Method Article

Wizualizacja interakcji między białkiem znakowanym Qdot a specyficznie modyfikowanym λ DNA na poziomie pojedynczej cząsteczki

DOI:

10.3791/57967

⸱

July 17th, 2018

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do badania interakcji DNA-białko za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z pełnym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) przy użyciu specyficznie zmodyfikowanego substratu DNA λ i białka znakowanego kropkami kwantowymi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia fluorescencyjna wniosła ogromny wkład w analizę mechanizmów złożonych procesów biologicznych na poziomie pojedynczej cząsteczki. W testach jednocząsteczkowych do badania oddziaływań DNA-białko należy wziąć pod uwagę dwa ważne czynniki: substrat DNA o długości wystarczającej do łatwej obserwacji i znakowanie białka odpowiednią sondą fluorescencyjną. 48,5 kb λ DNA jest dobrym kandydatem na substrat DNA. Kropki kwantowe (Qdots), jako klasa sond fluorescencyjnych, umożliwiają długotrwałą obserwację (od minut do godzin) i akwizycję wysokiej jakości obrazu. W tym artykule przedstawiamy protokół badania interakcji DNA-białko na poziomie pojedynczej cząsteczki, który obejmuje przygotowanie specyficznie zmodyfikowanego DNA λ i znakowanie białka docelowego za pomocą Qdot pokrytych streptawidyną. Aby udowodnić słuszność koncepcji, wybieramy ORC (kompleks rozpoznawania pochodzenia) w pączkujących drożdżach jako białko będące przedmiotem zainteresowania i wizualizujemy jego interakcję z ARS (autonomicznie replikującą się sekwencją) za pomocą TIRFM. W porównaniu z innymi sondami fluorescencyjnymi, Qdots mają oczywiste zalety w badaniach pojedynczych cząsteczek ze względu na wysoką stabilność przed fotowybielaniem, ale należy zauważyć, że ta właściwość ogranicza jej zastosowanie w testach ilościowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje między białkiem a DNA są niezbędne dla wielu złożonych procesów biologicznych, takich jak replikacja DNA, naprawa DNA i transkrypcja. Chociaż konwencjonalne podejścia rzuciły światło na właściwości tych procesów, wiele kluczowych mechanizmów jest nadal niejasnych. Ostatnio, dzięki szybko rozwijającym się technikom pojedynczych cząsteczek, niektóre mechanizmy zostały rozwiązane1,2,3.

Zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki do wizualizacji oddziaływań białko-DNA w czasie rzeczywistym zależy głównie od rozwoju detek....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie substratu DNA λ-ARS317

