Method Article

Wizualizacja interakcji między białkiem znakowanym Qdot a specyficznie modyfikowanym λ DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki

DOI:

10.3791/57967

⸱

July 17th, 2018

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji DNA-białko za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z pełnym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) przy użyciu specyficznie zmodyfikowanego substratu DNA λ i białka znakowanego kropkami kwantowymi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia fluorescencyjna wniosła ogromny wkład w analizę mechanizmów złożonych procesów biologicznych na poziomie pojedynczej cząsteczki. W testach jednocząsteczkowych do badania oddziaływań DNA-białko należy wziąć pod uwagę dwa ważne czynniki: substrat DNA o długości wystarczającej do łatwej obserwacji i znakowanie białka odpowiednią sondą fluorescencyjną. 48,5 kb λ DNA jest dobrym kandydatem na substrat DNA. Kropki kwantowe (Qdots), jako klasa sond fluorescencyjnych, umożliwiają długotrwałą obserwację (od minut do godzin) i akwizycję wysokiej jakości obrazu. W tym artykule przedstawiamy protokół badania interakcji DNA-białko na poziomie pojedynczej cząsteczki, który obejmuje przygotowanie specyficznie zmodyfikowanego DNA λ i znakowanie białka docelowego za pomocą Qdot pokrytych streptawidyną. Aby udowodnić słuszność koncepcji, wybieramy ORC (kompleks rozpoznawania pochodzenia) w pączkujących drożdżach jako białko będące przedmiotem zainteresowania i wizualizujemy jego interakcję z ARS (autonomicznie replikującą się sekwencją) za pomocą TIRFM. W porównaniu z innymi sondami fluorescencyjnymi, Qdots mają oczywiste zalety w badaniach pojedynczych cząsteczek ze względu na wysoką stabilność przed fotowybielaniem, ale należy zauważyć, że ta właściwość ogranicza jej zastosowanie w testach ilościowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje między białkiem a DNA są niezbędne dla wielu złożonych procesów biologicznych, takich jak replikacja DNA, naprawa DNA i transkrypcja. Chociaż konwencjonalne podejścia rzuciły światło na właściwości tych procesów, wiele kluczowych mechanizmów jest nadal niejasnych. Ostatnio, dzięki szybko rozwijającym się technikom pojedynczych cząsteczek, niektóre mechanizmy zostały rozwiązane1,2,3.

Zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki do wizualizacji oddziaływań białko-DNA w czasie rzeczywistym zależy głównie od rozwoju detekcji fluorescencji i sond fluorescencyjnych. W przypadku badania pojedynczej cząsteczki ważne jest, aby oznaczyć interesujące białko odpowiednią sondą fluorescencyjną, ponieważ systemy wykrywania fluorescencji są najczęściej dostępne na rynku.

Białka fluorescencyjne są powszechnie używane w biologii molekularnej. Jednak niska jasność fluorescencji i odporność na fotowybielanie ograniczają jego zastosowanie w wielu testach jednocząsteczkowych. Kropki kwantowe (Qdots) to maleńkie nanocząstki emitujące światło4. Ze względu na swoje unikalne właściwości optyczne, Qdots są 10 - 20 razy jaśniejsze i kilka tysięcy razy bardziej stabilne niż powszechnie stosowane barwniki organiczne5. Co więcej, Qdot mają duże przesunięcie Stokesa (różnica między pozycją wzbudzenia a pikami emisji)5. W związku z tym Qdots mogą być używane do długotrwałej obserwacji (od minut do godzin) i pozyskiwania obrazów o wysokim stosunku sygnału do szumu, podczas gdy nie mogą być wykorzystywane w testach ilościowych.

Do tej pory istnieją dwa podejścia do oznaczania docelowego białka za pomocą Qdots specyficznie dla miejsca: znakowanie za pomocą pierwszorzędowych lub drugorzędowych przeciwciał sprzężonych z Qdot6,7,8; lub bezpośrednie znakowanie docelowego białka za pomocą Qdots, co opiera się na silnym oddziaływaniu między biotyną a streptawidyną9,10,11,12,13. Qdot powlekane streptawidyną są dostępne w handlu. W naszym niedawnym badaniu, specyficznie biotynylowane białka w pączkujących drożdżach o wysokiej wydajności zostały oczyszczone przez nadekspresję białek znakowanych BirA i Avi in vivo10. Śledząc i optymalizując testy jednocząsteczkowe14,15,16,17, zaobserwowaliśmy interakcje między białkami znakowanymi Qdot a DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki za pomocą TIRFM10.

