Artykuł metodologiczny

Analiza architektur białek i kompleksów białko-ligand za pomocą integracyjnej strukturalnej spektrometrii mas

16.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57966

⸱

15 października 2018

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, King's College London

W tym artykule

Podsumowanie

Spektrometria mas (MS) stała się ważnym narzędziem do badania struktury i dynamiki zespołów makromolekularnych. W tym miejscu integrujemy podejścia oparte na stwardnieniu rozsianym do badania tworzenia kompleksów białkowych i wiązania ligandów.

Streszczenie

Białka to ważna klasa biologicznych makromolekuł, które odgrywają wiele kluczowych ról w funkcjach komórkowych, w tym ekspresji genów, katalizowaniu reakcji metabolicznych, naprawie i replikacji DNA. Dlatego szczegółowe zrozumienie tych procesów dostarcza krytycznych informacji na temat funkcjonowania komórek. Integracyjne strukturalne metody MS dostarczają strukturalnych i dynamicznych informacji na temat składania kompleksów białkowych, złożonych połączeń, stechiometrii podjednostek, oligomeryzacji białek i wiązania ligandów. Niedawne postępy w dziedzinie integracyjnego strukturalnego stwardnienia rozsianego pozwoliły na scharakteryzowanie trudnych systemów biologicznych, w tym dużych białek wiążących DNA i białek błonowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób integrować różnorodne dane MS, takie jak natywne MS i spektrometria mas ruchliwości jonów (IM-MS) z symulacjami dynamiki molekularnej w celu uzyskania wglądu w kompleks białkowy naprawy DNA helikazy i nukleazy. Uzyskane w ten sposób podejście stanowi podstawę do szczegółowych badań nad wiązaniem ligandów z innymi kompleksami białkowymi zaangażowanymi w ważne procesy biologiczne.

Wprowadzenie

Natywna analiza spektrometryczna mas nienaruszonych białek i ich kompleksów jest przeprowadzana za pomocą jonizacji elektrorozpylania i nano-elektrorozpylania (nESI), które zachowują fałdowanie białek i interakcje niekowalencyjne podczas procesu jonizacji1,2. W natywnym MS struktura białek i ich kompleksów jest zachowywana w stanie zbliżonym do natywnego w fazie gazowej 3,4. Natywny MS wykrywa wiele naładowanych jonów białkowych, które są rozdzielane zgodnie ze stosunkiem masy do ładunku (m/z), co pozwala na obliczenie masy białka lub kompleksu białko-ligand. Informacje te umożliwiają określenie stechiometrii nienaruszonego białka, składu podjednostek, wiązania ligandów i sieci interakcji3,4,5,6. Natywne stwardnienie rozsiane ma kilka zalet w porównaniu z innymi technikami, takimi jak krystalografia rentgenowska i spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego5. Po pierwsze, natywne MS jest szybką i bardzo czułą techniką, wymagającą tylko kilku mikrolitrów (2-3 μl) próbki o stosunkowo niskich końcowych stężeniach kompleksu w zakresie od wysokiego nM do niskiego μM6. Po drugie, natywne stwardnienie rozsiane może być wykorzystywane do badania heterogenicznych próbek białek, co umożliwia jednoczesną analizę wielu białek i stanów oligomerycznych. Po trzecie, natywne stwardnienie rozsiane nie wymaga modyfikacji próbek białek przed analizą poprzez sieciowanie chemiczne lub znakowanie białek. Te zalety sprawiły, że strukturalny MS stał się potężnym narzędziem do badań strukturalnych kompleksów białkowych.

Natywne MS można połączyć z ruchliwością jonów (IM), techniką, która mierzy czas potrzebny jonowi białka na przejście przez pole elektryczne, umożliwiając określenie przekroju kolizyjnego (CCS). CCS dostarcza informacji strukturalnych o niskiej rozdzielczości, co umożliwia uzyskanie informacji o topologii i niejednorodności konformacyjnej białek. Ponadto umożliwia badanie modeli strukturalnych białek generowanych za pomocą podejść obliczeniowych.

Stabilność fazy gazowej białka można badać za pomocą rozwijania wywołanego zderzeniem (CIU) mierzonego za pomocą IM-MS. Podczas procesu CIU jony białkowe są przyspieszane i aktywowane poprzez zwiększone przyspieszanie zderzeń z obojętnym gazem buforowym w spektrometrze masowym7,8,9. Ten proces aktywacji kolizyjnej powoduje częściowe rozwinięcie się białka, co przekłada się na wzrost CCS. Ta zmiana w CCS i energii potrzebnej do rozwinięcia białka może być mierzona za pomocą IM-MS. Korzystając z tego podejścia, można zmierzyć wpływ wiązania ligandów na stabilność białka10. Podkompleksy można generować w roztworze przy użyciu metod rozbijania w roztworze, takich jak dodawanie rozpuszczalników organicznych w celu monitorowania natywnych topologii kompleksów białkowych. Rozerwanie kompleksów białkowych jest głównie spowodowane rozerwaniem oddziaływań wewnątrzkowalencyjnych. Podkompleksy utrzymują topologie podobne do natywnych, a po wykryciu stwardnienia rozsianego ujawniają informacje o łączności między podjednostkami.

Integracyjne podejścia w biologii strukturalnej łączą różne metody badania struktury i dynamiki białek i ich kompleksów3,4,5,6. Natywne MS i IM-MS zostały wykorzystane do odkrycia szczegółów molekularnych trudnych systemów biologicznych. Pojawiło się kilka przykładów zastosowań, w tym badanie szlaków składania białek11,12,13,14, badanie sieci interakcji białko-białko15,16,17, białka błonowe6,18,19,20,21, oraz interakcje białko-ligand, takie jak kwasy nukleinowe22,23,24.

Jednak natywny MS ma również swoje ograniczenia. Natywne pomiary MS są często wykonywane w lotnych, takich jak wodny octan amonu, w których niektóre białka nie zachowują swojego złożonego stanu natywnego3,25. Niemniej jednak ostatnie prace wykazały, że to ograniczenie można przezwyciężyć poprzez optymalizację średnicy końcówki igły do natryskiwania (końcówki 0,5 mm) w taki sposób, aby białka i jony złożone z białek mogły być tworzone bezpośrednio z nielotnych o wysokiej sile jonowej, które lepiej naśladują środowisko fizjologiczne26. Dodatkowo, natywny MS wykorzystuje elektrospray do jonizacji i przenoszenia zespołów niekowalencyjnych z roztworu do fazy gazowej; W związku z tym względna obfitość wykrytych kompleksów może nie w pełni odzwierciedlać tę w solution5,27. Co więcej, w porównaniu do roztworu, oddziaływania hydrofobowe w fazie gazowej stają się słabsze, a oddziaływania elektrostatyczne stają się silniejsze, a tym samym faworyzowane3,28.

