Wymuszone wydzielanie śliny jako metoda analizy kompetencji wektorowych komarów

Summary

Dla efektywnej kontroli przenoszenia wirusów przenoszonych przez komary, szczególnie interesująca jest wiedza na temat potencjału wektorowego poszczególnych komarów. Opisujemy wymuszone ślinotok jako metodę analizy kompetencji wektorowych Aedes albopictus i trzech różnych taksonów Culex pod kątem przenoszenia wirusa Zika.

Abstract

Kompetencja wektorowa jest definiowana jako zdolność gatunku komara do przenoszenia wirusa przenoszonego przez komary (mobowirusa) na żywiciela kręgowców. Żywe cząsteczki wirusa są przenoszone podczas posiłku z krwi przez ślinę zakażonego komara. Testy wymuszonego wydzielania śliny pozwalają określić potencjał wektora na podstawie pojedynczych komarów, unikając stosowania eksperymentów na zwierzętach. Metoda jest odpowiednia do analizy dużej liczby komarów w jednym eksperymencie w krótkim czasie. Wymuszone testy wydzielania śliny wykorzystano do analizy 856 pojedynczych komarów uwięzionych w Niemczech, w tym dwóch różnych biotypów Culex pipiens pipiens, Culex torrentium oraz Aedes albopictus, które zostały eksperymentalnie zakażone wirusem Zika (ZIKV) i inkubowane w temperaturze 18 °C lub 27 °C przez dwa i trzy tygodnie. Wyniki wskazują na brak kompetencji wektorowych różnych taksonów Culex dla ZIKV. Natomiast Aedes albopictus był podatny na ZIKV, ale tylko w temperaturze 27 °C, z szybkością transmisji podobną do kolonii laboratoryjnej Aedes aegypti badanej równolegle.

Introduction

W 2015 roku wirus Zika (ZIKV), wirus przenoszony przez komary (mobowirus) należący do rodziny Flaviviridae, pojawił się w Kolumbii i Brazylii i szybko rozprzestrzenił się po obu Amerykach i Karaibach, powodując epidemię z dużą liczbą powiązanych przypadków klinicznych mikrocefalii i zespołu Guillaina-Barrégo¹. Komary z gatunku Aedes aegypti i Aedes albopictus są uważane za główne i wtórne wektory ZIKV², ale inne gatunki z rodzaju Aedes również udowodniły, że mają eksperymentalną kompetencję wektorową³. W przeciwieństwie do gatunków Aedes, większość przebadanych do tej pory gatunków Culex nie jest w stanie przenosić wirusa⁴. Jedynie dane dotyczące Culex quinquefasciatus dostarczyły niejednoznacznych wyników³. Obecnie brakuje informacji na temat zdolności komarów do przenoszenia ZIKV w umiarkowanych warunkach temperaturowych (<20 °C). Informacje te są jednak istotne dla oceny ryzyka możliwego rozprzestrzeniania się wirusa w regionach o klimacie umiarkowanym, takich jak Europa Środkowa.

Kompetentny wektor dla ZIKV jest w stanie nabyć, utrzymać, amplifikować i w końcu przenieść wirusa. W związku z tym badanie ciał komarów lub części ciał, w tym nóg, jelita środkowego, głowy lub gruczołów ślinowych, na obecność ZIKV nie jest wystarczające do określenia kompetencji wektora. Obowiązkowe jest wykonanie testu na obecność zakaźnych cząstek wirusa w uwolnionej ślinie. Aby ocenić kompetencję wektora, należy określić zarówno wskaźnik infekcji (IR, liczba ciał komarów ZIKV-dodatnich na liczbę nabrzmiałych komarów), jak i współczynnik transmisji (TR, liczba komarów z dodatnim wynikiem ZIKV w ślinie na liczbę ciał komara dodatnich w stosunku do ZIKV). IR komarów można łatwo analizować, po prostu homogenizując komary, a następnie przeprowadzając reakcję łańcuchową polimerazy w czasie rzeczywistym z odwrotną transkryptazą (RT-qPCR) ukierunkowaną na ZIKV. Co więcej, infekcję można dodatkowo scharakteryzować, określając liczbę kopii wirusa na komara. Natomiast analiza szybkości transmisji opiera się na wykrywaniu żywych cząsteczek wirusa w ślinie poszczególnych komarów. Można to osiągnąć poprzez karmienie zakażonych komarów podatnymi zwierzętami gospodarzami, a następnie analizę wiremii w host⁵. Metoda ta opiera się jednak na odpowiednich organizmach modelowych i jest kosztowna oraz ograniczona przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt. Aby uniknąć wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych do analizy szybkości transmisji i obniżyć koszty, opisano systemy sztucznego ponownego karmienia za pomocą kropelek krwi⁶. Jednak badania na indywidualną skalę w połączeniu z dużą liczbą osobników są trudne i czasochłonne. Pierwszy opis testu ślinienia w skali indywidualnej został opublikowany w 1966 roku⁷, a w ostatnich latach eksperymenty z wymuszonym wydzielaniem śliny stały się metodą z wyboru do oceny kompetencji komarów jako wektora^3,8.