Tutaj wybieramy kompleks rozpoznawania pochodzenia pączkujących drożdży (ORC), który może specyficznie rozpoznawać i wiązać się z autonomicznie replikującą się sekwencją (ARS), jako nasze interesujące białko. Poniższy protokół przedstawia krok po kroku procedurę wizualizacji interakcji ORC oznaczonego znakiem Qdot z ARS za pomocą TIRFM. Opisano przygotowanie specyficznie zmodyfikowanego substratu DNA, biotynylację DNA, czyszczenie i funkcjonalizację szkiełka nakrywkowego, składanie komórek przepływowych oraz obrazowanie pojedynczych cząsteczek.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie substratu DNA λ-ARS317

  1. Budowa i pakowanie substratów DNA
    1. Trawić natywne λ DNA za pomocą enzymu XhoI; amplifikować fragment DNA o długości 543 pz zawierający ARS317 z genomowego DNA pączkujących drożdży przy użyciu starterów zawierających 20 pz homologicznych sekwencji przed i za miejscem enzymu XhoI na DNA lambda. Dodać 100 ng roztrawionego λ DNA XhoI i 10 ng fragmentu DNA do 10 μl homologicznego systemu reakcji rekombinacji i inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    2. Aby zapakować rekombinację λ DNA, dodać 25 μl ekstraktów z opakowania lambda do produktu rekombinacji i inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 90 minut. Następnie dodać dodatkowe 25 μl ekstraktów z opakowań lambda do probówki reakcyjnej. Kontynuować inkubację reakcji w temperaturze 30 °C przez 90 minut.
    3. Dodać 500 μl sterylnego buforu rozcieńczającego (10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2) do układu reakcyjnego i delikatnie wymieszać, kilkakrotnie obracając probówkę do góry dnem. Dodać 25 μl chloroformu, delikatnie wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    4. Dodać 100 μl pakowanego faga i 100 μl LE392MP bakteryjnego (hodowanego w temperaturze 0,8 - 1,0 przy użyciu pożywki LB, dodając 10 mMMgSO4) do nowej probówki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
    5. Dodać 200 μl mieszaniny fagów i bakterii do 4 ml agaru (pożywka LB + 0,7% agar + 10 mMMgSO4, schłodzona do 48 °C). Natychmiast wymieszaj, kilkakrotnie obracając probówkę do góry nogami i wylej ją na wstępnie podgrzany (37 °C) talerz LB.
    6. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez noc i przesiewać blaszkę λ-ARS317 za pomocą PCR i sekwencjonowania.
  2. Oczyszczanie substratu DNA z ciekłych lizatów11,18
    1. Pobrać jedną płytkę do 200 μl sterylnego ddH2O z 10 mM MgCl2 i 10 nM CaCl2. Wymieszać z 200 μl LE392MP bakterii (hodowanych przez noc w pożywce LB) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
    2. Mieszaninę fagów i bakterii dodać do 100 ml pożywki NZCYM (10 g/l NZ-aminy, 5 g/l ekstraktu drożdżowego, 5 g/l NaCl, 1 g/l hydrolizatu Casamino i 2 g/l MgSO4·7H2O) i hodować przez 7 godzin w temperaturze 37 °C. Dodać 250 μl chloroformu do kultury i wstrząsać przez kolejne 10 minut.
    3. Przenieść kulturę do kolby o pojemności 200 ml. Dodać 5,8 g NaCl (1 M stężenie końcowe), wymieszać do rozpuszczenia ręcznie i inkubować na lodzie przez 30 minut.
    4. Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia resztek komórek. Zebrać supernatant do kolby o pojemności 200 ml i dodać 10% PEG8000 (m/V). Mieszać do rozpuszczenia za pomocą mieszadła magnetycznego i inkubować na lodzie przez 30 minut lub dłużej.
    5. Wirować przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu wytrącenia bakteriofaga. Usunąć supernatant.
    6. Zawiesić osad w 2 ml buforu rozcieńczającego fagi. Przenieś go do probówki o pojemności 15 ml i dodaj 10 μl RNazy (końcowe stężenie wynosi 20 μg/ml) i 40 μl DNazy (końcowe stężenie wynosi 5 μg/ml). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    7. Dodać 2 ml 0,3 M Tris-HCl (pH 9,0), 100 mM EDTA + 1,25% SDS, 15 μL proteinazy K (końcowe stężenie to 10 μg/mL). Inkubować w temperaturze 65 °C przez 10 minut.
    8. Dodać 2 ml wstępnie schłodzonego octanu potasu (3 M, pH 4,8) i inkubować probówkę na lodzie przez 10 minut.
    9. Wirować przy 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia substancji nierozpuszczalnych.
    10. Dodać 0,7x objętość izopropanolu do supernatantu. Wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę do góry nogami i inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej (RT).
    11. Wirować przy 8 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu wytrącenia DNA. Usunąć supernatant.
    12. Przemyć DNA raz 70% etanolem przez odwirowanie przy 8 000 x g przez 10 minut. Usunąć supernatant.
    13. Delikatnie eluuj DNA za pomocą 500 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) i przenieś DNA do probówki o pojemności 1,5 ml.
    14. Dwukrotnie ekstrahować DNA za pomocą fenolu: chloroformu przez odwirowanie w stężeniu 8 000 g przez 10 minut.
    15. Wytrącić się za pomocą izopropanolu o objętości 0,7x. Wymieszać, delikatnie obracając probówkę do góry nogami i odwirować przy 8 000 x g przez 10 minut.
    16. Umyć raz 70% etanolem, ponownie zawiesić w 200 μl TE. Zmierzyć stężenie DNA i przechowywać w temperaturze -20 °C w podwielokrotnościach 12,5 μg.

