Artykuł metodologiczny

Analiza architektur białek i kompleksów białko-ligand za pomocą integracyjnej strukturalnej spektrometrii mas

DOI:

10.3791/57966

⸱

15 października 2018

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, King's College London

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spektrometria mas (MS) stała się ważnym narzędziem do badania struktury i dynamiki zespołów makromolekularnych. W tym miejscu integrujemy podejścia oparte na stwardnieniu rozsianym do badania tworzenia kompleksów białkowych i wiązania ligandów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka to ważna klasa biologicznych makromolekuł, które odgrywają wiele kluczowych ról w funkcjach komórkowych, w tym ekspresji genów, katalizowaniu reakcji metabolicznych, naprawie i replikacji DNA. Dlatego szczegółowe zrozumienie tych procesów dostarcza krytycznych informacji na temat funkcjonowania komórek. Integracyjne strukturalne metody MS dostarczają strukturalnych i dynamicznych informacji na temat składania kompleksów białkowych, złożonych połączeń, stechiometrii podjednostek, oligomeryzacji białek i wiązania ligandów. Niedawne postępy w dziedzinie integracyjnego strukturalnego stwardnienia rozsianego pozwoliły na scharakteryzowanie trudnych systemów biologicznych, w tym dużych białek wiążących DNA i białek błonowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób integrować różnorodne dane MS, takie jak natywne MS i spektrometria mas ruchliwości jonów (IM-MS) z symulacjami dynamiki molekularnej w celu uzyskania wglądu w kompleks białkowy naprawy DNA helikazy i nukleazy. Uzyskane w ten sposób podejście stanowi podstawę do szczegółowych badań nad wiązaniem ligandów z innymi kompleksami białkowymi zaangażowanymi w ważne procesy biologiczne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Natywna analiza spektrometryczna mas nienaruszonych białek i ich kompleksów jest przeprowadzana za pomocą jonizacji elektrorozpylania i nano-elektrorozpylania (nESI), które zachowują fałdowanie białek i interakcje niekowalencyjne podczas procesu jonizacji1,2. W natywnym MS struktura białek i ich kompleksów jest zachowywana w stanie zbliżonym do natywnego w fazie gazowej 3,4. Natywny MS wykrywa wiele naładowanych jonów białkowych, które są rozdzielane zgodnie ze stosunkiem masy do ładunku (m/z), co pozwala na obliczenie masy białka lub kompleksu białko-ligand. Informacje te umożliwiają określenie stechiometrii nienaruszonego białka, składu podjednostek, wiązania ligandów i sieci interakcji3,4,5,6. Natywne stwardnienie rozsiane ma kilka zalet w porównaniu z innymi technikami, takimi jak krystalografia rentgenowska i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego5. Po pierwsze, natywne MS jest szybką i bardzo czułą techniką, wymagającą tylko kilku mikrolitrów (2-3 μl) próbki o stosunkowo niskich końcowych stężeniach kompleksu w zakresie od wysokiego nM do niskiego μM6. Po drugie, natywne stwardnienie rozsiane może być wykorzystywane do badania heterogenicznych próbek białek, co umożliwia jednoczesną analizę wielu białek i stanów oligomerycznych. Po trzecie, natywne stwardnienie rozsiane nie wymaga modyfikacji próbek białek przed analizą poprzez sieciowanie chemiczne lub znakowanie białek. Te zalety sprawiły, że strukturalny MS stał się potężnym narzędziem do badań strukturalnych kompleksów białkowych.

Natywne MS można połączyć z ruchliwością jonów (IM), techniką, która mierzy czas potrzebny jonowi białka na przejście przez pole elektryczne, umożliwiając określenie przekroju kolizyjnego (CCS). CCS dostarcza informacji strukturalnych o niskiej rozdzielczości, co umożliwia uzyskanie informacji o topologii i niejednorodności konformacyjnej białek. Ponadto umożliwia badanie modeli strukturalnych białek generowanych za pomocą podejść obliczeniowych.

Stabilność fazy gazowej białka można badać za pomocą rozwijania wywołanego zderzeniem (CIU) mierzonego za pomocą IM-MS. Podczas procesu CIU jony białkowe są przyspieszane i aktywowane poprzez zwiększone przyspieszanie zderzeń z obojętnym gazem buforowym w spektrometrze masowym7,8,9. Ten proces aktywacji kolizyjnej powoduje częściowe rozwinięcie się białka, co przekłada się na wzrost CCS. Ta zmiana w CCS i energii potrzebnej do rozwinięcia białka może być mierzona za pomocą IM-MS. Korzystając z tego podejścia, można zmierzyć wpływ wiązania ligandów na stabilność białka10. Podkompleksy można generować w roztworze przy użyciu metod rozbijania w roztworze, takich jak dodawanie rozpuszczalników organicznych w celu monitorowania natywnych topologii kompleksów białkowych. Rozerwanie kompleksów białkowych jest głównie spowodowane rozerwaniem oddziaływań wewnątrzkowalencyjnych. Podkompleksy utrzymują topologie podobne do natywnych, a po wykryciu stwardnienia rozsianego ujawniają informacje o łączności między podjednostkami.

Integracyjne podejścia w biologii strukturalnej łączą różne metody badania struktury i dynamiki białek i ich kompleksów3,4,5,6. Natywne MS i IM-MS zostały wykorzystane do odkrycia szczegółów molekularnych trudnych systemów biologicznych. Pojawiło się kilka przykładów zastosowań, w tym badanie szlaków składania białek11,12,13,14, badanie sieci interakcji białko-białko15,16,17, białka błonowe6,18,19,20,21, oraz interakcje białko-ligand, takie jak kwasy nukleinowe22,23,24.

Jednak natywny MS ma również swoje ograniczenia. Natywne pomiary MS są często wykonywane w lotnych, takich jak wodny octan amonu, w których niektóre białka nie zachowują swojego złożonego stanu natywnego3,25. Niemniej jednak ostatnie prace wykazały, że to ograniczenie można przezwyciężyć poprzez optymalizację średnicy końcówki igły do natryskiwania (końcówki 0,5 mm) w taki sposób, aby białka i jony złożone z białek mogły być tworzone bezpośrednio z nielotnych o wysokiej sile jonowej, które lepiej naśladują środowisko fizjologiczne26. Dodatkowo, natywny MS wykorzystuje elektrospray do jonizacji i przenoszenia zespołów niekowalencyjnych z roztworu do fazy gazowej; W związku z tym względna obfitość wykrytych kompleksów może nie w pełni odzwierciedlać tę w solution5,27. Co więcej, w porównaniu do roztworu, oddziaływania hydrofobowe w fazie gazowej stają się słabsze, a oddziaływania elektrostatyczne stają się silniejsze, a tym samym faworyzowane3,28.