W tym artykule przedstawiamy protokoły, analizę danych i interpretację do identyfikacji białek i wiązania ligandów za pomocą natywnych MS, IM-MS, CIU, zakłóceń w roztworze i modelowania. Kompleks naprawy DNA, HerA-NurA, jest używany jako system modelowy. Dwuniciowe pęknięcia DNA (DSB) są jedną z najbardziej cytotoksycznych i szkodliwych form uszkodzenia DNA, powodującą niestabilność genetyczną i ostateczny rozwój raka u ludzi. Rekombinacja homologiczna jest mechanizmem naprawczym, który eliminuje DSB, proces, który jest koordynowany przez zależny od ATP kompleks helikaza-nukleaza, HerA-NurA22.

Połączenie natywnych MS i IM-MS z funkcjonalnymi testami i modelowaniem pozwoliło na zbadanie: i) roli NurA w składaniu, konformacji i stabilności kompleksu, ii) interakcji między dsDNA a kompleksem i jej wpływu na ogólną stabilność kompleksu, oraz iii) stechiometrii i wpływu wiązania ATP na złożenie22. Podsumowując, prace te doprowadziły do lepszego zrozumienia molekularnych podstaw kompleksu HerA-NurA poprzez powiązanie zmian konformacyjnych i stabilności kompleksu białkowego z wiązaniem nukleotydów. Protokół ten jest ogólny dla każdego kompleksu białkowego, który oddziałuje z jednym lub kilkoma typami ligandów.

Protokół

1. Przygotowanie próbek do natywnej spektrometrii mas białek i kompleksów białko-ligand

UWAGA: Aby zrozumieć molekularne podstawy kompleksu białkowego i wiązania ligandów przy użyciu natywnej MS, kluczowe jest odpowiednie przygotowanie próbek. Celem tej sekcji jest omówienie podstawowych etapów przygotowania próbek przed analizą MS na przykładzie kompleksu HerA-NurA, który wiąże DNA i nukleotydy.

  1. Przygotować aliquoty 20 µL skoncentrowanego oczyszczonego białka (zazwyczaj 15 - 30 µM) w probówce 1,5 mL.
  2. W przypadku analizy wiązania ATP lub ADP
    UWAGA: Dodać rosnące stężenia niehydrolyzowalnego analogu ATP, soli tetralitowej adenozyno-5′-O-(3-tiotrifosforanu) (ATP-γ-S) lub adenozyno-5′-difosforanu (ADP). Niehydrolyzowalne pochodne ATP tworzą stabilny kompleks, który umożliwia wychwycenie białka związanego z ATP. Inne analogi ATP, które można przetestować, to AMP-PNP i ATP-γ-S-Mg2+.
    1. W badaniach nad HerA-NurA zmieszać 5 µM oczyszczonego białka z ATP-γ-S i ADP w stężeniach od 0-1 mM.
    2. Aby uchwycić jednoczesne wiązanie ATP-γ-S i ADP, dodać oba nukleotydy w tych samych lub różnych stężeniach.
    3. Dodać 2 mM MgCl2 i inkubować w temperaturze 25 °C w inkubatorze z suchą kąpielą przez 1 h.
      UWAGA: Analiza wiązania nukleotydów przy użyciu nESI native MS może prowadzić do artefaktowego wiązania przy wysokich stężeniach, dlatego należy uwzględnić wiązania nieswoiste29. Aby zbadać wiązanie nieswoiste, dodać wyższe stężenie nukleotydów w zakresie 2-5 mM).
  3. W przypadku analizy wiązania DNA
    1. Zmieszać białko i DNA w stosunku molowym umożliwiającym tworzenie kompleksu białko-DNA. Dla HerA i HerA-NurA zmieszać 5 µM oczyszczonego białka z DNA w stosunku 1:1.
    2. Inkubować mieszaninę HerA-NurA lub HerA - DNA przez 30 min w temperaturze 25 °C w inkubatorze z suchą kąpielą aż do osiągnięcia stanu równowagi. Czas i temperatura inkubacji mogą się różnić w zależności od badanego białka.
    3. Przeprowadzić wymianę buforu próbek białkowych na bufory kompatybilne z MS. Najczęściej stosuje się wodne roztwory octanu amonu w stężeniu od 5 mM-1 M przy pH 7-8. Inne bufory kompatybilne z MS to diacetan etylenodiamoniowy (EDDA) i octan trietylammoniumu (TEAA)30. W badaniach nad HerA-NurA stosować 20 mM octanu amonu o pH 7.
      UWAGA: Istnieje kilka metod wymiany buforu przed analizą MS, takich jak zastosowanie koncentratora odśrodkowego (spin concentrator) lub kolumn chromatograficznych. Native MS jest w głównej mierze ograniczony przez jakość próbki, taką jak bufory i addukty użyte podczas oczyszczania. Dlatego niezbędne jest przeprowadzenie wystarczającego odsolenia w celu uzyskania rozdzielonych pików.
    4. W badaniach nad wiązaniem ligandów HerA-NurA przeprowadzić wymianę buforu próbek 6-8 razy do 200 mM octanu amonu przy użyciu koncentratora. Chociaż metoda ta jest bardziej czasochłonna, zapewnia uzyskanie rozdzielonych pików i pozwala na dokładne oznaczenie masy form związanych z ATP/ADP.

2. Nabywanie i analiza danych natywnej spektrometrii mas w badaniu kompleksów białkowych oraz kompleksów białko-ligand

Uwaga: warunki MS powinny zostać zoptymalizowane w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości pików, aby umożliwić dokładne pomiary masy. W tej sekcji szczegółowo opisano zoptymalizowane parametry dla spektrometru mas Q-ToF z quadruplem o górnej granicy m/z wynoszącej 32k.

