Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Znakowanie metaboliczne za pomocą 4-tiouracylu i kwantyfikacja nowo zsyntetyzowanego mRNA jako wskaźnika aktywności polimerazy II RNA

8.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57982

⸱

22 października 2018

 , 
1Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Illkirch, France, 2Centre National de la Recherche Scientifique, Illkirch, France, 3Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Illkirch, France, 4Université de Strasbourg

W tym artykule

Podsumowanie

Opisany tutaj protokół opiera się na kwantyfikacji całego genomu nowo zsyntetyzowanych mRNA oczyszczonych z komórek drożdży znakowanych 4-tiouracylem. Metoda ta pozwala na pomiar syntezy mRNA niesprzężonej z rozpadem mRNA, a tym samym zapewnia dokładny pomiar transkrypcji polimerazy II RNA.

Streszczenie

Globalne defekty w transkrypcji polimerazy II RNA mogą zostać przeoczone w badaniach transkryptomicznych analizujących RNA w stanie ustalonym. Rzeczywiście, wykazano, że globalny spadek syntezy mRNA jest kompensowany przez jednoczesny spadek degradacji mRNA w celu przywrócenia normalnych poziomów w stanie ustalonym. W związku z tym kwantyfikacja syntezy mRNA w całym genomie, niezależnie od rozpadu mRNA, jest najlepszym bezpośrednim odzwierciedleniem aktywności transkrypcyjnej polimerazy II RNA. W tym miejscu omówiono metodę wykorzystującą niezakłócające znakowanie metaboliczne powstających RNA w Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). W szczególności komórki są hodowane przez 6 minut z analogiem uracylu, 4-tiouracylem, a znakowane nowo transkrybowane RNA są oczyszczane i oznaczane ilościowo w celu określenia szybkości syntezy wszystkich pojedynczych mRNA. Co więcej, użycie znakowanych komórek pombe Schizosaccharomyces jako wzorca wewnętrznego pozwala na porównanie syntezy mRNA w różnych szczepach S. cerevisiae. Korzystając z tego protokołu i dopasowując dane do dynamicznego modelu kinetycznego, można określić odpowiednie tempo rozpadu mRNA.

Wprowadzenie

Komórki reagują na endogenne i egzogenne sygnały, poprzez dynamiczną zmianę ich programu ekspresji genów. W ostatnich latach ogromny rozwój metodologii obejmujących cały genom pozwala na precyzyjny i kompleksowy opis zmian transkryptomu w różnych warunkach. W większości badań transkryptomicznych hybrydyzacja mikromacierzy lub sekwencjonowanie wysokoprzepustowe są stosowane do ilościowego określania poziomów RNA z całkowitej frakcji RNA w stanie ustalonym. Zmiany transkrypcji pod wpływem określonych zaburzeń mogą wykazywać szeroki zakres możliwych wyników, przy czym albo określone zmiany ekspresji genów, albo duże spektrum genów jest regulowane w górę lub w dół. Ekspresja genów jest wynikiem precyzyjnie dostrojonej równowagi - lub stanu ustalonego - między syntezą RNA przez polimerazy RNA a innymi procesami wpływającymi na poziomy RNA. Transkrypcja polimerazy II RNA, w tym jej trzy odrębne fazy (inicjacja, wydłużenie i zakończenie), jest silnie i misternie związana z przetwarzaniem mRNA, eksportem, translacją i degradacją cytoplazmy.