2. biotynylacja DNA λ-ARS317

  1. Aby fosforylować biotynylowane oligonukleotydy (5'-AGGTCGCCGCC-TEG-Biotyna-3') komplementarne do lewego końca natywnego λ DNA, dodaj 1 μl (100 μM) oligonukleotydów, 7,5 μl ddH2O, 1 μl 10x buforu ligazy i 0,5 μl T4 PNK. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
  2. Aby ufosforylować λ-ARS317, dodać 12,5 μg λ-ARS317, 3 μl 10x buforu ligazy, 1 μL T4 PNK i ddH2O do całkowitej objętości 30 μL. Inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
  3. Do wyżarzanych oligonukleotydów z λ-ARS317 dodać 0,5 μl fosforylowanych oligonukleotydów, 195 μl ddH2O, 25 μl buforu 10×ligazy do fosforylowanej probówki λ-ARS317. Delikatnie wymieszać, odwracając probówkę do góry dnem i inkubować w temperaturze 65 °C przez 5 minut. Wyłączyć grzałkę bloku i pozostawić próbkę do ostygnięcia do temperatury poniżej 33 °C w bloku.
  4. Aby podwiązać oligonukleotydy λ-ARS317, dodaj 1 μl ligazy DNA T4 i 0,63 μl ATP (200 mM). Delikatnie wymieszać, obracając probówkę do góry dnem i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub 4 °C przez noc. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
    UWAGA: Aby uniknąć rozpadu DNA, wszystkie etapy mieszania należy wykonać, delikatnie obracając probówkę do góry nogami, zamiast mieszać za pomocą pipet.