  1. Przygotować własne kapilary do nano-elektrosprayu i przeprowadzić kalibrację masy instrumentu w celu uzyskania dokładnych pomiarów masy, zgodnie z opisem Kirshenbaum et al.1.
  2. Wybrać tryby: czułość (sensitivity), akwizycję jonów dodatnich oraz mobilność TOF.
  3. Włączyć gazy Trap, API i IMS. W przypadku separacji IM jako wartości wyjściowe zastosować azot (60 mL/min) i argon (8,4 mL/min dla obszaru pułapki), a następnie dostosować parametry.
  4. Ustawić odpowiedni zakres akwizycji m/z. W przypadku nieznanego białka pierwsze kroki optymalizacji powinny obejmować szeroki zakres, np. 500-32 0 m/z.
  5. Nabrać 2-3 µL roztworu kompleksu białkowego do analizy do kapilary powlekanej złotem i umieścić ją w uchwycie kapilary.
  6. Delikatnie dokręcić kapilarę, umieścić ją w stopniu źródła elektrosprayu i przesunąć stopień do odpowiedniej pozycji, aby rozpocząć akwizycję danych.
  7. Zastosować niskie ciśnienie gazu nano-flow (0,00-0,05 Bar), aż do utworzenia się kropli na końcówce kapilary. Następnie można obniżyć ciśnienie nano-flow do poziomu, przy którym utrzymuje się spray.
  8. Wyregulować położenie kapilary względem stożka, przesuwając ją w osiach x, y, z i monitorując prąd jonowy, aż do uzyskania jego stabilizacji. Zastosować napięcie kapilary w zakresie 0,9-1,6 kV.
  9. Ustawić napięcie stożka próbkowania (sampling cone) (50-120 V), offset źródła (60,0), temperaturę źródła (25 °C) i przepływ gazu w stożku (0,0 L/h). Te sugerowane warunki początkowe mogą być modyfikowane.
  10. Aby uzyskać dobrze rozdzielone widmo masowe i zmaksymalizować transmisję jonów, dostosować parametry MS i monitorować wynikowe zmiany w widmach. Obejmuje to regulację przepływu gazu w pułapce (Trap) (2-8 mL/min), komórce He (He Cell) (180 mL/min) i komórce IMS (90 mL/min), aby osiągnąć najlepszą separację przy maksymalnej transmisji.
  11. Dostosować energie kolizyjne pułapki, jeśli offsety napięć są niewystarczające. Optymalnym punktem wyjściowym jest zakres 10-50 V.
    UWAGA: Zwiększenie energii pułapki może usunąć niekowalencyjnie związane addukty. Należy jednak uważać, aby uniknąć dysocjacji indukowanej kolizyjnie i rozfałdowania kompleksu białko-ligand. Przeprowadzić pomiary mobilności jonowej, aby sprawdzić, czy warunki instrumentu utrzymują białko w natywnym stanie pofałdowanym (Krok 3).
  12. Poprawić desolwatację poprzez optymalizację napięcia polaryzującego pułapkę (trap bias voltage). Optymalnym punktem wyjściowym jest 20-45 V.
  13. Zoptymalizować prędkość fali (wave velocity) i wysokość fali (wave height), aby uzyskać najlepszą separację mobilnościową. Szczegółowe wyjaśnienie i protokół znajdują się tutaj31. W badaniach nad HerA-NurA zastosować prędkość fali 40 (m/s) i wysokość fali 50-650 (V).
  14. W przypadku wszystkich pozostałych parametrów zastosować domyślne wartości instrumentu.
  15. Przygotować próbkę pozbawioną liganda do analizy jako kontrolę dla każdego pomiaru (Rycina 1). W eksperymentach dotyczących wiązania ligandów wykonać co najmniej trzy niezależne pomiary.
  16. Użyć oprogramowania Masslynx do pomiaru mas powstałych gatunków i identyfikacji wiązania ligandów, takich jak wiązanie ATP i ADP, oraz stanów oligomerycznych (Rycina 2 i 3). Inne dostępne oprogramowania to UniDec32, PULSAR33 oraz Amphitrite34.
  17. Aby określić względną obfitość gatunków, należy użyć odpowiadających im intensywności jonów zaobserwowanych w surowych widmach ESI-MS (np. dla ligandu związanego, różnych oligomerów itp.). Alternatywnie można przeprowadzić kwantyfikację przy użyciu specjalistycznego oprogramowania, takiego jak UniDec i Massign35 (Rycina 1 i 3).

3. Pozyskiwanie i analiza danych IM-MS

UWAGA: IM-MS rozdziela jony w fazie gazowej na podstawie ich rozmiaru (masy), kształtu i ładunku. Każda cecha rozdzielona w widmie m/z jest powiązana z rozkładem czasu dryfu. IM-MS mierzy czas dryfu jonu, który może być wykorzystany do obliczenia przekroju czynnego zderzeń (CCS). Wartości czasu dryfu mierzone z danych IM-MS pozyskanych przy użyciu rurki dryfu mogą być liniowo skorelowane z wartościami CCS36. W przypadku pomiarów IM-MS z wykorzystaniem fali wędrującej (TWIMS), obliczenie wartości CCS wymaga krzywej kalibracyjnej uzyskanej z wzorców białkowych o znanych wartościach CCS37. Struktury zwarte poruszają się szybciej niż struktury rozciągnięte lub wydłużone ze względu na ograniczone oddziaływania z gazem buforowym w komórce mobilności38. Dlatego IM-MS może być wykorzystywany do wykrywania, czy w fazie gazowej zachowano natywną strukturę pofałdowaną39,40. Niniejsza sekcja opisuje sposób pomiaru IM-MS oraz obliczania CCS białka przy użyciu TWIMS.

  1. Po zoptymalizowaniu parametrów urządzenia w celu uzyskania stabilnej transmisji (Krok 2), należy maksymalnie obniżyć energię kolizyjną oraz napięcie stożka próbkowania, zachowując przy tym dobrą jakość widm.
  2. Użyj zoptymalizowanej prędkości i wysokości fali do przeprowadzenia pomiaru IM-MS (Krok 2).
  3. Zmierz czas dryfu jonów za pomocą IM-MS przy trzech różnych prędkościach fali (np. 550, 60 i 650 m/s), utrzymując tę samą wysokość fali (np. 40 V).
  4. Aby wyznaczyć CCS jonów białek, zmierz kalibratory białkowe w tych samych warunkach instrumentu, które zastosowano dla badanego białka. Optymalna kalibracja czasu dryfu wymaga pomiaru białek o znanych wartościach CCS.
    1. Wybierz cztery kalibratory, dwa o masie większej i dwa o masie mniejszej niż badane białko37. Co najważniejsze, upewnij się, że wysokość i prędkość fali są takie same, jak te zarejestrowane dla badanego białka.
  5. Oblicz CCS ręcznie41 lub za pomocą specjalistycznego oprogramowania, takiego jak PULSAR3 i Amphitrite34 (Rysunek 5).
  6. Aby sprawdzić, czy białko w fazie gazowej zachowuje strukturę natywną, porównaj eksperymentalne CCS z teoretycznymi wartościami CCS uzyskanymi z struktur o wysokiej rozdzielczości. Dla HerA-NurA oblicz teoretyczne CCS metodą przybliżenia projekcyjnego (PA) dostępną w programie MOBCAL42. Inne metody obejmują metodę trajektorii (TM)42 oraz dokładne rozpraszanie sfery twardej (EHS)43.

4. Rozbijanie kompleksów białkowych w roztworze w celu wyznaczenia struktury za pomocą natywnej spektrometrii mas (Native MS) i spektrometrii mas z mobilnością jonową (IM-MS)

Uwaga: Subkompleksy białkowe mogą w niektórych przypadkach zostać zidentyfikowane z tego samego roztworu co kompleks nienaruszony. Jednakże dodatkowe informacje strukturalne, takie jak łączność między podjednostkami i skład kompleksu, mogą zostać uzyskane poprzez zaburzenie oddziaływań białkowych w roztworze w celu utworzenia subkompleksów. Można to osiągnąć na kilka sposobów, m.in. poprzez dodanie rozpuszczalnika organicznego, zwiększenie siły jonowej lub manipulację pH. Aby uzyskać wgląd w łączność podjednostek i skład kompleksu HerA-NurA, subkompleksy generowano w roztworze poprzez dodawanie rozpuszczalników zaburzających oddziaływania podjednostek.