  1. Budowa i pakowanie substratów DNA
    1. Trawić natywne λ DNA za pomocą enzymu XhoI; amplifikować fragment DNA o długości 543 pz zawierający ARS317 z genomowego DNA pączkujących drożdży przy użyciu starterów zawierających 20 pz homologicznych sekwencji przed i za miejscem enzymu XhoI na DNA lambda. Dodać 100 ng roztrawionego λ DNA XhoI i 10 ng fragmentu DNA do 10 μl homologicznego systemu reakcji rekombinacji i inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    2. Aby zapakować rekombinację λ DNA, dodać 25 μl ekstraktów z opakowania lambda do produktu rekombinacji i inkubow....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zobrazować interakcję między ORC znakowanym Qdot a ARS, najpierw skonstruowaliśmy substrat DNA λ-ARS317. Fragment DNA zawierający ARS317 został zintegrowany z miejscem XhoI (33,5 kb) natywnego DNA λ przez rekombinację homologiczną (Figura 1A). Produkt rekombinacji został zapakowany przy użyciu ekstraktów, a zapakowane cząstki fagów hodowano na płytkach LB (Rysunek 1B). Dodatnia blaszka fagowa została przebadana metodą PCR i potwierdzona.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy protokół obserwacji interakcji między białkiem znakowanym Qdot a specyficznie zmodyfikowanym λ DNA za pomocą TIRFM w komórce przepływowej. Niezbędne kroki obejmują specyficzną dla miejsca modyfikację substratu DNA, biotynylację DNA, czyszczenie i funkcjonalizację szkiełka nakrywkowego, przygotowanie komórek przepływowych i obrazowanie pojedynczych cząsteczek. Są dwa kluczowe punkty, na które należy zwrócić uwagę. Po pierwsze, wszystkie etapy związane z λ DNA powinny być delikatnie manipulowane.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy dr Hasanowi Yardimci i dr Sevimowi Yardimci z Instytutu Francisa Cricka za życzliwą pomoc w eksperymentach z pojedynczymi cząsteczkami, dr Danielowi Duzdevichowi z laboratorium dr Erica C. Greene'a z Uniwersytetu Columbia, dr Yujie Sun z Uniwersytetu Pekińskiego i dr Chunlai Chen z Uniwersytetu Tsinghua za przydatną dyskusję. Badanie to było wspierane przez National Natural Science Foundation of China 31371264, 31401059, CAS Interdisciplinary Innovation Team oraz Newton Advanced Fellowship (NA140085) z Royal Society.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Lambda DNANew England BiolabsN3011Sklep 25 μ L podwielokrotności przy -20 ºC.
XhoIenzym Thermo Fisher ScientificFD0694
Zestaw do klonowania szybkiej fuzjiBiotoolB22611
MaxPlax Ekstrakty opakowaniowe Lambda
EpicentreMP5110Szczep bakteryjny LE392MP
jest zawarty w tym pakiecie.
MgSO4Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10013092Każda marka jest dopuszczalna.
TrisAmresco0497-5KG
NaClBeijing Chemical worksN/AKażda marka jest dopuszczalna.
MgCl2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10012818
ChloroformBeijing Chemical worksN/AKażda marka jest dopuszczalna.
NZ-aminaAmrescoJ853-250G
Casamino acidsSigma-Aldrich22090-500G
PEG8000BeyotimeST483
Mieszadło magnetyczneIKAKMO2 basic
15 mL ProbówkaEppendorf Eppendorf3012215115 mL, sterylna, luzem, 500szt
RnaseSIGMAR4875-100MG
DnazaSIGMAD5319-500UG
Proteinaza KAmresco0706-100MG
Biotynylowane starteryThermo Fisher ScientificN/A
T4 Ligaza DNA, Ligaza DNA T4, Bufor reakcyjny (10x)New England BiolabsM0202
Szkiełko nakrywkoweThermo Fisher Scientific22266882
EtanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd10009259
Wodorotlenek potasu (KOH)Sigma-Aldrich306568-100G
AcetonThermo Fisher ScientificA949-4
H2SO4Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd80120891kwas siarkowy
H2O2Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd1001121830% Nadtlenek wodoru
Metanol Sigma-Aldrich322415-2L
Kwas octowySigma-AldrichV900798
APTESSigma-AldrichA3648
mPEG
(glikol metoksypolietylenowy)		LysanmPEG-SVA-5000
biotyna-PEG
(glikol biotynowo-polietylenowy)		LysanBiotin-PEG-SVA-5000
NaHCO3Sigma-Aldrich31437-500G
Eksykator próżniowyTianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.IPC250-1
Zgrzewarka próżniowaMAGIC SEALWP300
Rysik szklany z diamentową końcówkąMIKROSKOPIA ELEKTRONOWA NAUKI70036
Szkiełko szkiełkoweMarka żagla7101
Rurka doprowadzającaSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/2średnica wewnętrzna 0,38 mm; średnica zewnętrzna 1,09 mm.
Rurka wylotowaSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE/4średnica wewnętrzna 0,76 mm; średnica zewnętrzna 1,22 mm.
Taśma dwustronnaSigma-AldrichGBL620001-1EA
EpoxyLEAFTOP9005pięciominutowa żywica epoksydowa
StreptawidynaSigma-AldrichS4762
Mikroskop fluorescencyjnyOlympusIX71
Pompa programowalna do infuzji/odstawienia
Aparat Harvard70-4504
Laser 532 nmCoherentSapphire-532-50
640 nm laserCoherentOBIS-640-100
EMCCD KameraAndorDU-897E-CS0-BV
W-View Gemini Obrazowanie
optyka dzielona		Hamamatsu photonics KKA12801-01
System oświetlenia TIRFOlympusIX2-RFAEVA2
60 razy; Obiektyw TIRFOlympusAPON60XOTIRF
Czterokrawędziowy laserowy dichroiczny
beamsplitter		SemrockDi01-R405/488/
532/635-25x36
Czterozakresowy filtr pasmowo-przepustowySemrockFF01-446/510/
581/703-25
Dichroiczny rozdzielacz wiązkiSemrockFF649-Di01-25x36
Filtr emisyjnyChroma Technology CorpET585/65m
Filtr emisyjnyChroma Technology CorpET665lp
FocalCheck fluorescencja, szkiełko testowe mikroskopu #1Thermo Fisher ScientificF36909
SYTOX OrangeThermo Fisher ScientificS11368
Qdot705 sprzężony streptawidynyThermo Fisher ScientificQ10163MPStore przy 4 º C, nie zamrażać.
ATPAmresco0220-25GPrzygotuj 200 mM roztwór ATP, używając ddH2O, dostosuj pH do 7,0 i przechowuj 10 μ L podwielokrotności przy -20 ºC.
Naziemna telewizja cyfrowaAmrescoM109-5GPrzygotuj 1 M roztwór za pomocą ddH2O i przechowuj 10 μ l podwielokrotności przy -20 ºC.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
  2. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. C....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule ImagingDNA Protein InteractionQuantum Dot LabelingLambda DNA SubstrateSite Specific ModificationTIRF MicroscopyFlow Cell AssemblyStreptavidin Coated QdotsORC Qdot705 LabelingSYTOX Orange Staining

Related Articles