Artykuł metodologiczny

Test sekwestracji dehydrogenazy mleczanowej — prosta i wiarygodna metoda określania masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków

DOI:

10.3791/57971

⸱

27 lipca 2018

 ,  , 
1The Autophagy Team, Centre for Molecular Medicine Norway (NCMM), Nordic EMBL Partnership, University of Oslo

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisany jest prosty i dobrze sprawdzony protokół pomiaru masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków. Metoda opiera się na ilościowym określeniu proporcji dehydrogenazy mleczanowej (LDH) we frakcjach komórek sedymentacyjnych w porównaniu z całkowitymi poziomami LDH w komórkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Masowa autofagia charakteryzuje się sekwestracją dużych porcji cytoplazmy na podwójne/wielobłonowe struktury zwane autofagosomami. Tutaj opisano prosty protokół monitorowania tego procesu. Ponadto przedstawiono typowe wyniki i eksperymentalną walidację metody w warunkach indukujących autofagię w różnych typach hodowanych komórek ssaków. Podczas autofagii masowej autofagosomy sekwestrują cytozol, a tym samym rozpuszczalne białka cytozolowe, wraz z innymi ładunkami autofagicznymi. LDH jest stabilnym i bardzo obfitym, rozpuszczalnym enzymem cytozolowym, który jest nieselektywnie sekwestrowany do autofagosomów. Wielkość sekwestracji LDH odzwierciedla zatem wielkość masowej sekwestracji autofagicznej. Aby skutecznie i dokładnie określić sekwestrację LDH w komórkach, stosujemy protokół frakcjonowania oparty na elektrozakłóceniach, który skutecznie oddziela LDH osadowy od cytozolowego, a następnie mierzy aktywność enzymatyczną we frakcjach sedymentacyjnych w porównaniu z próbkami całych komórek. Sekwestrację autofagiczną określa się poprzez odjęcie proporcji sedymentacyjnego LDH w komórkach niepoddanych działaniu substancji od proporcji w komórkach poddanych działaniu substancji chemicznej. Zaletą testu sekwestracji LDH jest to, że daje ilościową miarę autofagicznej sekwestracji ładunku endogennego, w przeciwieństwie do innych metod, które obejmują ektopową ekspresję sond sekwestracyjnych lub półilościowe analizy ochrony proteazy markerów lub receptorów autofagii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autofagia (po grecku "samozjadanie") to ewolucyjnie zachowany proces wakuolarnej/lizosomalnej degradacji materiału wewnątrzkomórkowego. Po odkryciu genów związanych z autofagią ("ATG"), które są ważne dla autofagii u drożdży i ludzi, oraz uświadomieniu sobie, że autofagia odgrywa znaczącą rolę w ludzkim zdrowiu i chorobach (potwierdzone Nagrodą Nobla w dziedzinie medycyny lub fizjologii w 2016 r. dla Yoshinori Ohsumi), autofagia szybko stała się jednym z najintensywniej badanych procesów w biologii komórki1, 2.

Makroautofagia (zwana dalej "autofagią") charakteryzuje się rozszerzaniem i fałdowaniem wewnątrzkomórkowych błon cisternae ("fagoforów") w szczelne, podwójne lub wielobłonowe struktury ("autofagosomy"), które skutecznie sekwestrują owinięty materiał od reszty cytoplazmy. Po fuzji autofagosomów z lizosomami wewnętrzna błona autofagosomalna i sekwestrowany ładunek są degradowane i poddawane recyklingowi. Autofagosomy mogą sekwestrować materiał cytoplazmatyczny zarówno w sposób losowy (autofagia nieselektywna), jak i selektywny (autofagia selektywna). Autofagia masowa najprawdopodobniej stanowi mieszankę autofagii nieselektywnej i selektywnej.