  1. Przygotować próbkę białka i przeprowadzić wymianę buforu na octan amonu zgodnie z opisem w Kroku 1.
  2. Dodać od 10% do 40% rozpuszczalnika w przyrostach po 10%. Typowo stosowanymi rozpuszczalnikami są metanol (MeOH), dimetylosulfotlenek (DMSO) lub acetonitryl (ACN).
    UWAGA: Czynność tę można wykonać w polipropylenowej probówce do mikrowirówki.
  3. Inkubować mieszaninę na lodzie przez 1 h.
  4. Uzyskać widmo IM-MS dla każdego z warunków (Kroki 2 i 3) (Rysunek 4).
  5. Użyć oprogramowania SUMMIT4 do przypisania podkompleksów białkowych i wygenerowania sieci oddziaływań białek. Alternatywnie można ręcznie przygotować listę teoretycznych mas oczekiwanych form.
  6. Aby upewnić się, że podkompleksy są prawidłowo sfałdowane, obliczyć eksperymentalne wartości CCS dla podkompleksów i porównać je z teoretycznymi wartościami CCS, zgodnie z wyjaśnieniami w Kroku 3 (Tabela 1, Rysunek 5 oraz Rysunek 6).

5. Badanie stabilności kompleksów białkowych z wykorzystaniem rozwijania indukowanego zderzeniami (CIU)

Uwaga: CIU może być wykorzystywane do badania stabilności strukturalnej białek i ich kompleksów po wiązaniu ligandu. Specjalistyczne pakiety oprogramowania, takie jak PULSAR3, Amphitrite34 oraz CIU suite9, mogą być następnie użyte do modelowania rozwijania białka w fazie gazowej z ligandem i bez niego. Jako przykład, w tej sekcji przedstawiono procedurę monitorowania trajektorii rozwijania w fazie gazowej oraz badania stabilizującego efekt wiązania DNA i ATP w kompleksie HerA-NurA.

  1. Rejestruj dane IM-MS, zwiększając napięcie przyspieszenia pułapki od 10 V do 20 V w przyrostach 2–10 V, aby stopniowo rozwinąć białko w fazie gazowej.
    UWAGA: Rejestrowanie mniejszych przyrostów skutkuje większą liczbą plików danych do przetworzenia, jednak podejście to zapewnia bardziej szczegółowy wykres rozfałdowania, co jest istotne przy analizie punktów przejścia między formami sfałdowanymi a rozfałdowanymi.
  2. Przeanalizuj dane pozyskane przy użyciu PULSAR33, Amphitrite34 lub zestaw CIU9 or generować dwuwymiarowe wykresy rozfałdowania w jednostkach CCS w funkcji napięcia przyspieszającego (Krok 3). Dla każdego stanu ładunku jest to tworzone poprzez nakładanie na siebie znormalizowanych pod względem intensywności rozkładów CCS dla każdego napięcia przyspieszającego (Rycina 7 A-Bi).
  3. Wygeneruj teoretyczny wykres rozwijania (unfolding plot) przy użyciu jednego z pakietów oprogramowania. Dane zostaną dopasowane do modelu rozwijania. Umożliwia to ilościowe określenie energii kolizyjnej, przy której zachodzą przejścia rozwijania, oraz ustalenie stabilności białek z przyłączonymi ligandami i bez nich.33Przejście rozwijania (ang. unfolding transition) zachodzi, gdy dany gatunek przechodzi z jednego stanu (na podstawie eksperymentalnych wartości CCS) do innego stanu o większej wartości CCS.
  4. Aby ilościowo określić przejścia, należy obliczyć punkt(y) środkowy(e) przejścia między stanami, korzystając z algorytmów i oprogramowania, takiego jak PULSAR.33Jest to powszechnie określane jako CV50, co stanowi wartość napięcia kolizyjnego (pułapki), przy której ulega wyczerpaniu 50% konkretnego stanu.
  5. Zastosowanie CV50 wartość, obliczyć całkowitą energię wewnętrzną jonu, korzystając z energii kolizji w układzie centrum masy (KECOM)45KECOM jest definiowana przez całkowitą energię wewnętrzną dostępną dla przejścia rozwijania jonu i jest obliczana na podstawie energii kinetycznej oraz mas partnerów kolizyjnych (jonu białkowego i gazu neutralnego), zgodnie z opisem w równaniu (1)10
    KEcom (eV) = Wzór matematyczny do analizy CV, CV50×Z×(MN/MN+MIon), stosowany w obliczeniach naukowych. (równanie 1).
    Gdzie Z jest ładunkiem jonu, MN jest masa gazu obojętnego i MJON jest masą jonu białka.
    UWAGA: Wynika to z faktu, że CIU białek jest zależne od ładunku46,47. Zaleca się przeprowadzenie KECOM analiza więcej niż jednego stanu ładunku ( Rysunek 7Aii).

6. Procedury modelowania dla różnicowych symulacji dynamiki molekularnej stosowanych w zintegrowanej spektrometrii mas

UWAGA: Wykorzystując modele podjednostek lub kompleksów białkowych, na przykład pochodzące ze struktur krystalicznych, można przeprowadzić różnicowe symulacje MD (kompleks białkowy z ligandem i bez ligandu), aby określić wpływ np. obecności ligandu na strukturę i dynamikę białka. Niniejsza sekcja szczegółowo opisuje przepływ pracy oraz narzędzia niezbędne do procedur modelowania koniecznych do przygotowania różnicowych symulacji dynamiki molekularnej.

  1. Zidentyfikuj podjednostki tworzące kompleks (Rysunek 8A, w krokach 2 i 3). Pozyskaj istniejące modele podjednostek, np. struktury krystaliczne z bazy danych RCSB (https://www.rcsb.org). Wpis białka w bazie UniProt będzie zawierał listę znanych struktur krystalograficznych/NMR (http://www.uniprot.org). Jeśli nie są one dostępne, teoretyczną sekwencję można wprowadzić do programu BLAST w celu zidentyfikowania odpowiednich szablonów do modelowania homologicznego (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
  2. Zmontuj kompleks w odpowiedniej topologii (Rycina 8A-ii). Można to przeprowadzić za pomocą różnych metod. Poszczególne podjednostki można dopasować do dostępnych map mikroskopii elektronowej znajdujących się w bazie EMDB, aby złożyć nienaruszony kompleks (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/). Samouczek dotyczący dopasowywania struktur PDB do map EM przy użyciu metody Molecular Dynamics Flexible Fitting (MDFF) znajduje się tutaj: http://www.ks.uiuc.edu/Training/Tutorials/science/mdff/tutorial_mdff-html/.
  3. Zidentyfikuj brakujące regiony kompleksu (Rysunek 8A-iii). Przeprowadź wielokrotne wyrównanie sekwencji (MSA) pomiędzy sekwencją z PDB a sekwencją teoretyczną, aby zidentyfikować reszty, które mogą być niedopasowane do struktur krystalicznych, lub wszelkie mutacje wprowadzone na potrzeby eksperymentów krystalograficznych. MSA można przeprowadzić przy użyciu serwerów internetowych takich jak T-Coffee (http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular).
  4. Rekonstrukcja brakujących reszt metodą modelowania homologicznego (Rycina 8A-iv). Brakujące reszty kompleksu białkowego można zrekonstruować za pomocą programu MODELLER (https://salilab.org/modeller/). MODELLER może wygenerować zespół n modeli w różnych zregenerowanych konfiguracjach. Właściwe modele można zidentyfikować na podstawie wyniku energii DOPE (Discrete Optimised Protein Energy). Szczegółowy samouczek znajduje się na stronie internetowej oprogramowania (https://salilab.org/modeller/tutorial/).
  5. Przeprowadź różnicowe symulacje dynamiki molekularnej (MD) kompleksu białkowego (Rysunek 8B) w celu zidentyfikowania regionów białek, które reagują na konkretną zmianę środowiskową, np. obecność ligandu. W takich symulacjach parametry behawioralne z symulacji A (sama białko), która służy jako referencja, są odejmowane od parametrów z symulacji B (białko+ligand). Różnicowe średniokwadratowe odchylenie fluktuacji (RMSF), obliczone pomiędzy symulacjami A i B, może dostarczyć informacji o regionach białka, których elastyczność zwiększa się lub zmniejsza w sposób zależny od ligandu.
    1. Przeprowadź symulacje MD oraz analizy końcowe przy użyciu oprogramowania GROMACS (http://www.gromacs.org). Samouczek dostępny jest pod adresem: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/Lysozyme/index.html. Aby wyeliminować błąd modelu, należy najpierw wygenerować strukturę kompleksu z ligandem. Następnie z tej struktury należy skopiować białko bez liganda, aby uzyskać model białka identyczny z modelem kompleksu z ligandem. 

