Artykuł metodologiczny

Test sekwestracji dehydrogenazy mleczanowej — prosta i wiarygodna metoda określania masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków

17.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57971

⸱

27 lipca 2018

 ,  , 
1The Autophagy Team, Centre for Molecular Medicine Norway (NCMM), Nordic EMBL Partnership, University of Oslo

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisany jest prosty i dobrze sprawdzony protokół pomiaru masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków. Metoda opiera się na ilościowym określeniu proporcji dehydrogenazy mleczanowej (LDH) we frakcjach komórek sedymentacyjnych w porównaniu z całkowitymi poziomami LDH w komórkach.

Streszczenie

Masowa autofagia charakteryzuje się sekwestracją dużych porcji cytoplazmy na podwójne/wielobłonowe struktury zwane autofagosomami. Tutaj opisano prosty protokół monitorowania tego procesu. Ponadto przedstawiono typowe wyniki i eksperymentalną walidację metody w warunkach indukujących autofagię w różnych typach hodowanych komórek ssaków. Podczas autofagii masowej autofagosomy sekwestrują cytozol, a tym samym rozpuszczalne białka cytozolowe, wraz z innymi ładunkami autofagicznymi. LDH jest stabilnym i bardzo obfitym, rozpuszczalnym enzymem cytozolowym, który jest nieselektywnie sekwestrowany do autofagosomów. Wielkość sekwestracji LDH odzwierciedla zatem wielkość masowej sekwestracji autofagicznej. Aby skutecznie i dokładnie określić sekwestrację LDH w komórkach, stosujemy protokół frakcjonowania oparty na elektrozakłóceniach, który skutecznie oddziela LDH osadowy od cytozolowego, a następnie mierzy aktywność enzymatyczną we frakcjach sedymentacyjnych w porównaniu z próbkami całych komórek. Sekwestrację autofagiczną określa się poprzez odjęcie proporcji sedymentacyjnego LDH w komórkach niepoddanych działaniu substancji od proporcji w komórkach poddanych działaniu substancji chemicznej. Zaletą testu sekwestracji LDH jest to, że daje ilościową miarę autofagicznej sekwestracji ładunku endogennego, w przeciwieństwie do innych metod, które obejmują ektopową ekspresję sond sekwestracyjnych lub półilościowe analizy ochrony proteazy markerów lub receptorów autofagii.

Wprowadzenie

Autofagia (po grecku "samozjadanie") to ewolucyjnie zachowany proces wakuolarnej/lizosomalnej degradacji materiału wewnątrzkomórkowego. Po odkryciu genów związanych z autofagią ("ATG"), które są ważne dla autofagii u drożdży i ludzi, oraz uświadomieniu sobie, że autofagia odgrywa znaczącą rolę w ludzkim zdrowiu i chorobach (potwierdzone Nagrodą Nobla w dziedzinie medycyny lub fizjologii w 2016 r. dla Yoshinori Ohsumi), autofagia szybko stała się jednym z najintensywniej badanych procesów w biologii komórki1, 2.

Makroautofagia (zwana dalej "autofagią") charakteryzuje się rozszerzaniem i fałdowaniem wewnątrzkomórkowych błon cisternae ("fagoforów") w szczelne, podwójne lub wielobłonowe struktury ("autofagosomy"), które skutecznie sekwestrują owinięty materiał od reszty cytoplazmy. Po fuzji autofagosomów z lizosomami wewnętrzna błona autofagosomalna i sekwestrowany ładunek są degradowane i poddawane recyklingowi. Autofagosomy mogą sekwestrować materiał cytoplazmatyczny zarówno w sposób losowy (autofagia nieselektywna), jak i selektywny (autofagia selektywna). Autofagia masowa najprawdopodobniej stanowi mieszankę autofagii nieselektywnej i selektywnej.

W latach sześćdziesiątych i siedemdziesiątych ("era morfologiczna" badań nad autofagią), sekwestracja autofagiczna była głównie oceniana za pomocą analiz ultrastrukturalnych. W latach osiemdziesiątych i na początku lat dziewięćdziesiątych ("era biochemiczna") Per Seglen i współpracownicy, którzy badali autofagię w pierwotnych hepatocytach szczurów, opracowali pierwsze metody ilościowego pomiaru aktywności sekwestracji autofagicznej3. Korzystając z tych testów, Seglen zdefiniował i scharakteryzował różne etapy szlaku autofagiczno-lizosomalnego4,5, odkrył i ukuł amfisom6 (produkt fuzji endosomu z autofagosomem) i jako pierwszy opisał rolę fosforylacji białek w regulacji autofagii7. Jednak po odkryciu ATG w latach 90. ("era molekularna") i pierwszej charakterystyce ssaczego białka ATG8, białka związanego z mikrotubulami 1A/1B-łańcuch lekki 3 (LC3) w 20008, zastosowanie białek ATG jako markerów procesu autofagicznego szybko zyskało popularność, a starsze i bardziej pracochłonne metody biochemiczne pozostały w tyle. W rzeczywistości, w ciągu ostatnich 18 lat, analizy LC3 za pomocą western blot i mikroskopii fluorescencyjnej stały się zdecydowanie najpopularniejszym (a w wielu przypadkach jedynym) sposobem badania autofagii w komórkach ssaków. Zaletą jest względna łatwość, z jaką można przeprowadzić te metody. Wadą jest to, że bada się komponent wózka (LC3), a nie rzeczywisty ładunek autofagiczny. Jest to dość poważna wada, ponieważ związek między stanami i/lub przepływem LC3 przez ścieżkę a sekwestracją i przepływem ładunku jest wysoce niejasny. W rzeczywistości wykazaliśmy, że strumień ładunków masowych może być utrzymywany na wysokim poziomie w warunkach, w których nie ma strumienia LC3, pomimo obecności sprzężonego LC3 w komórkach9. Co więcej, wykazaliśmy, że na masową autofagię nie ma wpływu efektywne zubożenie LC3, a zatem prawdopodobnie jest niezależna od LC39. Odkrycie to zostało później potwierdzone przez LC3 knock-out studies10,11, które wskazują również, że mitofagia zależna od Parkiny (selektywna autofagia mitochondriów) jest niezależna od LC310,11.