Na podstawie naszego badania kompetencji wektorowych komarów z Europy Środkowej, opublikowanego niedawno⁹, opisujemy wymuszone wydzielanie śliny, jak donoszą Anderson et al. ⁸ z pewnymi modyfikacjami. Metoda ta pozwala na wysokoprzepustowe, standaryzowane eksperymenty w warunkach wysokiego poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3) i obejmuje identyfikację aktywnego wirusa za pomocą testów opartych na hodowlach komórkowych. Opisane tutaj eksperymenty obejmują 856 komarów. Zostali oni zakażeni ZIKV za pomocą sztucznej mączki z krwi, a następnie przeanalizowani pod kątem obecności zakaźnych cząstek wirusa w ślinie. Komary wprowadzone do eksperymentów obejmowały dwie od dawna znane populacje laboratoryjne Ae. aegypti i Culex pipiens pipiens biotype molestus (Cx. p. molestus), a także poławiane w terenie Culex pipiens pipiens biotype pipiens (Cx. p. pipiens), Culex torrentium (Cx. torrentium) i dwie populacje Ae. albopictus. Z wyjątkiem jednej z dwóch populacji Ae. albopictus, która została zebrana we Włoszech, wszystkie komary zostały zebrane w Niemczech.

Protocol

1. Przygotuj samice komarów

1. Zbieraj komary z dużej klatki za pomocą aspiratora (około 400 komarów na dużą klatkę).
2. Znieczulać komary dwutlenkiem węgla (CO₂ ) przez 7 s.
3. Sortować 20 samic w plastikowej fiolce (Ø 50 mm × 100 mm).
   Uwaga: Jeśli komary się obudzą, użyj kolejnych 3 s CO_{2 .}
4. Zagłodzić komary przez noc.

2. Sztuczny posiłek z krwi

UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w warunkach BSL-3.