Wyniki

Wyniki natywnej spektrometrii mas (native MS) ujawniły stan oligomeryczny, skład oraz topologię kompleksu HerA-NurA (Rysunek 1). Ponieważ oddziaływania niewiążące są zachowane w fazie gazowej, natywna MS w eksperymentach miareczkowania ATP-γ-S i ADP pozwoliła określić wiązanie poszczególnych nukleotydów z HerA-NurA (Rysunek 2) oraz wykazała, że zwiększenie stężenia ATP-γ-S zwiększa względną intensywność heksamerycznego HerA (Rysunek 3). Informacje strukturalne dotyczące oddziaływań między podjednostkami uzyskano poprzez dysocjację w roztworze, po której przeprowadzono natywną MS; wyniki te były zgodne z masami teoretycznymi (Rysunek 4 i Tabela 1).

Eksperymentalne wartości CCS białek i ich kompleksów uzyskano w drodze eksperymentów IM-MS (Rycina 5). Wartości te stanowią uśrednione rotacyjnie obliczenia przekroju czynnego w fazie gazowej dla kształtu cząsteczki i opisują stan wymiarowy białka. Wartości CCS są porównywane z pomiarami teoretycznymi z krystalografii rentgenowskiej, a ich zgodność świadczy o zachowaniu natywnego kształtu w fazie gazowej. (Tabela 1)Potwierdza to zasadność wykorzystania wartości CCS do budowania niskorozdzielczych modeli kompleksu białkowego48.

Eksperymentalne wartości CCS można obliczyć dla każdego stanu ładunkowego jonu. Konformer białka o strukturze zbliżonej do natywnej może generować jony o różnych stanach ładunkowych o podobnych wartościach CCS. Jednak jony o wyższym stanie ładunkowym wykazują zwiększone odpychanie kulombowskie, co może prowadzić do rozfałdowania białka w fazie gazowej i uzyskania większych wartości CCS w porównaniu z teoretycznymi wartościami CCS. Dlatego zazwyczaj wykorzystuje się wartości CCS dla jonów o najniższym stanie ładunkowym49. W przypadku kompleksu HerA-NurA eksperymenty z dysocjacją w roztworze białek HerA oraz HerA-NurA z DNA i bez DNA pozwoliły na zaproponowanie ścieżki składania kompleksu, rozpoczynającej się od monomerów, które następnie tworzą cały kompleks heksamerycznego HerA (HerA6)-dimerycznego NurA (NurA2) z DNA (Rycina 6).

Różnice w wykresach rozwijania CIU pomiędzy formą apo (wolną od liganda) a formą związaną z ligandem definiują zmianę stabilności kompleksu po związaniu liganda. Wyższa wartość CV50 lub KECOM oznacza bardziej stabilną jon w fazie gazowej. Analiza CIU i KECOM wykazała, że HerA-NurA związany z DNA jest bardziej stabilny niż kompleks wolny od DNA (Rysunek 7Aii). Z analizy CIU-MS w odpowiednich stanach wiązania ATP wynika, że stan z czterema związanymi ATP-γ-S zmniejszył stabilność kompleksu w fazie gazowej, a najstabilniejszy był stan z sześcioma związanymi ATP-γ-S, w którym wszystkie miejsca były zajęte (Rysunek 7Bii). Natywna MS może ujawnić dyskretne stany wiązania nukleotydów HerA; nie potrafi jednak rozróżnić, które podjednostki HerA wiążą ATP i gdzie to wiązanie ma miejsce. Informacje te można uzyskać z symulacji MD w jawnych rozpuszczalnikach dla heksamerycznego HerA oraz kompleksu HerA-NurA, postępując zgodnie z podsumowanym schematem postępowania (Rysunek 8).