W latach sześćdziesiątych i siedemdziesiątych ("era morfologiczna" badań nad autofagią), sekwestracja autofagiczna była głównie oceniana za pomocą analiz ultrastrukturalnych. W latach osiemdziesiątych i na początku lat dziewięćdziesiątych ("era biochemiczna") Per Seglen i współpracownicy, którzy badali autofagię w pierwotnych hepatocytach szczurów, opracowali pierwsze metody ilościowego pomiaru aktywności sekwestracji autofagicznej3. Korzystając z tych testów, Seglen zdefiniował i scharakteryzował różne etapy szlaku autofagiczno-lizosomalnego4,5, odkrył i ukuł amfisom6 (produkt fuzji endosomu z autofagosomem) i jako pierwszy opisał rolę fosforylacji białek w regulacji autofagii7. Jednak po odkryciu ATG w latach 90. ("era molekularna") i pierwszej charakterystyce ssaczego białka ATG8, białka związanego z mikrotubulami 1A/1B-łańcuch lekki 3 (LC3) w 20008, zastosowanie białek ATG jako markerów procesu autofagicznego szybko zyskało popularność, a starsze i bardziej pracochłonne metody biochemiczne pozostały w tyle. W rzeczywistości, w ciągu ostatnich 18 lat, analizy LC3 za pomocą western blot i mikroskopii fluorescencyjnej stały się zdecydowanie najpopularniejszym (a w wielu przypadkach jedynym) sposobem badania autofagii w komórkach ssaków. Zaletą jest względna łatwość, z jaką można przeprowadzić te metody. Wadą jest to, że bada się komponent wózka (LC3), a nie rzeczywisty ładunek autofagiczny. Jest to dość poważna wada, ponieważ związek między stanami i/lub przepływem LC3 przez ścieżkę a sekwestracją i przepływem ładunku jest wysoce niejasny. W rzeczywistości wykazaliśmy, że strumień ładunków masowych może być utrzymywany na wysokim poziomie w warunkach, w których nie ma strumienia LC3, pomimo obecności sprzężonego LC3 w komórkach9. Co więcej, wykazaliśmy, że na masową autofagię nie ma wpływu efektywne zubożenie LC3, a zatem prawdopodobnie jest niezależna od LC39. Odkrycie to zostało później potwierdzone przez LC3 knock-out studies10,11, które wskazują również, że mitofagia zależna od Parkiny (selektywna autofagia mitochondriów) jest niezależna od LC310,11.

Podsumowując, istnieje wyraźna potrzeba testów opartych na ładunku do monitorowania aktywności autofagicznej. Optymalnie takie testy powinny mieć szerokie zastosowanie, być dobrze zdefiniowane i łatwe do wykonania. W ciągu ostatnich kilku lat szczególnie zainteresowaliśmy się testem sekwestracji LDH, który został opracowany przez Pera Seglena w latach 1980-tych12 i opiera się na pomiarze transferu cytozolowego LDH do sedymentowalnych, autofagicznych frakcji komórek zawierających wakuolę. LDH jest stabilnym, rozpuszczalnym białkiem cytozolowym, które jest łatwo sekwestrowane, gdy fagofory owijają ładunek cytoplazmatyczny. Sekwestracja LDH jest zatem ogólną miarą sekwestracji autofagicznej. LDH jest rozkładany wyłącznie przez szlak autofagiczno-lizosomalny12. Tak więc, w obecności lizosomalnych inhibitorów degradacji, np. bafilomycyny A1 (Baf)13, eksperymentalne efekty leczenia bezpośrednio odzwierciedlają zmiany w aktywności sekwestracji autofagicznej. W przypadku braku inhibitorów degradacji można zmierzyć efekt netto zmian w sekwestracji i degradacji LDH.

Test sekwestracji LDH ma szerokie zastosowanie, ponieważ LDH jest wysoce i wszechobecnie wyrażany we wszystkich typach komórek, a poziomy LDH mogą być dokładnie określone ilościowo za pomocą testu enzymatycznego14,15. Jednak oryginalny protocol12 — ustalony w pierwotnych hepatocytach szczurów — był dość czasochłonny i wymagał dużej ilości materiału wyjściowego, a także specjalnie wykonanego kondensatora wyładowczego. Stopniowo przekształcaliśmy test w łatwą i wszechstronną metodę. Po pierwsze, oryginalny protokół został zaadaptowany do użytku w liniach komórkowych ssaków16. Po drugie, metoda została znacznie przeskalowana w dół3,9. Po trzecie, wyeliminowano kilka etapów protokołu, w tym pracochłonny etap poduszki gęstości17. Umożliwiło to jednocześnie dalsze zmniejszenie skali metody, od pierwotnego punktu wyjścia, w którym używano płytki o średnicy 10 cm na próbkę16, do użycia pojedynczego dołka z płytki 12-dołkowej na próbkę (tj. około 15-krotnie mniej materiału wyjściowego)17. Po czwarte, zidentyfikowaliśmy komercyjne urządzenie do elektroporacji, które mogłoby zastąpić wykonany na zamówienie kondensator wyładowczy elektryczny17.

