Opracowaliśmy prosty i wszechstronny system do karmienia królików laboratoryjnych twardymi kleszczami. Nasz niepracochłonny protokół wykorzystuje łatwo dostępne materiały i może być dostosowywany w zależności od wymagań różnych ustawień eksperymentalnych. Metoda ta pozwala na komfortowe monitorowanie i/lub pobieranie próbek kleszczy przez cały okres karmienia.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wszechstronny model inwazji kleszczy twardych na królikach laboratoryjnych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wykorzystanie żywych zwierząt w badaniach nad kleszczami jest kluczowe dla różnych celów eksperymentalnych, w tym dla utrzymania kolonii kleszczy twardych w laboratorium. U kleszczy wszystkie etapy rozwojowe (z wyjątkiem jaja) są hematofagiczne, a uzyskanie mączki z krwi po przyczepieniu do kręgowców gospodarzy jest niezbędne do pomyślnego zakończenia ich cyklu życiowego. Tutaj pokazujemy prostą metodę, która wykorzystuje łatwo otwierane kapsułki do karmienia twardych kleszczy na królikach. Do zalet proponowanej metody należy jej prostota, krótki czas trwania, a przede wszystkim wszechstronne dostosowanie do potrzeb konkretnych wymagań doświadczalnych. Metoda ta umożliwia użycie wielu komór (o różnych rozmiarach) na tym samym zwierzęciu, co pozwala na karmienie wielu etapów lub różnych grup doświadczalnych przy jednoczesnym zmniejszeniu ogólnego zapotrzebowania zwierzęcia. Zastosowane niedrażniące i łatwo dostępne materiały minimalizują dyskomfort zwierząt, które można łatwo odzyskać z eksperymentu i zaoferować do adopcji lub ponownie wykorzystać, jeśli pozwala na to protokół etyczny.
Wprowadzenie
Kleszcze twarde (Ixodidae) są dobrze znane jako wolno żerujące stawonogi i mogą być przyczepione do żywiciela na kilka dni lub tygodni, w zależności od gatunku i etapu rozwoju1. Te obowiązkowe stawonogi hematofagiczne są wektorami szerokiej gamy czynników zakaźnych, takich jak bakterie, pierwotniaki i wirusy, a zatem stanowią znaczne zagrożenie dla zdrowia ludzi i zwierząt1. Podczas badania biologii kleszczy lub oceny nowych metod kontroli, ustanowienie skutecznego systemu żywienia kleszczy ma kluczowe znaczenie dla skutecznego zaprojektowania eksperymentów i osiągnięcia celu (celów) badania. Ostatnio opracowano kilka systemów sztucznego karmienia kleszczy (unikających wykorzystywania żywych zwierząt)2,3,4 i powinny być używane, gdy tylko jest to możliwe. Jednak systemy te nie były w stanie całkowicie zastąpić żywienia się kleszczy na żywych zwierzętach i nie są odpowiednimi substytutami wielu warunków fizjologicznych wymaganych do badań naukowych. W związku z tym w niektórych przypadkach wykorzystanie żywicieli będących zwierzętami doświadczalnymi ma zasadnicze znaczenie dla zagwarantowania przydatności wyników doświadczalnych.
Laboratoryjne króliki nowozelandzkie okazały się najbardziej odpowiednimi i dostępnymi żywicielami dla kilku gatunków kleszczy ixodid5,6,7,8,9. Często stosowane były dwie popularne strategie żerowania kleszczy na królikach: a) karmienie uszu królika pokrytych bawełnianą tkaniną lub skarpetkami6,7, oraz b) karmienie w bawełnianych torbach9, nylonowe butelki10 lub komory neoprenowe11 przyklejone do grzbietu królika. Żerowanie na uszach królika nie jest eleganckim systemem, ponieważ kleszcze (zwłaszcza we wczesnych stadiach, larwy lub nimfy) mogą pełzać i przyczepiać się głęboko w przewodzie słuchowym, co jest niewygodne dla zwierzęcia i utrudnia monitorowanie żerowania kleszczy i/lub powrót do zdrowia nabrzmiałych kleszczy. System ten jest również ograniczony tylko do dwóch grup kleszczy na uszach całkowicie zakrytych skarpetkami chronionymi przez obroże elżbietańskie, co stanowi znaczny dyskomfort dla zwierzęcia. Inne systemy9,10,11 są zdecydowanie bardziej zaawansowane i dobrze nadają się do utrzymania kolonii kleszczy. Są one jednak ograniczone pod względem liczby grup doświadczalnych umieszczanych na króliku, a także modyfikowalnych rozmiarów/kształtów komór do karmienia. Ponadto protokoły te często wymagają kuśtykania tylnych nóg królika, aby uniknąć drapania i używania obroży elżbietańskich, aby zapobiec pielęgnacji.