Schemat spektrometrii mas tworzenia kompleksu DNA-białko ze spektrami m/z; wykres słupkowy intensywności względnej.
Rysunek 1Badanie stanu oligomerycznego, składu i topologii kompleksu niekowalencyjnego HerA-NurA. (A) Widma mas HerA, HerA-NurA oraz HerA-NurA w obecności DNA (dwuniciowe DNA 25 bp o masie 15,4 kDa). Podkompleks HerA występuje zarówno jako heksamer, jak i heptamer. Dimer NurA wiąże się z heksamerem HerA, wymuszając konwersję oligomeryczną. DNA wiąże się z utworzonym kompleksem HerA-NurA (Wyniki zaadaptowane z Z. Ahdash) i wsp., 201722). (B) Względne intensywności zidentyfikowanych gatunków obliczono przy użyciu programu UniDec32. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza spektrometrią masową; kompleks HerA-NurA; wpływ ATP, ADP; diagram widma; badanie białek.
Rycina 2Natywna spektrometria mas z jonizacją elektrosprayową (ESI-MS) ujawnia mechanizm wiązania nukleotydów z kompleksem HerA-NurA. Widma masowe (A) HerA-NurA oraz (B) HerA-NurA-DNA przy zwiększających się stężeniach (i) ATP-γ-S i (ii) ADP. Zmierzone masy zestawiono z masami teoretycznymi, a następnie określono liczbę związanych cząsteczek ATP-γ-S lub ADP. Zmierzone masy oraz liczba związanych nukleotydów są przedstawione na widmach. Eksperymenty z miareczkowaniem ATP-γ-S i ADP pozwoliły określić parowe wiązanie nukleotydów z samym kompleksem HerA-NurA oraz w kompleksie z DNA, co wskazuje na cykliczny mechanizm reakcji (wyniki zaadaptowane z Z. Ahdash) i in., 201722). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Wykres analizy spektrometrycznej; wiązanie ATP, intensywność w funkcji m/z, względne poziomy oddziaływań białek.
Rycina 3Pomiar wpływu rosnących stężeń ATP-γ-S na stan oligomeryczny HerA. (A) Widma masowe HerA przy rosnących stężeniach ATP-γ-S. (B) Wykres przedstawiający względne intensywności różnych gatunków z natywnej MS obliczone przy użyciu oprogramowania do dekonwolucji UniDec32Wraz ze wzrostem stężenia ATP-γ-S wzrasta również względna intensywność heksamerowego HerA. Liczba związanych cząsteczek ATP-γ-S została naniesiona na widma (wyniki zaadaptowane z Z. Ahdash). i wsp., 201722). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza spektrometrią mas; kompleksy HerA, NurA z dsDNA w roztworach acetonitrylu i metanolu.
Rycina 4Widma mas i produkty dysocjacji podkompleksów (A) HerA oraz (B) HerA-NurA (i) osobno i w obecności (ii) DNA po rozbiciu w roztworze. Eksperymenty z rozbiciem w roztworze przeprowadzono przy użyciu 10–40% acetonitrylu, metanolu (MeOH) lub dimetylosulfotlenku (DMSO), co doprowadziło do powstania różnych podkompleksów. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza kompleksu białko-DNA; wykres CCS spektrometrii mas; widma subkompleksów i kompleksów.
Rysunek 5Rozkłady czasów przylotu w spektrometrii mobilności jonowej przedstawione na osi CCS dla kompleksów oraz powstałych podkompleksów. Ikony dla każdego podkompleksu odpowiadają tym naniesionym na widma w Rysunek 4Wartości mas eksperymentalnych i obliczonych oraz wartości CCS dla podkompleksów wymieniono w Tabela 1 wszystkie z nich wykazały zgodność między wartościami eksperymentalnymi a obliczonymi (po uwzględnieniu typowej niepewności rozdzielczości w spektrometrii mas z mobilnością jonów w fali wędrującej wynoszącej ±5-8%)37). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat oddziaływania HerA-NurA z dsDNA wraz z procesem tworzenia multimerów, ilustrujący kompleksy białkowe.
Rycina 6Ścieżka składania kompleksu HerA-NurA wygenerowana na podstawie natywnej spektrometrii mas (native MS) i spektrometrii mas z mobilnością jonową (IM-MS) po rozbiciu w roztworze. Kolorowe okręgi wskazują warunki, w których obserwowano poszczególne podkompleksy: natywne (zielony, przed rozbiciem), metanol (żółty), DMSO (fioletowy) lub acetonitryl (czerwony). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza spektrometrią mas kompleksów HerA6-NurA2 z ATP/dsDNA, przedstawiająca wykresy CCS w funkcji napięcia.
Rysunek 7Badanie efektu stabilizującego (A) DNA na kompleks HerA-NurA oraz (B) wiązania ATP do kompleksu HerA-NurA-DNA. (i) Wykresy CIU-MS w fazie gazowej oraz (ii) obliczenia energii kolizyjnej w środku masy (KEcom) wykazują, że obecność dsDNA stabilizuje kompleks HerA-NurA i że stan z sześcioma związanymi cząsteczkami ATP-γ-S jest najbardziej stabilny. Przedstawiono stabilizację dla różnych stanów ładunkowych. Wykresy zostały wygenerowane przy użyciu programu PULSAR. 33Wyniki z (A) zaadaptowane z Z. Ahdash i inni, 201722. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat montażu kompleksu białkowego i symulacji dynamiki molekularnej przedstawiający RMSF oraz analizę różnicową.
Rysunek 8Schemat procedur modelowania dla różnicowych symulacji dynamiki molekularnej. (A) Generowanie badanego kompleksu poprzez budowę topologii z istniejących podjednostek i odbudowę brakujących reszt. (B) Schemat przeprowadzania symulacji dynamiki molekularnej kompleksu białkowego z ligandem i bez liganda. Symulacje dynamiki molekularnej są przeprowadzane dla samego białka, które służy jako referencja i jest odejmowane od symulacji białka z ligandem. Następnie obliczana jest różnicowa średniokwadratowa fluktuacja (RMSF) między symulacjami w celu określenia wpływu wiązania liganda. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Kompleks / podkompleksMasa teoretyczna (kDa)Masa eksperymentalna (kDa)Teoretyczna powierzchnia kontaktu (Å2)Eksperymentalne CCS (Å2) [ładunek]Stan HN
HerA6-NurA2416.22417.851453114577 [42+]
14599 [43+]
14608 [44+]
14637 [45+]		10-20% ACN, 10-40% DMSO, 10% MeOH
HerA6-NurA2-dsDNA431.72432.27-14661 [39+]
14728 [40+]
14781 [41+]
14837 [42+]		10% ACN, 10% MeOH
NurA139.1238.1832542618 [10+]
2746 [11+]
2878 [12+]		10-40% ACN, 10% MeOH, 20-40% DMSO
NurA278.2478.3648904903 [16+]
4614 [17+]
4537 [18+]
4666 [19+]		10-40% MeOH, 20-40% DMSO
HerA156.3356.3241313647 [14+]
3792 [15+]
3950 [16+]		10-40% ACN, 40% DMSO
HerA2112.66112.9564755648 [20+]
5747 [21+]
5842 [22+]
5996 [23+]		40% metanolu, 10-40% ACN
HerA3168.99169.3986077501 [25+]
7616 [26+]
7717 [27+]
7867 [28+]		10-40% MeOH, 10-40% CAN, 40% DMSO
HerA3 + DNA183.99184.976-7655 [26+]
7990 [27+]
8107 [28+]		10-30% ACN
HerA4225.32226.2104779205 [30+]
9287 [31]
9493 [32+]
9961 [33+]		10-40% MeOH, 10-40% ACN
HerA4 +DNA240.82241.33-9637 [31+]
9756 [32+]
9830 [33+]		10-30% ACN
HerA5281.65282.751185310847 [36+]
10958 [37+]
11161 [38+]		30-40% ACN
HerA6337.98339.31251712335 [38+]
12386 [39+]
12498 [40+]
12590 [41+]
12676 [42+]
13019 [43+]		10-40% MeOH, 10-40% ACN
HerA6 +DNA353.48354.626-12890 [40+]
13081 [41+]
13184 [42+]
13273 [43+]
13463 [44+]
13576 [45+]		30% ACN
HerA7394.3395.851390114154 [42+]
14219 [43+]
14261 [44+]
14285 [45+]
14335 [46+]		10-40% MeOH, 10-40% ACN, 10-40% DMSO
HerA7 +DNA409.8410.62-14414 [41+]
14510 [42+]
14558 [43+]
14598 [44+]
14630 [45+]
14641 [46+]		10% ACN

Tabela 1. Eksperymentalne i obliczone masy oraz wartości CCS HerA-NurA i jego podkompleksów uzyskanych w badaniach rozpadu w roztworze.

Dyskusja

Stwardnienie rozsiane odgrywa coraz ważniejszą rolę w charakterystyce stechiometrii, oddziaływań i architektury podjednostek kompleksów białkowych. Dane IM-MS mogą być wykorzystywane do definiowania układów topologicznych podjednostek w obrębie kompleksów wieloskładnikowych. W porównaniu z innymi istniejącymi metodami biologii strukturalnej, stwardnienie rozsiane ma kilka zalet. Natywne stwardnienie rozsiane jest szybką i bardzo czułą techniką i może być stosowane do badania heterogenicznych próbek białek. W połączeniu z eksperymentami z zakłóceniami w roztworze można monitorować szlaki dysocjacji zespołów białek. Wraz ze strukturami krystalicznymi lub modelami homologii, informacje oferowane przez strukturalne stwardnienie rozsiane stanowią narzędzie do badania interakcji białko-ligand i dostarczają niemal natywnych modeli i ścieżek składania11.

W tym miejscu opisujemy niezbędne procedury eksperymentalne do analizy stechiometrii i składu oddziaływań białko-ligand, z jednym lub więcej ligandami, przy użyciu integracyjnego MS. Obejmuje to przygotowanie próbek MS, pozyskiwanie danych, analizę danych oraz integrację danych MS za pomocą narzędzi obliczeniowych. W tym celu jako nasz system modelowy użyliśmy heterooligomerycznego kompleksu białkowego HerA-NurA do resekcji DNA, związanego z trzema ligandami (DNA, ATP i ADP). Protokół pokazuje wykorzystanie obecnie dostępnego oprogramowania wspomagającego analizę i prezentację danych.

Uzyskanie wysokiej jakości widm jest ważne dla analizy wiązania ligandów, dlatego kluczowe znaczenie mają staranne etapy przygotowania próbki, w tym oczyszczanie białka, miareczkowanie ligandów i wymiana. Jednym z ograniczeń natywnego stwardnienia rozsianego nESI podczas badania wiązania ligandów jest niespecyficzne wiązanie. Niespecyficzne wiązanie zachodzi podczas desolwatacji kropel w całym procesie elektrorozpylania. Zwiększa to stężenie ligandów, a tym samym zmienia stosunek białka do liganda29. Wiązanie nukleotydów powoduje stosunkowo niewielką różnicę masy między apo a białkiem związanym z nukleotydem, co nie zmienia wydajności jonizacji50,51.

Do naszej pracy wykorzystaliśmy system Synapt G2-Si MS, ale protokoły mają zastosowanie do różnych badań innych kompleksów białko-ligand przy użyciu innych dostępnych na rynku spektrometrów masowych nano-elektrorozpylania. Integracyjne strukturalne państwa członkowskie odgrywają coraz ważniejszą rolę w rozwiązywaniu problemów biologicznych o większej złożoności. Opisany tutaj przepływ pracy i techniki są dobrze przystosowane do zrozumienia konsekwencji strukturalnych i mechanizmów budowania kompleksu białkowego i tworzenia białka-liganda, które są trudne do zbadania przy użyciu konwencjonalnych technik strukturalnych.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Karlowi-Peterowi Hopfnerowi i Robertowi Thomasowi Byrne'owi za uprzejme dostarczenie próbek białek HerA i HerA-NurA oraz za pomoc w projektowaniu eksperymentalnym. Dziękujemy również dr Eamonnowi Readingowi za jego recenzję manuskryptu. Z wdzięcznością dziękujemy naszym instytucjom finansującym: Wellcome Trust [109854/Z/15/Z] i Royal Society [RG150216 do A.P.].

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sól tetralitowa adenozyny 5′-(3-tiotrifosforanu) MerckMillipore119120-25MG
Adenozyno-5′-difosforan Sigma-Aldrich20398-34-9
Roztwór octanu amonuSigma-AldrichA2706
Kolumny do chromatografii mikro biospinowejKoncentrator Bio-Rad7326204
VivaspinSartoriusZ614041-25EA
Sześciowodny chlorek magnezuSigma-Aldrich246964
Water TraceSelectSigma-Aldrich95305
Kapilary borokrzemianoweAparat Harvard300060