Kilka ostatnich badań wykazało, że synteza i rozpad mRNA są sprzężonymi mechanizmami i pokazały, że efekty transkrypcyjne po mutacji lub pod wpływem bodźców mogą być pominięte przy ilościowym określaniu całkowitego RNA w stanie ustalonym. Po pierwsze, wykrywanie zmian transkrypcyjnych poprzez analizę poziomów mRNA w stanie stacjonarnym zawsze zależy od okresu półtrwania mRNA. Po wprowadzeniu perturbacji, poziomy mRNA w stanie stacjonarnym z długimi okresami półtrwania będą znacznie mniej naruszone niż w przypadku mRNA z krótkimi okresami półtrwania. W związku z tym wykrywalność zmian w syntezie RNA jest silnie obciążona na korzyść krótkotrwałych transkryptów, podczas gdy analiza dłużej żyjących gatunków mRNA może nie ujawnić dynamicznych zmian w szybkości transkrypcji. Po drugie, kilka doniesień wykazało, że zarówno u drożdży, jak i ssaków, globalne zmiany w transkrypcji mogą zostać pominięte podczas analizy poziomów mRNA w stanie stacjonarnym. Jest to prawdopodobnie spowodowane mechanizmami łączącymi syntezę i degradację mRNA, co skutkuje buforowaniem mRNA. Skłoniło to do opracowania nowych protokołów do ilościowego określania syntezy mRNA niesprzężonej z degradacji poprzez analizę nowo transkrybowanego mRNA. W ostatnich latach zaprezentowano kilka alternatyw, w tym globalne sekwencjonowanie run-on (GRO-seq)1 oraz natywne sekwencjonowanie transkryptów elongacji (NET-seq)2,3. Tutaj prezentujemy protokół początkowo opracowany w komórkach ssaków4,5,6, a następnie dostosowany do drożdży7,8,9,10,11, który opiera się na znakowaniu RNA tiolowanym nukleozydem lub analogiem zasady, odpowiednio 4-tiourydyną (4sU) lub 4-tiouracylem (4tU).

Ta metoda specjalnie oczyszcza nowo transkrybowane RNA z komórek, w których RNA jest znakowane impulsowo za pomocą 4sU, praktycznie bez ingerencji w homeostazę komórki. W związku z tym, gdy komórki są wystawione na działanie 4sU, cząsteczka jest szybko wchłaniana, fosforylowana do 4sU-trifosforanu i włączana do transkrybowanych RNA. Po znakowaniu impulsowym możliwe jest wyekstrahowanie całkowitego komórkowego RNA (odpowiadającego poziomom RNA w stanie ustalonym), a następnie frakcja RNA znakowana 4sU jest modyfikowana specyficznie dla tiolu, co prowadzi do powstania wiązania dwusiarczkowego między biotyną a nowo transkrybowanym RNA4,5. Jednak 4sU może być wychwytywany tylko przez komórki wyrażające transporter nukleozydów, taki jak ludzki równowagowy transporter nukleozydów (hENT1), zapobiegając jego natychmiastowemu wykorzystaniu w drożdżach pączkujących lub rozszczepiających. Podczas gdy można wyrazić hENT1 zarówno w S. pombe, jak i S. cerevisiae, łatwiejsze podejście można osiągnąć przy użyciu zmodyfikowanej zasady 4tU, ponieważ komórki drożdży mogą pobierać 4tU, bez potrzeby ekspresji transportera nukleozydów10,11,12,13. W rzeczywistości metabolizm 4tU wymaga aktywności enzymu fosforybozylotransferazy uracylu (UPRT). W kilku organizmach, w tym drożdżach, ale nie u ssaków, UPRT jest niezbędny dla szlaku odzyskiwania pirymidyny, recyklingu uracylu do monofosforanu urydyny.

Istotną stronniczość w badaniach transkryptomicznych może wprowadzić normalizacja między różnymi próbkami analizowanymi równolegle. Rzeczywiście, wiele odbiegających czynników może wpływać na analizę porównawczą transkryptomu zmutowanych i dzikich szczepów: między innymi efektywność lizy komórek, różnice w ekstrakcji i odzyskiwaniu RNA oraz różnice w kalibracji skanera do analiz mikromacierzy. Jak omówiono powyżej, takie zmiany mogą być szczególnie mylące, gdy spodziewany jest globalny wpływ na transkrypcję polimerazy II RNA. Elegancki sposób do dokładnego porównywania szybkości syntezy mRNA między różnymi próbkami został zaprojektowany przy użyciu daleko spokrewnionych drożdży rozszczepialnych Schizosaccharomyces pombe jako wzorca wewnętrznego. W tym celu do próbek S. cerevisiae, komórek typu dzikiego lub zmutowanego, dodaje się ustaloną liczbę oznakowanych komórek S. pombe, przed lizą komórek i ekstrakcją RNA10. Następnie, zarówno w stanie ustalonym, jak i nowo zsyntetyzowane RNA z S. pombe i S. cerevisiae są oznaczane ilościowo za pomocą RT-qPCR lub za pomocą chipów mikromacierzy lub sekwencjonowania o wysokiej przepustowości10. Łącząc te dane z modelowaniem kinetycznym, można zmierzyć bezwzględne tempo syntezy i rozpadu mRNA w pączkujących drożdżach.