Tutaj prezentowany jest nasz najbardziej aktualny protokół testu sekwestracji LDH, który zawiera kilka dalszych uproszczeń metody w porównaniu do poprzednio opublikowanego17. Ponadto przedstawiono zestaw typowych wyników uzyskanych na wielu różnych typach komórek, a co ważne, przedstawiono wiele linii eksperymentalnych walidacji metody przy użyciu metod farmakologicznych oraz genetycznych knockdown i knockout. Aby zapoznać się z ogólnym schematem przepływu całego protokołu, zobacz Rysunek 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Sadzenie i leczenie komórek

  1. Hodować przylegające komórki w kolbach do hodowli tkankowych o długości 75cm2 w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C, stosując pożywkę preferowaną dla danego typu komórki. Pozwól komórkom rosnąć, aż dotrą do prawie zlewającej się warstwy komórek.
    UWAGA: Użyj pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) dla LNCaP, HEK293, mysich fibroblastów zarodkowych (MEF), komórek BJ, MCF-7 i RPE-1.
    1. Przemyć komórki 3 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o temperaturze 37 °C, pH 7,4. Zastąp PBS 3 ml 0,25% (w/v) trypsyny-etylenodiaminotetraoctanu (EDTA) i inkubuj kolbę w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C, aż komórki odłączą się (2–5 min).
    2. Zawiesić oderwane komórki za pomocą 7 ml pożywki hodowlanej zawierającej 10% FBS. Wymieszać 10 μl zawiesiny komórek z 10 μl 0,4% błękitu trypanowego w probówce do mikrowirówki, używając końcówki do pipety o pojemności 0,5–20 μl. Użyj tej samej końcówki pipety, aby natychmiast napełnić szkiełko komory liczącej i policzyć komórki w automatycznym liczniku komórek.
  2. Przygotować odpowiednie rozcieńczenie (patrz uwaga poniżej) zawiesiny komórek z kroku 1.1.2 przy użyciu pożywki hodowlanej zawierającej 10% FBS i zasiać 1 ml rozcieńczonej zawiesiny komórkowej w każdym dołku 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej (powierzchnia ~3,8cm2) przy użyciu techniki aseptycznej. Pozostawić wzrost w nawilżonym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C, aż do osiągnięcia pożądanej gęstości komórek, np. 60–90% konfluencji podczas zbioru.
    UWAGA: Odpowiednie rozcieńczenie zawiesiny komórek, które zapewni pożądane zbieganie się komórek podczas zbioru, będzie się różnić w zależności od typu komórki, a także w zależności od czasu trwania i rodzaju eksperymentalnych zabiegów. W związku z tym musi to być empirycznie ocenione w każdym przypadku.
    1. W przypadku eksperymentów, które mają być zarówno poddane obróbce, jak i zebrane 2 dni po wysianiu, wysiewaj 2,5 x 105 komórek LNCaP, HEK293 lub MCF-7, 5 x 104 MEF, 4 x 105 BJ lub 1,5 x 105 komórek RPE-1 w każdym dołku 12-dołkowej płytki.
    2. W przypadku komórek, które luźno przylegają, należy pokryć płytki rodzajem powłoki zalecanym dla danego typu ogniwa. W przypadku ogniw LNCaP (i HEK293) należy stosować płytki pokryte poli-D-lizyną (PDL).
    3. W tym celu dodać 500 μl PDL w stężeniu 2,5 μg/ml w sterylnymH2Odo każdego dołka i inkubować płytki w sterylnym środowisku przez 30 minut w temperaturze pokojowej (20–25 °C). Wyjąć PDL za pomocą odsysania i krótko umyć każdą studzienkę 1 ml sterylnego H2O.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, krok 1.2.1 jest wykonywany bez żadnych eksperymentalnych zabiegów. Jeśli jednak wykonujesz RNAi, wygodne może być rozpoczęcie odwrotnej transfekcji za pomocą seeding9.
  3. Wykonaj zabiegi eksperymentalne w zduplikowanych lub potrójnych studzienkach na warunek.
    1. Na przykład, potraktuj komórki 50 nM inhibitora mTOR Torin1, który na ogół jest skutecznym induktorem sekwestracji autofagicznej, lub poddaj komórki ostremu głodowi surowicy i aminokwasów, przemłukując komórki 1 ml bezaminokwasowego roztworu soli Earle'a (EBSS), a następnie inkubuj komórki w 1 ml EBSS w nawilżanym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
    2. Pozostawić jeden zestaw studzienek niepoddanych działaniu substancji czynnej w celu określenia poziomów tła LDH dającego się osadzać.
    3. Dodać nasyconą ilość inhibitora po sekwestracji bafilomycyny A1 (Baf)3,13,16,18 w przypadku braku lub obecności eksperymentalnych zabiegów, 3–4 godziny przed pobraniem komórek. Inkubować komórki w nawilżonym inkubatorze z 5% stężeniem CO2 w temperaturze 37 °C.
      1. Użyj 100 nM Baf dla ogniw LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 i RPE-1 oraz 10 nM Baf dla MEF.
      2. W przypadku zabiegów eksperymentalnych, które trwają tylko 3-4 godziny (jak te opisane w kroku 1.3.1), należy dodać Baf jednocześnie z zabiegami. W przypadku dłuższych zabiegów eksperymentalnych należy odczekać do 3-4 godzin przed zbiorem i dodać 2 μl 500-krotnie zagęszczonego bulionu Baf bezpośrednio do podłoża.
      3. Wymieszać przez mieszanie płytki natychmiast po dodaniu Baf. W tym miejscu zaleca się również dodanie makroautofagicznych inhibitorów sekwestracji jako kontroli, np. 10 mM inhibitora kinazy panfosfoinozytolu 3 (PI3K) inhibitora 3-metyloadeniny (3MA)19, lub 10 μM selektywnego inhibitora PI3K klasy III SAR-40520.

