytami B, limfocytami T, neutrofilami lub komórkami NK, co zostało potwierdzone odpowiednio markerami CD19, CD3, CD56 i CD66b. Oceniając względne położenie innych populacji, jasne jest, że limfocyty T i neutrofile znajdują się daleko poza kształtem monocytu "┐" na wykresie CD16 / CD14 (Figura 2A i 2D). Jednak zarówno populacje komórek NK, jak i limfocytów B pokrywały się z nieklasyczną populacją monocytów (Figura 2B i 2C). Potwierdzono, że etapy strategii bramkowania (Rysunek 1D i 1E) wykluczają komórki NK (Figura 3A) i komórki B (Rysunek 3B). Chociaż populacja limfocytów B obejmowała niewielką część nieklasycznych monocytów, ilość ta była znikoma.

Po bramkowaniu podzbiorów, oceniono stopień, w jakim wyrażały one różne znaczniki powierzchni, M1 (CD64, CD86 i CD120b) oraz M2 (CD163, CD11b i CD93). Markery wykazały pozytywną ekspresję w porównaniu z odpowiadającymi im kontrolami izotypowymi, co widać po przesunięciu histogramów (Rysunek 4). Mediana markerów była większa niż w kontrolach izotypu.

Zastosowanie tej strategii bramkowania do próbki krwi, która została podzielona na cztery probówki, wybarwiona i przeanalizowana oddzielnie, daje porównywalne wyniki między probówkami (Tabela 4).

Wykresy punktowe cytometrii przepływowej; klasyfikacja komórek odpornościowych; diagram; Markery do płyt CD; analiza subpopulacji.
Rycina 1: Reprezentatywna strategia bramkowania monocytów w pełnej krwi ludzkiej. (A) Wykres FSC(A) vs. FSC(H): Bramkowanie komórek o równej powierzchni i wysokości, usuwając w ten sposób grudki (większy FSC(A) w stosunku do FSC(H)) i zanieczyszczenia (bardzo niski FSC) K= 1000. (B) Wykres FSC(A) vs. SSC(A): Szeroki wybór monocytów na podstawie ich właściwości SSC/FSC. (C) Wykres CD16 vs. CD14: Bramkowanie w celu wyselekcjonowania monocytów na podstawie ich charakterystycznego kształtu "┐". (D) Wykres CD16 vs. HLA-DR: Bramkowanie w celu wybrania komórek HLA-DR dodatnich i usunięcia komórek NK. (E) CD14 vs. HLA-DR: Bramkowanie w celu wykluczenia limfocytów B (wysoki HLA-DR / niski CD14) z monocytów. (F) Wybrane monocyty ponownie wyświetlane na wykresie CD16 i CD14 w celu bramkowania podzbiorów monocytów. W przypadku A-F kolor reprezentuje gęstość komórek, przy czym niebieski i zielony oznaczają niską gęstość, czerwony i pomarańczowy oznaczają wysoką gęstość, a pomarańczowy oznacza gęstość w średnim zakresie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Diagramy cytometrii przepływowej różnicowania komórek odpornościowych: komórki T, B, NK, neutrofile; Markery do płyt CD.
Rysunek 2: Walidacja strategii bramkowania poprzez identyfikację potencjalnie zanieczyszczających komórek. Potencjalnie zanieczyszczające komórki są identyfikowane za pomocą markerów (A) limfocytów T (CD3), (B) komórek B (CD19), (C) komórek NK (CD56) i (D) neutrofili (CD66b). Panele po lewej stronie pokazują identyfikację każdej populacji po bramkowaniu zgodnie z Rysunek 1A i 1B, z kolorem reprezentującym gęstość komórek od wysokiej (czerwony) do niskiej (niebieski). Prawe panele boczne pokazują każdą populację komórek (niebieska) nałożoną na końcowy wykres monocytów CD16 / CD14, aby ujawnić bliskość tych populacji do monocytów (czerwony). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Analiza cytometrii przepływowej; wykresy rozrzutowe monocytów, limfocytów NK i B według markerów CD, dystrybucja danych.
Rysunek 3: Potwierdzenie, że etapy bramkowania usuwają komórki zanieczyszczające. Mapy cieplne przedstawiające stopień ekspresji (A) CD56 i (B) CD19 od wysokiego (czerwonego) do niskiego (niebieskiego). Etapy bramkowania skutecznie wykluczają komórki o wysokim CD56 (komórki NK) i wysokim CD19 (komórki B). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykresy cytometrii przepływowej; Znaczniki M1, M2; Fenotypy makrofagów: klasyczne, pośrednie, nieklasyczne.
Rycina 4: Ekspresja monocytów markerów M1 (CD120b) i M2 (CD93). Wygładzone histogramy ekspresji markera monocytów M1 i M2 (niebieskie) pokazujące wyraźne przesunięcie od izotypu (czerwony) dla (A) klasycznych, (B) półproduktów i (C) nieklasycznych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