3. Czyszczenie i funkcjonalizacja szkiełek nakrywkowych

  1. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych
    1. Umieść 20 szkiełek nakrywkowych w 4 słoikach do barwienia (5 szkiełek nakrywkowych/słoik), sonikuj przez 30 minut w etanolu i spłucz szkiełka nakrywkowe ultraczystymH2O3 razy.
    2. Sonikować przez 30 minut 1 M wodorotlenkiem potasu (KOH) i przepłukać szkiełka nakrywkowe ultraczystymH2O3 razy. Powtórz raz sonikację etanolu i KOH.
    3. Sonikować acetonem przez 30 minut, a następnie dokładnie spłukać ultraczystymH2O(co najmniej 3 razy).
      UWAGA: Aceton musi być dokładnie usunięty przez płukanie ultraczystymH2O, ponieważ może to spowodować wybuch, gdy rozpuszczalnik organiczny (taki jak aceton) zostanie omyłkowo zmieszany z roztworem piranii14.
    4. Umieścić szkiełka nakrywkowe w roztworze piranii (mieszanina 3:1H2SO4 i 30%H2O2) i inkubować w temperaturze 95 °C przez 1 h.
      UWAGA: Roztwór Pirania jest wysoce energetyczny i erozyjny, więc używaj go ostrożnie. Przygotowując roztwór piranii, należy najpierw dodać 50 mlH2O2do szklanej zlewki o pojemności 500 ml, a następnie powoli dodać 150 mlH2SO4 do zlewki.
    5. Szkiełka nakrywkowe spłukać ultraczystymH2O5 razy. Następnie dokładnie umyć każde szkiełko nakrywkowe ultraczystymH2Oza pomocą 3 zlewek wypełnionych ultraczystymH2Oi wysuszyć szkiełko nakrywkowe papierem od krawędzi szkiełka nakrywkowego. Umieść szkiełko nakrywkowe w słoiku do barwienia i dokładnie wysusz je w piekarniku o temperaturze 110 °C przez 30 minut.
      1. Opłucz szkiełko nakrywkowe metanolem i ponownie umieść słoik do barwienia w piekarniku o temperaturze 110 °C, aby dokładnie wysuszyć szkiełko nakrywkowe.
        UWAGA: Dokładne wysuszenie szkiełka nakrywkowego jest bardzo ważne, ponieważ APTES będzie miał wiele możliwych struktur powierzchni, gdy znajdzie się w obecności wody19.
  2. Funkcjonalizacja szkiełka nakrywkowego
    1. Dodaj 70 ml roztworu silanu (93% metanolu, 5% octu i 2% APTES) do każdego słoika, zakręć nakrętkę i pozostaw słoik w temperaturze pokojowej na noc.
    2. Umyj i wysusz szkiełka nakrywkowe zgodnie z opisem w kroku 3.1.5, z wyjątkiem dokładnego wysuszenia szkiełek nakrywkowych przy użyciu gazowego azotu zamiast umieszczania ich w suszarce.
    3. Dokładnie rozpuścić 150 mg mPEG (glikolu metoksypolietylenowego) i 6 mg biotyny-PEG (glikolu biotynowo-polietylenowego) w 1 ml 0,1 M świeżo wytworzonego NaHCO3 (pH 8,2). Następnie odwirować przy 17 000 x g przez 1 minutę w celu usunięcia nierozpuszczalnych PEG.
      UWAGA: Świeżo przygotowany NaHCO3 jest gotowy; nie ma potrzeby dostosowywania jego pH.
    4. Umieść silanizowane szkiełka nakrywkowe w pudełkach i połóż dwa małe szkiełka nakrywkowe na dwóch końcach silanizowanych szkiełek nakrywkowych. Odpipetować 100 μl roztworu PEG na środku silanizowanego szkiełka nakrywkowego i umieścić kolejne silanizowane szkiełko nakrywkowe na wierzchu.
    5. Dodaj trochę ultraczystegoH2Odo pudełka, aby było wilgotne, i inkubuj szkiełka nakrywkowe z roztworem PEG przez co najmniej 3 godziny w ciemności. Inkubacja przez noc również może zadziałać.
    6. Oddziel pary szkiełek nakrywkowych i trzymaj funkcjonalizowaną powierzchnię skierowaną do góry, dokładnie spłucz szkiełka nakrywkowe ultraczystymH2Oi wysusz je gazowym azotem.
    7. Zaznacz funkcjonalizowaną stronę szkiełek nakrywkowych na jednym z rogów za pomocą markera, trzymaj funkcjonalizowaną stronę do góry, umieść je w pudełkach i przechowuj pudełka w eksykatorze próżniowym przez 1 miesiąc.
    8. Aby przechowywać szkiełka nakrywkowe przez dłuższy czas, umieść jedno szkiełko nakrywkowe w probówce o pojemności 50 ml wywierconej z jednym otworem w nakrętce, a następnie włóż probówkę do plastikowej torby i zamknij torebkę za pomocą zgrzewarki próżniowej. W ten sposób szkiełka nakrywkowe można przechowywać w temperaturze -20 °C przez około 3 miesiące.