W ramach tego manuskryptu pokażemy, jak analiza nowo transkrybowanego RNA pozwoliła ujawnić globalną rolę kompleksów koaktywatorów SAGA i TFIID w transkrypcji polimerazy RNA II w pączkujących drożdżach14,15,16. Co ważne, wcześniejsze badania określiły ilościowo poziomy mRNA w stanie stacjonarnym u S. cerevisiae i zasugerowały, że SAGA odgrywa dominującą funkcję w ograniczonym zestawie genów drożdży, które są silnie dotknięte mutacjami w SAGA, ale stosunkowo odporne na mutacje TFIID17,18,19. Co zaskakujące, wykazano, że aktywność enzymatyczna SAGA działa na cały transkrybowany genom, co sugeruje szerszą rolę tego koaktywatora w transkrypcji polimerazy II RNA. Zmniejszoną rekrutację polimerazy II RNA do większości genów ulegających ekspresji zaobserwowano po inaktywacji SAGA lub TFIID, co sugeruje, że te koaktywatory współpracują ze sobą w co najwyżej genach. W związku z tym kwantyfikacja nowo transkrybowanego mRNA ujawniła, że SAGA i TFIID są wymagane do transkrypcji prawie wszystkich genów przez polimerazę RNA II14,15,16. Implementacja mechanizmów kompensacyjnych pojawia się jako sposób na radzenie sobie przez komórki z globalnym spadkiem syntezy mRNA, który jest buforowany przez jednoczesny globalny spadek degradacji mRNA. SAGA dodaje do listy czynników mających globalny wpływ na transkrypcję polimerazy II RNA, takich jak podjednostki RNA Pol II10, kompleks koaktywatora Mediator20, ogólny czynnik transkrypcyjny TFIIH21,22, a pośrednio elementy maszynerii degradacji mRNA9,10,23. Takie zdarzenia kompensacyjne były powszechnie obserwowane w mutantach SAGA, odpowiadając za umiarkowane i ograniczone zmiany poziomów mRNA w stanie stacjonarnym, pomimo globalnego i poważnego spadku syntezy mRNA14. Podobne analizy przeprowadzono również w przypadku szczepu delecyjnego BRE1, co spowodowało całkowitą utratę ubikwitynacji histonu H2B. Co ciekawe, znacznie łagodniejszy, ale spójny globalny wpływ na transkrypcję polimerazy II RNA można wykryć przy braku Bre1, co wskazuje, że znakowanie metaboliczne nowo transkrybowanego RNA u drożdży może wykrywać i określać ilościowo szeroki zakres zmian w szybkości syntezy mRNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórkowa i wyczerpanie rapamycyny w podjednostce SAGA

  1. Dla każdego szczepu i repliki S. cerevisiae, w tym szczepów typu dzikiego lub kontrolnego, należy zaszczepić pojedynczą kolonię ze świeżej płytki na 5 ml pożywki YPD (2% peptonu, 1% ekstraktu drożdżowego i 2% glukozy).
  2. Komórki S. cerevisiae hodować przez noc w temperaturze 30 °C przy stałym mieszaniu (150 obr./min).
  3. Zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) i rozcieńczyć kulturę do OD600 około 0,1 na 100 ml pożywki YPD i pozwolić jej rosnąć, aż OD600 osiągnie około 0,8.
  4. Równolegle zaszczepić pojedynczą kolonię komórek S. pombe ze świeżej płytki na 50 ml pożywki YES (0,5% ekstraktu drożdżowego; 250 mg/l adeniny, histydyny, uracylu, leucyny i lizyny; 3% glukozy) i hodować komórki przez noc w temperaturze 32 °C przy stałym mieszaniu (150 obr./min).
  5. Zmierz OD600 w nocnej hodowli S. pombe i rozcieńczyć kulturę do OD600 około 0,1 na 500 ml pożywki YES i pozwól jej rosnąć, aż OD600 wyniesie około 0,8.
  6. Dla każdego szczepu i repliki S. cerevisiae, w tym szczepów typu dzikiego lub kontrolnego, należy zaszczepić pojedynczą kolonię ze świeżej płytki na 5 ml pożywki YPD (2% peptonu, 1% ekstraktu drożdżowego i 2% glukozy).
  7. Hodować komórki przez noc w temperaturze 30 °C przy stałym mieszaniu (150 obr./min).
  8. Następnego ranka zmierz OD600, rozcieńczyć kulturę do OD600 około 0,1 na 100 ml pożywki YPD i pozwól jej rosnąć do OD600≈ 0,8.
  9. Dodać 100 μl rapamycyny do hodowli z roztworu podstawowego o stężeniu 1 mg/ml (końcowe stężenie rapamycyny 1 μg/ml) i pozostawić komórki do inkubacji w temperaturze 30 °C przy stałym mieszaniu przez czas niezbędny do warunkowego wyczerpania białka będącego przedmiotem zainteresowania z jądra (zwykle 30 minut jest wystarczające). Do kontroli użyj podobnej kultury drożdży, ale zamiast dodawać rapamycynę, dodaj równoważną objętość dimetylosulfotlenku (DMSO).