1. Przygotuj zakaźny posiłek z krwi.
   1. Rozcieńczyć materiał wirusa do stężenia 1 x 10⁸ jednostek tworzących płytkę miażdżycową (PFU)/ml.
      Uwaga: Stężenie zapasu zostało określone metodą dawki 50 infekcji kulturą tkankową (TCID50) i obliczone za pomocą algorytmu Spearman & Kärber^10,11.
   2. Zmieszaj przeterminowaną krew ludzką (zachowanie krwi) z banku krwi (nie nadaje się już dla ludzi, ale jest przydatna dla komarów) z fruktozą (8% roztwór), przefiltrowaną surowicą bydlęcą (FBS) i roztworem roboczym zapasu wirusa (przeterminowana krew ludzka: fruktoza: FBS: roztwór roboczy = 5:3:1:1).
      Uwaga: Wybraliśmy ludzką krew, ponieważ jest to znany naturalny ssak żywiciel ZIKV.
2. Zamrozić 140 μl mieszanki mączek z krwi do dalszej analizy za pomocą TCID50.
3. Wykonaj sztuczne karmienie przy użyciu różnych metod karmienia, w zależności od gatunku:
   1. Aedes aegypti: Używaj systemu karmienia membranowego przez 30 minut (1 ml na karmnik).
   2. Culex spp.: Krew zakaźną należy podawać przez noc za pomocą wacika i nie podgrzewać krwi (300 μl na fiolkę).
   3. Aedes albopictus: Umieść dwie kropelki (po 50 μl każda) mieszanki mączki z krwi do plastikowej fiolki i pozwól komarom żerować przez 2 godziny. Nie rozgrzewaj krwi.
      Uwaga: Komary będą żerować w ciągu pierwszych 15 minut. Wydłużony czas inkubacji jest konieczny ze względów bezpieczeństwa. Kropelki krwi są odprowadzane po 2 godzinach, dzięki czemu zmniejsza się ryzyko zanieczyszczenia podczas sortowania karmionych komarów.
4. Znieczulić komary CO₂ przez 7 s.
   UWAGA: Jeśli komary się obudzą, użyj kolejnych 3 s CO₂ .
5. Posortuj i policz w pełni nabrzmiałe komary do nowej fiolki.
6. Dodać wacik nasączony fruktozą (8% roztwór) między fiolkę a zatyczkę.
7. Utrzymuj komary w wyznaczonej temperaturze 18 °C lub 27 °C przy wilgotności 80% przez 14 lub 21 dni.
8. Nakarm komary wacikami nasączonymi fruktozą. Uzupełniać co 72 godziny 1,5 ml fruktozy (8% roztwór) na fiolkę (do 20 komarów, w zależności od dawki karmienia, patrz krok 2.5).

3. Test wymuszonego wydzielania śliny w dniu 14 lub 21

UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w warunkach BSL-3.

1. Wysiew 2 x 10⁴ komórek Vero / na studzienkę w 96-dołkowej płytce z 200 μl pożywki wzrostowej (zmodyfikowana pożywka orła Dulbecco (DMEM) uzupełniona 3% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 mg / ml streptomycyny, 5 μg / ml amfoterycyny B, 2 mM L-glutaminy, 1% aminokwasów endogennych (NEAA), 1% pirogronianu sodu).
2. Przygotuj urządzenie do ślinienia:
   1. Umieść kwadratową szklaną płytkę (20 × 20 cm) na ławce pod kątem 30°.
      Uwaga: Jest to konieczne ze względu na zbyt niskie ciśnienie w laboratorium bezpieczeństwa. Jeśli płyta jest pozioma lub pionowa, płyn będzie wyciekał.
   2. Umieść dwustronną taśmę klejącą na szklanej płycie.
   3. Ułóż plastelinę, aż osiągnie średnicę 0,5 cm i przymocuj ją poziomo w odległości 1 cm od dwustronnej taśmy klejącej.
   4. Odetnij pierwsze 0,3 cm końcówki końcówki filtra o pojemności 10 μl.
      UWAGA: Zaleca się przygotowanie go przed rozpoczęciem eksperymentu poza laboratorium bezpieczeństwa biologicznego.
   5. Napełnij końcówki filtra 10 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4).
   6. Umieść końcówki filtra na plastelinie końcówką w kierunku taśmy klejącej.
   7. Zabezpiecz końcówki filtra delikatnym naciskiem.
3. Przygotuj komary:
   1. Znieczulić komary CO₂ .
   2. Usuń nogi i skrzydła, aby unieruchomić komary.
   3. Przymocuj żywe ciała komarów do taśmy klejącej nad końcówką filtra.
   4. Delikatnie umieść sondę w końcówce filtra.
   5. Uruchom test wydzielania śliny przez 30 minut.
   6. Zdejmij końcówki filtra i wyrzuć glinę i taśmę.

4. Przetwarzanie śliny

UWAGA: Kroki 4.1–4.6.2 są wykonywane w warunkach BSL-3.