Podsumowując, istnieje wyraźna potrzeba testów opartych na ładunku do monitorowania aktywności autofagicznej. Optymalnie takie testy powinny mieć szerokie zastosowanie, być dobrze zdefiniowane i łatwe do wykonania. W ciągu ostatnich kilku lat szczególnie zainteresowaliśmy się testem sekwestracji LDH, który został opracowany przez Pera Seglena w latach 1980-tych12 i opiera się na pomiarze transferu cytozolowego LDH do sedymentowalnych, autofagicznych frakcji komórek zawierających wakuolę. LDH jest stabilnym, rozpuszczalnym białkiem cytozolowym, które jest łatwo sekwestrowane, gdy fagofory owijają ładunek cytoplazmatyczny. Sekwestracja LDH jest zatem ogólną miarą sekwestracji autofagicznej. LDH jest rozkładany wyłącznie przez szlak autofagiczno-lizosomalny12. Tak więc, w obecności lizosomalnych inhibitorów degradacji, np. bafilomycyny A1 (Baf)13, eksperymentalne efekty leczenia bezpośrednio odzwierciedlają zmiany w aktywności sekwestracji autofagicznej. W przypadku braku inhibitorów degradacji można zmierzyć efekt netto zmian w sekwestracji i degradacji LDH.

Test sekwestracji LDH ma szerokie zastosowanie, ponieważ LDH jest wysoce i wszechobecnie wyrażany we wszystkich typach komórek, a poziomy LDH mogą być dokładnie określone ilościowo za pomocą testu enzymatycznego14,15. Jednak oryginalny protocol12 — ustalony w pierwotnych hepatocytach szczurów — był dość czasochłonny i wymagał dużej ilości materiału wyjściowego, a także specjalnie wykonanego kondensatora wyładowczego. Stopniowo przekształcaliśmy test w łatwą i wszechstronną metodę. Po pierwsze, oryginalny protokół został zaadaptowany do użytku w liniach komórkowych ssaków16. Po drugie, metoda została znacznie przeskalowana w dół3,9. Po trzecie, wyeliminowano kilka etapów protokołu, w tym pracochłonny etap poduszki gęstości17. Umożliwiło to jednocześnie dalsze zmniejszenie skali metody, od pierwotnego punktu wyjścia, w którym używano płytki o średnicy 10 cm na próbkę16, do użycia pojedynczego dołka z płytki 12-dołkowej na próbkę (tj. około 15-krotnie mniej materiału wyjściowego)17. Po czwarte, zidentyfikowaliśmy komercyjne urządzenie do elektroporacji, które mogłoby zastąpić wykonany na zamówienie kondensator wyładowczy elektryczny17.

Tutaj prezentowany jest nasz najbardziej aktualny protokół testu sekwestracji LDH, który zawiera kilka dalszych uproszczeń metody w porównaniu do poprzednio opublikowanego17. Ponadto przedstawiono zestaw typowych wyników uzyskanych na wielu różnych typach komórek, a co ważne, przedstawiono wiele linii eksperymentalnych walidacji metody przy użyciu metod farmakologicznych oraz genetycznych knockdown i knockout. Aby zapoznać się z ogólnym schematem przepływu całego protokołu, zobacz Rysunek 1.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Wysiew i traktowanie komórek