przeciwciałoObjętość (50 μL krwi)Objętość (16x) 800 μL krwi
CD14 - V4500,75 μL12 μL
CD16 - Transporter opancerzony (APC)0,5 μL8 μL
HLA-DR-PerCP0,625 μL10 μL

Tabela 1: Przeciwciała dla pełnego przepływu krwi i głównej mieszanki.

ruraPrzeciwciała PEkodDopasowanie izotypuKoncentracja zapasówObjętość robocza
1IgG1BD (555749)nie1,0 μg/20 μL 0,625 μL
cyfra arabskaPłyta CD163BD (556018)BD IgG1 0,125 μg/20 μL5 μL
3Płyta CD64BD (558592)BD IgG1 0,06 μg/20 μL10 μL
4IgG1BD (555749)nie1,0 μg/20 μL1,25 μL
5Płyta CD86BD (555658)BD IgG1 1,0 μg/20 μL1,25 μL
6Płyta CD11bBD (561001)BD IgG1 1,0 μg/20 μL1,25 μL
7IgG2aPrace badawczo-rozwojowe (IC003P)nie25 μg/ml5 μL
8CD120b (TNFRII)Prace badawczo-rozwojowe (FAB226P)Prace badawczo-rozwojowe IgG2a25 μg/ml5 μL
9IgG1BL (400112)nie0,2 mg/ml2,5 μl
10Płyta CD93BL (336108)BL IgG150 μg/ml1,25 μL

Tabela 2: Przeciwciała monoklonalne znakowane fluorochromem M1/M2-PE dla przepływu krwi pełnej.

ruraprzeciwciałoObjętość robocza
11Płyta CD35 μL
12Płyta CD195 μL
13Płyta CD66b1,25 μL
14Płyta CD565 μL

Tabela 3: Przeciwciała monoklonalne znakowane fluorochromem PE dla limfocytów (limfocytów T, limfocytów B), neutrofili i komórek NK.

pkt. pkt. pkt. pkt.
rura% Klasyczny% Pośredni% Nieklasyczne
184,3Klasa 5.11Rozdział 10.1
cyfra arabska84,2Godzina 5.05Pytanie 10,5
384,3Norma 5.03Rozdział 10.7
481,6Norma 5.03Rozdział 12.1

Tabela 4: Proporcje podzbioru monocytów z jednej próbki krwi barwione i analizowane oddzielnie.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytometria przepływu krwi pełnej jest idealnym podejściem do badania monocytów, ponieważ komórki są badane w warunkach zbliżonych do ich fizjologicznego mikrośrodowiska, co daje wgląd w ich rolę w infekcjach i stanach zapalnych. Co więcej, użycie świeżych (tj. nieprzetworzonych) próbek krwi minimalizuje zmiany lub transformacje komórek, które mogą wystąpić w wyniku przechowywania lub obchodzenia sięz 18,19, takich jak te, o których wiadomo, że występują w przypadku monocytów rozmrożonych w zamrażarce20. Zaleca się szybkie przygotowanie próbki, ponieważ niektóre markery są regulowane w górę, jeśli próbki są przechowywane w temperaturze pokojowej przed przetwarzaniem19. Optymalne stężenia markerów M1 i M2 określono przez miareczkowanie i należy to zrobić dla każdego nowego przeciwciała, aby ograniczyć niespecyficzne wiązanie, zapewniając jednocześnie, że stopień przesunięcia jest spowodowany ekspresją antygenu, a nie ograniczony przez brak przeciwciała. Usunięcie czerwonych krwinek i utrwalenie białych krwinek za pomocą roztworu do lizy jest ważnym krokiem w tym protokole, ponieważ obecność czerwonych krwinek może zakłócać cytometrię przepływową 21,22. Należy pamiętać, że chociaż niektóre roztwory do lizy są kompatybilne z barwieniem bez mycia, wyraźniejsze populacje są widoczne w naszych rękach, gdy używany jest etap mycia.