1. Usunąć zawartość do probówek reakcyjnych zawierających 10 μl PBS.
2. Delikatnie wymieszać i przenieść zawartość do dołków przygotowanej płytki 96-dołkowej, używając jednego dołka na próbkę.
3. Inkubować płytkę przez 7 dni w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
4. Użyj lornetki, aby sprawdzić komórki pod kątem obecności efektu cytopatycznego (CPE).
5. Jeśli studzienka jest dodatnia na obecność CPE, zebrać supernatant przez pipetowanie 140 μl do probówki reakcyjnej w celu ekstrakcji RNA.
6. Oczyść RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA.
   1. Zmieszać 140 μl supernatantu z 560 μl buforu AVL (bufor do lizy wirusów) i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Dodać 560 μl etanolu (96%) i zagniecić próbkę.
      UWAGA: Po tym etapie próbki są inaktywowane i można je wypisać z laboratorium BSL-3.
   3. Odpipetować 630 μl próbki na kolumnę i odwirować z 6 000 x g przez 1 min.
   4. Odrzucić filtrat, odpipetować pozostałe 630 μl na kolumnę i powtórzyć wirowanie.
   5. Przepłukać RNA, związany z membraną kolumny, dodając 500 μl buforu płuczącego 1 do kolumny i odwirować przy 6 000 x g przez 1 min.
   6. Wyrzuć probówkę zbiorczą i umieść kolumnę w nowej probówce zbiorczej. Dodać 500 μl buforu myjącego 2 i wirować przy 12 500 x g przez 3 min.
   7. Wyrzucić probówkę zbiorczą i umieścić kolumnę w probówce reakcyjnej o pojemności 1,5 ml.
   8. Dodać 50 μl buforu elucyjnego i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
   9. Wirować przy 6 000 x g przez 1 minutę, a następnie wyrzucić kolumnę.
7. Analizować próbki pod kątem RNA ZIKV za pomocą RT-qPCR.

5. Przetwarzanie ciał komarów

UWAGA: Kroki 5.1–5.5 są wykonywane w warunkach BSL-3.

1. Usuń ciała komara i umieść je w probówce reakcyjnej.
   UWAGA: W tym momencie możliwe jest wstrzymanie eksperymentu i przechowywanie próbek w temperaturze -80 °C.
2. Dodać 500 μl pożywki homogenizacyjnej (DMEM bez żadnych dodatków) do probówki reakcyjnej.
3. Homogenizować ciało za pomocą ręcznego miksera silnikowego i używać nowego słupka do każdej próbki.
4. Dodać 200 μl homogenatu do płytki 96-dołkowej w celu oczyszczenia.
   UWAGA: W tym momencie możliwe jest wstrzymanie eksperymentu i przechowywanie próbek w temperaturze -80 °C.
5. Inaktywować płytkę przez inkubację przez 60 minut w temperaturze 60 °C.
6. Oczyść RNA przez automatyczne oczyszczanie kwasów nukleinowych.
   UWAGA: W tym momencie możliwe jest wstrzymanie eksperymentu i przechowywanie próbek w temperaturze -80 °C.

6. Analiza

1. Określ ilościowo kopie wirusowego RNA za pomocą RT-qPCR.
   UWAGA: Kopie RNA zostały uśrednione dla wszystkich ciał komarów ZIKV-dodatnich i bez uwzględniania komarów ZIKV-ujemnych.
2. Obliczyć IR, zdefiniowaną jako liczba ciał komarów z dodatnim wynikiem ZIKV na liczbę karmionych samic.
3. Obliczyć TR, zdefiniowaną jako liczba komarów z dodatnim wynikiem śliny na liczbę ciał komarów dodatnich w skali ZIKV. Nie można było obliczyć szybkości transmisji dla kombinacji gatunków i temperatur bez ciał dodatnich w skali ZIKV.

Results

Aedes aegypti jest znany jako kompetentny wektor dla ZIKV, przynajmniej w tropikalnych warunkach klimatycznych¹². Dlatego użyliśmy Ae. aegypti jako kontroli pozytywnej do ustalenia testu i analizy IR, a także TR w temperaturze inkubacji 27 °C i wilgotności 80%. IR i TR zdefiniowano zgodnie z wcześniejszym opisem Fortuny i wsp. ¹³. Challenge Ae. aegypti wykazało IR na poziomie 50% i 72% oraz TR na poziomie 42% i 31% odpowiednio po 14 i 21 dniach od infekcji (dpi) (Rysunek 1A i 1B). Następnie europejskie komary zostały przebadane pod kątem zakażenia i przenoszenia ZIKV w tropikalnych i umiarkowanych warunkach klimatycznych.

Przy temperaturze inkubacji 27 °C, wszystkie gatunki komarów wykazywały infekcję ZIKV na poziomie 14 dpi, jak również 21 dpi, z wyjątkiem osobników Cx. p. pipiens i Cx. torrentium, które były pozytywne tylko przy 14 dpi. Wszystkie gatunki Aedes wykazywały wyższe IR (od 50% do 72%), a także wyższe stężenie RNA wirusa (10,⁶ do 10,⁹ kopii RNA/próbki komarów) w porównaniu z różnymi taksonami Culex, które wykazały IR w zakresie od 0% do 32% i miano wirusa od 10³ do 10⁴ kopii RNA/próbki komarów. Wszystkie gatunki Aedes wykazywały ślinę ZIKV dodatnią (TR 13–42%), podczas gdy żadna z próbek śliny z taksonów Culex nie zawierała ZIKV (Ryc. 1A i 1B). Co ciekawe, wskaźniki transmisji na poziomie 21 dpi były podobne u Ae. aegypti i Ae. albopictus z Niemiec (30%), ale znacznie niższe u Ae. albopictus z Włoch (13%).

Inkubacja komarów w umiarkowanej temperaturze 18 °C ujawniła ogólnie niższe obciążenie wirusem u gatunków Aedes (10⁴–10⁶ kopii RNA/komara), jak również u różnych taksonów Culex (10^2–10⁴ kopii RNA/komar). Jednak w temperaturze inkubacji wynoszącej 18 °C nie zaobserwowano przenoszenia ZIKV w przypadku żadnego z badanych gatunków komarów.

Rycina 1: Szybkość transmisji komarów eksperymentalnie zakażonych ZIKV. Wyniki badań kompetencji wektorowych z użyciem ZIKV u różnych gatunków komarów. Sześć różnych taksonów komarów zostało zakażonych ZIKV i inkubowanych w temperaturze 27 °C lub 18 °C przez 14 (A) lub 21 (B) dni. TR definiuje się jako liczbę komarów ze śliną ZIKV-dodatnią na liczbę ciał komarów ZIKV-dodatnich. Całkowita liczba badanych komarów wyniosła 856, z minimum 30 osobnikami na każdy punkt czasowy/temperaturę/takson komarów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Wcześniej wykazano, że wyniki uzyskane przy wymuszonym wydzielaniu śliny są zgodne z klasycznymi eksperymentami z ponownym karmieniem⁶. Jednak zarówno w eksperymentach z ponownym karmieniem, jak i w przedstawionej przez nas metodzie wymuszonego wydzielania śliny, niemożliwe jest bezpośrednie udowodnienie aktywności śliny lub monitorowanie uwalniania śliny. Aby udowodnić aktywność śliny, próbki można przetestować pod kątem innych składników obecnych w ślinie (np. białek, węglowodanów itp.). Co więcej, dodatkowe qPCR pozwoliłyby na wykrycie kopii wirusowego RNA. Wymaga to jednak rozszczepienia próbek śliny do różnych analiz, co może ograniczyć czułość w teście hodowli komórkowej w przypadku bardzo niskiej liczby cząstek. To z kolei może prowadzić do niedoszacowania wyznaczonych szybkości transmisji.

Aby uzyskać powtarzalne wyniki, konieczne jest upewnienie się, że wszystkie komary pozostaną przy życiu do końca eksperymentu. Jest to kontrolowane poprzez wizualne monitorowanie aktywności ruchów ciała komarów. Ponadto podstawowe zastosowanie testu śliny w odniesieniu do danego gatunku komarów musi zostać przetestowane poprzez karmienie wirusami kontrolnymi, o których wiadomo, że są przenoszone przez ten konkretny gatunek komarów. I na odwrót, każdy wirus wprowadzony do eksperymentu musi zostać przetestowany na podatnym komarze.

Testy wymuszonego wydzielania śliny mają wiele zalet. Duża liczba komarów może być badana jednocześnie na jednej podstawie próbki w kontrolowanych, znormalizowanych warunkach, bez naruszania przepisów dotyczących dobrostanu zwierząt⁹.

Metoda jest stosowana przez kilka laboratoriów. Jednak dokładne konfiguracje mogą się różnić, co może prowadzić do różnic w wynikach między laboratoriami. Jednym z krytycznych elementów jest kapilara do zbierania śliny, która może być wykonana ze szkła¹⁴ lub plastiku¹⁵. Aby spełnić wysokie przepisy bezpieczeństwa dotyczące środków owadobójczych o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3, zamiast szklanych kapilar użyliśmy plastikowych końcówek filtrujących, zmniejszając w ten sposób ryzyko obrażeń. Ponadto końcówki filtrujące mają tę zaletę, że zebraną ciecz można łatwo przenieść za pomocą pipety.

Przedstawiona tutaj konfiguracja testu wymuszonego wydzielania śliny opiera się na współpracy dwóch badaczy i podziale obowiązków. Demobilizacja komara jest wykonywana przez jedną osobę, podczas gdy druga jednocześnie przygotowuje zestaw do wymuszonego wydzielania śliny. To znacznie skraca czas obsługi i minimalizuje ryzyko zmiany próbki, ponieważ zmiana między miejscem pracy demobilizacji a płytką ślinową nie jest konieczna. Co więcej, umożliwia umieszczenie komarów na urządzeniu do wymuszonego ślinienia natychmiast po demobilizacji. Ten dość krótki czas radzenia sobie z komarami jest niezbędny do udanego wymuszonego wydzielania śliny. Wreszcie, komary mogą być bezpośrednio monitorowane pod kątem ruchliwości przez cały czas trwania eksperymentu.

Przedstawiony tutaj test wydzielania śliny służy do uzyskania wglądu w potencjał wektorowy gatunków komarów. Jednak, aby odpowiedzieć na kilka innych konkretnych pytań (np. liczba ukąszeń komarów, które są potrzebne do zakażenia kręgowców), nadal mogą być wymagane eksperymenty na zwierzętach.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inject+matic Sleeper	Inject+matic
Bugdorm-1 Klatka do hodowli owadów	Sklep
Rurki do uprawy Drosophila	Carl	Roth PK11.2	Plastikowa fiolka na komary
Zatyczka do rurek do hodowli Drosophila	Carl	Roth PK15.1
Komora klimatyczna do testów stabilności	Spoiwo	KBF-240
Bankowanie krwi			krwi ludzkiej, przeterminowana, nienadająca się do użytku medycznego
Dumont-Pincette Electronic SS	Dumont	B40c
Vero cells	BNITM
Aspirator światła flash	Bioquip	2809
taśma			bez konkretnego dostawcy
Gammex Rękawice bezpudrowe z AMT	Ansell		ze względów bezpieczeństwa niezbędnych podczas pracy z ukłuciami w laboratorium BSL3
RealStar Wirus Zika RT-PCR-Kit	diagnostyka altona	591013
MagMax Pathogen RNA/DNA Kit	Thermo fisher 4462359 naukowe		izolacja RNA ciał komarów
Qiamp wirusowy RNA Mini Kit	Qiagen	52906	RNA-Izolacja filtra supernatantu
Napiwki (20 i mikro; L)	Sarstedt	701,116,210	Wytnij pierwsze 3 mm końcówki
Ręczny mikser silnikowy	Carl Roth	Wyprzedane
Mikro tłuczki do ręcznego miksera silnikowego	Carl Roth	CXH8.1
DMEM		P0403550
L Glutamina Penicylina/Streptomycyna	PAN	P0819100
Amfoterycyna B	PAN	P06-0110
Fruktoza	carl roth	4981.5
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami	PAN	P04-36500
FBS	PAN
Pirogronian sodu	PAN	P0443100
MEM NAA	PAN
Podajnik	Hemotek PS6
Light Cycler	Roche	480 II
Light Cycler Oprogramowanie	Roche	480 SW 1.5.1
Modelina			brak konkretnego dostawcy
System oczyszczania King Fisher Flex	ThermoFisher scientific
Aedes albopictus			zostały zebrane we Freiburgu, Niemcy
Lornetka	MOTIC	SMZ-168
Lampa lornetkowa	MOTIC	MLC-150C
CO2-Inkubator	Thermo scientific	MIDI 40