  1. Hodowla komórek adherentnych w kolbach 75 cm²2 kolby do hodowli tkankowych w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO22 w 37 °Cstosując preferowaną pożywkę hodowlaną dla danego typu komórek. Pozostawić komórki do wzrostu, aż osiągną stan niemal pełnej konfluencji.
    UWAGA: Dla komórek LNCaP, HEK293, embrionalnych fibroblastów mysich (MEF), BJ, MCF-7 oraz RPE-1 należy stosować pożywkę RPMI 1640 uzupełnioną o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
    1. Przemyj komórki 3 ml 37 °C bufor fosforanowy (PBS), pH 7,4. PBS należy zastąpić 3 ml 0,25% (m/v) trypsyny z etylenodiaminotetraoctanem (EDTA), a następnie inkubować kolbę w wilgotnej inkubatorze z 5% CO2 w 37 °C do czasu odklejenia się komórek (2–5 min).
    2. Resuspenduj odspojone komórki w 7 ml pożywki hodowlanej zawierającej 10% FBS. Wymieszaj 10 µL alikwot zawiesiny komórkowej z 10 µL 0,4% błękitu trypanu w probówce do mikrowirówki, używając 0,5–20 µL końcówka do pipety. Używając tej samej końcówki, należy niezwłocznie napełnić komorę licznikową na szkiełku i policzyć komórki w automatycznym liczniku komórek.
  2. Przygotować odpowiednie rozcieńczenie (patrz uwaga poniżej) zawiesiny komórek z kroku 1.1.2, używając pożywki hodowlanej zawierającej 10% FBS, a następnie zasiać 1 ml rozcieńczonej zawiesiny komórek do każdego dołka 12-dołkowej płytki do hodowli tkanek (powierzchnia ~3,8 cm2).2) stosując technikę aseptyczną. Pozostawić do wzrostu w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO22 w 37 °C do czasu osiągnięcia pożądanej gęstości komórek, np. 60–90% konfluencji w momencie zbioru.
    UWAGA: Odpowiednie rozcieńczenie zawiesiny komórkowej, które pozwoli uzyskać pożądaną konfluencję komórek w momencie zbioru, będzie różnić się w zależności od typu komórek, a także czasu trwania i rodzaju zastosowanych zabiegów doświadczalnych. W związku z tym musi to być w każdym przypadku ocenione empirycznie.
    1. W przypadku eksperymentów, w których zarówno traktowanie, jak i zbiór mają nastąpić 2 dni po wysiewie, wysiać 2,5 x 105 komórki LNCaP, HEK293 lub MCF-7, 5 x 104 MEF, 4 x 105 BJ lub 1,5 x 105 komórki RPE-1 w każdym dołku płytki 12-dołkowej.
    2. W przypadku komórek słabo przylegających, należy pokryć płytki powłoką zalecaną dla danego typu komórek. Dla komórek LNCaP (oraz HEK293) należy stosować płytki pokryte poli-D-lizyną (PDL).
    3. W tym celu należy dodać 500 µL PDL w 2.5 µg/mL w sterylnym H2O2do każdej studni i inkubować płytki w sterylnym środowisku przez 30 min w temperaturze pokojowej (20–25 °C). Usunąć PDL za pomocą ssaka i krótko przemyć każdą studzienkę 1 ml sterylnej H2O.
      UWAGA: Zazwyczaj krok 1.2.1 wykonuje się bez żadnych zabiegów eksperymentalnych. Jednak w przypadku przeprowadzania RNAi wygodne może być rozpoczęcie transfekcji odwrotnej równocześnie z wysiewaniem komórek.9.
  3. Przeprowadzić zabiegi eksperymentalne w dwóch lub trzech powtórzeniach w dołkach dla każdego warunku.
    1. Na przykład należy potraktować komórki 50 nM inhibitora mTOR Torin1, który zazwyczaj jest wydajnym induktorem sekwestracji autofagicznej, lub poddać komórki gwałtownemu głodzeniu seryjnemu i aminokwasowemu poprzez przemycie ich 1 ml bezaminokwasowego zrównoważonego roztworu soli Earle'a (EBSS), a następnie inkubować komórki w 1 ml EBSS w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO2.2 w 37 °C.
    2. Pozostaw jeden zestaw studzienek niepoddanych działaniu czynnika, aby określić poziom tła osiadalnej LDH.
    3. Dodaj nasycającą ilość inhibitora stosowanego po sekwestracji, bafilomycyny A1 (Baf)3,13,16,18 w obecności lub w nieobecności traktowań eksperymentalnych, od 3 do 4 h przed zbiorem komórek. Inkubować komórki w inkubatorze z nawilżoną atmosferą i 5% CO22 w 37 °C.
      1. Stosuj 100 nM Baf dla komórek LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 i RPE-1 oraz 10 nM Baf dla MEFs.
      2. W przypadku zabiegów eksperymentalnych o czasie trwania wynoszącym jedynie 3–4 h (takich, jak te przedstawione w kroku 1.3.1), należy dodać Baf jednocześnie z rozpoczęciem zabiegów. W przypadku dłuższych zabiegów eksperymentalnych należy odczekać do momentu, gdy do zbioru pozostaną 3–4 h, a następnie dodać 2 µL stoku Baf o stężeniu 500x bezpośrednio do pożywki.
      3. Wymieszaj zawartość, potrząsając płytką bezpośrednio po dodaniu Baf. Na tym etapie zaleca się również dodanie inhibitorów sekwestracji makroautofagicznej w celu uzyskania kontroli. np. 10 mM inhibitora pan-fosfoinozytolo-3-kinazy (PI3K) 3-metyloadeniny (3MA)19lub 10 µM selektywnego inhibitora PI3K klasy III SAR-40520.

2. Zbiór komórek i przygotowanie do elektrodestrukcji

  1. Po zakończeniu okresu traktowania odessać medium za pomocą odsysacza i dodać 200 µL roztworu do odrywania komórek (wstępnie podgrzanego do 37 °C) do każdej studni. Inkubować w 37 °C do momentu odrywania się komórek (zazwyczaj około 5 min).
    UWAGA: Zamiast roztworu do odrywania komórek można zastosować 0,25% (w/v) Trypsyny-EDTA, jednak ten drugi zawiera DNazę, która pomaga zmniejszyć lepkość zawiesiny odrywałych komórek. Przy dokładnym odessaniu medium nie ma potrzeby przemywania komórek przed dodaniem Trypsyny-EDTA lub roztworu do odrywania komórek.
  2. Do każdej studni dodać 500 µL PBS o temperaturze pokojowej (20-25 °C), pH 7,4, zawierającego 2% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA), a następnie resuspender za pomocą pipety do momentu, aż znikną skupiska komórek. Natychmiast przenieść zawiesinę komórek do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL umieszczonych w lodzie.
    UWAGA: O ile nie wskazano inaczej, wszystkie kolejne kroki należy przeprowadzać w lodzie.
  3. Osadzić komórki poprzez wirowanie przy 400 x g przez 5 min w 4 °C.
  4. Dokładnie odessać nadsącz (za pomocą odsysacza), aby osady komórkowe pozostały jak najsuchsze.
  5. Do każdej probówki dodać 400 µL 10% (w/v) sacharozy (w ultrazczystej H2O).