Tutaj proponujemy prostą, niepracochłonną i bardzo skuteczną metodę karmienia wielu grup twardych kleszczy w zamkniętych komorach przyklejonych do grzbietu królika przykrytego kurtką, eliminując potrzebę noszenia elżbietańskich obroży lub kuśtykania podczas eksperymentu. W szczególności nasz system wykorzystuje elastyczne kapsułki wykonane z arkusza pianki etylenowo-winylo-octanu (EVA) pokrytego moskitierą i przyklejonego do ogolonego grzbietu królika za pomocą szybko krzepnącego (3 min) niedrażniącego kleju lateksowego. Technika ta pozwala na dołączenie wielu kapsułek o pożądanym rozmiarze lub kształcie, a kilka tygodni po eksperymencie króliki są w pełni wyleczone. System nadaje się głównie do stadiów nimfalnych i dorosłych kleszczy twardych, ale po niewielkiej modyfikacji może być również stosowany do żerowania larw. Metody żywienia kleszczy twardych oparte na piance EVA mogą być dostosowane do innych typów żywicieli kręgowców, na przykład owiec (co przedstawiono jako jedną z alternatyw w tym artykule).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
UWAGA: W tym badaniu, króliki były trzymane w standardowych klatkach z jedzeniem i wodą oferowanymi ad libitum w akredytowanych przez Francuską Agencję ds. Żywności, Środowiska i Bezpieczeństwa i Bezpieczeństwa (ANSES) obiektach dla zwierząt w Maisons-Alfort, Francja. Zwierzęta były monitorowane dwa razy dziennie przez dwóch doświadczonych techników pod kątem wszelkich nieprawidłowych reakcji skórnych, problemów zdrowotnych lub powikłań. Pomieszczenie doświadczalne zostało zabezpieczone poprzez obramowanie wnętrza drzwi taśmą dwustronną, aby uniknąć przypadkowej ucieczki kleszczy. Metoda sprawdza się najlepiej, gdy dwie osoby pracują w zespole, ale możliwe jest wykonanie jej samodzielnie przez jedną doświadczoną osobę. Chociaż większość królików jest posłuszna i spokojna, podczas manipulacji mogą wystąpić oznaki stresu. Aby upewnić się, że królik nie zrani się podczas szarpania, ręczne przytrzymywanie można osiągnąć, delikatnie trzymając kark w jednej ręce, podczas gdy drugą ręką podtrzymując go w tylnych ćwiartkach. Sześciomiesięczna samica owcy rasy Rambouillet była trzymana w obiektach Centrum Badań Biomedycznych (CRBM) w Narodowej Szkole Weterynaryjnej w Alfort (ENVA), gdzie woda i pokarm były dostarczane ad libitum i były sprawdzane dwa razy dziennie.
UWAGA: Nasze laboratorium otrzymało pozwolenie na wykorzystanie królików i owiec do karmienia kleszczy od Komitetu Etyki ds. Eksperymentów na Zwierzętach ComEth Anses/ENVA/UPEC, numery zezwoleń odpowiednio 01741.01 i 11/10/16-5B. Ponieważ w naszych eksperymentach używaliśmy tylko kleszczy wolnych od patogenów, wszystkie króliki użyte w tym badaniu zostały zaoferowane do adopcji za pośrednictwem Stowarzyszenia Białych Królików w Paryżu we Francji.
1. Przygotowanie kapsułek
- Wytnij żądany rozmiar kapsułki z arkusza pianki EVA (Rysunek 1A). Zaokrąglij zewnętrzne rogi (Rysunek 1B) kapsułki, aby zminimalizować przypadkowe oderwanie się podczas przyklejania jej do skóry królika.
UWAGA: Grubość ramy kapsuły powinna wynosić około 8 mm. Użyj arkusza pianki o grubości 5 mm dla larw, nimf i dorosłych gatunków małych kleszczy, takich jak Ixodes. Arkusz pianki o grubości 1 cm jest odpowiedni dla dorosłych kleszczy o dużych rozmiarach, takich jak Amblyomma sp., Hyalomma sp. itp. Rozmiar kapsułki różni się w zależności od wymagań eksperymentalnych. Na przykład dla 20 dorosłych par Ixodes, 200 nimf lub 1000 larw używamy wewnętrznej kapsułki o wymiarach odpowiednio 5 x 5 cm2, 6 x 7 cm2 lub 7 x 9 cm2. - Wytnij paski samoprzylepnej taśmy haczykowej o szerokości 8 mm (patrz Tabela materiałów) i przyklej je do przygotowanej ramy z pianki EVA (Rysunek 1C).
- Wytnij paski tego samego rozmiaru z samoprzylepnej taśmy pętelkowej (patrz Tabela materiałów) i przymocuj je do boków haczyka przymocowanych do ramy z pianki EVA (Rysunek 1D).