Prawidłowa konfiguracja cytometru przepływowego ma również kluczowe znaczenie przy porównywaniu ekspresji markerów monocytów. Zalecamy, aby badacze utrzymywali stałe docelowe intensywności fluorescencji kulek kontrolnych i przeprowadzali kontrolę jakości urządzenia, które ma być używane w celu zapewnienia spójnych wyników dla różnych próbek pobranych w różnych dniach. Oprócz tego kontrole izotypów są wykorzystywane do pomocy w interpretacji wszelkich niespecyficznych sygnałów tła generowanych przez niespecyficzne wiązanie przeciwciał. Monocyty mają wysoki poziom receptorów Fc11 i dlatego są podatne na niespecyficzne wiązanie. Warto zauważyć, że poziom niespecyficznego wiązania różni się dla różnych podzbiorów, a zatem użycie kontroli izotypu staje się ważne przy porównywaniu stopnia ekspresji markera między podzbiorami.

Innym ważnym kryterium, które należy wziąć pod uwagę, są zastosowane stopnie bramkowania. Niektóre badania sugerują, że kluczowe jest narysowanie szczelnej bramy wokół populacji monocytów na wykresie FSC(A)/SSC(A), aby pozbyć się większości niemonocytowych komórek CD16 dodatnich 23,24,25, ale może to prowadzić do utraty niektórych monocytów, ponieważ komórki niemonocytowe mogą nakładać się na monocyty na poletkach FSC/SSC 26. Raczej, aby wykluczyć wszelkie inne komórki krwi, które mogą zanieczyszczać monocyty, konieczne jest włączenie trzeciego markera monocytów oprócz CD14 i CD1626,27. Z tego powodu HLA-DR jest często stosowany i jest idealny, ponieważ nie ulega ekspresji przez komórki NK ani neutrofile17,28. Chociaż limfocyty (limfocyty B i limfocyty T) mogą wykazywać ekspresję HLA-DR, różnią się one od monocytów pod względem ekspresji CD14. Podczas gdy HLA-DR jest idealnym trzecim markerem, CD86 również został zarekomendowany 5,27,29, ale nie został tutaj zastosowany, ponieważ jest również markerem M1, a zatem oceniono jego stopień ekspresji w podzbiorach monocytów.

Walidacja zastosowanej strategii bramkowania ma kluczowe znaczenie. Podczas gdy wiadomo, że komórki NK nakładają się na nieklasyczne, jeśli nie są bramkowane28, zauważamy, że komórki B mogą również nakładać się na nieklasyczne (Figura 2B); To, czy tak jest w przypadku innych badań, może zależeć od wyboru fluorochromu, konfiguracji instrumentu, czułości detektora, a nawet badanego stanu chorobowego. W tym przypadku nakładające się na siebie komórki B wykazywały wysoką ekspresję HLA-DR i nie były bramkowane przez selekcję komórek HLA-DR dodatnich na rysunku 1D. Zamiast tego, aby usunąć limfocyty B, użyliśmy dodatkowego wykresu CD14 / HLA-DR, gdzie komórki B oddzielają się od nieklasycznych ze względu na ich wyższą ekspresję HLA-DR i niską ekspresję CD14.