2. Etykietowanie 4tU z S. pombe jako Spike-in (Liczenie)

  1. Przygotować świeży roztwór 2 M 4-tiouracyl. Po przygotowaniu przechowuj go w temperaturze pokojowej i z dala od światła.
    1. Dokładnie odważyć 64,1 mg 4-tiouracylu dla każdej kultury S. cerevisiae i rozpuścić ją w 250 μl dimetyloformamidu (DMF) lub w 250 μl DMSO.
    2. Aby kultura S. pombe mogła być użyta jako spike in, należy odważyć 320,5 mg 4-tiouracylu i rozpuścić go w 1,250 μl DMSO.
  2. Dodać roztwór 4-tiouracylu do kultur S. cerevisiae i S. pombe do końcowego stężenia 5 mM i inkubować je przez 6 minut przy stałym mieszaniu odpowiednio w temperaturze 30 °C i 32 °C.
  3. Po 6 minutach usunąć małą porcję każdej kultury w celu zliczenia komórek. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub komory Neubauera.
  4. Zebrać komórki przez odwirowanie (2 500 x g) przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Odrzucić sklarowany osad, przemyć komórki lodowatym środkiem 1x PBS i ponownie odwirować (2 500 x g, 4 °C, 5 min).
  6. Obliczyć całkowitą liczbę komórek w każdej z próbek S. cerevisiae i S. pombe.
  7. Ponownie zawiesić komórki w 5 ml lodowatego 1x PBS i wymieszać S. cerevisiae z komórkami S. pombe w stosunku 3:1.
  8. Odwirować komórki (2 500 x g, 4 °C, 5 min), usunąć PBS, błyskawicznie zamrozić komórki w cieczyN2 i przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

3. Ekstrakcja RNA i leczenie DNazą

  1. Rozmrażaj komórki na lodzie przez około 20–30 minut.
  2. Kontynuuj ekstrakcję RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji drożdży i RNA (tabela materiałów) z kilkoma adaptacjami.
  3. Na każdą próbkę wlej 750 μl lodowatych kulek cyrkonu do 1,5 ml nakrętki dostarczonej z zestawem. Należy pamiętać, że na każdą probówkę można skutecznie wyekstrahować RNA z maksymalnie 109 komórek. W związku z tym należy przygotować liczbę probówek niezbędną dla każdej próbki. Na przykład hodowla S. cerevisiae o objętości 100 ml (OD600≈ 0,8) może wyrenderować około 2 x 109 do 3 x 109 komórek, co prowadzi do łącznej liczby 2,7 x 109 do 4 x 109 komórek (po wbiciu jednej trzeciej komórek S. pombe). W takim przypadku wymagane byłyby do 3 - 4 probówek reakcyjnych na każdą próbkę/stan/mutant/kontrpróbę.
  4. Na każdą 1 x 109 komórek dodaj 480 μl buforu do lizy dostarczonego z zestawem, 48 μl 10% SDS i 480 μl fenolu: chloroformu: alkoholu izoamylowego (25:24:1, v/v/v).
  5. Wymieszaj komórki za pomocą mieszalnika wirowego i przenieś je do probówek zawierających lodowate kulki cyrkonu.
  6. Umieść rurki na adapterze mieszalnika wirowego, obracaj wir z maksymalną prędkością i ubijaj przez 10 minut, aby zlizować komórki drożdży (w pomieszczeniu o temperaturze 4 °C). Alternatywnie wykonaj lizę komórek w automatycznym ubijaku do kulek.
  7. Odwirować probówki o masie 16 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ostrożnie pobrać górną fazę (fazę zawierającą RNA) do świeżej probówki falcon o pojemności 15 ml. Zazwyczaj objętość odzyskiwana z każdej probówki wynosi około 500–600 μl.
  8. Do probówek o pojemności 15 ml zawierających częściowo oczyszczony RNA dodać bufor wiążący dostarczony z zestawem i dokładnie wymieszać. Na każde 100 μl roztworu RNA dodać 350 μl buforu wiążącego (tj. gdy objętość roztworu w fazie wodnej wynosi 600 μl, należy dodać 2,1 ml buforu wiążącego).
  9. Do poprzedniej mieszanki dodaj 100% etanol i dokładnie wymieszaj. Na każde 100 μl roztworu RNA dodać 235 μl 100% etanolu (tj. gdy objętość roztworu w fazie wodnej wynosi 600 μl, dodać 1,41 ml etanolu).
  10. Nanieść do 700 μl mieszaniny z kroku 3.9 na wkład filtracyjny zmontowany w probówce zbiorczej, oba dostarczone z zestawem.
  11. Wirować przez 1 minutę przy 16 000 x g. Jeśli czas wirowania był niewystarczający, aby cała objętość przeszła przez filtr, powtórz wirowanie przez 30 sekund.
  12. Wyrzuć przepływowy przepływ i ponownie użyj tej samej probówki zbiorczej. Dodać kolejne 700 μl roztworu etanolu wiążącego RNA do filtra i ponownie odwirować przy 16 000 x g przez 1 minutę.
  13. Odrzucić przepływ i powtarzać kroki 3.11 i 3.12, aż roztwór RNA będzie gotowy.
  14. Umyj filtr 2x 700 μl roztworu myjącego 1. Zebrać roztwór myjący przez odwirowanie w stężeniu 16 000 x g przez 1 minutę i zawsze przechowywać probówkę zbiorczą.
  15. Umyj filtr 2x 500 μl roztworu myjącego 2. Zebrać roztwór myjący przez odwirowanie w stężeniu 16 000 x g przez 1 minutę i zawsze przechowywać probówkę zbiorczą.
  16. Ponownie odwirować probówki o sile 16 000 x g przez 1 minutę, aby całkowicie wysuszyć filtr.
  17. Przenieść wkład filtra do końcowej probówki zbiorczej (probówka odpowiednia dla RNA) i wymyć RNA za pomocą 50 μl H2O poddanego działaniu DEPC, wolnego od RNaz (podgrzanego do 100 °C).
  18. Wirować przez 1 minutę przy 16 000 x g.
  19. Ponownie wypłukać RNA (do tej samej probówki) za pomocą 50 μl wstępnie podgrzanego, poddanego działaniu DEPC, wolnego od RNazH2O. Upewnij się, że cała objętość przeszła przez filtr; w przeciwnym razie wirować przez dłuższy czas.
  20. Jeśli używa się wielu probówek na jedną próbkę, należy je wszystkie umieścić w jednej probówce.
  21. Określić ilościowo i sprawdzić czystość próbki przy użyciu odpowiedniego sprzętu.
    UWAGA: Chociaż 4tU jest włączany tylko do nowo zsyntetyzowanego RNA, istnieje szansa na niewielkie zanieczyszczenie DNA. Z tego powodu zawsze zaleca się traktowanie próbek DNazą I. W tym celu należy użyć odczynników dostarczonych z zestawem do ekstrakcji RNA (tabela materiałów) zgodnie z zaleceniami producenta.

4. Specyficzna dla tiolu biotynylacja nowo zsyntetyzowanego RNA

  1. Dostosuj stężenie RNA uzyskane zgodnie z sekcją 3 protokołu do 2 mg/ml. Porcjować 200 μg całkowitego RNA, podgrzewać przez 10 minut w temperaturze 60 °C i natychmiast schładzać na lodzie przez 2 minuty.
  2. Do podwielokrotności RNA dodać odczynniki wymienione poniżej w następującej kolejności: 600 μl H2O poddanych działaniu DEPC, wolnych od RNaz, 100 μl buforu biotynylacyjnego (100 mM Tris-HCl [pH 7,5] i 10 mM EDTA, w roztworze DEPC, H2Owolnym od RNaz) i 200 μl biotyny-HPDP z zapasu 1 mg/ml biotyny-HPDP w DMSO lub DMF.
    1. W niektórych sytuacjach roztwór biotyny-HPDP ma tendencję do wytrącania się, prawdopodobnie ze względu na jego niską rozpuszczalność w wodzie. W takiej sytuacji należy zwiększyć objętość DMSO/DMF do 40% objętości reakcji (do próbki RNA dodać 400 μl H2O poddanego działaniu DEPC, 100 μl buforu biotynylacyjnego i 400 μl biotyny-HPDP z zapasu 0,5 mg/ml).
  3. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej i chronić przed światłem przez 3 godziny, delikatnie mieszając.
  4. Po inkubacji dodać w przybliżeniu równą objętość chloroformu do probówek i energicznie wymieszać.
  5. Wirować próbkę w temperaturze 13 000 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C. Ten krok pozwala na usunięcie nadmiaru biotyny, która nie biotynylowała RNA. Alternatywnie wykonaj ten krok za pomocą rurek z blokadą fazową (ciężkich). W tym celu należy odwirowywać probówki z blokadą fazową przez 1 minutę przy 13 000 x g, dodać mieszaninę RNA i równą ilość chloroformu, energicznie wymieszać i odwirować w temperaturze 13 000 x g przez 5 minut, w temperaturze 4 °C.
  6. Ostrożnie przenieść górną fazę do nowych probówek o pojemności 2 ml.
  7. Dodać jedną dziesiątą objętości 5 M NaCl i wymieszać próbkę.
  8. Dodać równą objętość izopropanolu, dokładnie wymieszać próbkę i wirować w temperaturze 13 000 x g przez co najmniej 30 minut, w temperaturze 4 °C.
  9. Ostrożnie usuń supernatant i dodaj 1 ml lodowatego 75% etanolu.
  10. Wirować w temperaturze 13 000 x g przez 10 minut, w temperaturze 4 °C.
  11. Ostrożnie usuń sklarowany osad, szybko odkręć probówkę i usuń pozostały roztwór etanolu. Upewnij się, że osad RNA nie wysycha.
  12. Zawiesić RNA w 100 μl H2O poddanego działaniu DEPC, wolnego od RNaz.

5. Oczyszczanie nowo zsyntetyzowanej frakcji z całkowitego i nieznakowanego RNA za pomocą kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną

  1. Podgrzewać biotynylowane RNA przez 10 minut w temperaturze 65 °C, a następnie schładzać próbki na lodzie przez 5 minut.
  2. Dodać 100 μl kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną do biotynylowanego RNA (przy końcowej objętości 200 μl). W szczególności zaleca się stosowanie koralików wskazanych w Tabeli materiałów, ponieważ po rozmowach z innymi laboratoriami wydawały się one bardziej spójne i niezawodne.
  3. Inkubować próbkę, lekko wstrząsając przez 90 minut, w temperaturze pokojowej.
  4. Umieść kolumny dostarczone z zestawem (tabela materiałów) w stojaku magnetycznym.
  5. Dodać 900 μl buforu do mycia o temperaturze pokojowej (100 mM Tris-HCl [pH 7,5], 10 mM EDTA, 1 M NaCl i 0,1% Tween 20, w H2Opoddanym działaniu DEPC, wolnym od RNaz) do kolumn (wstępny przebieg i równowaga).
  6. Nanieść mieszaninę kulek/RNA (200 μl) na kolumny.
  7. Zbierz przepływ do probówek o pojemności 1,5 ml i nałóż go ponownie na tę samą kolumnę magnetyczną. Jeśli to konieczne, utrzymuj ten przepływ, ponieważ reprezentuje on nieznakowaną frakcję RNA.
  8. Przemyć kolumny 5x zwiększając objętości buforu płuczącego (600, 700, 800, 900 i 1 000 μL).
  9. Eluować nowo zsyntetyzowany RNA za pomocą 200 μl 0,1 M naziemnej telewizji cyfrowej.
  10. Wykonaj drugą elucję, 3 minuty później, z równą objętością 0,1 M DTT.
  11. Po wylucowaniu RNA dodać 0,1 objętości 3 M NaOAc (pH 5,2), 3 objętości lodowatego 100% etanolu i 2 μl 20 mg/ml glikogenu (klasy RNA) i pozostawić RNA na noc do wytrącenia się w temperaturze -20 °C.
  12. Odzyskać RNA przez odwirowanie (13 000 x g przez 10 minut, w temperaturze 4 °C) i ponownie zawiesić w 15 μl H20 poddanego działaniu DEPC. Oczekuje się, że proporcja znakowanego do całkowitego RNA wyniesie około 2% - 4% (zwykle bardziej w kierunku dolnego końca), co daje około 2,0 μg nowo zsyntetyzowanego RNA. Ilość ta wystarcza do przeprowadzenia kilku eksperymentów qPCR, a także do analiz mikromacierzowych/sekwencjonowania.

6. Walidacja różnych frakcji metodą RT-qPCR

  1. Zsyntetyzuj cDNA z 2 μg całkowitego RNA lub 10 μl znakowanego RNA za pomocą losowych heksamerów i wybranej odwrotnej transkryptazy, zgodnie z instrukcjami producenta (Tabela materiałów).
  2. Amplifikacja cDNA za pomocą qPCR w czasie rzeczywistym przy użyciu standardowego protokołu (tabela materiałów).
    UWAGA: Wszystkie próbki należy pobrać w trzech egzemplarzach z co najmniej dwóch kontrprób biologicznych. Skorygować wszystkie surowe wartości dla ekspresji tubuliny S. pombe.

7. Hybrydyzacja mikromacierzy

  1. Hybrydyzuj próbki RNA na preferowanych chipach mikromacierzy zgodnie z instrukcjami producenta (dla tego konkretnego protokołu, patrz Tabela materiałów). Krótko mówiąc, przygotuj biotynylowane cele cRNA ze 150 ng RNA za pomocą zestawu Premier RNA Amplification Kit (tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta. Hybrydyzować 4 mg rozdrobnionych cRNA przez 16 godzin w temperaturze 45 °C i 60 obr./min na chipach mikromacierzy.
  2. Umyj, wybarwić i zeskanuj wióry za pomocą wskazanej stacji i skanera (Tabela materiałów). Wyodrębnij surowe dane (pliki CEL Intensywność) z zeskanowanych obrazów za pomocą konsoli poleceń (AGCC, wersja 4.1.2).
  3. Dalsze przetwarzanie plików CEL za pomocą oprogramowania Expression Console w wersji 1.4.1 w celu obliczenia intensywności sygnału zestawu sondy, przy użyciu algorytmów opartych na statystyce MAS 5.0 z ustawieniami domyślnymi i globalnym skalowaniem jako metodą normalizacji.
    UWAGA: Przycięta średnia docelowa intensywność każdego żetonu została arbitralnie ustawiona na 100. Wszystkie doświadczenia należy przeprowadzić, stosując co najmniej dwie niezależne kontrpróby biologiczne. Znormalizuj surowe dane do sygnału S. pombe i oblicz zmiany fałdowania w całkowitych i nowo zsyntetyzowanych poziomach RNA.