W tym artykule przedstawiamy protokoły, analizę danych i interpretację do identyfikacji białek i wiązania ligandów za pomocą natywnych MS, IM-MS, CIU, zakłóceń w roztworze i modelowania. Kompleks naprawy DNA, HerA-NurA, jest używany jako system modelowy. Dwuniciowe pęknięcia DNA (DSB) są jedną z najbardziej cytotoksycznych i szkodliwych form uszkodzenia DNA, powodującą niestabilność genetyczną i ostateczny rozwój raka u ludzi. Rekombinacja homologiczna jest mechanizmem naprawczym, który eliminuje DSB, proces, który jest koordynowany przez zależny od ATP kompleks helikaza-nukleaza, HerA-NurA22.

Połączenie natywnych MS i IM-MS z funkcjonalnymi testami i modelowaniem pozwoliło na zbadanie: i) roli NurA w składaniu, konformacji i stabilności kompleksu, ii) interakcji między dsDNA a kompleksem i jej wpływu na ogólną stabilność kompleksu, oraz iii) stechiometrii i wpływu wiązania ATP na złożenie22. Podsumowując, prace te doprowadziły do lepszego zrozumienia molekularnych podstaw kompleksu HerA-NurA poprzez powiązanie zmian konformacyjnych i stabilności kompleksu białkowego z wiązaniem nukleotydów. Protokół ten jest ogólny dla każdego kompleksu białkowego, który oddziałuje z jednym lub kilkoma typami ligandów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie próbki do natywnego MS kompleksów białkowych i białko-ligand

UWAGA: Aby zrozumieć molekularne podstawy kompleksu białkowego i wiązania ligandów za pomocą natywnego MS, kluczowe jest odpowiednie przygotowanie próbki. Celem tej sekcji jest zwrócenie uwagi na podstawowe etapy przygotowania próbki przed analizą SM na przykładzie kompleksu HerA-NurA, który wiąże DNA i nukleotydy.

  1. Przygotować 20 μl porcji skoncentrowanego oczyszczonego białka (zwykle 15 - 30 μM) w probówce o pojemności 1,5 ml.
  2. Do analizy powiązań ATP lub ADP
    UWAGA: Dodać rosnące stężenia niehydrolizowanego analogu ATP adenozyny 5′-O-(3-tiotrifosforanu), soli tetralitowej (ATP-γ-S) lub 5′-difosforanu adenozyny (ADP). Niehydrolizowalne pochodne ATP generują stabilny kompleks, który umożliwiłby wychwycenie białka związanego z ATP. Inne niehydrolizowane analogi ATP, które można testować, to AMP-PNP i ATP-γ-S-Mg2+.
    1. W badaniach HerA-NurA należy zmieszać 5 μM oczyszczonego białka z ATP-γ-S i ADP w stężeniach w zakresie 0-1 mM.
    2. Aby uchwycić jednoczesne wiązanie ATP-γ-S i ADP, dodaj oba nukleotydy w tych samych lub różnych stężeniach.
    3. Dodać 2 mM MgCl2 i inkubować w temperaturze 25 °C w inkubatorze w suchej kąpieli przez 1 h.
      UWAGA: Analiza wiązania nukleotydów przy użyciu natywnego MS nESI może skutkować sztucznym wiązaniem w wysokich stężeniach, dlatego należy wziąć pod uwagę wiązanie niespecyficzne29. Aby zbadać niespecyficzne wiązanie, dodaj wyższe stężenie nukleotydów między 2-5 mM).
  3. Do analizy wiązania DNA
    1. Wymieszaj białko i DNA w stosunku molowym, który pozwala na tworzenie kompleksu białko-DNA. W przypadku HerA i HerA-NurA zmieszaj 5 μM oczyszczonego białka z DNA w stosunku 1:1.
    2. Inkubować mieszaninę HerA-NurA lub HerA-DNA przez 30 minut w temperaturze 25 °C w inkubatorze w suchej kąpieli, aż do osiągnięcia równowagi. Czas trwania i temperatura inkubacji mogą się różnić w zależności od badanego białka.
    3. Wymiana buforowa próbek białek na kompatybilne z MS. Zwykle stosuje się wodny roztwór octanu amonu o stężeniu 5 mM-1 M i pH 7-8. Inne kompatybilne z MS to dioctan etylenodiamoniu (EDDA) i octan trietyloamonu (TEAA)30. Do badań HerA-NurA należy użyć octanu amonu o pH 200 mM 7,
      UWAGA: Istnieje kilka metod wymiany buforu przed analizą przez MS, takich jak użycie koncentratora wirowego lub kolumn chromatograficznych. Natywne stwardnienie rozsiane jest w większości ograniczone jakością próbki, taką jak i addukty używane podczas oczyszczania. Dlatego konieczne jest wykonanie wystarczającego odsalania, aby uzyskać rozwiązane piki.
    4. W przypadku badań wiązania ligandów HerA-NurA należy wymienić próbki buforowe 6-8 razy na 200 mM octanu amonu za pomocą koncentratora. Chociaż metoda ta jest bardziej czasochłonna, zapewnia osiągnięcie rozdzielczych pików i pozwala na dokładne określenie masy gatunków związanych z ATP/ADP.

2. Natywna akwizycja i analiza MS do badania kompleksów białkowych i kompleksów białko-ligand

Uwaga: warunki MS powinny być zoptymalizowane, aby osiągnąć piki o wysokiej rozdzielczości, aby umożliwić dokładne pomiary masy. Ta sekcja zawiera szczegółowe informacje o zoptymalizowanych parametrach spektrometru mas Q-ToF z górnym limitem kwadrupola 32k m/z.