Istnieje również wiele różnych sposobów, w jakie bramy dla samych monocytów zostały narysowane w literaturze; Należą do nich ćwiartki (podzbiory są oddzielone znacznikami kwadrantów) oraz prostokątne lub trapezowe pola13 (z osobnymi ramkami narysowanymi dla każdego podzbioru), które ponadto różnią się rozmieszczeniem, wyznaczając, gdzie kończy się jeden podzbiór, a zaczyna drugi. Różnice te prawdopodobnie odzwierciedlają fakt, że monocyty istnieją jako kontinuum komórek, różnicujących się od klasycznych do nieklasycznych, a nie jako wyraźnie odrębne populacje. Ponieważ jednak różnice w technikach identyfikacji samych podzbiorów mogą prowadzić do różnic w obliczonych proporcjach podzbiorów monocytów, ważne jest, aby metoda bramkowania była w miarę obiektywna, a nie subiektywna, ponieważ dzięki temu metoda będzie bardziej solidna i odtwarzalna. W niektórych badaniach stosuje się kontrolę izotypu dla CD16 w celu określenia granicy między podzbiorami klasycznymi i pośrednimi30. Z drugiej strony, w celu zdefiniowania separacji między półproduktami i nieklasycznymi, zaproponowano, aby granica odcięcia była pionowa lub ukośna, przy czym wybór należy do badaczy, z zastrzeżeniem, że powinna być odtwarzalna, ale zalecono bramkę prostokątną w celu ułatwienia porównań między badaniami 13,30,31. W tym przypadku większą obiektywność uzyskano poprzez wykreślenie danych na wykresie zebry i zastosowanie obiektywnych reguł wizualnych, ponieważ wykresy zebry zapewniają dodatkową wskazówkę wizualizacyjną poprzez mieszanie gradientu kolorów do każdego równego przedziału prawdopodobieństwa w porównaniu z tradycyjnym wykresem konturowym. Prawa granica klasycznego podzbioru została narysowana w taki sposób, że populacja była równomiernie rozłożona wokół mediany populacji. Podział na półprodukty i nieklasyczne został również ustandaryzowany poprzez wyrównanie podstawy półproduktów z dolną częścią koncentrycznych okręgów w populacji klasycznej (tj. populacja pośrednia wyraźnie wyraża wysokie poziomy CD14, zgodnie ze standardową nomenklaturą1).

Podczas gdy niektóre badania sugerowały użycie dodatkowych markerów, takich jak receptor chemokiny C-C typu 2 (CCR2) lub 6-sulfoLacNAc (SLAN) w celu uzyskania pomyślnego zliczenia monocytów i ujawnienia ich znaczenia klinicznego32,33, w naszych rękach poziom ekspresji wielu markerów funkcjonalnych monocytów różni się znacznie u poszczególnych osób14. Taka zmienność może ograniczać przydatność tych markerów do definiowania podzbiorów na podstawie ich wyrażenia. Zautomatyzowane podejścia obliczeniowe zostały również wykorzystane do wizualizacji i grupowania podzbiorów monocytów, w tym wizualnego interaktywnego osadzania stochastycznego sąsiada (viSNE), osadzania stochastycznego sąsiada z rozkładem t (tSNE) lub analizy progresji drzewa rozpinającego zdarzeń znormalizowanych gęstości (SPADE)34,35, które mogą zapewnić wizualną reprezentację komórek na podstawie zestawu użytych wielu markerów. Chociaż wykazano, że zwiększa to dokładność strategii bramkowania w klasyfikacji podzbiorów monocytów, uznaje się, że wadą jest wymagana liczba przeciwciał (i odpowiadających im kanałów fluoroforowych). Jego przydatność będzie zależeć od zadawanych pytań; Dodatkowa złożoność może nie być uzasadniona, na przykład w badaniach wyliczeniowych.

Monocyty bramkowane naszą techniką wykazują proporcje zgodne z literaturą, a ekspresję markerów powierzchniowych przez trzy podzbiory można łatwo określić. Ogólnie rzecz biorąc, opisana tutaj technika i metodologia zapewnia ustandaryzowaną i prostą metodę liczenia proporcji podzbioru monocytów i oceny ekspresji markerów powierzchniowych, które można rozszerzyć na inne markery, potwierdzając w ten sposób ich funkcjonalne role w różnych innych warunkach.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytometria przepływowa została wykonana w Głównym Ośrodku Cytometrii Przepływowej, który jest wspierany przez Westmead Institute for Medical Research, Westmead Research Hub, Cancer Institute New South Wales oraz National Health and Medical Research Council. Badanie to było wspierane przez Fundusz Badań i Edukacji w Dziedzinie Chemii Klinicznej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zestaw do pobierania krwi BectonDickinson367286
Vacuitainer BD K2E 5,5 mg plus probówki do pobierania krwi -3,0 mlBecton Dickinson7128959
Sól fizjologiczna buforowana fosforem (PBS)Lonza17-516F
5ml polistyrenowa probówka FACS z okrągłym dnem (styl 12 mm x 75 mm)Technologie invitro352054
Mysie przeciwciało anty-ludzkie CD14 V450 [Mφ P9]BD Biosciences560349
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-CD16 APC [3G8]Abcam Australiaab140477
Per CP Przeciwciało anty-ludzkie HLA-DR [L243]BioLegend307628
PE Mysz IgG1 κ Kontrola izotypu [MOPC-21]BD Biosciences555749Lot # 4283901
PE Mysz Przeciwciało anty-ludzkie CD163 [GHI/61]BD Biosciences556018Lot # 2335626
Przeciwciało anty-ludzkie CD64 myszy PE [10.1]BD Biosciences558592Lot # 36768
PE Mysz Przeciwciało anty-ludzkie CD86 [2331 (FUN-1)]BD Biosciences555658Lot # 3109766
Mysz PE Przeciwciało anty-ludzkie CD11b / Mac-1 [ ICRF44]BD Biosciences561001Lot # 3228959
PE Kontrola izotypu myszy IgG2A [20102]R& D SystemsIC003PLot # 1212031
PE Ludzkie przeciwciało TNF RII/TNFRSF1B [22235]R& Systemy DFAB226PLot # 612051
Mysz PE IgG1, κ Kontrola izotypu [MOPC-21]BioLegend400112Lot # B220359
PE Przeciwciało anty-ludzkie CD93 [VIMD2]BioLegend336107Lot # B143544
Mysz PE Przeciwciało anty-ludzkie CD3 [SK7]BD Biosciences347347Lot # 3010929
Mysz PE Przeciwciało anty-ludzkie CD19 [HIB19]BD Biosciences561741Lot # 2307721
Mysz PE Przeciwciało anty-ludzkie CD56 [B159]BD Biosciences561903Lot # 3011796
PE Przeciwciało anty-ludzkie CD66b [G10F5]BioLegend305105Lot # B154037
OptiLyse CBeckman CoulterA11895
Roztwór formaldehydu 37%SigmaF1635
BD FACSCanto II Cytometr przepływowyBD Biosciences
XT-1800iSysmex
GS-6ROprogramowanie Beckman
Flowjo v10.0.7Tree Star Inc
Automatyczny analizator hematologiczny, Wirówka

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
  2. Rossol, M., Kraus, S., Pierer, M., Baerwald, C., Wagner, U. The CD14(bright) CD16+ monocyte subset is expanded in rheumatoid arthritis and promotes expansion of the Th17 cell population. Arthritis & Rheumatism. 64 (3), 671-677 (2012).
  3. Wildgruber, M., et al. The "Intermediate" CD14++CD16+ monocyte subset increases in severe peripheral artery disease in humans. Scientific Reports. 6, 39483(2016).
  4. Heine, G. H., et al. Monocyte subpopulations and cardiovascular risk in chronic kidney disease. Nature Review Nephrology. 8 (6), 362-369 (2012).
  5. Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes independently predict cardiovascular events: a cohort study of 951 patients referred for elective coronary angiography. Journal of the American College of Cardiology. 60 (16), 1512-1520 (2012).
  6. Bories, G., et al. Impaired alternative macrophage differentiation of peripheral blood mononuclear cells from obese subjects. Diabetes and Vascular Disease Research. 9 (3), 189-195 (2012).
  7. Fadini, G. P., et al. An unbalanced monocyte polarisation in peripheral blood and bone marrow of patients with type 2 diabetes has an impact on microangiopathy. Diabetologia. 56 (8), 1856-1866 (2013).
  8. Satoh, N., et al. Unbalanced M1/M2 phenotype of peripheral blood monocytes in obese diabetic patients: effect of pioglitazone. Diabetes Care. 33 (1), 7(2010).
  9. Chen, X., Devaraj, S. Monocytes from metabolic syndrome subjects exhibit a proinflammatory M1 phenotype. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 12 (7), 362-366 (2014).
  10. Williams, H., et al. Human classical monocytes display unbalanced M1/M2 phenotype with increased atherosclerotic risk and presence of disease. International Angiology. 36 (2), 145-155 (2017).
  11. Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
  12. Hijdra, D., Vorselaars, A. D., Grutters, J. C., Claessen, A. M., Rijkers, G. T. Phenotypic characterization of human intermediate monocytes. Frontiers in Immunology. 4, 339(2013).
  13. Zawada, A. M., et al. Comparison of two different strategies for human monocyte subsets gating within the large-scale prospective CARE FOR HOMe Study. Cytometry Part A. 87 (8), 750-758 (2015).
  14. Patel, V. K., Williams, H., Li, S. C. H., Fletcher, J. P., Medbury, H. J. Monocyte inflammatory profile is specific for individuals and associated with altered blood lipid levels. Atherosclerosis. 263, 15-23 (2017).
  15. Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 72 (1), 8-13 (2007).
  16. Szaloki, G., Goda, K. Compensation in multicolor flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 982-985 (2015).
  17. Abeles, R. D., et al. CD14, CD16 and HLA-DR reliably identifies human monocytes and their subsets in the context of pathologically reduced HLA-DR expression by CD14(hi) /CD16(neg) monocytes: Expansion of CD14(hi) /CD16(pos) and contraction of CD14(lo) /CD16(pos) monocytes in acute liver failure. Cytometry Part A. 81 (10), 823-834 (2012).
  18. Mukherjee, R., et al. Non-Classical monocytes display inflammatory features: Validation in Sepsis and Systemic Lupus Erythematous. Scientific Reports. 5, 13886(2015).
  19. Lundahl, J., Halldén, G., Hallgren, M., Sköld, C. M., Hed, J. Altered expression of CD11b/CD18 and CD62L on human monocytes after cell preparation procedures. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 93-100 (1995).
  20. Appleby, L. J., et al. Sources of heterogeneity in human monocyte subsets. Immunology Letters. 152 (1), 32-41 (2013).
  21. Dagur, P. K., McCoy, J. P., et al. Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells. Current protocols in cytometry. Robinson, J. P. 73, 5.1.1-5.1.16 (2015).
  22. Einwallner, E., et al. Lysis matters: Red cell lysis with FACS Lyse affects the flow cytometric enumeration of circulating leukemic blasts. Journal of Immunological Methods. 390 (1), 127-132 (2013).
  23. Tsujioka, H., et al. Impact of Heterogeneity of Human Peripheral Blood Monocyte Subsets on Myocardial Salvage in Patients With Primary Acute Myocardial Infarction. Journal of the American College of Cardiology. 54 (2), 130-138 (2009).
  24. Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Immunophenotyping of lymphocyte, monocyte and dendritic cell subsets in normal rhesus macaques by 12-color flow cytometry: Clarification on DC heterogeneity. Journal of Immunological Methods. 360 (1), 119-128 (2010).
  25. Hristov, M., Schmitz, S., Nauwelaers, F., Weber, C. A flow cytometric protocol for enumeration of endothelial progenitor cells and monocyte subsets in human blood. Journal of Immunological Methods. 381 (1-2), 9-13 (2012).
  26. Zawada, A. M., et al. Monocyte heterogeneity in human cardiovascular disease. Immunobiology. 217 (12), 1273-1284 (2012).
  27. Zawada, A. M., et al. SuperSAGE evidence for CD14++CD16+ monocytes as a third monocyte subset. Blood. 118 (12), e50-e61 (2011).
  28. Heimbeck, I., et al. Standardized single-platform assay for human monocyte subpopulations: Lower CD14+CD16++ monocytes in females. Cytometry Part A. 77 (9), 823-830 (2010).
  29. Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
  30. Ziegler-Heitbrock, L., Hofer, T. P. J. Toward a Refined Definition of Monocyte Subsets. Frontiers in Immunology. 4, 23(2013).
  31. Weber, C., et al. Role and analysis of monocyte subsets in cardiovascular disease. Joint consensus document of the European Society of Cardiology (ESC) Working Groups "Atherosclerosis & Vascular Biology" and "Thrombosis". Thromb Haemost. 116 (4), 626-637 (2016).
  32. Shantsila, E., et al. Immunophenotypic characterization of human monocyte subsets: possible implications for cardiovascular disease pathophysiology. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1056-1066 (2011).
  33. Hofer, T. P., et al. slan-defined subsets of CD16-positive monocytes: impact of granulomatous inflammation and M-CSF receptor mutation. Blood. 126 (24), 2601-2610 (2015).
  34. Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. 29, 886(2011).
  35. Thomas, G. D., et al. Human Blood Monocyte Subsets: A New Gating Strategy Defined Using Cell Surface Markers Identified by Mass Cytometry. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1548-1558 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Bramkowanie CD14 CD16analiza markera HLA DRekspresja marker w M1 M2przygotowanie pr bki krwilizy erytrocyt wanaliza rozproszenia wiat a przedniego FSCbramkowanie wykluczaj ce dubletyusuwanie kom rek zanieczyszczaj cych

Powiązane artykuły