4. Zespół komory przepływowej

  1. Wytnij kanał 15 mm × 2 mm na środku kawałka taśmy dwustronnej (30 mm × 12 mm) za pomocą dziurkacza.
  2. Odklej papierową stronę taśmy dwustronnej i wklej ją na szkiełko podstawowe z dwoma otworami. Naciśnij, aby usunąć pęcherzyki powietrza. Z naszego doświadczenia wynika, że łatwiej jest usunąć pęcherzyki powietrza poprzez odklejenie strony papierowej niż plastikowej strony taśmy dwustronnej.
  3. Pokrój funkcjonalizowane szkiełko nakrywkowe (60 mm × 24 mm) na cztery części (30 mm × 12 mm) za pomocą rysika szklanego z diamentową końcówką i usuń zanieczyszczenia za pomocą gazowego azotu. Pamiętaj, aby trzymać funkcjonalną stronę do góry.
  4. Odklej plastikową stronę taśmy dwustronnej i wklej szkiełko na funkcjonalizowany szkiełko nakrywkowe. Delikatnie dociśnij, aby usunąć pęcherzyki powietrza między szkiełkiem nakrywkowym a taśmą. Dokładne usunięcie pęcherzyków powietrza może uchronić komorę przepływową przed wyciekiem podczas pompowania do niej.
  5. Włóż rurki dolotowe i wylotowe odpowiednio do małych i dużych otworów. Zamocuj rurkę za pomocą żywicy epoksydowej.
  6. Przepompować 20 μl streptawidyny (0,2 mg/ml) do komory przepływowej za pomocą strzykawki ręcznie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie pompuj bufor blokujący 10 do komory przepływowej, aby zastąpić streptawidynę i utrzymywać ją w temperaturze pokojowej.

5. Wizualizacja pojedynczej cząsteczki

  1. Uzyskaj wyrównanie ogniskowej czerwieni i dalekiej czerwieni za pomocą A5 na szkiełku testowym mikroskopu fluorescencyjnego #1 poprzez jednoczesne wzbudzenie za pomocą lasera 532 nm i lasera 640 nm. Twórz obrazy o podwójnej długości fali z układem optycznym rozdzielającym (patrz tabela materiałów).
  2. Umieścić celę przepływową na mikroskopie i podłączyć jej rurkę wylotową do dłuższej rurki łączącej się ze sprężyną o pojemności 10 ml zainstalowaną na automatycznej programowalnej pompie do infuzji/odstawienia.
    UWAGA: Pompowanie do komory przepływowej wymienionej poniżej oznacza wycofanie z rurki wlotowej komory przepływowej do strzykawki.
  3. Pompuj bufor blokujący o wydajności 500 μl/min do komory przepływowej, aby szybko usunąć powietrze i zapewnić odblokowanie bufora w komorze przepływowej. Następnie pompuj bufor blokujący z prędkością 200 μl/min do komory przepływowej i odwróć rurkę wylotową, aby dokładnie usunąć pęcherzyki powietrza z rurki dolotowej i komory przepływowej.
    UWAGA: Wszystkie pompowane do komory przepływowej należy przed użyciem odgazować w eksykatorze próżniowym przez co najmniej 15 minut.
  4. Dodać 0,5 μl biotynylowanego λ-ARS317 DNA do 80 μl buforu blokującego i pompować go do komory przepływowej z prędkością 25 μl/min przez 2 min. Następnie przepłukać DNA λ-ARS317 za pomocą 200 μl buforu blokującego z szybkością 50 μl/min.
  5. Przepompować 200 μl bufora wiążącego10 z szybkością 50 μL/min, aby usunąć bufor blokujący w komorze przepływowej.
  6. Dodać 0,2 μl Qdot705 pokrytego streptawidyną (1 μM) i 0,2 μl biotynylowanego ORC (1,2 μM) do probówki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. Następnie dodaj 20 μl buforu wiążącego do probówki i umieść ją na lodzie. Końcowe stężenie ORC-Qdot705 wynosi około 10 nM.
  7. Dodać 2 μl ORC-Qdot705 (10 nM), 1 μl DTT (100 mM), 1 μl ATP (200 mM) do 96 μl buforu wiążącego. Końcowe stężenie ORC-Qdot705 wynosi 0,2 nM.
  8. Pompować 20 μL 0,2 nM ORC-Qdot705 z prędkością 10 μL/min do komory przepływowej. Wypłukać nadmiar ORC-Qdot705 za pomocą 200 μl buforu wiążącego z szybkością 100 μL/min. Następnie pompuj bufor wiążący z 30 nM SYTOX Orange do komórki przepływowej, aby wybarwić substraty DNA z szybkością 100 μl / min.
  9. Wzbudz sygnał ORC-Qdot705 i sygnał SYTOX Orange Barwionego DNA za pomocą odpowiednio lasera 405 nm i lasera 532 nm. Obserwuj sygnały jednocześnie z przepływem 100 μl/min za pomocą czteropasmowego filtra pasmowo-przepustowego (FF01-446/510/581/703-25) i rejestruj obrazy za pomocą EM-CCD z prędkością 100 ms na klatkę. Zbierz 20 stosów obrazów z różnych pól.