  1. Przygotuj własne kapilary do nano-elektrorozpylania i wykonaj kalibrację masy przyrządu w celu uzyskania dokładnych pomiarów masy, zgodnie z opisem Kirshenbauma i wsp.1.
  2. Wybierz tryby TOF czułości, akwizycji jonów dodatnich i mobilności.
  3. Włącz gazy Trap, API i IMS. Do separacji IM użyj azotu (60 ml/min) i argonu (8,4 ml/min dla obszaru pułapki) jako punktów początkowych, a następnie dostosuj.
  4. Ustaw odpowiedni zakres akwizycji m/z. W przypadku nieznanego białka początkowe kroki optymalizacji powinny wykorzystywać szeroki zakres, taki jak 500-32 000 m/z.
  5. Załaduj 2-3 μl roztworu kompleksu białkowego do analizy do pokrytej złotem kapilary i włóż go do uchwytu kapilarnego.
  6. Delikatnie dokręć kapilę i umieść kapilarnę w stopniu źródła elektrorozpylania i wsuń stopień na miejsce, aby rozpocząć pobieranie danych.
  7. Zastosuj niskie ciśnienie gazu nano-flow (0,00-0,05 bara), aż na końcu kapilary utworzy się kropla. Ciśnienie nanoprzepływu można następnie obniżyć, aż spray zostanie utrzymany.
  8. Wyreguluj kapilarę w stosunku do stożka, przesuwając kapilarnę w pozycjach x, y, z i monitoruj prąd jonowy, aby uzyskać stabilny prąd jonowy. Zastosować napięcie kapilarne w zakresie 0,9-1,6 kV.
  9. Ustawić stożek pobierania próbek (50-120 V), przesunięcie źródła (60,0), temperaturę źródła (25 °C) i przepływ gazu w stożku (0,0 l/h). Te sugerowane warunki początkowe można dostosować.
  10. Aby uzyskać dobrze rozdzielcze widmo masowe i zmaksymalizować transmisję jonów, dostosuj parametry MS i monitoruj wynikającą z tego zmianę widm. Obejmują one regulację przepływu gazu w pułapce (2-8 ml/min), komórce He (180 ml/min) i komórce IMS (90 ml/min) w celu uzyskania najlepszej separacji przy maksymalnej transmisji.
  11. Dostosuj energie zderzenia pułapki, jeśli przesunięcia napięcia są niewystarczające. Optymalnym punktem wyjścia jest 10-50 V.
    UWAGA: Zwiększenie energii pułapki może usunąć niekowalencyjnie związane addukty. Należy jednak uważać, aby uniknąć indukowanej kolizją dysocjacji i rozwijania się kompleksu białko-ligand. Wykonaj pomiary ruchliwości jonów, aby sprawdzić, czy warunki panujące na instrumencie utrzymują białko w natywnym stanie pofałdowania (Krok 3).
  12. Popraw desolwatację, optymalizując napięcie polaryzacji pułapki. Optymalnym punktem wyjścia jest 20-45 V.
  13. Zoptymalizuj prędkość i wysokość fali, aby uzyskać najlepszą separację mobilności. Szczegółowe wyjaśnienie i protokół można znaleźć tutaj31. W badaniach HerA-NurA należy użyć prędkości fali 40 (m/s) i wysokości fali 550-650 (V).
  14. Użyj wszystkich innych parametrów jako wartości domyślnych instrumentu.
  15. Przygotuj próbkę wolną od ligandów do analizy jako kontrolę dla każdego przebiegu (Rysunek 1). W przypadku eksperymentów z wiązaniem ligandów należy wykonać co najmniej trzy niezależne pomiary.
  16. Użyj oprogramowania Masslynx do pomiaru mas generowanych gatunków i identyfikacji wiązania ligandów, takich jak wiązanie ATP i ADP oraz stany oligomeryczne (Rysunek 2 i 3). Inne dostępne programy to UniDec32, PULSAR33 i Amphitrite34.
  17. Aby określić ilościowo względną liczebność gatunków, należy użyć odpowiednich intensywności jonów obserwowanych w surowych widmach ESI-MS (na przykład związane ligandy, różne oligomery itp.). Alternatywnie, przeprowadź kwantyfikację za pomocą specjalistycznego oprogramowania, takiego jak UniDec i Massign35 (Rysunek 1 i 3
    18. ).

3. Pozyskiwanie i analizowanie IM-MS

UWAGA: IM-MS rozdziela jony w fazie gazowej na podstawie ich wielkości (masy), kształtu i ładunku. Każda cecha rozwiązana w widmie m/z jest powiązana z rozkładem czasu dryfu. IM-MS mierzy czas dryftu jonu, który można wykorzystać do obliczenia przekroju zderzenia (CCS). Wartości czasu dryftu mierzone na podstawie danych IM-MS uzyskanych za pomocą rurki dryfu mogą być liniowo skorelowane z wartościami CCS36. W przypadku pomiarów fali biegnącej IM-MS (TWIMS) obliczanie wartości CCS wymaga krzywej kalibracyjnej uzyskanej z wzorców białkowych o znanych wartościach CCS37. Struktury zwarte poruszają się szybciej niż struktury wydłużone lub wydłużone ze względu na zmniejszone interakcje z gazem buforowym w komórce mobilności38. W związku z tym IM-MS może być używany do wykrywania, czy natywna struktura fałdowa została zachowana w fazie gazowej39,40. W tej sekcji opisano, jak mierzyć IM-MS i obliczać CCS białka za pomocą TWIMS.

  1. Po zoptymalizowaniu warunków przyrządu pod kątem stabilnej transmisji (Krok 2), należy jak najniżej zmniejszyć energię zderzenia i stożek próbkowania, zachowując przy tym dobrą jakość widm.
  2. Użyj zoptymalizowanej prędkości fali i wysokości fali, aby uzyskać IM-MS (krok 2).
  3. Zmierz czas dryfu jonów za pomocą IM-MS przy trzech różnych prędkościach fal (np. 550, 600 i 650 m/s) przy zachowaniu tej samej wysokości fali (np. 40 V).
  4. Aby oznaczyć CCS jonów białkowych, należy zmierzyć kalibrbranty białek w tych samych warunkach przyrządów, które są używane do badanego białka. Optymalna kalibracja czasu dryftu wymaga pomiaru białek o znanym CCS.
    1. Wybierz cztery kalibry, dwa o masie powyżej i dwa o masie poniżej masy badanego białka37. Co najważniejsze, upewnij się, że wysokość i prędkość fali są takie same, jak te zarejestrowane dla badanego białka.
  5. Oblicz CCS ręcznie41 lub za pomocą specjalistycznego oprogramowania, takiego jak PULSAR33 i Amphitrite34 (Rysunek 5).
  6. Aby sprawdzić, czy białko jest natywne w fazie gazowej, porównaj eksperymentalny CCS z teoretycznym CCS uzyskanym ze struktur o wysokiej rozdzielczości. Dla HerA-NurA oblicz teoretyczne CCS przy użyciu metody aproksymacji projekcji (PA) używanej w MOBCAL42. Inne metody obejmują metodę trajektorii (TM)42 i dokładne rozpraszanie twardych sfer (EHS)43.

4. Zakłócanie kompleksów białkowych w roztworze do natywnego oznaczania struktury prowadzonej przez MS i IM-MS

Uwaga: Podkompleksy białkowe mogą być w niektórych przypadkach zidentyfikowane na podstawie tego samego roztworu, co nienaruszony kompleks. Jednak dalsze informacje strukturalne, takie jak łączność między podjednostkami i złożone składanie, można uzyskać poprzez zakłócanie interakcji białek w roztworze w celu utworzenia podkompleksów. Można to osiągnąć na kilka sposobów, takich jak dodanie rozpuszczalnika organicznego, zwiększenie siły jonowej lub manipulowanie pH. Aby uzyskać wgląd w łączność i złożone składanie podjednostek kompleksu HerA-NurA, wytworzono podkompleksy w roztworze poprzez dodanie rozpuszczalników, które zaburzają interakcje podjednostek.

  1. Przygotować próbkę białka i wymienić bufor na octan amonu, jak opisano w kroku 1.
  2. Dodawaj 10-40% rozpuszczalnika w odstępach co 10%. Zazwyczaj stosowanymi rozpuszczalnikami są metanol (MeOH), dimetylosulfotlenek (DMSO) lub acetonitryl (ACN).
    UWAGA: Można to wykonać w probówce do mikrowirówek z polipropylenu.
  3. Inkubować mieszaninę na lodzie przez 1 godzinę.
  4. Uzyskaj widmo IM-MS dla każdego warunku (kroki 2 i 3) (Rysunek 4).
  5. Użyj oprogramowania SUMMIT44, aby przypisać podkompleksy białkowe i wygenerować sieci interakcji białek. Alternatywnie można ręcznie wygenerować listę teoretycznych mas oczekiwanych gatunków.
  6. Aby upewnić się, że podkompleksy są złożone, oblicz eksperymentalne wartości CCS dla podkompleksów i porównaj je z teoretycznym CCS, jak wyjaśniono w kroku 3 (Tabela 1, Rysunek 5 i Rysunek 6).

5. Badanie stabilności kompleksu białkowego za pomocą rozwijania wywołanego zderzeniem (CIU)

Uwaga: CIU może być używany do badania stabilności strukturalnej białek i ich kompleksów po związaniu liganda. Specjalistyczne pakiety oprogramowania, takie jak PULSAR33, Amphitrite34 i CIU suite9 mogą być następnie wykorzystane do modelowania rozwoju badanego białka w fazie gazowej z ligandem i bez niego. Jako przykład, w tej sekcji przedstawiono procedurę monitorowania trajektorii rozwoju fazy gazowej i badania stabilizującego wpływu wiązania DNA i ATP na kompleks HerA-NurA.

  1. Rejestruj dane IM-MS, zwiększając napięcie przyspieszenia pułapki z 10 V do 200 V w krokach co 2-10 V, aby stopniowo rozwijać białko w fazie gazowej.
    UWAGA: Rejestrowanie mniejszych przyrostów skutkuje większą liczbą plików danych do przetworzenia, jednak takie podejście zapewnia bardziej rozdzielczy wykres rozwijania, co jest ważne przy analizie punktów przejścia między złożonymi/rozwiniętymi gatunkami.
  2. Przeanalizuj dane uzyskane za pomocą PULSAR33, Amphitrite34 lub CIU suite9 i wygeneruj dwuwymiarowe wykresy rozwijające w jednostkach CCS w funkcji napięcia przyspieszającego (Krok 3). Dla każdego stanu naładowania jest on tworzony przez ułożenie w stos znormalizowanych rozkładów CCS intensywności przy każdym napięciu przyspieszającym (Rysunek 7 A-Bi).
  3. Wygeneruj teoretyczny wykres rozwijania za pomocą jednego z pakietów oprogramowania. Dane zostaną dopasowane do rozwijającego się modelu. Umożliwia to ilościowe określenie energii zderzenia, przy której zachodzą rozwijające się przejścia, oraz określenie stabilności białek z ligandami związanymi i bez nich33. Rozwijające się przejście ma miejsce, gdy gatunek przechodzi z jednego stanu (w oparciu o jego eksperymentalne wartości CCS) do innego stanu z większym CCS.
  4. Aby określić ilościowo przejścia, należy obliczyć przejściowe punkty środkowe między stanami za pomocą algorytmów i oprogramowania, takiego jak PULSAR33. Jest to zwykle zgłaszane jako CV50, które jest wartością napięcia zderzenia (pułapki), przy której 50% określonego stanu jest wyczerpane.
  5. Korzystając z wartości CV50, oblicz całkowitą energię wewnętrzną jonu, korzystając z energii zderzenia środka masy (KECOM)45. KECOM jest definiowany przez całkowitą energię wewnętrzną dostępną dla rozwijającego się przejścia jonu i jest obliczany na podstawie energii kinetycznej i mas partnerów zderzenia (jonu białkowego i gazu obojętnego), jak opisano w równaniu (1)10
    KEcom (eV) = figure-protocol-1 (równanie 1).
    Gdzie Z jest ładunkiem jonowym, MN jest masą gazu obojętnego, a MION jest masą jonu białkowego.
    UWAGA: Dzieje się tak, ponieważ CIU białek jest zależny od ładunku46,47. Zaleca się przeprowadzenie analizyKE COM dla więcej niż jednego stanu naładowania ( Rysunek 7Aii).

6. Procedury modelowania dla symulacji różnicowej dynamiki molekularnej stosowane w integracyjnym MS

UWAGA: Korzystając z modeli podjednostek lub kompleksów białkowych, takich jak struktury krystaliczne, można użyć symulacji różnicowych MD (kompleks białkowy z ligandem i bez liganda) do określenia wpływu np. obecności liganda na strukturę i dynamikę białka. W tej sekcji szczegółowo opisano przebieg pracy i narzędzia potrzebne do modelowania procedur niezbędnych do tworzenia symulacji różnicowej dynamiki molekularnej.

  1. Zidentyfikuj podjednostki, które składają się na kompleks (Rysunek 8A, w krokach 2 i 3). Pozyskaj istniejące modele podjednostek, np. struktury krystaliczne z bazy danych RCSB (https://www.rcsb.org). Wpis UniProt białka będzie zawierał listę znanych struktur krystalograficznych/NMR (http://www.uniprot.org). Jeśli nie są one dostępne, sekwencja teoretyczna może zostać wprowadzona do BLAST w celu zidentyfikowania odpowiednich szablonów do modelowania homologii (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
  2. Złóż kompleks w odpowiedniej topologii (Rysunek 8A-ii). Można to zrobić różnymi metodami. Poszczególne podjednostki można dopasować do dostępnych map mikroskopii elektronowej znajdujących się w EMDB w celu złożenia nienaruszonego kompleksu (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/). Samouczek dotyczący dopasowywania PDB do map EM za pomocą elastycznego dopasowania dynamiki molekularnej (MDFF) można znaleźć tutaj: http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/science/mdff/tutorial_mdff-html/.
  3. Zidentyfikuj brakujące regiony kompleksu (Rysunek 8A-iii). Przeprowadzić wyrównanie wielu sekwencji (MSA) między PDB a sekwencją teoretyczną w celu zidentyfikowania reszt, które mogą być niedopasowane do struktur krystalicznych, lub jakichkolwiek mutacji odziedziczonych w wyniku eksperymentów krystalograficznych. MSA można wykonać za pomocą serwerów internetowych, takich jak T-Coffee (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular).
  4. Regeneracja brakujących reszt za pomocą modelowania homologicznego (Rysunek 8A-iv). Brakujące reszty kompleksu białkowego można zbudować za pomocą programu MODELLER (https://salilab.org/modeller/). MODELLER może wyprowadzić zestaw n modeli w różnych zregenerowanych konfiguracjach. Dobre modele można zidentyfikować na podstawie ich wyniku w skali DOPE (Discrete Optimized Protein Energy). Obszerny samouczek znajduje się na stronie internetowej oprogramowania (https://salilab.org/modeller/tutorial/).
  5. Wykonaj symulacje różnicowej dynamiki molekularnej (MD) kompleksu białkowego (Rysunek 8B), aby zidentyfikować regiony białek, które reagują na określoną zmianę środowiskową, np. obecność liganda. W takich symulacjach parametry behawioralne z symulacji A (tylko białko), która działa jako odniesienie, są odejmowane od symulacji B (białko + ligand). Różnicowa fluktuacja średniej kwadratowej (RMSF) obliczona między symulacjami A i B może informować o regionach białka, które zwiększają lub zmniejszają elastyczność w sposób zależny od liganda.
    1. Wykonuj symulacje MD i dalsze analizy za pomocą GROMACS (http://www.gromacs.org). Samouczek można znaleźć pod adresem: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/Lysozyme/index.html. Aby wyeliminować błąd systematyczny modelu, najpierw należy wygenerować strukturę kompleksu związanego z ligandem. Białko jest następnie kopiowane z tego bez liganda, aby uzyskać model białka identyczny z kompleksem związanym z ligandem.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki rodzimego MS ujawniły stan oligomeryczny, skład i topologię kompleksu HerA-NurA (Rysunek 1). Ponieważ oddziaływania niekowalencyjne są zachowane w fazie gazowej, natywne MS eksperymentów miareczkowania ATP-γ-S i ADP określiły parami wiązanie nukleotydów z HerA-NurA (Rysunek 2) i że zwiększenie stężenia ATP-γ-S zwiększa względną intensywność heksamerycznego HerA (Rysunek 3). Informacje strukturalne dotyczące interakcji podjednostek uzyskano z zakłócenia w roztworze, a następnie natywnego MS i były zgodne z masami teoretycznymi (Rysunek 4 i Tabela 1).

Eksperymentalne wartości CCS białek i ich kompleksów pochodzą z eksperymentów IM-MS (Rysunek 5). Wartości te są uśrednionymi rotacyjnie obliczeniami przekroju poprzecznego fazy gazowej kształtu cząsteczki i opisują stan wymiarowy białka. Wartości CCS są porównywane z teoretycznymi pomiarami krystalografii rentgenowskiej i dobra zgodność wskazuje, że natywny kształt jest zachowany w fazie gazowej (Tabela 1). To weryfikuje użycie wartości CCS do budowania modeli białek o niskiej rozdzielczości48.

Eksperymentalne CCS mogą być obliczane dla każdego stanu naładowania. Natywny konformer białkowy może powodować powstawanie jonów w stanie naładowania o podobnych wartościach CCS. Jednak jony o wyższym stanie naładowania zwiększały odpychanie kulombowskie, co może prowadzić do rozwoju białka w fazie gazowej i większych wartości CCS w porównaniu z teoretycznymi CCS. W związku z tym zwykle stosuje się wartość CCS jonów o najniższym stanie naładowania49. W przypadku HerA-NurA eksperymenty z zakłóceniami w roztworze na HerA i HerA-NurA z DNA i bez DNA skłoniły do wygenerowania szlaku składania rozpoczynającego się od monomerów, a następnie tworzącego cały heksameryczny kompleks HerA (HerA6)-dimerycznego NurA (NurA2) z DNA (Figura 6).

Różnice w wykresach rozwijania CIU między apo (bez ligandu) a ligandem związanym definiują zmianę w stabilności kompleksu po związaniu liganda. Wyższa wartość CV50 lub KECOM oznacza bardziej ustabilizowany jon w fazie gazowej. AnalizaCOM CIU i KE wykazała, że HerA-NurA związana z DNA jest bardziej stabilna niż kompleks wolny od DNA (Figura 7Aii). Z analizy CIU-MS w odpowiednich stanach wiązania ATP, stan związany z czterema ATP-γ-S zmniejszył stabilność zespoloną w fazie gazowej, a stan związany z sześcioma -ATP-γ-S, w którym wszystkie miejsca są zajęte, był najbardziej stabilny (Rysunek 7Bii). Natywne stwardnienie rozsiane może ujawnić dyskretne stany wiązania nukleotydów HerA; jednak nie może rozróżnić, które podjednostki HerA wiążą ATP i gdzie to wiązanie ma miejsce. Informacje te można uzyskać z jawnych symulacji MD rozpuszczalnika na heksamerycznych HerA i HerA-NurA zgodnie z podsumowanym przepływem pracy (Rysunek 8).

figure-results-1
Rysunek 1. Badanie stanu oligomerycznego, składu i topologii kompleksu niekowalencyjnego HerA-NurA. (A) Widma masowe HerA, HerA-NurA i HerA-NurA w obecności DNA (dwuniciowy DNA 15,4 kDa 25 pz). Podkompleks HerA występuje zarówno jako heksamer, jak i heptamer. Dimer NurA wiąże się i z heksamerem HerA narzucającym konwersję oligomeryczną. DNA wiąże utworzony kompleks HerA-NurA (wyniki zaczerpnięte z Z. Ahdash i wsp., 201722). (B) Względne intensywności zidentyfikowanych gatunków są obliczane przy użyciu UniDec32. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Natywny ESI-MS ujawnia mechanizm wiązania nukleotydów z HerA-NurA. Widma masowe (A) HerA-NurA i (B) HerA-NurA-DNA z rosnącymi stężeniami (i) ATP-γ-S i (ii) ADP. Zmierzone masy są porównywane z masami teoretycznymi i określana jest ilość związanego ATP-γ-S lub ADP. Zmierzone masy i liczba związanych nukleotydów są pokazane na widmach. Eksperymenty miareczkowania ATP-γ-S i ADP określiły parami wiązanie nukleotydów z HerA-NurA samodzielnie i w kompleksie z DNA, co wskazuje na cykliczny mechanizm reakcji (Wyniki zaadaptowane z Z. Ahdash i wsp., 201722). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Pomiar wpływu wzrostu stężenia ATP-γ-S na stan oligomeryczny HerA. (A) Widma masowe HerA przy rosnących stężeniach ATP-γ-S. (B) Wykres przedstawiający względne intensywności różnych gatunków z rodzimego MS obliczone przy użyciu oprogramowania do dekonwolucji UniDec 32. Wraz ze wzrostem stężenia ATP-γ-S wzrasta również względna intensywność heksamerycznego HerA. Liczba związanych cząsteczek ATP-γ-S jest pokazana na widmach (Wyniki zaczerpnięte z Z. Ahdash et al., 201722). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Widma masowe i produkty dysocjacji podkompleksów (A) HerA i (B) HerA-NurA (i) samodzielnie oraz w obecności (ii) DNA po rozerwaniu w roztworze. Eksperymenty z rozrywaniem w roztworze przeprowadzono przy użyciu 10-40% acetonitrylu, metanolu (MeOH) lub dimetylosulfotlenku (DMSO) i doprowadziły do powstania różnych podkompleksów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5. Rozkłady czasu przybycia ruchliwości jonów pokazane na osi CCS dla kompleksów i wygenerowanych podkompleksów. Ikony dla każdego podkompleksu korelują z ikonami opisanymi na widmach w Rysunek 4. Eksperymentalne i obliczone masy oraz wartości CCS podkompleksów są wymienione w Tabeli 1, z których wszystkie wykazały zgodność między wartościami eksperymentalnymi a obliczonymi (po uwzględnieniu typowej niepewności w rozdzielczości spektrometrii mas ruchliwości jonów fali przemieszczającej się wynoszącej ±5-8%37). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6. Ścieżka składania kompleksu HerA-NurA wygenerowana w wyniku zakłócenia w roztworze natywnego MS i IM-MS. Kolorowe kółka wskazują warunki, w których zaobserwowano każdy podkompleks: natywny (zielony, przed rozerwaniem), metanol (żółty), DMSO (fioletowy) lub acetonitryl (czerwony). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7. Badanie stabilizującego wpływu (A) DNA na HerA-NurA i (B) wiązanie ATP z HerA-NurA-DNA. (i) Wykresy CIU-MS w fazie gazowej i (ii) obliczenia energii zderzeń środka masy (KEcom) pokazują, że obecność dsDNA stabilizuje kompleks HerA-NurA i że sześć stanów związanych z ATP-γ-S jest najbardziej stabilnych. Pokazana jest stabilizacja dla różnych stanów naładowania. Wykresy zostały wygenerowane przy użyciu PULSAR 33. Wyniki z (A) zaadaptowane z Z. Ahdash et al., 201722. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 8. Przepływ pracy dla procedur modelowania dla symulacji różnicowej dynamiki molekularnej. (A) Wygenerowanie badanego kompleksu poprzez zbudowanie topologii z istniejących podjednostek i odtworzenie brakujących pozostałości. (B) Przebieg pracy do przeprowadzania symulacji dynamiki molekularnej kompleksu białkowego z ligandem i bez ligandu. Symulacje dynamiki molekularnej są przeprowadzane tylko dla białka, które działa jako odniesienie i które jest odejmowane od symulacji białka i liganda. Następnie oblicza się różnicową fluktuację średniej kwadratowej (RMSF) między symulacjami i określa efekt wiązania ligandów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Kompleks / podkompleks Masa teoretyczna (kDa) Masa doświadczalna (kDa) Teoretyczne CCS (Å2) Eksperymentalny CCS (Å2) [opłata] Warunek HN HerA6-NurA 2 416,22 pkt. 417,85 pkt. Numer katalogowy: 14531 14577 [42+]
14599 [43+]
14608 [44+]
14637 [45+] 10-20% ACN, 10-40% DMSO, 10% MeOH HerA6-NurA 2-dsDNA 431,72 pkt. 432,27 pkt. - 14661 [39+]
14728 [40+]
14781 [41+]
14837 [42+] 10% ACN, 10% MeOH NurA1 Dnia 39,12 pkt. Godzina 38,18 3254 TGL 2618 [10+]
2746 [11+]
2878 [12+] 10-40% ACN, 10% MeOH, 20-40% DMSO NurA2 Nr kat. 78,24 pkt. Nr kat. 78,36 pkt. Numer katalogowy: 4890 4903 [16+]
4614 [17+]
4537 [18+]
4666 [19+] 10-40% MeOH, 20-40% DMSO HerA1 Norma 56,33 pkt. Godzina 56,32 pkt. Numer katalogowy: 4131 3647 [14+]
3792 [15+]
3950 [16+] 10-40% ACN, 40% DMSO HerA2 112,66 pkt. 112,95 pkt. Numer katalogowy: 6475 5648 [20+]
5747 [21+]
5842 [22+]
5996 [23+] 40% metamfetaminy, 10-40% ACN HerA3 168,99 pkt. 169,39 pkt. Numer katalogowy: 8607 7501 [25+]
7616 [26+]
7717 [27+]
7867 [28+] 10-40% MeOH, 10-40% CAN, 40% DMSO HerA3 + DNA 183,99 zł 184.976 TGL - 7655 [26+]
7990 [27+]
8107 [28+] 10-30% PKW HerA4 225,32 pkt. 226,2 pkt. Numer katalogowy: 10477 9205 [30+]
9287 [31]
9493 [32+]
9961 [33+] 10-40% MeOH, 10-40% ACN HerA4 +DNA 240,82 pkt. 241,33 pkt. - 9637 [31+]
9756 [32+]
9830 [33+] 10-30% PKW HerA5 281,65 pkt. 282,75 pkt. Numer katalogowy: 11853 10847 [36+]
10958 [37+]
11161 [38+] 30-40% PKW OnaA 6 337,98 pkt. 339,3 pkt. Numer katalogowy: 12517 12335 [38+]
12386 [39+]
12498 [40+]
12590 [41+]
12676 [42+]
13019 [43+] 10-40% MeOH, 10-40% ACN HerA6 +DNA 353,48 pkt. 354.626 TGL - 12890 [40+]
13081 [41+]
13184 [42+]
13273 [43+]
13463 [44+]
13576 [45+] 30% PKW HerA7 394,3 pkt. 395,85 pkt. Numer katalogowy: 13901 14154 [42+]
14219 [43+]
14261 [44+]
14285 [45+]
14335 [46+] 10-40% MeOH, 10-40% ACN, 10-40% DMSO HerA7 +DNA 409,8 pkt. 410,62 pkt. - 14414 [41+]
14510 [42+]
14558 [43+]
14598 [44+]
14630 [45+]
14641 [46+] 10% PKW

Tabela 1. Eksperymentalne i obliczone masy oraz wartości CCS HerA-NurA i jego podkompleksów uzyskane w wyniku badań zakłóceń w roztworze.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stwardnienie rozsiane odgrywa coraz ważniejszą rolę w charakterystyce stechiometrii, oddziaływań i architektury podjednostek kompleksów białkowych. Dane IM-MS mogą być wykorzystywane do definiowania układów topologicznych podjednostek w obrębie kompleksów wieloskładnikowych. W porównaniu z innymi istniejącymi metodami biologii strukturalnej, stwardnienie rozsiane ma kilka zalet. Natywne stwardnienie rozsiane jest szybką i bardzo czułą techniką i może być stosowane do badania heterogenicznych próbek białek. W połączeniu z eksperymentami z zakłóceniami w roztworze można monitorować szlaki dysocjacji zespołów białek. Wraz ze strukturami krystalicznymi lub modelami homologii, informacje oferowane przez strukturalne stwardnienie rozsiane stanowią narzędzie do badania interakcji białko-ligand i dostarczają niemal natywnych modeli i ścieżek składania11.

W tym miejscu opisujemy niezbędne procedury eksperymentalne do analizy stechiometrii i składu oddziaływań białko-ligand, z jednym lub więcej ligandami, przy użyciu integracyjnego MS. Obejmuje to przygotowanie próbek MS, pozyskiwanie danych, analizę danych oraz integrację danych MS za pomocą narzędzi obliczeniowych. W tym celu jako nasz system modelowy użyliśmy heterooligomerycznego kompleksu białkowego HerA-NurA do resekcji DNA, związanego z trzema ligandami (DNA, ATP i ADP). Protokół pokazuje wykorzystanie obecnie dostępnego oprogramowania wspomagającego analizę i prezentację danych.

Uzyskanie wysokiej jakości widm jest ważne dla analizy wiązania ligandów, dlatego kluczowe znaczenie mają staranne etapy przygotowania próbki, w tym oczyszczanie białka, miareczkowanie ligandów i wymiana. Jednym z ograniczeń natywnego stwardnienia rozsianego nESI podczas badania wiązania ligandów jest niespecyficzne wiązanie. Niespecyficzne wiązanie zachodzi podczas desolwatacji kropel w całym procesie elektrorozpylania. Zwiększa to stężenie ligandów, a tym samym zmienia stosunek białka do liganda29. Wiązanie nukleotydów powoduje stosunkowo niewielką różnicę masy między apo a białkiem związanym z nukleotydem, co nie zmienia wydajności jonizacji50,51.

Do naszej pracy wykorzystaliśmy system Synapt G2-Si MS, ale protokoły mają zastosowanie do różnych badań innych kompleksów białko-ligand przy użyciu innych dostępnych na rynku spektrometrów masowych nano-elektrorozpylania. Integracyjne strukturalne państwa członkowskie odgrywają coraz ważniejszą rolę w rozwiązywaniu problemów biologicznych o większej złożoności. Opisany tutaj przepływ pracy i techniki są dobrze przystosowane do zrozumienia konsekwencji strukturalnych i mechanizmów budowania kompleksu białkowego i tworzenia białka-liganda, które są trudne do zbadania przy użyciu konwencjonalnych technik strukturalnych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Karlowi-Peterowi Hopfnerowi i Robertowi Thomasowi Byrne'owi za uprzejme dostarczenie próbek białek HerA i HerA-NurA oraz za pomoc w projektowaniu eksperymentalnym. Dziękujemy również dr Eamonnowi Readingowi za jego recenzję manuskryptu. Z wdzięcznością dziękujemy naszym instytucjom finansującym: Wellcome Trust [109854/Z/15/Z] i Royal Society [RG150216 do A.P.].

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sól tetralitowa adenozyny 5′-(3-tiotrifosforanu) MerckMillipore119120-25MG
Adenozyno-5′-difosforan Sigma-Aldrich20398-34-9
Roztwór octanu amonuSigma-AldrichA2706
Kolumny do chromatografii mikro biospinowejKoncentrator Bio-Rad7326204
VivaspinSartoriusZ614041-25EA
Sześciowodny chlorek magnezuSigma-Aldrich246964
Water TraceSelectSigma-Aldrich95305
Kapilary borokrzemianoweAparat Harvard300060