- Przytnij odpowiedni rozmiar drobnej siatki przeciw komarom (rozmiar oczek mniejszy niż 50 μm) do rozmiaru ramy z pianki EVA i przyklej ją do samoprzylepnej pętli (Rysunek 1E i 1F). W razie potrzeby przyciąć zwisy.
UWAGA: Ten rodzaj kapsułki może być używany do karmienia nimf i dorosłych gatunków kleszczy twardych, podczas gdy do karmienia larw potrzebny jest inny system uszczelniania kapsułek (rysunek uzupełniający 1), aby zapobiec przypadkowemu ucieczce larw przez zamocowaną stronę z rzepem.
2. Przygotowanie królika przed inwazją kleszczy
- Ogol obszar grzbietu i boków królika, który ma być używany za pomocą maszynki do strzyżenia (Rysunek 2A).
- Nałóż niedrażniący klej lateksowy na całą powierzchnię przygotowanej kapsułki i odczekaj 1 minutę (Rysunek 2B).
- Przyklej kapsułkę, dociskając palcami do skóry (szczególnie w rogach) przez około 3 minuty (Rysunek 2C i 2D).
UWAGA: W przypadku klejenia więcej niż jednej kapsułki należy zachować odstęp co najmniej 5 mm między nimi (Rysunek 2E i 2F). Zazwyczaj omijamy okolicę kręgosłupa, ale w razie potrzeby można ją wykorzystać. - Lekko unieś kapsułki, aby wizualnie sprawdzić ich przyczepienie do skóry. Jeśli zostaną znalezione nieprzyczepione obszary, nałóż klej za pomocą szpatułki i dociskaj przez kolejne 3 minuty.
- Nałóż taśmę ochronną na tylne łapy królika, aby zapobiec uszkodzeniu kurtki (Rysunek 2G).
UWAGA: Ten krok jest opcjonalny i ma na celu głównie zapobieżenie uszkodzeniu kurtki, a nie uszkodzeniu kapsułki na kleszcze. - Załóż kurtkę królika, wkładając przednie nogi przez otwory i zaciskając szyję, upewniając się, że oddychanie królika pozostaje wygodne. Na tym etapie nie należy umieszczać tylnych nóg przez elastyczne obudowy i pozostawić otwarty zamek błyskawiczny (Rysunek 2H).
3. Inwazja kleszczy
- Umieść kleszcze w plastikowej strzykawce (1 lub 5 ml w zależności od liczby osobników) z naciętym końcem igły i zatkanym bawełnianą bawełną (Rysunek 1G). Jeśli ma zostać zaatakowana niewielka ilość kleszczy, użyj kleszczy.
UWAGA: W celu utrzymania kolonii kleszczy pozwól nabrzmiałej samicy (samicom) kleszcza złożyć jaja, a następnie wykluć się wewnątrz strzykawki (5 lub 10 ml) pokrytej siatką przeciw komarom owiniętej gumką recepturką12, aby uniknąć pracochłonnej manipulacji larwami w momencie ich nałożenia na żywiciela (Rysunek 1H). Również w pełni nabrzmiałe larwy mogą zostać dopuszczone do linienia w strzykawce (rysunek uzupełniający 1I; 5 lub 10 ml) w celu bezpośredniego zarażenia królika nimfami. - Umieścić strzykawkę głęboko w kapsułce przez otwarty róg i zaszczepić kleszcze, naciskając tłok strzykawki. Powoli przekręć tłok w kierunku skóry królika, aby usunąć pozostałe kleszcze przyczepione do tłoka i jednocześnie wyciągnij go z kapsułki (Rysunek 2I).
UWAGA: Jeśli niektóre osoby wypełzną z kapsuły, zwróć je za pomocą kleszczy. - Zamknij kapsułkę, ponownie zapinając taśmę na rzep .
- Umieść tylne nogi królika w tylnych elastycznych obudowach kurtki i zapnij zamek błyskawiczny.
UWAGA: Spraw, aby palec wskazujący zmieścił się między szyją kurtki a królikiem, aby zapewnić wygodę, a także uniknąć gryzienia kurtki. - Umieść królika z powrotem w klatce (Rysunek 2J).
UWAGA: Czas od inwazji do zebrania obfitych kleszczy różni się w zależności od gatunku kleszczy i etapów rozwoju. Na przykład w przypadku Ixodes scapularis i Ixodes ricinus czas żerowania dorosłych, nimf i larw wynosi odpowiednio 6-9, 3-4 i 2-3 dni. Listę odniesień do 29 różnych cykli życiowych kleszczy twardych w warunkach laboratoryjnych można znaleźć w Levin and Shumacher (2016)9.
4. Zbieranie i monitorowanie kleszczy
- