Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Modelowanie choroby Charcota-Marie-Tootha in vitro poprzez transfekcję pierwotnych neuronów ruchowych myszy

6.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57988

⸱

7 stycznia 2019

 ,  , 
1Institut NeuroMyoGène, CNRS UMR5310, INSERM U1217, Université Lyon, 2Unité Fonctionnelle de Neurogénétique Moléculaire, Hospices Civils de Lyon, 3Centre de Biotechnologie Cellulaire, Hospices Civils de Lyon

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tej techniki jest przygotowanie wysoce wzbogaconej kultury pierwotnych neuronów ruchowych (MN) z mysiego rdzenia kręgowego. Aby ocenić konsekwencje mutacji powodujących choroby MN, opisujemy tutaj izolację tych izolowanych MN i ich transfekcję przez magnetofekcję.

Streszczenie

Neurodegeneracja rdzeniowych neuronów ruchowych (MN) jest związana z szerokim spektrum zaburzeń neurologicznych, w tym stwardnieniem zanikowym bocznym, chorobą Charcota-Marie-Tootha i rdzeniowym zanikiem mięśni, które są związane z atrofią mięśni. Pierwotne hodowle rdzeniowych MN były szeroko stosowane w celu wykazania udziału określonych genów w takich chorobach i scharakteryzowania komórkowych konsekwencji ich mutacji. Protokół ten modeluje pierwotną kulturę MN wywodzącą się z przełomowych prac Hendersona i współpracowników sprzed ponad dwudziestu lat. Po pierwsze, szczegółowo opisujemy metodę wycinania przednich rogów rdzenia kręgowego z zarodka myszy i izolowania MN od sąsiednich komórek za pomocą gradientu gęstości. Następnie prezentujemy nowy sposób efektywnej transfekcji MN plazmidami ekspresyjnymi za pomocą magnetofekcji. Na koniec ilustrujemy, jak naprawić i immunobarwić pierwotne MN. Wykorzystując mutacje neurofilamentów, które powodują chorobę Charcota-Marie-Tootha typu 2, protokół ten demonstruje jakościowe podejście do ekspresji białek będących przedmiotem zainteresowania i badania ich udziału we wzroście, utrzymaniu i przeżyciu MN.

Wprowadzenie

Choroby nerwowo-mięśniowe obejmują różne klinicznie i genetycznie odrębne patologie, które charakteryzują się zmianami w mięśniach i/lub układzie nerwowym. Dzięki postępowi w technologiach sekwencjonowania, w ciągu ostatniej dekady zidentyfikowano setki genów odpowiedzialnych za te rzadkie zaburzenia (lista dostępna w Centrum Chorób Nerwowo-Mięśniowych, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). Różnorodność zidentyfikowanych mutacji wskazuje, że różne mutacje w pojedynczym genie mogą powodować różne fenotypy i choroby1,2,3 oraz że mutacje w różnych genach mogą powodować podobne fenotypy4,5. W tym kontekście podejmowane są wysiłki na rzecz opracowania modeli komórkowych, które mogą stać się potężnymi narzędziami do analizy konsekwencji mutacji i mechanizmów patologicznych.

Rdzeniowe MN mają duże somy zlokalizowane w brzusznych rogach rdzenia kręgowego, tworzą długie aksony do docelowych włókien mięśni szkieletowych i pozwalają na dobrowolne ruchy poprzez uwalnianie acetylocholiny w połączeniach nerwowo-mięśniowych. Ponieważ MN są dotknięte chorobami nerwowo-mięśniowymi, takimi jak stwardnienie zanikowe boczne, choroba Charcota-Marie-Tootha (CMT) i rdzeniowy zanik mięśni, dr Henderson i współpracownicy opracowali pierwszy protokół6, który pozwolił na hodowlę rdzeniowych MN in vitro i odkrycie czynnika neurotroficznego GDNF7 (czynnik neurotroficzny pochodzenia glejowego). Udoskonalenia techniczne od tego czasu pozwoliły na dokładniejsze oczyszczanie rdzeniowych MN i ich podtypów przy użyciu FACS8, ale wzbogacanie przez gradient gęstości pozostaje potężne i szeroko stosowane w laboratoriach obecnie pracujących z pierwotnymi rdzeniowymi MNs9,10,11,12,13,14. Następnie możliwe jest również uzyskanie wyższego stopnia oczyszczenia MN poprzez immunopanning, wykorzystując marker powierzchniowy p75(NTR) 15,16,17.

Rdzeń kręgowy zawiera różne podtypy MN szyjnych, piersiowych i lędźwiowych, a także środkowe i boczne kolumny motoryczne, które różnią się między sobą położeniem w rogu przednim na osi grzbietowo-brzusznej oraz między celami, które unerwiają8,18. Pierwotne kultury MN mogą odzyskać wszystkie te podtypy MN w proporcjach fizjologicznych. Głównym ograniczeniem tej techniki jest niewielka liczba MN uzyskanych pod koniec zabiegu; w rzeczywistości można oczekiwać, że uzyska około 105 MN z sześciu zarodków, co nadaje się do mikroskopii, ale ogranicza do eksperymentów biochemicznych. Aby przeprowadzić eksperymenty z bardziej wystandaryzowanymi podtypami i licznymi MN (>106 komórek), należy rozważyć MN pochodzące z embrionalnych komórek macierzystych18.

Transfekcja dzikich transgenów lub endogennych genów typu dzikiego do pierwotnych MN jest szybkim i pomocnym narzędziem do rozszyfrowywania ścieżek fizjopatologicznych, zwłaszcza gdy modele myszy są niedostępne. Magnetofekcja jest jedną z technik transfekcji neuronów pierwotnych, podobną do lipofekcji bez związanej z nią neurotoksyczności. Co więcej, transfekcja może być wykonana na dojrzałych neuronach po kilku dniach in vitro, w przeciwieństwie do technik opartych na elektroporacji9. Jednak jedną z wad tej techniki jest to, że kulki wiążą kwasy nukleinowe w kulturze, powodując szum podczas etykietowania DAPI. Infekcja wirusowa jest prawdopodobnie najskuteczniejszą techniką transfekcji MN; Jednak magnetofekcja nie wymaga pewnych procedur bezpieczeństwa potrzebnych do produkcji wirusa i infekcji komórkowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zaakceptowane przez komisję etyki instytucji.

1. Przygotowanie roztworu

  1. Przygotować 10 ml 4% BSA dializowanego w pożywce L-15.
    1. Rozpuścić sproszkowaną albuminę surowicy bydlęcej w stężeniu 4% (w/v) w 10 ml pożywki L-15.
    2. Dodać roztwór do kasety dializacyjnej o pojemności 20 ml z wartością odcięcia 20 kDa. Dializować z 500 ml pożywki L-15 przez 3 dni pod mieszaniem w temperaturze 4 °C. Zmieniaj pożywkę L-15 codziennie.
    3. Przefiltrować roztwór przez membranę 0,22 μm i podwielokrotność w probówkach o pojemności 15 ml. Przechowywać probówki w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: W tym protokole stosuje się następujące odniesienia: niemodyfikowane surowe podłoże L-15 = pożywka L-15, kwaśne podłoże L-15 = pH L-15 i podłoże zasadowe L-15 = wodorowęglan L-15.
  2. Przygotuj 200 ml pH L-15.
    1. Dostosuj pH pożywki L-15: Najpierw napełnij butelkę do mycia kilkoma kawałkami suchego lodu. Wstrzyknąć gaz (CO2) do pożywki L-15, aż kolor zmieni kolor na pomarańczowy (~pH 6,4 i ciśnienie ~40). pH można również regulować za pomocą standardowego pH-metru.
    2. Przefiltrować pożywkę przez membranę 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez jeden miesiąc.
  3. Przygotuj 100 ml wodorowęglanu L-15.
    1. Dodać 2,5 ml 7% wodorowęglanu sodu do 97,5 ml pożywki L-15 i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotuj suplementy IPCS (Insulina Putrescin Conalbumin Selenite).
    1. Rozpuścić 2,5 mg insuliny w 0,5 ml 0,1 M HCl. Dodać 4,5 ml podwójnie destylowanej wody.
    2. Rozpuścić 8 mg putrescyny w 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    3. Rozpuścić 100 mg konalbuminy w 10 ml PBS.
    4. Rozpuścić 1 mg seleninu sodu w 19,3 ml wody, dostosować pH do 7,4 i rozcieńczyć roztwór 10-krotnie.
    5. Połączyć 1 ml roztworu insuliny, 1 ml roztworu putrescyny, 1 ml konalbuminy i 0,1 ml roztworu seleninu sodu, aby uzyskać 3,1 ml roztworu suplementu IPCS. Przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.
  5. Przygotuj roztwór progesteronu o stężeniu 0,02 mM.
    1. Rozpuść 1 mg progesteronu w 1,6 ml 80% etanolu.
    2. Rozcieńczyć roztwór 100-krotnie w 100% etanolu i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  6. Przygotować 100 ml kompletnej pożywki L-15.
    1. Dodać 1,8 ml roztworu D-glukozy (200 mg/ml) do 92 ml pH L-15, aby uzyskać końcowe stężenie 3,5 mg/ml glukozy.
    2. Połącz 1 ml 100x penicylina-streptomycyna (10 000 U/ml), 2 ml inaktywowanej termicznie surowicy końskiej, 3,1 ml mieszanki IPCS i 0,1 ml roztworu progesteronu (2 x 10-5 M).
    3. Przefiltrować pożywkę na membranie 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  7. Przygotować 5 ml roztworu gradientu gęstości (końcowe stężenie 5,5%) na eksperyment.
    1. Dodać 476 μl komercyjnej pożywki o gradionym gradiencie gęstości 60% do 4524 μl L-15 (jeśli to możliwe, bez czerwonego fenolu w celu zwiększenia kontrastu wizualnego na interfazie; stosunek rozcieńczenia 1:10,5).
    2. Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C przez 2 tygodnie lub zamrozić w temperaturze -20 °C.
  8. Przygotować 10 ml pożywki hodowlanej.
    1. Dodaj 200 μl pożywki uzupełniającej do 9,6 ml pożywki do hodowli komórek neuronalnych.
    2. Dodaj 200 μl inaktywowanej termicznie surowicy końskiej (która ma tendencję do różnicowania prekursorów komórek glejowych i przeciwdziała proliferacji) do 25 μl glutaminy i 10 μl 2-merkaptoetanolu.
    3. Przefiltruj media przez filtr 0,22 μm.
    4. Dodać następujące czynniki neurotroficzne: rzęskowy czynnik neurotroficzny (CNTF) w końcowym stężeniu 10 ng/ml oraz neurotroficzny czynnik pochodzenia mózgowego (BDNF) i neurotroficzny czynnik pochodzenia glejowego (GDNF) w końcowych stężeniach 1 ng/ml.
    5. Przechowuj nośnik w temperaturze 4 °C.
  9. Przygotuj 50 ml pożywki preparucyjnej.
    1. Dodaj 2,25 ml glukozy (200 mg/ml) do 47,05 ml HBSS. Dodać 700 μl 1 M HEPES, o pH 7,4. Przechowuj nośnik w temperaturze 4 °C.
  10. Przygotuj 4% roztwór PFA.
    1. Rozpuścić 20 g PFA w 500 ml PBS.
    2. Pod kapturem chemicznym podgrzać roztwór do temperatury 60 °C i dodawać kilka kropli 1 M NaOH, aż roztwór stanie się klarowny.
    3. Przefiltrować roztwór przez bibułę filtracyjną i dostosować pH do 7,2. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Alternatywnie można użyć innych komercyjnych roztworów PFA i rozcieńczyć je do 4% w PBS.
  11. Przed użyciem wyczyść narzędzia do preparowania, w tym kleszcze, nożyczki i naczynia silikonowe, 70% etanolem, a po użyciu mydłem i czystą wodą.

2. Powłoka naczynia z poliornityny/laminy (Po/L)

UWAGA: Objętości są dostosowane do pokrycia płytki 24-dołkowej.

  1. W razie potrzeby umieść w studzience sterylne szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm.
  2. Pokryj studzienki 500 μl 10 μg/ml roztworu poli-L-ornityny rozpuszczonego w wodzie.
  3. Pozwól studzienkom osiąść w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  4. Usuń roztwór poli-L-ornityny i susz na powietrzu przez 30 minut.
  5. Studzienki pokryć na noc w temperaturze 37 °C 500 μl lamininy o stężeniu 3 μg/ml w wodorowęglanie L-15,
    UWAGA: Studzienki można przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 7 dni. W przypadku długich inkubacji dodanie sterylnego PBS między studzienkami może pomóc w uniknięciu parowania pożywki.

3. Sekcja

  1. Złożyć w ofierze ciężarną mysz, gdy zarodki są w stadium embrionalnym E12.5. Oczyść brzuch 70% etanolem.
  2. Usuń macicę, przecinając dwa jajowody i pochwę i umieść ją na szalce Petriego wypełnionej zimnym PBS (bez Ca2 + Mg2 +).
  3. Zebrać wszystkie zarodki i przenieść je do świeżego, zimnego PBS (bez Ca2 + Mg2 +) na szalce Petriego.
  4. Umieść jeden zarodek w naczyniu pokrytym silikonem i wypełnionym pożywką separacyjną (z HBSS, 4,5 g/L glukozy i 7 mM HEPES pH 7,4).
    UWAGA: Sekcja zarodków odbywa się pod mikroskopem przy użyciu czystych, cienkich kleszczy i nożyczek. Alternatywnie do preparacji można użyć zwykłej szalki Petriego bez silikonu.
  5. Usuń głowę, ogon i wnętrzności, używając kleszczy jako nożyczek.
  6. Trzymaj zarodek brzuchem przy silikonie za pomocą kleszczy.
  7. Za pomocą drugiej pary kleszczy włóż jedną z końcówek do centralnego kanału rostralnego rdzenia kręgowego.
  8. Zamknij kleszcze, aby rozerwać tkankę grzbietową na kilka milimetrów.
  9. Powtarzaj tę operację w kierunku strony ogonowej, aż cały rdzeń kręgowy zostanie otwarty (Rysunek 1B).
  10. Odłącz rostralną część rdzenia kręgowego (tułów mózgowy) od ciała.
  11. Obróć zarodek, aby utrzymać otwarty rdzeń kręgowy przy silikonie.
  12. Ściśnij rostralną część rdzenia kręgowego i pociągnij zarodek za głowę, aby usunąć rdzeń kręgowy.
    UWAGA: Opony mózgowe i zwoje korzenia grzbietowego (DRG) powinny pozostać przyczepione do zarodka. W przeciwnym razie ostrożnie odciągnij wszelkie pozostałe opony mózgowe i DRG nadal przyczepione do rdzenia kręgowego. Na tym etapie można również pobrać DRG do hodowli wrażliwych neuronów (patrz Dyskusja).
  13. Spłaszcz rdzeń kręgowy na silikonie i usuń grzbietową połowę rdzenia, przecinając wzdłuż środka każdej strony za pomocą skalpela. Pokrój środkową część na 10 kawałków za pomocą skalpela i przenieś kawałki do nowej tuby.

4. Zawieszenie komórek rdzenia kręgowego

  1. Powtórz tę procedurę preparowania dla 6 do 8 rdzeni kręgowych.
  2. Pozwól, aby kawałki rdzenia kręgowego zebrały się na dnie rurki i zastąp HBSS 1 ml pożywki Ham-F10.
  3. Dodać 10 μl trypsyny (2,5% w/v; stężenie końcowe 0,025%). Inkubować probówkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Aby zatrzymać trawienie enzymatyczne, należy przenieść fragmenty do nowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 800 μl kompletnej pożywki L-15, 100 μl 4% (w/v) BSA i 100 μl DNazy (1 mg/ml w pożywce L-15).
  5. Przeprowadzić dwukrotne rozcieranie, odsysając 1 ml za pomocą pipety P1000. Pozwól fragmentom osiąść na 2 minuty. Zebrać supernatant do świeżej probówki o pojemności 15 ml.
  6. Do fragmentów dodać 900 μl kompletnej pożywki L-15, 100 μl 4% (w/v) BSA i 100 μl DNazy (1 mg/ml w pożywce L-15).
  7. Rozcierać 6 razy, odsysając 1 ml za pomocą pipety P1000. Pozwól fragmentom osiąść na 2 minuty. Dodać supernatant do probówki o pojemności 15 ml otrzymanej w kroku 4.5.
  8. Do fragmentów dodać 900 μl kompletnej pożywki L-15, 100 μl 4% (w/v) BSA i 100 μl DNazy (1 mg/ml w pożywce L-15).
  9. Rozcierać 10 razy, odsysając 1 ml za pomocą pipety P1000. Pozwól fragmentom osiąść na 2 minuty. Dodać supernatant do probówki o pojemności 15 ml otrzymanej w kroku 4.5. Postępuj z supernatantem.
  10. Używając pipety P1000, delikatnie umieść poduszkę 2 ml BSA 4% (w/v) na dnie probówki z supernatantem. Wirować przy 470 x g przez 5 min.
  11. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy z 2 ml kompletnej pożywki L-15.

5. Wzbogacenie MN przez gęstość gradientu

  1. Podziel zawiesinę komórek na dwie probówki o pojemności 15 ml (każda po 1 ml). Następnie dodaj 2 ml kompletnej pożywki L-15. Jeśli zaczynasz od 6 zarodków, użyj odpowiednika 3 zarodków w probówce w 3 ml pożywki.
  2. Dodać 2 ml roztworu gradientu gęstości, powoli dodając roztwór na dno każdej probówki, aby uzyskać ostrą granicę fazy.
  3. Wirować przy 830 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po tym kroku małe komórki powinny znajdować się na dnie probówki, podczas gdy duże komórki, takie jak MN, powinny znajdować się na granicy faz roztworu gradientu gęstości / medium.
  4. Zebrać komórki na granicy faz, zasysając 1 lub 2 ml i przenieść je do świeżej probówki o pojemności 15 ml. Dostosuj objętość do 10 ml za pomocą pożywki o pH L-15.
  5. Dodać 2 ml 4% poduszki BSA na dno probówki i odwirować przy 470 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml kompletnej pożywki L-15.
  7. Powtórz krok 5.5.
  8. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml kompletnej pożywki hodowlanej. Policz liczbę komórek i ich żywotność pod mikroskopem z kontrastem fazowym za pomocą hemocytometru.
    UWAGA: W przypadku 6 rdzeni kręgowych oczekuje się, że liczba komórek wyniesie około 1 x 105 MN.

6. Kultura MN

  1. Rozcieńczyć MN do odpowiedniej gęstości, zwykle od 5 000 do 10 000 komórek w 500 μl pożywki hodowlanej na basenie na płytce 24-dołkowej.
    UWAGA: Gęstość wysiewu wynosi około 30 000 i 1 500 komórek odpowiednio dla płytek 6- i 96-dołkowych.
  2. Usuń roztwór lamininy za pomocą P1000.
  3. Natychmiast przenieść MN rozcieńczone w pożywce hodowlanej na płytki powlekające, aby uniknąć wysuszenia.
  4. Inkubować kulturę przez 2 dni w temperaturze 37 °C.

7. Magnetofekcja MN

UWAGA: W poniższych krokach, użyte ilości są przeznaczone do transfekcji jednego dołka z płytki 24-dołkowej. Zapoznaj się z protokołem producenta, aby uzyskać inny format.

  1. W celu przygotowania DNA należy ponownie zawiesić 1 μg DNA w 50 μl pożywki do hodowli neuronów i wirować przez 5 sekund.
  2. W celu przygotowania rurki perełkowej należy ponownie zawiesić 1,5 μl kulek w 50 μl pożywki do hodowli neuronów.
  3. Dodać 50 μl roztworu kulek do 50 μl roztworu DNA i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (całkowita objętość = 100 μl).
  4. Podczas tej inkubacji należy pobrać 100 μl pożywki hodowlanej z dołka, który będzie transfekowany.
    UWAGA: Umieść płytkę magnetyczną w inkubatorze, aby ogrzać ją do 37 °C.
  5. Przenieść 100 μl mieszaniny DNA/kulek do studzienki i inkubować płytkę przez 20–30 minut na płytce magnetycznej w temperaturze 37 °C.
  6. Odczekaj co najmniej 24 godziny przed wykryciem ekspresji cDNA.

8. Utrwalanie i barwienie

  1. Umyj kulturę 2 razy za pomocą PBS.
  2. Inkubować kulturę przez 20 minut w temperaturze pokojowej w 4% PFA/PBS.
  3. Umyj kulturę 2 razy za pomocą PBS.
  4. Inkubować kulturę w 500 μl buforu blokującego (PBS, 4% BSA, 2% normalna surowica, 0,3% Triton X-100, 0,1 M glicyny) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Normalna surowica powinna pochodzić z tego samego gatunku, co przeciwciało drugorzędowe (np. Normalna surowica kozia).
  5. Inkubować kulturę przez noc w temperaturze 4 °C z pierwszorzędowym przeciwciałem rozcieńczonym w 250 μl buforu blokującego.
    UWAGA: Na przykład TUJ1 jest używany przy 1/1000, SMI32 jest używany przy 1/1 000, a Lc3b jest używany przy 1/200.
  6. Umyj kulturę 3 razy za pomocą PBS.
  7. Inkubować kulturę z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem rozcieńczonymi w 250 μl buforu blokującego przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  8. Umyj kulturę 3 razy za pomocą PBS.
  9. Montaż na szkiełkach szkiełkowych za pomocą medium montażowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Po 24 godzinach hodowli motoneurony (MNs) powinny wykazywać już znaczny wzrost aksonów (przynajmniej 6-krotnie dłuższych niż rozmiar somy). W kolejnych dniach aksony powinny nadal rosnąć i tworzyć rozgałęzienia (Rysunek 2). Wystąpią różne morfologie ze względu na specyfikę podtypów. Na przykład motoneurony kolumny przyśrodkowej, które unerwiają mięśnie osiowe, mają krótsze i bardziej rozgałęzione aksony niż motoneurony bocznej kolumny ruchowej, które unerwiaj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jednym z krytycznych punktów tego protokołu jest to, że zarodki myszy są preparowane w precyzyjnym oknie czasowym podczas rozwoju (E12.5) w celu optymalizacji ilości MN uzyskanych na końcu. Ponadto, aby uzyskać optymalną wydajność, rozwarstwienie należy wykonywać rano lub wczesnym popołudniem. Przed E12,5 (np. przy E11,5) rozwarstwienie jest trudne, zwłaszcza jeśli chodzi o eliminację opon mózgowych. Po E12,5 liczba uzyskiwanych MN znacznie spada. Aby kontrolować etap rozwoju zarodka, dorosłe samice i samce są n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować "Association pour le développement de la neurogénétique" za stypendium dr Jacquier oraz AFM-Telethon za wsparcie poprzez plan strategiczny MyoNeurAlp. Chcielibyśmy również podziękować dr Chrisowi Hendersonowi, dr Williamowi Camu, dr Brigitte Pettmann, dr Cedricowi Raoulowi i dr Georgowi Haase, którzy uczestniczyli w opracowywaniu i doskonaleniu techniki oraz szerzyli swoją wiedzę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiał
Silikonowa miska preparcyjnaOprzyrządowanie systemów żywychDD-90-S-BLK-3PK
Szkiełko nakrywkowe okrągłeNeuVitro, Szkło KnittelGG-12-Pre12 mm
Kasety Slide a LyzerThermoFisher Scientific6603020 000 MWCO ; 30 mL
Jednostka filtrującaMillipore
Płytka 4-dołkowaMilliporeSLGP033RS
FST firmy Dumont11252-20
NożyczkiFST firmy Dumont14060-10cienkie nożyczki
10035-20zakrzywionym ostrzem
FST firmy Dumont10316-14skalpel z mikronożem
szalka PetriegoGreiner663102ø x h = 100 x 15 mm
Rurka polipropylenowa 15 ml
Watman1001125, szkiełko komorowe o średnicy 125 mm
Lab-Tek1545264 komory
Plazmid pCAGENAddgene#11160
NazwaFirmaNumer katalogowy>Uwagi
Roztwory i podłoża
Albuminasurowicy bydlęcejSigma-AldrichA9418
L-15 mediumThermoFisher Scientific11415056
L-15 medium, bez czerwonego fenoluThermoFisher Scientific21083027
InsulinaSigma-AldrichI6634
PutrescynaSigma-AldrichP5780
ConalbuminaSigma-AldrichC7786
Selenin soduSigma-AldrichS5261
ProgesteronSigma-AldrichP8783
Poli-DL-OrnitynaSigma-AldrichP8638
LamininSigma-AldrichL2020
trypsyna 2,5%, 10xThermoFisher Scientific15090046
DNAseSigma-AldrichDN25
PBS bez Ca MgThermoFisher Scientific14190144bez Mg2+ Ca2+
sodu ThermoFisherScientific25080094
Pożywka do hodowli komórek neuronówThermoFisher ScientificA3582901Neurobasal Plus podłoże
HBSSSigma-AldrichH6648-500ML
HEPES bufor 1 MThermoFisher Scientific15630056
Pożywka o gradiantach gęstościSigma-AldrichD1556Optiprep
pożywkasuplementowa ThermoFisher ScientificA3582801B-27 Plus
Surowica dla koni inaktywowana termicznieThermoFisher Scientific26050-088
L-Glutamina 200 mMThermoFisher Scientific25030024
2-merkaptoetanolThermoFisher Scientific31350010
penicylina/streptomycynaThermoFisher Scientific1514012210 000 U/ml
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
>Immuno fluorescencja
PBS, 10xThermoFisher ScientificX0515bez Mg2+ Ca2+
Paraformaldehyd (PFA)Sigma-Aldrich441244
normalna surowica koziaSigma-AldrichG6767
glicynaSigma-AldrichG7126
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Acetylotransferaza choliny (CHAT)ChemiconAb144P
Neurofilament H niefosforylowany (SMI32)BiolegendsSMI-32PIF przy 1/1000
Wysepka-1DSHB40.2D6
Wysepka-2DSHB39.4D5
HB9DSHB81.5C10
Podłoże montażowe VectashieldTubulina Vector LabH-1000
Beta3 (klon Tuj1)Biolegends801201IF przy 1/1000
Lc3bTechnologia sygnalizacji komórkowej#2775IF przy 1/200
Sylgard Sterylne filtry strzykawkowe SCGVU02RE GP ThermoFisher Scientific 167063 Kleszczyki płytkowe z powłoką Delta#5 do kleszczyków skalpel FST firmy Dumont skalpel z Bibuła filtracyjna Falcon 352096 koło