3. Elektrodisrupcja błony plazmatycznej i rozdzielenie frakcji komórek osadzalnych oraz frakcji komórek całkowitych

  1. Resuspender osad komórkowy za pomocą pipety, aby uzyskać niemal jednokomórkową zawiesinę, a następnie przenieść go do kuwety do elektroporacji o szerokości 4 mm.
    UWAGA: Zazwyczaj wystarczające jest pipetowanie w górę i w dół ok. 10–15 razy przy użyciu końcówki do pipety 100–1,000 µL.
  2. Umieścić kuwetę w elektroporatorze z falą o wykładniczym spadku i przyłożyć pojedynczy impuls elektryczny o parametrach 800 V, 25 µF oraz 400 Ω; ustawienia te generują impuls o czasie trwania ~8 ms.
  3. Używając nowej końcówki do pipety, przenieść disruptat komórkowy do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL zawierającej 400 µL lodowatego roztworu sacharozy w buforze fosforanowym (100 mM monofosforanu sodu, 2 mM ditiotreitolu (DTT), 2 mM EDTA oraz 1.75% sacharozy, pH 7.5) i krótko wymieszać poprzez pipetowanie.
    1. Opcjonalnie: Aby zweryfikować wydajność elektrodisrupcji błony plazmatycznej17, wymieszać 10 µL rozcieńczonego disruptatu komórkowego z kroku 3.3 z 10 µL 0.4% Trypan Blue w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 mL. Przenieść do komory liczbowej i sprawdzić, czy odsetek komórek dodatnich z Trypan Blue wynosi >99%.
      1. Pozostawić próbkę w komorze liczbowej przez 30 min w temperaturze pokojowej (20–25 °C) i zweryfikować, czy odsetek komórek dodatnich z Trypan Blue nadal wynosi >99%.
    2. Opcjonalnie: Aby zweryfikować, czy elektrodisrupcja nie była zbyt gwałtowna, tj. czy nie uszkodziła organelli wewnątrzkomórkowych, wykonać kroki 1.1–3.3 zgodnie z powyższym opisem, lecz użyć większej ilości materiału wyjściowego (dołek z płytki 6-dołkowej z warstwą komórek o konfluencji ~80%) oraz zastosować 150 µL 10% sacharozy w kroku 2.5 i 150 µL roztworu sacharozy w buforze fosforanowym bez DTT w kroku 3.3.
      1. Za pomocą pipety ostrożnie nanieść 200 µL roztworu rozcieńczonego disruptatu komórkowego na wierzch poduszki gęstościowej o objętości 1.2 mL, składającej się z fosforanowego medium gradientu gęstości 8% (w/v) (np. 8% Nycodenz, 50 mM fosforanu sodu, 2.2% sacharozy, 1 mM EDTA) w probówce do wirowania o pojemności 2 mL. Wirować przy 20,000 x g przez 45 min w 4 °C w mikrocentryfudze z funkcją soft-mode (dla łagodnego przyspieszania i zwalniania), a następnie ostrożnie umieścić probówki w lodzie.
      2. Ostrożnie pobrać 60 µL z górnej frakcji o objętości ~200 µL, dbając o to, aby nie pobrać roztworu medium gradientu gęstości, i przenieść do nowej probówki do mikrocentryfugi.
        UWAGA: Powinno to zawierać cytosol o wyjątkowej czystości, nazywany „sokiem komórkowym”21.
      3. Przetestować czystość frakcji uzyskanej w powyższym kroku, wykonując analizę western blot dla białek zawartych w organellach, stosując standardowe techniki i żele gradientowe 4–20%16.
      4. Wykonać na przykład immunoblotting dla katepsyny B21, cytochromu c oraz białkowej izomerazy disiarczkowej, aby zweryfikować, czy wstrząs elektryczny w kroku 3.2 nie uszkodził odpowiednio lizosomów, mitochondriów lub retikulum endoplazmatycznego, a także immunoblotting dla LDH, aby potwierdzić obecność białka cytosolowego w soku komórkowym.
      5. Równolegle wykonać immunoblotting ekstraktów białkowych przygotowanych z całkowitego roztworu disruptatu komórkowego16, aby potwierdzić, że użyte przeciwciała są w stanie wykryć oceniane białka zawarte w organellach.
  4. Powtórzyć kroki 3.1–3.3 dla każdej próbki.
  5. Odniesć 550 µL z każdego roztworu rozcieńczonego disruptatu komórkowego (uzyskanego w kroku 3.3) do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL zawierających 900 µL lodowatego buforu do resuspensji (50 mM monofosforanu sodu, 1 mM DTT, 1 mM EDTA oraz 5.9% sacharozy, pH 7.5) uzupełnionego o 0.5% BSA i 0.01% Tween-20, i krótko wymieszać poprzez pipetowanie.
  6. Wirować przy 18,000 x g przez 45 min w 4 °C, aby uzyskać osady zawierające „osadzone LDH”. Dokładnie odessać nadsącz (za pomocą odsysacza), aby osady pozostały jak najsuchsze. Umieścić próbki w zamrażarce -80 °C.
  7. Przenieść 150 µL z każdego roztworu rozcieńczonego disruptatu komórkowego (uzyskanego w kroku 3.3) do nowych probówek i umieścić próbki w zamrażarce -80 °C. Próbki te służą do oznaczenia poziomu „całkowitego LDH” w komórkach.
    UWAGA: Na tym etapie eksperyment można przerwać na dowolnie długi czas.

4. Ekstrakcja LDH i pomiar aktywności enzymatycznej LDH

  1. Odmroź na lodzie próbki „sedimented LDH” (z kroku 3.6) oraz „total LDH” (z kroku 3.7).
  2. Do próbek „total LDH” dodaj 300 µL schłodzonego w lodzie buforu do resuspensji zawierającego 1,5% Triton X-405 (aby uzyskać końcowe stężenie Triton X-405 wynoszące 1%). Próbki inkubuj na rotatorze w pomieszczeniu chłodniczym (4–8 °C) przez 30 min.
  3. Do próbek „sedimented LDH” dodaj 750 µL schłodzonego w lodzie buforu do resuspensji z 1% Triton X-405 i resuspenduj osady za pomocą pipety, aż do uzyskania jednorodnego roztworu.
  4. Próbki z kroków 4.2 i 4.3 odwiruj przy 18,000 x g przez 5 min w temperaturze 4 °C, aby osadzić nierozpuszczone szczątki komórkowe.
  5. Wymieszaj 4 części zimnego 65 mM imidazolu (pH 7,5)/0,75 mM pirogronianu z jedną częścią zimnego 65 mM imidazolu (pH 7,5)/1,8 mM NADH, aby otrzymać roztwór roboczy, który jest stabilny przez co najmniej trzy tygodnie w temperaturze 4 °C.
  6. Wymieszaj 3–30 µL supernatantów z kroku 4.4 z 200 µL roztworu roboczego z kroku 4.5.
  7. Wyznacz ilość LDH poprzez pomiar aktywności enzymatycznej LDH jako spadek absorbancji nikotynamidoadeninodynukleotydu (forma zredukowana) (NADH) przy 340 nm w temperaturze 37 °C w porównaniu do wzorca o znanym stężeniu LDH. Pomiary absorbancji prowadź do momentu, aż reakcja dobiegnie końca, t.j. dopóki absorbancja przy 340 nm nie przestanie zmieniać się w czasie.
    UWAGA: Jest to klasyczna metoda biochemiczna pomiaru aktywności LDH. Chociaż niniejszy protokół zakłada prowadzenie reakcji w 37 °C, można ją również przeprowadzić w temperaturze pokojowej (20–25 °C), co jest zalecane w przypadku ręcznej spektrofotometrii. Obecny protokół wykorzystuje zrobotyzowany multianalityzer, który w sposób zautomatyzowany miesza próbki z roztworem roboczym na płytce 96-dołkowej i mierzy absorbancję przy 340 nm w 37 °C co 20 s przez 3 min. Następnie oprogramowanie urządzenia oblicza stężenie LDH, wyrażone w jednostkach (U)/L, porównując nachylenie krzywej pomiarów absorbancji w czasie z krzywą wzorcową uzyskaną poprzez kalibrację wzorcem o znanym stężeniu LDH. Liniowy zakres detekcji tą metodą wynosi 30–1 500 U/L. Alternatywnie dostępne są różnorodne komercyjne zestawy do pomiaru LDH. Niektóre z nich opierają się na sprzęgnięciu reakcji enzymatycznej z generowaniem produktów kolorymetrycznych lub fluorescencyjnych, co umożliwia detekcję innymi metodami niż spektrofotometria UV oraz w innych liniowych zakresach detekcji.

5. Obliczanie sekwestracji LDH

  1. Oblicz procent osadzonej LDH w stosunku do całkowitej LDH dla każdej próbki, uwzględniając rozcieńczenia i pobieranie próbek:
    Sedimented LDH (%) = Wzór równowagi statycznej, stężenie LDH, diagram równań, proces analizy biochemicznej.
    UWAGA: Podczas etapów 3.1–3.3 ulega utracie około 50 µL w wyniku przenoszenia do i z kuwety do elektroporacji. W związku z tym, w etapie 3.3 obliczenia należy przeprowadzić przyjmując łączną objętość 750 µL (zamiast 800 µL) rozcieńczonego lizatu komórkowego.
  2. Odejmij procent osadzonej LDH uzyskany w próbkach z komórek nieleczonych (etap 1.3.2) od procenta osadzonej LDH uzyskanego w próbkach z komórek poddanych działaniu czynnika eksperymentalnego, a następnie podziel wynik przez czas traktowania Baf, aby otrzymać procent sekwestrowanej LDH na godzinę w okresie pobierania próbek:
    Sequestered LDH (%/h) = Równowaga statyczna; wzór: (%Sedimented LDH_treated - %Sedimented LDH_untreated)/Time (h); wykres.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zastosowanie opisanego tutaj protokołu pozwoliło na pomiar całkowitej aktywności sekwestracji autofagicznej w wielu różnych liniach komórkowych ssaków, w tym w komórkach LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, VCaP, H3122, Hec1A, MCF-7, T47D, U2OS, PC3, G361, embrionalnych fibroblastach mysich (MEFs), RPE-1, HEK293, BJ oraz LNCaP. Sekwestrację oceniano w warunkach bazalnych (w pełnym, bogatym w składniki odżywcze medium) lub w komórkach poddanych ostremu głodzeniu z surowicy i aminokwasów (warun...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podsumowując, opisany tutaj protokół stanowi wiarygodną i szeroko stosowaną metodę monitorowania masowej aktywności sekwestracji autofagicznej w komórkach ssaków. W porównaniu z pierwotną metodą12,16 usunęliśmy szereg niepotrzebnych kroków, uprościliśmy kilka pozostałych kroków i wprowadziliśmy znaczne zmniejszenie skali. W rezultacie, protokół został znacznie ulepszony pod względem efektywności kosztowej i czasowej, a ta sama liczba próbek może być teraz przetwa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana finansowo przez Norweską Radę ds. Badań Naukowych, Uniwersytet w Oslo, Fundację Andersa Jahre, Fundację Nansena oraz Dziedzictwo ku pamięci Henrika Homana. Dziękujemy dr Noboru Mizushimie za ATG5+/+ MEFy i ATG5-/- MEF, dr Masaaki Komatsu za MEFy ATG7+/+ i MEFy ATG7-/- oraz dr Shizuo Akirze za MEFy ATG9A+/+ i MEFy ATG9A-/- MEF. Dziękujemy Frankowi Sætre'owi za pomoc techniczną i dr Perowi O. Seglenowi za konstruktywne dyskusje metodologiczne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml i 2 ml Eppendorf211-2130 i 211-2120
płytki 12-dołkowe Falcon353043
Accumax  rozwiązanie do odłączania komórekInnowacyjne technologie komórkoweA7089Utrzymuj podwielokrotności na poziomie -20 & deg; C przez lata, a w lodówce przez kilka miesięcy
Bafilomycyna A1EnzoBML-CM110-0100Rozpuścić w komórkach DMSO
BJATCCCRL-2522stosować przy pasażu < 30
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)VWR422361V
Komora licząca BurkerFisher Scientific139-658585
Szkiełka komory liczenia komórek CountessThermoFisher ScientficC10228
Automatyczny licznik komórek Countess IIThermoFisher ScientficAMQAX1000
Szkło nakrywkowe do komoryliczącej BurkerFisher Scientific139-658586
Criterion Tris-HCl Gel, 4– 20%, 26-dołkowe, 15 i mikro; dł., 13,3 cm x 8,7 cm (szer. x dł.) Bio-Rad3450034
DTTSigma-AldrichD0632
Zrównoważony roztwór soli Earle'a (EBSS)Gibco24010-043zawiera 0,1% glukozy
EDTASigma-AldrichE7889
Kuweta elektroporacyjna (4 mm)Bio-Rad1652088
Elektroporator fali rozpadu wykładniczegoBTX Harvard Aparatura  EMC 630
Płodowa surowica bydlęca (FBS)SigmaF752410% stężenie końcowe w RPMI 1640 pożywka
HEK293 komórkiATCCCRL-1573
ImidazolSigma-Aldrich56750Autoklaw 65 mM roztwór i przechowywać w lodówce przez miesiące
Inkubator; Inkubator CO2 z automatycznym przepływem IR Direct HeatNuAireNU-5510E
Lipofectamina RNAiMAX Odczynnik do transfekcjiThermoFisher13778150
Ogniwa LNCaPATCCCRL-1740zastosowanie przy pasażu < 30
3-metyloadenina (3MA)Sigma-AldrichM9281Zapas 100 mM w RPMI w -20 °C.  Podgrzej zapas do 65 & deg; C przez 10 minut i stosować przy końcowym stężeniu 10 mM
Mikrowirówka chłodniczaBeckman Coulter Life Sciences368831
Mikrowirówka lodówkowa z funkcją trybu miękkiegoEppendorf Eppendorf 5417R 
MRT67307 chlorowodorek (ULKi)Sigma-AldrichSML0702Hamuje aktywność kinazy ULK. Rozpuścić w DMSO.
Przyrząd MaxMat MultianalyzerErba DiagnosticsPL-II
MCF7 komórkiATCCHTB-22
NADHMerck-Millipore1.24644.001
NycodenzAxis-Shield1002424
Opti-MEM Obniżona surowicaThermoFisher31985062
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Gibco20012-019
Końcówki do pipet 3 (0,5-20 &mikro; L)VWR732-2223Thermo Fischer ART Końcówki barierowe
Końcówki do pipet (1-200 &mikro; L)VWR732-2207 Thermo Fischer ART Końcówki barierowe
Końcówki do pipet (100-1 000 i mikro; L)VWR732-2355 Thermo Fischer ART Końcówki barierowe
PipetyThermoFisher4701070Finnpipette F2 GLP Kit
Poly-D-lizynaSigma-AldrichP6407-10X5MGPrzygotuj roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml w sterylnym H2O. To rozwiązanie jest stabilne przy -20 ° C przez co najmniej 1 rok.
PirogronianyMerck-Millipore1066190050
Ogniwa RPE-1 (hTERT RPE-1)ATCCCRL-4000
RPMI 1640Gibco21875-037
SAR-405ApexBio A8883Hamuje kinazę fosfoinozytolu 3-klasy III (PIK3C3). Rozpuścić w DMSO.
Tłumik Select Negative Control #1 (siCtrl)ThermoFisher/Ambion4390843
Silencer Select ATG9-ukierunkowany na siRNA (siATG9A)ThermoFisher/Ambions35504
Silencer Select FIP200 ukierunkowany na FIP200ThermoFisher/Ambions18995
Tuner Select siRNA ukierunkowany na ULK1 (siULK1)ThermoFisher/Ambions15964
Silencer Select siRNA ukierunkowany na ULK2 (siULK2)ThermoFisher/Ambions18705
Silencer Select siRNA ukierunkowany na GABARAP (siGABARAP)ThermoFisher/Ambions22362
Silencer Select siRNA ukierunkowany na GABARAPL1 (siGABARAPL1)ThermoFisher/Ambions24333
Silencer Select siRNA ukierunkowany na GABARAPL2 (siGABARAPL2)ThermoFisher/Ambions22387
Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodny (NaH2PO4 • 2H2O) Merck-Millipore1.06580.1000
Fosforan sodu dwuzasadowy dwuwodny (Na2HPO4 • 2H2O ) Prolabo28014.291
SacharozaVWR443816T10% stężenie końcowe w wodzie; przefiltrować przez 0,45 i mikro; m przefiltrować i przechowywać w lodówce przez miesiące
ThapsigarginSigma-AldrichT9033Hamuje pompę SERCA ER Ca2+. Rozpuścić w DMSO.
Tryton X-405 Sigma-AldrichX4051% końcowy
Trypan Blue barin 0,4%Sondy molekularneT10282
Trypsin-EDTA (0,25% w/v Trypsyna)Gibco25200-056
Tween-20Sigma-AldrichP22870,01% końcowy