8. Analiza danych przy użyciu istniejącego potoku R

  1. Obliczanie szybkości syntezy i rozpadu przy użyciu publicznie dostępnego pakietu potoku i R/Bioconductor, zgodnie z wcześniejszym opisem8,10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Podczas przeprowadzania znakowania metabolicznego nowo transkrybowanego RNA należy kontrolować kilka aspektów: czas i wydajność znakowania, proporcję dodanego standardu wewnętrznego (spike-in), protokół ekstrakcji oraz skuteczność biotinylacji (w tym stosunek sygnału do szumu) i inne. Warunki te zostały szeroko i metodycznie opisane w innych pracach7,10,11. W niniejszej pracy skupiamy się głównie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podczas gdy narzędzia obejmujące cały genom do analizy zmian w transkrypcji wciąż się poprawiają, sama analiza transkryptomu poprzez kwantyfikację poziomów RNA w stanie stacjonarnym może nie odzwierciedlać dokładnie zmian w aktywności polimerazy II RNA. Rzeczywiście, poziomy mRNA są regulowane nie tylko przez syntezę RNA, ale także przez ich dojrzewanie i degradację. Aby zmierzyć syntezę mRNA niesprzężoną z degradacji mRNA, w ostatnich latach opracowano odrębne protokoły analizy powstającej transkrypcji zarówno u drożdży...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Laszlo Torze za wsparcie oraz V. Fisherowi, K. Schumacherowi i F. El Saafinowi za ich dyskusje. T.B. był wspierany przez stypendium Marie Curie-ITN (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) oraz Fundację ARC. Prace te były wspierane przez fundusze z Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Badanie to było również wspierane przez ANR-10-LABX-0030-INRT, francuski fundusz państwowy zarządzany przez Agence Nationale de la Recherche w ramach programu ramowego Investissements d'Avenir ANR-10-IDEX-0002-02.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-tiouracylSigma-AldrichCat# 440736
RapamycinEuromedexCat# SYN-1185
Countess II FL Automatyczny licznik komórekThermoFisherN/A
Zestaw do oczyszczania RiboPure RNA, drożdżeThermoFisherCat# AM1926
Spektrofotometr NanoDrop 2000ThermoFisherND-2000
Zestaw TURBO bez DNAThermoFisherAM1907
EZ-Link HPDP BiotynaThermoFisherCat# 21341
TiolutynaAbcamab143556
µ Zestaw MACS StreptavidinMiltenyi BiotecCat# 130-074-101
Odwrotna transkryptaza transkryptora z transkryptoremRoche03 531 295 001
SYBR Green I MasterRoche4707516001
GeneChip Genome drożdży 2.0ThermoFisher900555
GeneChip Fluidics Station 450ThermoFisher00-0079
GeneChip Skaner 3000 7GThermoFisher00-0210

Bibliografia

  1. Gardini, A. Global Run-On Sequencing (GRO-Seq). Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).
  2. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
  3. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Native elongating transcript sequencing (NET-seq). Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 4 Unit 4 11-17 (2012).
  4. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).
  5. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
  6. Kenzelmann, M., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).
  7. Radle, B., et al. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195(2013).
  8. Schwalb, B., et al. Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA). Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).
  9. Sun, M., et al. Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels. Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).
  10. Sun, M., et al. Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation. Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).
  11. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458(2011).
  12. Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
  13. Eser, P., et al. Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome. Molecular Systems Biology. 12 (2), 857(2016).
  14. Baptista, T., et al. SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription. Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).
  15. Bonnet, J., et al. The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription. Genes & Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).
  16. Warfield, L., et al. Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID. Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).
  17. Huisinga, K. L., Pugh, B. F. A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).
  18. Lee, T. I., et al. Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription. Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).
  19. Lenstra, T. L., et al. The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast. Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).
  20. Plaschka, C., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex. Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).
  21. Helenius, K., et al. Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover. Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).
  22. Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization. Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).
  23. Haimovich, G., et al. Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis. Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).
  24. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
  25. Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq. RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).
  26. Shetty, A., et al. Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation. Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).
  27. Xu, Y., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex. Nature Communications. 8, 15741(2017).
  28. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).
  29. Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide. Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).
  30. Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses. PloS One. 8 (1), 53822(2013).
  31. Tani, H., et al. Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability. RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).
  32. Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
  33. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  34. Palozola, K. C., et al. Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit. Science. 358 (6359), 119-122 (2017).
  35. Ardehali, M. B., et al. Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription. Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).
  36. Schulz, D., et al. Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis. Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).
  37. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282(2015).
  38. Duffy, E. E., et al. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
  39. Rutkowski, A. J., Dolken, L. High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine. Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).
  40. Darzacq, X., et al. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).
  41. Fuchs, G., et al. Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq. Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).
  42. Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).
  43. Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Synteza mRNASchizosaccharomyces pombeekstrakcja RNAbiotynilacjakulki streptawidynoweRT qPCR
Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Znakowanie metaboliczne za pomocą 4-tiouracylu i kwantyfikacja nowo zsyntetyzowanego mRNA jako wskaźnika aktywności polimerazy II RNA
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.