Bibliografia

  1. Gonzalez, M. A., et al. A novel mutation in VCP causes Charcot-Marie-Tooth Type 2 disease. Brain. 137 (11), 2897-2902 (2014).
  2. Johnson, J. O., et al. Exome sequencing reveals VCP mutations as a cause of familial ALS. Neuron. 68 (5), 857-864 (2010).
  3. Watts, G. D. J., et al. Inclusion body myopathy associated with Paget disease of bone and frontotemporal dementia is caused by mutant valosin-containing protein. Nature Genetics. 36 (4), 377-381 (2004).
  4. Brown, R. H., Al-Chalabi, A. Amyotrophic Lateral Sclerosis. New England Journal of Medicine. 377 (2), 162-172 (2017).
  5. Taylor, J. P., Brown, R. H., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
  6. Henderson, C. E., Bloch-Gallego, E., Camu, W. Purified embryonic motoneurons. Nerve Cell Culture: A Practical Approach. , 69-81 (1995).
  7. Henderson, C. E., et al. GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science. 266 (5187), 1062-1064 (1994).
  8. Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (12), E2486-E2493 (2017).
  9. Jacquier, A., et al. Alsin/Rac1 signaling controls survival and growth of spinal motoneurons. Annals of Neurology. 60 (1), 105-117 (2006).
  10. Raoul, C., et al. Chronic activation in presymptomatic amyotrophic lateral sclerosis (ALS) mice of a feedback loop involving Fas, Daxx, and FasL. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (15), 6007-6012 (2006).
  11. Madji Hounoum, B., et al. Wildtype motoneurons, ALS-Linked SOD1 mutation and glutamate profoundly modify astrocyte metabolism and lactate shuttling. Glia. 65 (4), 592-605 (2017).
  12. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial Dynamics and Bioenergetic Dysfunction Is Associated with Synaptic Alterations in Mutant SOD1 Motor Neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  13. Jacquier, A., et al. Cryptic amyloidogenic elements in mutant NEFH causing Charcot-Marie-Tooth 2 trigger aggresome formation and neuronal death. Acta Neuropathologica Communications. 5, (2017).
  14. Aebischer, J., et al. IFNγ triggers a LIGHT-dependent selective death of motoneurons contributing to the non-cell-autonomous effects of mutant SOD1. Cell Death and Differentiation. 18 (5), 754-768 (2011).
  15. Wiese, S., et al. Isolation and enrichment of embryonic mouse motoneurons from the lumbar spinal cord of individual mouse embryos. Nature Protocols. 5 (1), 31-38 (2010).
  16. Camu, W., Henderson, C. E. Purification of embryonic rat motoneurons by panning on a monoclonal antibody to the low-affinity NGF receptor. Journal of Neuroscience Methods. 44 (1), 59-70 (1992).
  17. Conrad, R., Jablonka, S., Sczepan, T., Sendtner, M., Wiese, S., Klausmeyer, A. Lectin-based Isolation and Culture of Mouse Embryonic Motoneurons. Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
  18. Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110 (3), 385-397 (2002).
  19. Francius, C., Clotman, F. Generating spinal motor neuron diversity: a long quest for neuronal identity. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (5), 813-829 (2014).
  20. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  21. Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (1), 16-22 (2004).
  22. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, (2016).
  23. Yu, L., et al. Highly efficient method for gene delivery into mouse dorsal root ganglia neurons. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8 (2), (2015).
  24. Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kultura neuron w ruchowychsekcja rdzenia kr gowegowirowanie w gradiencie g sto citransfekcja metod magnetofekcjiwzbogacanie pierwotnych neuron w ruchowychimmunohistochemia neurofilament wanaliza z u yciem mikroskopii konfokalnejmodelowanie choroby Charcota Marie Toothaocena transportu aksonalnegomechanizmy neurodegeneracji
Modelowanie choroby Charcota-Marie-Tootha in vitro poprzez transfekcję pierwotnych neuronów ruchowych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.