Bibliografia

  1. Rubinsztein, D. C., Frake, R. A. Yoshinori Ohsumi's Nobel Prize for mechanisms of autophagy: from basic yeast biology to therapeutic potential. J R Coll Physicians Edinb. 46 (4), 228-233 (2016).
  2. Mizushima, N. The exponential growth of autophagy-related research: from the humble yeast to the Nobel Prize. FEBS Lett. 591 (5), 681-689 (2017).
  3. Seglen, P. O., et al. Macroautophagic cargo sequestration assays. Methods. 75, 25-36 (2015).
  4. Hoyvik, H., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Use of a hydrolysable probe, [14C]lactose, to distinguish between pre-lysosomal and lysosomal steps in the autophagic pathway. Exp Cell Res. 166 (1), 1-14 (1986).
  5. Plomp, P. J., Gordon, P. B., Meijer, A. J., Hoyvik, H., Seglen, P. O. Energy dependence of different steps in the autophagic-lysosomal pathway. J Biol Chem. 264 (12), 6699-6704 (1989).
  6. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Prelysosomal convergence of autophagic and endocytic pathways. Biochem Biophys Res Commun. 151 (1), 40-47 (1988).
  7. Holen, I., Gordon, P. B., Seglen, P. O. Protein kinase-dependent effects of okadaic acid on hepatocytic autophagy and cytoskeletal integrity. Biochem J. 284, Pt 3 633-636 (1992).
  8. Kabeya, Y., et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. Embo j. 19 (21), 5720-5728 (2000).
  9. Szalai, P., et al. Autophagic bulk sequestration of cytosolic cargo is independent of LC3, but requires GABARAPs. Exp Cell Res. 333 (1), 21-38 (2015).
  10. Nguyen, T. N., et al. Atg8 family LC3/GABARAP proteins are crucial for autophagosome-lysosome fusion but not autophagosome formation during PINK1/Parkin mitophagy and starvation. J Cell Biol. , (2016).
  11. Pontano Vaites, L., Paulo, J. A., Huttlin, E. L., Harper, J. W. Systematic analysis of human cells lacking ATG8 proteins uncovers roles for GABARAPs and the CCZ1/MON1 regulator C18orf8/RMC1 in macro and selective autophagic flux. Mol Cell Biol. , (2017).
  12. Kopitz, J., Kisen, G. O., Gordon, P. B., Bohley, P., Seglen, P. O. Nonselective autophagy of cytosolic enzymes by isolated rat hepatocytes. J Cell Biol. 111 (3), 941-953 (1990).
  13. Bowman, E. J., Siebers, A., Altendorf, K. Bafilomycins: a class of inhibitors of membrane ATPases from microorganisms, animal cells, and plant cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (21), 7972-7976 (1988).
  14. Hadjivassiliou, A. G., Rieder, S. V. The enzymatic assay of pyruvic and lactic acids. A definitive procedure. Clin Chim Acta. 19 (3), 357-361 (1968).
  15. Bergmeyer, H. U., Bernt, E. Methods of enzymatic analysis (2nd English ed). Bergmeyer, H. U. 2, Verlag Chemie. 574-579 (1974).
  16. Engedal, N., et al. Modulation of intracellular calcium homeostasis blocks autophagosome formation. Autophagy. 9 (10), 1475-1490 (2013).
  17. Luhr, M., et al. A Simple Cargo Sequestration Assay for Quantitative Measurement of Nonselective Autophagy in Cultured Cells. Methods Enzymol. 587, 351-364 (2017).
  18. Mousavi, S. A., et al. Effects of inhibitors of the vacuolar proton pump on hepatic heterophagy and autophagy. Biochim Biophys Acta. 1510 (1-2), 243-257 (2001).
  19. Seglen, P. O., Gordon, P. B. 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (6), 1889-1892 (1982).
  20. Ronan, B., et al. A highly potent and selective Vps34 inhibitor alters vesicle trafficking and autophagy. Nat Chem Biol. 10 (12), 1013-1019 (2014).
  21. Saetre, F., Hagen, L. K., Engedal, N., Seglen, P. O. Novel steps in the autophagic-lysosomal pathway. Febs j. 282 (11), 2202-2214 (2015).
  22. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12 (1), 1-222 (2016).
  23. Seglen, P. O., Overbye, A., Saetre, F. Sequestration assays for mammalian autophagy. Methods Enzymol. 452, 63-83 (2009).