2. Pobieranie komórek i przygotowanie do elektrozakłócenia

  1. Pod koniec okresu poddawania działaniu substancji odessać pożywkę z odsysaniem i dodać 200 μl roztworu do oddzielania komórek (wstępnie podgrzanego do 37 °C) do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C aż do oderwania się komórek (zwykle około 5 minut).
    UWAGA: Podczas gdy 0,25% (w/v) trypsyna-EDTA może być stosowana zamiast roztworu do odrywania komórek, ten ostatni zawiera DNazę, która pomaga zmniejszyć lepkość oderwanych komórek. Dopóki pożywka jest dokładnie odessana, nie jest konieczne mycie komórek przed dodaniem Trypsyny-EDTA lub roztworu do odrywania komórek.
  2. Dodać 500 μl PBS o temperaturze pokojowej (20-25 °C) o pH 7,4 i zawartości 2% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do każdego dołka i zawiesić pipetą do momentu, gdy nie będą widoczne grudki komórek. Natychmiast przenieść zawiesinę komórek do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml na lodzie.
    UWAGA: O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie kolejne kroki wykonuj na lodzie.
  3. Osadzać komórki przez odwirowanie w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Dokładnie odessać supernatant (z odsysaniem), aby pozostawić osady komórek tak suche, jak to możliwe.
  5. Dodać 400 μl 10% (w/v) sacharozy (w ultraczystymH2O) do każdej probówki.

3. Elektrozakłócenie błony plazmatycznej i separacja frakcji sedymentacyjnych i całkowitych komórek

  1. Ponownie zawiesić osad ogniwa za pomocą pipety, aby uzyskać zawiesinę prawie jednoogniwową, i przenieść go do kuwety do elektroporacji o średnicy 4 mm.
    UWAGA: Pipetowanie w górę i w dół ~10–15 razy przy użyciu końcówki do pipety o pojemności 100–1 000 μl jest zwykle wystarczające.
  2. Umieść kuwetę w elektroporatorze fali rozpadu wykładniczego i wyładuj pojedynczy impuls elektryczny o napięciu 800 V, 25 μF i 400 Ω; te ustawienia wytwarzają impuls o czasie trwania ~8 ms.
  3. Za pomocą nowej końcówki pipety przenieś rozdrobniony czynnik komórkowy do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 400 μl lodowatego roztworu sacharozy buforowanego fosforanem (100 mM monofosforanu sodu, 2 mM ditiotreitolu (DTT), 2 mM EDTA i 1,75% sacharozy, pH 7,5) i krótko wymieszaj pipetując.
    1. Opcjonalnie: Aby zweryfikować skuteczność elektrorewolucji błony plazmatycznej17, zmieszaj 10 μl rozcieńczonej frakcji komórkowej z kroku 3.3 z 10 μl 0,4% błękitu trypanowego w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Przenieść do komory liczącej i sprawdzić, czy procent komórek dodatnich błękitu trypanowego wynosi >99%.
      1. Pozostawić próbkę w komorze zliczającej na 30 minut w temperaturze pokojowej (20–25 °C) i sprawdzić, czy procent komórek niebieskiego trypan-dodatniego pozostał >99%.
    2. Opcjonalnie: Aby sprawdzić, czy elektrorozerwanie nie było zbyt ostre, to znaczy nie zakłóciło organelli wewnątrzkomórkowych, wykonaj kroki 1.1–3.3, jak opisano powyżej, ale użyj większego materiału wyjściowego (studzienka z 6-dołkowej płytki z ~80% zlewającą się warstwą komórkową) i użyj 150 μl 10% sacharozy w kroku 2.5 i 150 μl buforowanego fosforanem roztworu sacharozy bez DTT w kroku 3.3.
      1. Za pomocą pipety ostrożnie nałożyć 200 μl rozcieńczonego roztworu zaburzającego tworzenie komórek na wierzchu poduszki o gęstości 1,2 ml buforowanej fosforanem pożywki o gradinie gęstości 8% (w/v) (np. 8% nykodenzu, 50 mM fosforanu sodu, 2,2% sacharozy, 1 mM EDTA) w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml. Wirować przy 20 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C w mikrowirówce z funkcją trybu miękkiego (do łagodnego przyspieszania i zwalniania) i ostrożnie umieścić probówki na lodzie.
      2. Ostrożnie usunąć 60 μL z ~200 μL górnej frakcji, uważając, aby nie pobrać żadnego roztworu pożywki o gradiencie gęstości, i przenieść do świeżej probówki do mikrowirówki.
        UWAGA: Powinien zawierać cytozol o wyjątkowej czystości, określany jako "sok komórkowy"21.
      3. Przetestuj czystość frakcji otrzymanej w powyższym kroku, wykonując analizy western blot białek zawartych w organellach, używając standardowych technik i żeli o gradinie 4–20%16.
      4. Wykonaj na przykład immunoblotting dla katepsyny B21, cytochromu c i izomerazy dwusiarczku białka, aby sprawdzić, czy porażenie prądem w kroku 3.2 nie zakłóciło odpowiednio lizosomów, mitochondriów lub retikulum endoplazmatycznego, oraz immunoblot dla LDH, aby zweryfikować obecność białka cytozolowego w soku komórkowym.
      5. Równolegle należy przeprowadzić immunoblotting na ekstraktach białkowych wykonanych z roztworu całkowitego rozpadu komórek16, aby potwierdzić, że użyte przeciwciała mogą wykryć białka zawarte w organellach, które są oceniane.
  4. Powtórzyć kroki 3.1–3.3 dla każdej próbki.
  5. Usunąć 550 μl z każdego rozcieńczonego roztworu rozbijającego komórki (otrzymanego w kroku 3.3) do 2 ml probówek wirówkowych zawierających 900 μl lodowatego buforu do resuspensji (50 mM monofosforanu sodu, 1 mM DTT, 1 mM EDTA i 5,9% sacharozy, pH 7,5) uzupełnionych 0,5% BSA i 0,01% Tween-20 i krótko wymieszać pipetując.
  6. Wirować przy 18 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C w celu wytworzenia granulek zawierających "osadzony LDH". Dokładnie odessać supernatant (z odsysaniem), aby granulki pozostały jak najbardziej suche. Umieścić próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
  7. Przenieść 150 μl z każdego rozcieńczonego roztworu zaburzającego tworzenie komórek (otrzymanego w kroku 3.3) do nowych probówek i umieścić próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Użyj tych próbek, aby określić "całkowite poziomy LDH" w komórkach.
    UWAGA: W tym momencie eksperyment można wstrzymać na tak długo, jak jest to pożądane.