6. Analiza danych

  1. Przytnij obrazy za pomocą oprogramowania Fiji za pomocą nowej wtyczki, która jest modyfikowana przez nas w oparciu o wtyczkę Image (OI_cut_RGBmerge) opracowaną przez laboratorium dr Rona Vale'a na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco.
    1. Przytnij stos obrazów (512 × 512 pikseli) do dwóch stosów obrazów (256 × 256 pikseli). Jeden to ekscytujący wynik lasera 532 nm, a drugi to ekscytujący wynik lasera 405 nm.
  2. Przetwarzaj 61 obrazów sekwencyjnych za pomocą projektu Fiji-Image-Stacks-Z (średnia intensywność).
  3. Zmierz ręcznie długość DNA (LDNA) i odległość od miejsca wiązania ORC-Qdot705 (LORC) na DNA do spętanego końca DNA.
  4. Oblicz wynik LORC/LDNA za pomocą programu Excel, przeanalizuj dane za pomocą metody bootstrap według R, a następnie utwórz histogram i dopasuj rozkłady Gaussa.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zobrazować interakcję między ORC znakowanym Qdot a ARS, najpierw skonstruowaliśmy substrat DNA λ-ARS317. Fragment DNA zawierający ARS317 został zintegrowany z miejscem XhoI (33,5 kb) natywnego DNA λ przez rekombinację homologiczną (Figura 1A). Produkt rekombinacji został zapakowany przy użyciu ekstraktów, a zapakowane cząstki fagów hodowano na płytkach LB (Rysunek 1B). Dodatnia blaszka fagowa została przebadana metodą PCR i potwierdzona...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy protokół obserwacji interakcji między białkiem znakowanym Qdot a specyficznie zmodyfikowanym λ DNA za pomocą TIRFM w komórce przepływowej. Niezbędne kroki obejmują specyficzną dla miejsca modyfikację substratu DNA, biotynylację DNA, czyszczenie i funkcjonalizację szkiełka nakrywkowego, przygotowanie komórek przepływowych i obrazowanie pojedynczych cząsteczek. Są dwa kluczowe punkty, na które należy zwrócić uwagę. Po pierwsze, wszystkie etapy związane z λ DNA powinny być delikatnie manipulowane...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Hasanowi Yardimci i dr Sevimowi Yardimci z Instytutu Francisa Cricka za życzliwą pomoc w eksperymentach z pojedynczymi cząsteczkami, dr Danielowi Duzdevichowi z laboratorium dr Erica C. Greene'a z Uniwersytetu Columbia, dr Yujie Sun z Uniwersytetu Pekińskiego i dr Chunlai Chen z Uniwersytetu Tsinghua za przydatną dyskusję. Badanie to było wspierane przez National Natural Science Foundation of China 31371264, 31401059, CAS Interdisciplinary Innovation Team oraz Newton Advanced Fellowship (NA140085) z Royal Society.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lambda DNANew England BiolabsN3011Sklep 25 μ L podwielokrotności przy -20 ºC.
XhoIenzym Thermo Fisher ScientificFD0694
Zestaw do klonowania szybkiej fuzjiBiotoolB22611
MaxPlax Ekstrakty opakowaniowe Lambda
EpicentreMP5110Szczep bakteryjny LE392MP
jest zawarty w tym pakiecie.
MgSO4Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013092Każda marka jest dopuszczalna.
TrisAmresco0497-5KG
NaClBeijing Chemical worksN/AKażda marka jest dopuszczalna.
MgCl2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10012818
ChloroformBeijing Chemical worksN/AKażda marka jest dopuszczalna.