Bibliografia

  1. Wilm, M., Mann, M. Analytical Properties of the Nanoelectrospray Ion Source. Analytical Chemistry. 68 (1), 1-8 (1996).
  2. Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecule. Science. 246 (4926), 64-71 (1989).
  3. Hernandez, H., Robinson, C. V. Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (3), 715-726 (2007).
  4. Heck, A. J., Van Den Heuvel, R. H. Investigation of intact protein complexes by mass spectrometry. Mass Spectrom Review. 23 (5), 368-389 (2004).
  5. Boeri Erba, E., Petosa, C. The emerging role of native mass spectrometry in characterizing the structure and dynamics of macromolecular complexes. Protein Science. 24 (8), 1176-1192 (2015).
  6. Laganowsky, A., Reading, E., Hopper, J. T. S., Robinson, C. V. Mass spectrometry of intact membrane protein complexes. Nature. 8 (4), 639-651 (2013).
  7. Benesch, J. L. Collisional activation of protein complexes: picking up the pieces. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 20 (3), 341-348 (2009).
  8. Tian, Y., Han, L., Buckner, A. C., Ruotolo, B. T. Collision Induced Unfolding of Intact Antibodies: Rapid Characterization of Disulfide Bonding Patterns, Glycosylation, and Structures. Analytical Chemistry. 87 (22), 11509-11515 (2015).
  9. Eschweiler, J. D., Rabuck-Gibbons, J. N., Tian, Y., Ruotolo, B. T. CIUSuite: A Quantitative Analysis Package for Collision Induced Unfolding Measurements of Gas-Phase Protein Ions. Analytical Chemistry. 87 (22), 11516-11522 (2015).
  10. Hopper, J. T., Oldham, N. J. Collision induced unfolding of protein ions in the gas phase studied by ion mobility-mass spectrometry: the effect of ligand binding on conformational stability. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 20 (10), 1851-1858 (2009).
  11. Politis, A., et al. Topological models of heteromeric protein assemblies from mass spectrometry: application to the yeast eIF3:eIF5 complex. Chemical Biology. 22 (1), 117-128 (2015).
  12. Morgner, N., et al. Hsp70 forms antiparallel dimers stabilized by post-translational modifications to position clients for transfer to Hsp90. Cell Reports. 11 (5), 759-769 (2015).
  13. Lai, Y. T., et al. Structure of a designed protein cage that self-assembles into a highly porous cube. Nature Chemistry. 6 (12), 1065-1071 (2014).
  14. Levy, E. D., Boeri Erba, E., Robinson, C. V., Teichmann, S. A. Assembly reflects evolution of protein complexes. Nature. 453 (7199), 1262-1265 (2008).
  15. Sharon, M., et al. Symmetrical modularity of the COP9 signalosome complex suggests its multifunctionality. Structure. 17 (1), 31-40 (2009).
  16. Jurneczko, E., Barran, P. E. How useful is ion mobility mass spectrometry for structural biology? The relationship between protein crystal structures and their collision cross sections in the gas phase. Analyst. 136 (1), 20-28 (2011).
  17. Politis, A., Schmidt, C. Structural characterisation of medically relevant protein assemblies by integrating mass spectrometry with computational modelling. Journal of Proteomics. 175, 34-41 (2017).
  18. Zhou, M., et al. Mass spectrometry of intact V-type ATPases reveals bound lipids and the effects of nucleotide binding. Science. 334 (6054), 380-385 (2011).
  19. Barrera, N. P., Booth, P. J., Robinson, C. V. Micelles Protect Membrane Complexes from Solution to Vacuum. Science. 321 (5886), 243-246 (2008).
  20. Konijnenberg, A., et al. Global structural changes of an ion channel during its gating are followed by ion mobility mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17170-17175 (2014).
  21. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Mohammed, S., Robinson, C. V. Acetylation and phosphorylation control both local and global stability of the chloroplast F1 ATP synthase. Scientific Reports. 7, 44068(2017).
  22. Ahdash, Z., et al. Mechanistic insight into the assembly of the HerA-NurA helicase-nuclease DNA end resection complex. Nucleic Acids Research. 45 (20), 12025-12038 (2017).
  23. Pagel, K., Natan, E., Hall, Z., Fersht, A. R., Robinson, C. V. Intrinsically disordered p53 and its complexes populate compact conformations in the gas phase. Angewandte Chemie. 52 (1), 361-365 (2013).
  24. Afonso, J. P., et al. Insights into the structure and assembly of the Bacillus subtilis clamp-loader complex and its interaction with the replicative helicase. Nucleic Acids Research. 41 (9), 5115-5126 (2013).
  25. van Duijn, E. Current limitations in native mass spectrometry based structural biology. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 21 (6), 971-978 (2010).
  26. Susa, A. C., Xia, Z., Williams, E. R. Native Mass Spectrometry from Common Buffers with Salts That Mimic the Extracellular Environment. Angewandte Chemie. 56 (27), 7912-7915 (2017).
  27. Breukera, K., McLafferty, F. W. Stepwise evolution of protein native structure with electrospray into the gas phase, 10 to 10 s. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18145-18152 (2008).
  28. Robinson, C. V., et al. Probing the Nature of Noncovalent Interactions by Mass Spectrometry. A Study of Protein-CoA Ligand Binding and Assembly. Journal of the American Chemical Society. 118 (36), 8646-8653 (1996).
  29. Shimon, L., Sharon, M., Horovitz, A. A method for removing effects of nonspecific binding on the distribution of binding stoichiometries: application to mass spectroscopy data. Biophysical Journal. 99 (5), 1645-1649 (2010).
  30. Dyachenko, A., Gruber, R., Shimon, L., Horovitz, A., Sharon, M. Allosteric mechanisms can be distinguished using structural mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7235-7239 (2013).
  31. Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. 19 (40), (2010).
  32. Marty, M. T., et al. Bayesian deconvolution of mass and ion mobility spectra: from binary interactions to polydisperse ensembles. Analytical Chemistry. 87 (8), 4370-4376 (2015).
  33. Allison, T. M., et al. Quantifying the stabilizing effects of protein-ligand interactions in the gas phase. Nature Communications. 6, 8551-8561 (2015).
  34. Sivalingam, G. N., Yan, J., Sahota, H., Thalassinos, K. Amphitrite: A program for processing travelling wave ion mobility mass spectrometry data. International Journal of Mass Spectrometry. 345-347, 54-62 (2013).
  35. Morgner, N., Robinson, C. V. Massign: an assignment strategy for maximizing information from the mass spectra of heterogeneous protein assemblies. Analytical Chemistry. 84 (6), 2939-2948 (2012).
  36. Bush, M. F., et al. Collision Cross Sections of Proteins and Their Complexes: A Calibration Framework and Database for Gas-Phase Structural Biology. Analytical Chemistry. 82, 9557-9565 (2010).
  37. Ruotolo, B. T., Benesch, J. L., Sandercock, A. M., Hyung, S. J., Robinson, C. V. Ion mobility-mass spectrometry analysis of large protein complexes. Nature Protocols. 3 (7), 1139-1152 (2008).
  38. Lanucara, F., Holman, S. W., Gray, C. J., Eyers, C. E. The power of ion mobility-mass spectrometry for structural characterization and the study of conformational dynamics. Nature Chemistry. 6 (4), 281-294 (2014).
  39. Wyttenbach, T., Bowers, M. T. Structural stability from solution to the gas phase: native solution structure of ubiquitin survives analysis in a solvent-free ion mobility-mass spectrometry environment. Journal of Physical Chemistry B. 115 (42), 12266-12275 (2011).
  40. Marcoux, J., Robinson, C. V. Twenty years of gas phase structural biology. Structure. 21 (9), 1541-1550 (2013).
  41. Michaelevski, I., Kirshenbaum, N., Sharon, M. T-wave ion mobility-mass spectrometry: basic experimental procedures for protein complex analysis. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
  42. Mesleh, M. F., Hunter, J. M., Shvartsburg, A. A., Schatz, G. C., Jarrold, M. F. Structural Information from Ion Mobility Measurements: Effects of the Long-Range Potential. Journal of Physical Chemistry A. 100, 16082-16086 (1996).
  43. Shvartsburg, A. A., Jarrold, M. F. An exact hard-spheres scattering model for the mobilities of polyatomic ions. Chemical Physics Letters. 261, 86-91 (1996).
  44. Taverner, T., Hernández, H., Sharon, M., Ruotolo, B. T., Matak-Vinković, D., Devos, D., Russell, R. B., Robinson, C. V. Subunit Architecture of Intact Protein Complexes from Mass Spectrometry and Homology Modeling. Accounts of Chemical Research. 41 (5), 617-627 (2008).
  45. Wysocki, V. H., Joyce, K. E., Jones, C. M., Beardsley, R. L. Surface-induced dissociation of small molecules, peptides, and non-covalent protein complexes. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 19 (2), 190-208 (2008).
  46. Hall, Z., Politis, A., Bush, M. F., Smith, L. J., Robinson, C. V. Charge-state dependent compaction and dissociation of protein complexes: insights from ion mobility and molecular dynamics. Journal of the American Chemical Society. 134 (7), 3429-3438 (2012).
  47. Hyung, S. J., Robinsons, C. V., Ruotolo, B. T. Gas-Phase Unfolding and Disassembly Reveals Stability Differences in Ligand-Bound Multiprotein Complexes. Chemistry & Biology. 16, 382-390 (2009).
  48. Hall, Z., Politis, A., Robinson, C. V. Structural modeling of heteromeric protein complexes from disassembly pathways and ion mobility-mass spectrometry. Structure. 20 (9), 1596-1609 (2012).
  49. Woods, L. A., Radford, S. E., Ashcroft, A. E. Advances in ion mobility spectrometry-mass spectrometry reveal key insights into amyloid assembly. Biochimica et Biophysica Acta. 1834 (6), 1257-1268 (2013).
  50. Daubenfeld, T., Bouin, A. P., van der Rest, G. A deconvolution method for the separation of specific versus nonspecific interactions in noncovalent protein-ligand complexes analyzed by ESI-FT-ICR mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. 17 (9), 1239-1248 (2006).
  51. Loo, J. A. Studying noncovalent protein complexes by electrospray ionization mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 16, 1-23 (1997).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Spektrometria mas w stanie natywnymspektrometria mas z separacją według mobilności jonowejoligomeryzacja białekanaliza wiązania ligandówsymulacje dynamiki molekularnejprzekrój czynny zderzeniowyskładanie kompleksów białkowychbadania wiązania nukleotydówbiałka naprawy DNAintegracyjna spektrometria mas strukturalna
Analiza architektur białek i kompleksów białko-ligand za pomocą integracyjnej strukturalnej spektrometrii mas
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.