  24. Hurley, J. H., Young, L. N. Mechanisms of Autophagy Initiation. Annu Rev Biochem. 86, 225-244 (2017).
  25. Thastrup, O., Cullen, P. J., Drobak, B. K., Hanley, M. R., Dawson, A. P. Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (7), 2466-2470 (1990).
  26. Kuma, A., et al. The role of autophagy during the early neonatal starvation period. Nature. 432 (7020), 1032-1036 (2004).
  27. Komatsu, M., et al. Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 169 (3), 425-434 (2005).
  28. Saitoh, T., et al. Atg9a controls dsDNA-driven dynamic translocation of STING and the innate immune response. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20842-20846 (2009).
  29. Gordon, P. B., Seglen, P. O. Autophagic sequestration of [14C]sucrose, introduced into rat hepatocytes by reversible electro-permeabilization. Exp Cell Res. 142 (1), 1-14 (1982).
  30. An, H., Harper, J. W. Systematic analysis of ribophagy in human cells reveals bystander flux during selective autophagy. Nat Cell Biol. 20 (2), 135-143 (2018).
  31. Fass, E., Shvets, E., Degani, I., Hirschberg, K., Elazar, Z. Microtubules support production of starvation-induced autophagosomes but not their targeting and fusion with lysosomes. J Biol Chem. 281 (47), 36303-36316 (2006).
  32. Velikkakath, A. K., Nishimura, T., Oita, E., Ishihara, N., Mizushima, N. Mammalian Atg2 proteins are essential for autophagosome formation and important for regulation of size and distribution of lipid droplets. Mol Biol Cell. 23 (5), 896-909 (2012).
  33. Øverbye, A., Sætre, F., Hagen, L. K., Johansen, H. T., Seglen, P. O. Autophagic activity measured in whole rat hepatocytes as the accumulation of a novel BHMT fragment (p10), generated in amphisomes by the asparaginyl proteinase, legumain. Autophagy. 7 (9), 1011-1027 (2011).
  34. Kominami, E., Hashida, S., Khairallah, E. A., Katunuma, N. Sequestration of cytoplasmic enzymes in an autophagic vacuole-lysosomal system induced by injection of leupeptin. J Biol Chem. 258 (10), 6093-6100 (1983).
  35. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
  36. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  37. Ogier-Denis, E., et al. A heterotrimeric Gi3-protein controls autophagic sequestration in the human colon cancer cell line HT-29. J Biol Chem. 270 (1), 13-16 (1995).
  38. Seglen, P. O., Gordon, P. B., Tolleshaug, H., Hoyvik, H. Use of [3H]raffinose as a specific probe of autophagic sequestration. Exp Cell Res. 162 (1), 273-277 (1986).
  39. Luhr, M., Sætre, F., Engedal, N. The Long-lived Protein Degradation Assay: an Efficient Method for Quantitative Determination of the Autophagic Flux of Endogenous Proteins in Adherent Cell Lines. Bio-protocol. 8 (9), e2836(2018).
  40. Ronning, O. W., Pettersen, E. O., Seglen, P. O. Protein synthesis and protein degradation through the cell cycle of human NHIK 3025 cells in vitro. Exp Cell Res. 123 (1), 63-72 (1979).
  41. Seglen, P. O., Grinde, B., Solheim, A. E. Inhibition of the lysosomal pathway of protein degradation in isolated rat hepatocytes by ammonia, methylamine, chloroquine and leupeptin. Eur J Biochem. 95 (2), 215-225 (1979).
  42. Seglen, P. O., Solheim, A. E. Valine uptake and incorporation into protein in isolated rat hepatocytes. Nature of the precursor pool for protein synthesis. Eur J Biochem. 85 (1), 15-25 (1978).
  43. Bauvy, C., Meijer, A. J., Codogno, P. Assaying of autophagic protein degradation. Methods Enzymol. 452, 47-61 (2009).
  44. Engedal, N., Seglen, P. O. Autophagy of cytoplasmic bulk cargo does not require LC3. Autophagy. 12 (2), 1-3 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Frakcjonowanie poprzez elektrodisrupcjpomiar sedymentowalnej LDHtworzenie si autofagosom wprotok hodowli kom rkowejtraktowanie bafilomycyn A1knockout genu ATGenzymatyczny test LDHmetoda monitorowania autofagii

Powiązane artykuły