NZ-aminaAmrescoJ853-250G
Casamino acidsSigma-Aldrich22090-500G
PEG8000BeyotimeST483
Mieszadło magnetyczneIKAKMO2 basic
15 mL ProbówkaEppendorf Eppendorf3012215115 mL, sterylna, luzem, 500szt
RnaseSIGMAR4875-100MG
DnazaSIGMAD5319-500UG
Proteinaza KAmresco0706-100MG
Biotynylowane starteryThermo Fisher ScientificN/A
T4 Ligaza DNA, Ligaza DNA T4, Bufor reakcyjny (10x)New England BiolabsM0202
Szkiełko nakrywkoweThermo Fisher Scientific22266882
EtanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009259
Wodorotlenek potasu (KOH)Sigma-Aldrich306568-100G
AcetonThermo Fisher ScientificA949-4
H2SO4Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd80120891kwas siarkowy
H2O2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd1001121830% Nadtlenek wodoru
Metanol Sigma-Aldrich322415-2L
Kwas octowySigma-AldrichV900798
APTESSigma-AldrichA3648
mPEG
(glikol metoksypolietylenowy)		LysanmPEG-SVA-5000
biotyna-PEG
(glikol biotynowo-polietylenowy)		LysanBiotin-PEG-SVA-5000
NaHCO3Sigma-Aldrich31437-500G
Eksykator próżniowyTianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.IPC250-1
Zgrzewarka próżniowaMAGIC SEALWP300
Rysik szklany z diamentową końcówkąMIKROSKOPIA ELEKTRONOWA NAUKI70036
Szkiełko szkiełkoweMarka żagla7101
Rurka doprowadzającaSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/2średnica wewnętrzna 0,38 mm; średnica zewnętrzna 1,09 mm.
Rurka wylotowaSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/4średnica wewnętrzna 0,76 mm; średnica zewnętrzna 1,22 mm.
Taśma dwustronnaSigma-AldrichGBL620001-1EA
EpoxyLEAFTOP9005pięciominutowa żywica epoksydowa
StreptawidynaSigma-AldrichS4762
Mikroskop fluorescencyjnyOlympusIX71
Pompa programowalna do infuzji/odstawienia
Aparat Harvard70-4504
Laser 532 nmCoherentSapphire-532-50
640 nm laserCoherentOBIS-640-100
EMCCD KameraAndorDU-897E-CS0-BV
W-View Gemini Obrazowanie
optyka dzielona		Hamamatsu photonics KKA12801-01
System oświetlenia TIRFOlympusIX2-RFAEVA2
60 razy; Obiektyw TIRFOlympusAPON60XOTIRF
Czterokrawędziowy laserowy dichroiczny
beamsplitter		SemrockDi01-R405/488/
532/635-25x36
Czterozakresowy filtr pasmowo-przepustowySemrockFF01-446/510/
581/703-25
Dichroiczny rozdzielacz wiązkiSemrockFF649-Di01-25x36
Filtr emisyjnyChroma Technology CorpET585/65m
Filtr emisyjnyChroma Technology CorpET665lp
FocalCheck fluorescencja, szkiełko testowe mikroskopu #1Thermo Fisher ScientificF36909
SYTOX OrangeThermo Fisher ScientificS11368
Qdot705 sprzężony streptawidynyThermo Fisher ScientificQ10163MPStore przy 4 º C, nie zamrażać.
ATPAmresco0220-25GPrzygotuj 200 mM roztwór ATP, używając ddH2O, dostosuj pH do 7,0 i przechowuj 10 μ L podwielokrotności przy -20 ºC.
Naziemna telewizja cyfrowaAmrescoM109-5GPrzygotuj 1 M roztwór za pomocą ddH2O i przechowuj 10 μ l podwielokrotności przy -20 ºC.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
  2. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
  3. Chong, S., Chen, C., Ge, H., Xie, X. S. Mechanism of transcriptional bursting in bacteria. Cell. 158 (2), 314-326 (2014).