4. Ekstrakcja LDH i pomiar aktywności enzymatycznej LDH

  1. Próbki "osadzonego LDH" (z etapu 3.6) i "całkowitego LDH" (z etapu 3.7) rozmrozić na lodzie.
  2. Do próbek "całkowitego LDH" dodać 300 μl lodowatego buforu do sporządzania zawiesiny zawierającego 1,5% Triton X-405 (uzyskując końcowe stężenie Triton X-405 wynoszące 1%). Obracać próbki na wałku w chłodni (4–8 °C) przez 30 minut.
  3. Dodać 750 μl lodowatego buforu do sporządzania zawiesiny z 1% Triton X-405 do próbek "osadzonego LDH" i ponownie zawiesić granulki za pomocą pipety, aż do uzyskania jednorodnego roztworu.
  4. Odwirować próbki z etapów 4.2 i 4.3 przy 18 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C do osadzenia nierozpuszczonych szczątków komórkowych.
  5. Zmieszać 4 części zimnego 65 mM imidazolu (pH 7,5)/0,75 mM pirogronianu z jedną częścią zimnego 65 mM imidazolu (pH 7,5)/1,8 mM NADH, aby uzyskać roztwór roboczy, który jest stabilny przez co najmniej trzy tygodnie w temperaturze 4 °C.
  6. Zmieszać 3–30 μl supernatantów z kroku 4.4 z 200 μl roztworu roboczego z kroku 4.5.
  7. Określić ilość LDH, mierząc aktywność enzymatyczną LDH jako spadek absorbancji dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (forma zredukowana) (NADH) przy 340 nm w temperaturze 37 °C w porównaniu z wzorcem o znanym stężeniu LDH. Pomiary absorbancji należy wykonywać do momentu, gdy reakcja zbliży się do zakończenia, tj. do momentu, gdy absorbancja przy 340 nm przestanie się zmieniać w czasie.
    UWAGA: Jest to klasyczna metoda biochemiczna pomiaru aktywności LDH. Chociaż obecny protokół przeprowadza reakcję w temperaturze 37 °C, można ją również przeprowadzić w temperaturze pokojowej (20–25 °C), co jest zalecane w przypadku ręcznej spektrofotometrii. Obecny protokół wykorzystuje zrobotyzowany multianalizator, który w sposób zautomatyzowany miesza próbki z roztworem roboczym na 96-dołkowej płytce i mierzy absorbancję przy 340 nm w temperaturze 37 °C co 20 s przez 3 minuty. Następnie oprogramowanie przyrządu oblicza stężenie LDH, wyrażone w jednostkach (U)/L, porównując nachylenie pomiarów absorbancji w czasie w porównaniu ze standardową krzywą uzyskaną przez kalibrację z wzorcem znanego stężenia LDH. Liniowy zakres detekcji przy tym podejściu wynosi 30–1 500 U/L. Alternatywnie istnieje szeroka gama dostępnych na rynku zestawów do pomiaru LDH. Niektóre z nich opierają się na sprzężeniu reakcji enzymatycznej z wytwarzaniem produktów kolorymetrycznych lub fluorescencyjnych, umożliwiając detekcję innymi środkami niż spektrofotometria UV oraz z innymi liniowymi zakresami detekcji.

5. Obliczanie sekwestracji LDH

  1. Obliczyć procentową zawartość LDH w stosunku do całkowitej masy LDH dla każdej próbki, biorąc pod uwagę rozcieńczenia i próbki:
    Osadzony LDH (%) = figure-protocol-1
    UWAGA: Podczas kroków 3.1–3.3 około 50 μl jest tracone w wyniku przenoszenia do i z kuwety elektroporacyjnej. W związku z tym oblicz na podstawie całkowitej ilości 750 μl (zamiast 800 μl) rozcieńczonych komórek w kroku 3.3.
  2. Odjąć zawartość procentową osadzonego LDH uzyskaną w próbkach z komórek niepoddanych działaniu substancji (etap 1.3.2) od zawartości procentowej osadzonego LDH uzyskanej w próbkach z komórek poddanych działaniu doświadczalnie i podzielić przez czas poddawania działaniu substancji Baf, aby uzyskać zawartość procentową sekwestrowanego LDH na godzinę w okresie pobierania próbek:
    Sekwestrowany LDH (%/h) = figure-protocol-2

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z opisanego tutaj protokołu, zmierzono masową aktywność sekwestracji autofagicznej w wielu różnych liniach komórkowych ssaków, w tym LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, mysich fibroblastach embrionalnych (MEF), komórkach RPE-1, HEK293, BJ i LNCaP. Sekwestrację oceniano w warunkach podstawowych (w kompletnym, bogatym w składniki odżywcze pożywce) lub w komórkach ostro pozbawionych surowicy i aminokwasów (stan indukujący autofagię <...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podsumowując, opisany tutaj protokół stanowi wiarygodną i szeroko stosowaną metodę monitorowania masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków. W porównaniu z pierwotną metodą12,16 usunęliśmy szereg niepotrzebnych kroków, uprościliśmy kilka pozostałych kroków i wprowadziliśmy znaczne zmniejszenie skali. W rezultacie, protokół został znacznie ulepszony pod względem efektywności kosztowej i czasowej, a ta sama liczba próbek może być teraz przetwa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana finansowo przez Norweską Radę ds. Badań Naukowych, Uniwersytet w Oslo, Fundację Andersa Jahre, Fundację Nansena oraz Dziedzictwo ku pamięci Henrika Homana. Dziękujemy dr Noboru Mizushimie za ATG5+/+ MEFy i ATG5-/- MEF, dr Masaaki Komatsu za MEFy ATG7+/+ i MEFy ATG7-/- oraz dr Shizuo Akirze za MEFy ATG9A+/+ i MEFy ATG9A-/- MEF. Dziękujemy Frankowi Sætre'owi za pomoc techniczną i dr Perowi O. Seglenowi za konstruktywne dyskusje metodologiczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml i 2 ml Eppendorf211-2130 i 211-2120
płytki 12-dołkowe Falcon353043
Accumax  rozwiązanie do odłączania komórekInnowacyjne technologie komórkoweA7089Utrzymuj podwielokrotności na poziomie -20 & deg; C przez lata, a w lodówce przez kilka miesięcy
Bafilomycyna A1EnzoBML-CM110-0100Rozpuścić w komórkach DMSO
BJATCCCRL-2522stosować przy pasażu < 30
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)VWR422361V
Komora licząca BurkerFisher Scientific139-658585
Szkiełka komory liczenia komórek CountessThermoFisher ScientficC10228
Automatyczny licznik komórek Countess IIThermoFisher ScientficAMQAX1000
Szkło nakrywkowe do komoryliczącej BurkerFisher Scientific139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4– 20%, 26-dołkowe, 15 i mikro; dł., 13,3 cm x 8,7 cm (szer. x dł.) Bio-Rad3450034
DTTSigma-AldrichD0632
Zrównoważony roztwór soli Earle'a (EBSS)Gibco24010-043zawiera 0,1% glukozy
EDTASigma-AldrichE7889
Kuweta elektroporacyjna (4 mm)Bio-Rad1652088
Elektroporator fali rozpadu wykładniczegoBTX Harvard Aparatura  EMC 630
Płodowa surowica bydlęca (FBS)SigmaF752410% stężenie końcowe w RPMI 1640 pożywka
HEK293 komórkiATCCCRL-1573
ImidazolSigma-Aldrich56750Autoklaw 65 mM roztwór i przechowywać w lodówce przez miesiące
Inkubator; Inkubator CO2 z automatycznym przepływem IR Direct HeatNuAireNU-5510E
Lipofectamina RNAiMAX Odczynnik do transfekcjiThermoFisher13778150
Ogniwa LNCaPATCCCRL-1740zastosowanie przy pasażu < 30
3-metyloadenina (3MA)Sigma-AldrichM9281Zapas 100 mM w RPMI w -20 °C.  Podgrzej zapas do 65 & deg; C przez 10 minut i stosować przy końcowym stężeniu 10 mM
Mikrowirówka chłodniczaBeckman Coulter Life Sciences368831
Mikrowirówka lodówkowa z funkcją trybu miękkiegoEppendorf Eppendorf 5417R 
MRT67307 chlorowodorek (ULKi)Sigma-AldrichSML0702Hamuje aktywność kinazy ULK. Rozpuścić w DMSO.
Przyrząd MaxMat MultianalyzerErba DiagnosticsPL-II
MCF7 komórkiATCCHTB-22
NADHMerck-Millipore1.24644.001
NycodenzAxis-Shield1002424
Opti-MEM Obniżona surowicaThermoFisher31985062
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco20012-019
Końcówki do pipet 3 (0,5-20 &mikro; L)VWR732-2223Thermo Fischer ART Końcówki barierowe
Końcówki do pipet (1-200 &mikro; L)VWR732-2207 Thermo Fischer ART Końcówki barierowe
Końcówki do pipet (100-1 000 i mikro; L)VWR732-2355 Thermo Fischer ART Końcówki barierowe
PipetyThermoFisher4701070Finnpipette F2 GLP Kit
Poly-D-lizynaSigma-AldrichP6407-10X5MGPrzygotuj roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml w sterylnym H2O. To rozwiązanie jest stabilne przy -20 ° C przez co najmniej 1 rok.
PirogronianyMerck-Millipore1066190050
Ogniwa RPE-1 (hTERT RPE-1)ATCCCRL-4000
RPMI 1640Gibco21875-037
SAR-405ApexBio A8883Hamuje kinazę fosfoinozytolu 3-klasy III (PIK3C3). Rozpuścić w DMSO.
Tłumik Select Negative Control #1 (siCtrl)ThermoFisher/Ambion4390843
Silencer Select ATG9-ukierunkowany na siRNA (siATG9A)ThermoFisher/Ambions35504
Silencer Select FIP200 ukierunkowany na FIP200ThermoFisher/Ambions18995
Tuner Select siRNA ukierunkowany na ULK1 (siULK1)ThermoFisher/Ambions15964
Silencer Select siRNA ukierunkowany na ULK2 (siULK2)ThermoFisher/Ambions18705
Silencer Select siRNA ukierunkowany na GABARAP (siGABARAP)ThermoFisher/Ambions22362
Silencer Select siRNA ukierunkowany na GABARAPL1 (siGABARAPL1)ThermoFisher/Ambions24333
Silencer Select siRNA ukierunkowany na GABARAPL2 (siGABARAPL2)ThermoFisher/Ambions22387
Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodny (NaH2PO4 • 2H2O) Merck-Millipore1.06580.1000
Fosforan sodu dwuzasadowy dwuwodny (Na2HPO4 • 2H2O ) Prolabo28014.291
SacharozaVWR443816T10% stężenie końcowe w wodzie; przefiltrować przez 0,45 i mikro; m przefiltrować i przechowywać w lodówce przez miesiące
ThapsigarginSigma-AldrichT9033Hamuje pompę SERCA ER Ca2+. Rozpuścić w DMSO.
Tryton X-405 Sigma-AldrichX4051% końcowy
Trypan Blue barin 0,4%Sondy molekularneT10282
Trypsin-EDTA (0,25% w/v Trypsyna)Gibco25200-056
Tween-20Sigma-AldrichP22870,01% końcowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi's Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46 (4), 228-233 (2016).
  2. Mizushima, N. The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize. FEBS Lett. 591 (5), 681-689 (2017).
  3. Seglen, P. O., et al. Macroautophagic cargo sequestration assays. Methods. 75, 25-36 (2015).
  4. Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway. Exp Cell Res. 166 (1), 1-14 (1986).
  5. Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway. J Biol Chem. 264 (12), 6699-6704 (1989).
  6. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways. Biochem Biophys Res Commun. 151 (1), 40-47 (1988).
  7. Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity. Biochem J. 284, Pt 3 633-636 (1992).
  8. Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. Embo j. 19 (21), 5720-5728 (2000).
  9. Szalai, P., et al. Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs. Exp Cell Res. 333 (1), 21-38 (2015).
  10. Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. J Cell Biol. , (2016).
  11. Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux. Mol Cell Biol. , (2017).
  12. Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes. J Cell Biol. 111 (3), 941-953 (1990).
  13. Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (21), 7972-7976 (1988).
  14. Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure. Clin Chim Acta. 19 (3), 357-361 (1968).
  15. Bergmeyer, H. U., Bernt, E. Methods of enzymatic analysis (2nd English ed). Bergmeyer, H. U. 2, Verlag Chemie. 574-579 (1974).
  16. Engedal, N., et al. Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation. Autophagy. 9 (10), 1475-1490 (2013).
  17. Luhr, M., et al. A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells. Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).
  18. Mousavi, S. A., et al. Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy. Biochim Biophys Acta. 1510 (1-2), 243-257 (2001).
  19. Seglen, P. O., Gordon, P. B. 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (6), 1889-1892 (1982).
  20. Ronan, B., et al. A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy. Nat Chem Biol. 10 (12), 1013-1019 (2014).
  21. Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway. Febs j. 282 (11), 2202-2214 (2015).
  22. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
  23. Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. Sequestration assays for mammalian autophagy. Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).
  24. Hurley, J. H., Young, L. N. Mechanisms of Autophagy Initiation. Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).
  25. Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (7), 2466-2470 (1990).
  26. Kuma, A., et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature. 432 (7020), 1032-1036 (2004).
  27. Komatsu, M., et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 169 (3), 425-434 (2005).
  28. Saitoh, T., et al. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20842-20846 (2009).
  29. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization. Exp Cell Res. 142 (1), 1-14 (1982).
  30. An, H., Harper, J. W. Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy. Nat Cell Biol. 20 (2), 135-143 (2018).
  31. Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes. J Biol Chem. 281 (47), 36303-36316 (2006).
  32. Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets. Mol Biol Cell. 23 (5), 896-909 (2012).
  33. Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain. Autophagy. 7 (9), 1011-1027 (2011).
  34. Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin. J Biol Chem. 258 (10), 6093-6100 (1983).
  35. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
  36. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  37. Ogier-Denis, E., et al. A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29. J Biol Chem. 270 (1), 13-16 (1995).
  38. Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration. Exp Cell Res. 162 (1), 273-277 (1986).
  39. Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines. Bio-protocol. 8 (9), e2836(2018).
  40. Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro. Exp Cell Res. 123 (1), 63-72 (1979).
  41. Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin. Eur J Biochem. 95 (2), 215-225 (1979).
  42. Seglen, P. O., Solheim, A. E. Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis. Eur J Biochem. 85 (1), 15-25 (1978).
  43. Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. Assaying of autophagic protein degradation. Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).
  44. Engedal, N., Seglen, P. O. Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3. Autophagy. 12 (2), 1-3 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Electrodisruption FractionationSedimentable LDH MeasurementAutophagosome FormationCell Culture ProtocolBafilomycin A1 TreatmentATG Gene KnockoutLDH Enzymatic AssayAutophagy Monitoring Method

Powiązane artykuły