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wilm, M., Mann, M. Analytical Properties of the Nanoelectrospray Ion Source. Analytical Chemistry. 68 (1), 1-8 (1996).
  2. Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecule. Science. 246 (4926), 64-71 (1989).
  3. Hernandez, H., Robinson, C. V. Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (3), 715-726 (2007).
  4. Heck, A. J., Van Den Heuvel, R. H. Investigation of intact protein complexes by mass spectrometry. Mass Spectrom Review. 23 (5), 368-389 (2004).
  5. Boeri Erba, E., Petosa, C. The emerging role of native mass spectrometry in characterizing the structure and dynamics of macromolecular complexes. Protein Science. 24 (8), 1176-1192 (2015).
  6. Laganowsky, A., Reading, E., Hopper, J. T. S., Robinson, C. V. Mass spectrometry of intact membrane protein complexes. Nature. 8 (4), 639-651 (2013).
  7. Benesch, J. L. Collisional activation of protein complexes: picking up the pieces. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 20 (3), 341-348 (2009).
  8. Tian, Y., Han, L., Buckner, A. C., Ruotolo, B. T. Collision Induced Unfolding of Intact Antibodies: Rapid Characterization of Disulfide Bonding Patterns, Glycosylation, and Structures. Analytical Chemistry. 87 (22), 11509-11515 (2015).
  9. Eschweiler, J. D., Rabuck-Gibbons, J. N., Tian, Y., Ruotolo, B. T. CIUSuite: A Quantitative Analysis Package for Collision Induced Unfolding Measurements of Gas-Phase Protein Ions. Analytical Chemistry. 87 (22), 11516-11522 (2015).
  10. Hopper, J. T., Oldham, N. J. Collision induced unfolding of protein ions in the gas phase studied by ion mobility-mass spectrometry: the effect of ligand binding on conformational stability. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 20 (10), 1851-1858 (2009).
  11. Politis, A., et al. Topological models of heteromeric protein assemblies from mass spectrometry: application to the yeast eIF3:eIF5 complex. Chemical Biology. 22 (1), 117-128 (2015).
  12. Morgner, N., et al. Hsp70 forms antiparallel dimers stabilized by post-translational modifications to position clients for transfer to Hsp90. Cell Reports. 11 (5), 759-769 (2015).
  13. Lai, Y. T., et al. Structure of a designed protein cage that self-assembles into a highly porous cube. Nature Chemistry. 6 (12), 1065-1071 (2014).
  14. Levy, E. D., Boeri Erba, E., Robinson, C. V., Teichmann, S. A. Assembly reflects evolution of protein complexes. Nature. 453 (7199), 1262-1265 (2008).
  15. Sharon, M., et al. Symmetrical modularity of the COP9 signalosome complex suggests its multifunctionality. Structure. 17 (1), 31-40 (2009).
  16. Jurneczko, E., Barran, P. E. How useful is ion mobility mass spectrometry for structural biology? The relationship between protein crystal structures and their collision cross sections in the gas phase. Analyst. 136 (1), 20-28 (2011).
  17. Politis, A., Schmidt, C. Structural characterisation of medically relevant protein assemblies by integrating mass spectrometry with computational modelling. Journal of Proteomics. 175, 34-41 (2017).
  18. Zhou, M., et al. Mass spectrometry of intact V-type ATPases reveals bound lipids and the effects of nucleotide binding. Science. 334 (6054), 380-385 (2011).
  19. Barrera, N. P., Booth, P. J., Robinson, C. V. Micelles Protect Membrane Complexes from Solution to Vacuum. Science. 321 (5886), 243-246 (2008).
  20. Konijnenberg, A., et al. Global structural changes of an ion channel during its gating are followed by ion mobility mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17170-17175 (2014).
  21. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Mohammed, S., Robinson, C. V. Acetylation and phosphorylation control both local and global stability of the chloroplast F1 ATP synthase. Scientific Reports. 7, 44068(2017).
  22. Ahdash, Z., et al. Mechanistic insight into the assembly of the HerA-NurA helicase-nuclease DNA end resection complex. Nucleic Acids Research. 45 (20), 12025-12038 (2017).
  23. Pagel, K., Natan, E., Hall, Z., Fersht, A. R., Robinson, C. V. Intrinsically disordered p53 and its complexes populate compact conformations in the gas phase. Angewandte Chemie. 52 (1), 361-365 (2013).
  24. Afonso, J. P., et al. Insights into the structure and assembly of the Bacillus subtilis clamp-loader complex and its interaction with the replicative helicase. Nucleic Acids Research. 41 (9), 5115-5126 (2013).
  25. van Duijn, E. Current limitations in native mass spectrometry based structural biology. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (6), 971-978 (2010).
  26. Susa, A. C., Xia, Z., Williams, E. R. Native Mass Spectrometry from Common Buffers with Salts That Mimic the Extracellular Environment. Angewandte Chemie. 56 (27), 7912-7915 (2017).
  27. Breukera, K., McLafferty, F. W. Stepwise evolution of protein native structure with electrospray into the gas phase, 10 to 10 s. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18145-18152 (2008).
  28. Robinson, C. V., et al. Probing the Nature of Noncovalent Interactions by Mass Spectrometry. A Study of Protein-CoA Ligand Binding and Assembly. Journal of the American Chemical Society. 118 (36), 8646-8653 (1996).
  29. Shimon, L., Sharon, M., Horovitz, A. A method for removing effects of nonspecific binding on the distribution of binding stoichiometries: application to mass spectroscopy data. Biophysical Journal. 99 (5), 1645-1649 (2010).
  30. Dyachenko, A., Gruber, R., Shimon, L., Horovitz, A., Sharon, M. Allosteric mechanisms can be distinguished using structural mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7235-7239 (2013).
  31. Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. 19 (40), (2010).
  32. Marty, M. T., et al. Bayesian deconvolution of mass and ion mobility spectra: from binary interactions to polydisperse ensembles. Analytical Chemistry. 87 (8), 4370-4376 (2015).
  33. Allison, T. M., et al. Quantifying the stabilizing effects of protein-ligand interactions in the gas phase. Nature Communications. 6, 8551-8561 (2015).
  34. Sivalingam, G. N., Yan, J., Sahota, H., Thalassinos, K. Amphitrite: A program for processing travelling wave ion mobility mass spectrometry data. International Journal of Mass Spectrometry. 345-347, 54-62 (2013).
  35. Morgner, N., Robinson, C. V. Massign: an assignment strategy for maximizing information from the mass spectra of heterogeneous protein assemblies. Analytical Chemistry. 84 (6), 2939-2948 (2012).
  36. Bush, M. F., et al. Collision Cross Sections of Proteins and Their Complexes: A Calibration Framework and Database for Gas-Phase Structural Biology. Analytical Chemistry. 82, 9557-9565 (2010).
  37. Ruotolo, B. T., Benesch, J. L., Sandercock, A. M., Hyung, S. J., Robinson, C. V. Ion mobility-mass spectrometry analysis of large protein complexes. Nature Protocols. 3 (7), 1139-1152 (2008).
  38. Lanucara, F., Holman, S. W., Gray, C. J., Eyers, C. E. The power of ion mobility-mass spectrometry for structural characterization and the study of conformational dynamics. Nature Chemistry. 6 (4), 281-294 (2014).
  39. Wyttenbach, T., Bowers, M. T. Structural stability from solution to the gas phase: native solution structure of ubiquitin survives analysis in a solvent-free ion mobility-mass spectrometry environment. Journal of Physical Chemistry B. 115 (42), 12266-12275 (2011).
  40. Marcoux, J., Robinson, C. V. Twenty years of gas phase structural biology. Structure. 21 (9), 1541-1550 (2013).
  41. Michaelevski, I., Kirshenbaum, N., Sharon, M. T-wave ion mobility-mass spectrometry: basic experimental procedures for protein complex analysis. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  42. Mesleh, M. F., Hunter, J. M., Shvartsburg, A. A., Schatz, G. C., Jarrold, M. F. Structural Information from Ion Mobility Measurements: Effects of the Long-Range Potential. Journal of Physical Chemistry A. 100, 16082-16086 (1996).
  43. Shvartsburg, A. A., Jarrold, M. F. An exact hard-spheres scattering model for the mobilities of polyatomic ions. Chemical Physics Letters. 261, 86-91 (1996).
  44. Taverner, T., Hernández, H., Sharon, M., Ruotolo, B. T., Matak-Vinković, D., Devos, D., Russell, R. B., Robinson, C. V. Subunit Architecture of Intact Protein Complexes from Mass Spectrometry and Homology Modeling. Accounts of Chemical Research. 41 (5), 617-627 (2008).
  45. Wysocki, V. H., Joyce, K. E., Jones, C. M., Beardsley, R. L. Surface-induced dissociation of small molecules, peptides, and non-covalent protein complexes. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 19 (2), 190-208 (2008).
  46. Hall, Z., Politis, A., Bush, M. F., Smith, L. J., Robinson, C. V. Charge-state dependent compaction and dissociation of protein complexes: insights from ion mobility and molecular dynamics. Journal of the American Chemical Society. 134 (7), 3429-3438 (2012).
  47. Hyung, S. J., Robinsons, C. V., Ruotolo, B. T. Gas-Phase Unfolding and Disassembly Reveals Stability Differences in Ligand-Bound Multiprotein Complexes. Chemistry & Biology. 16, 382-390 (2009).
  48. Hall, Z., Politis, A., Robinson, C. V. Structural modeling of heteromeric protein complexes from disassembly pathways and ion mobility-mass spectrometry. Structure. 20 (9), 1596-1609 (2012).
  49. Woods, L. A., Radford, S. E., Ashcroft, A. E. Advances in ion mobility spectrometry-mass spectrometry reveal key insights into amyloid assembly. Biochimica et Biophysica Acta. 1834 (6), 1257-1268 (2013).
  50. Daubenfeld, T., Bouin, A. P., van der Rest, G. A deconvolution method for the separation of specific versus nonspecific interactions in noncovalent protein-ligand complexes analyzed by ESI-FT-ICR mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. 17 (9), 1239-1248 (2006).
  51. Loo, J. A. Studying noncovalent protein complexes by electrospray ionization mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 16, 1-23 (1997).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Spektrometria mas w stanie natywnymspektrometria mas z separacj wed ug mobilno ci jonowejoligomeryzacja bia ekanaliza wi zania ligand wsymulacje dynamiki molekularnejprzekr j czynny zderzeniowysk adanie kompleks w bia kowychbadania wi zania nukleotyd wbia ka naprawy DNAintegracyjna spektrometria mas strukturalna

Powiązane artykuły