  4. Wegner, K. D., Hildebrandt, N. Quantum dots: bright and versatile in vitro and in vivo fluorescence imaging biosensors. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4792-4834 (2015).
  5. Gao, X., et al. In vivo molecular and cellular imaging with quantum dots. Current opinion in biotechnology. 16 (1), 63-72 (2005).
  6. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62(2014).
  7. Lee, J. Y., Finkelstein, I. J., Arciszewska, L. K., Sherratt, D. J., Greene, E. C. Single-molecule imaging of FtsK translocation reveals mechanistic features of protein-protein collisions on DNA. Molecular cell. 54 (5), 832-843 (2014).
  8. Wang, H., Tessmer, I., Croteau, D. L., Erie, D. A., Van Houten, B. Functional characterization and atomic force microscopy of a DNA repair protein conjugated to a quantum dot. Nano letters. 8 (6), 1631-1637 (2008).
  9. Redding, S., et al. Surveillance and processing of foreign DNA by the Escherichia coli CRISPR-Cas system. Cell. 163 (4), 854-865 (2015).
  10. Xue, H., et al. Utilizing Biotinylated Proteins Expressed in Yeast to Visualize DNA-Protein Interactions at the Single-Molecule Level. Frontiers in microbiology. 8, 2062(2017).
  11. Duzdevich, D., et al. The dynamics of eukaryotic replication initiation: origin specificity, licensing, and firing at the single-molecule level. Molecular cell. 58 (3), 483-494 (2015).
  12. Hughes, C. D., et al. Real-time single-molecule imaging reveals a direct interaction between UvrC and UvrB on DNA tightropes. Nucleic acids research. 41 (9), 4901-4912 (2013).
  13. Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van Houten, B. Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single-molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins. Molecular cell. 37 (5), 702-713 (2010).
  14. Chandradoss, S. D., et al. Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies. Jove-Journal of Visualized Experiments. (86), (2014).
  15. Chen, X. Q., Zhao, E. S., Fu, Y. V. Using single-molecule approach to visualize the nucleosome assembly in yeast nucleoplasmic extracts. Science Bulletin. 62 (6), 399-404 (2017).
  16. Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57 (2), 179-186 (2012).
  17. Tanner, N. A., Loparo, J. J., van Oijen, A. M. Visualizing single-molecule DNA replication with fluorescence microscopy. Journal of visualized experiments: JoVE. (32), (2009).
  18. Lockett, T. J. A bacteriophage λ DNA purification procedure suitable for the analysis of DNA from either large or multiple small lysates. Analytical biochemistry. 185 (2), 230-234 (1990).
  19. Smith, E. A., Chen, W. How to prevent the loss of surface functionality derived from aminosilanes. Langmuir. 24 (21), 12405-12409 (2008).
  20. Kim, Y., Torre, A., Leal, A. A., Finkelstein, I. J. Efficient modification of λ-DNA substrates for single-molecule studies. Scientific reports. 7 (1), 2071(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule ImagingDNA Protein InteractionQuantum Dot LabelingLambda DNA SubstrateSite Specific ModificationTIRF MicroscopyFlow Cell AssemblyStreptavidin Coated QdotsORC Qdot705 LabelingSYTOX Orange Staining

Related Articles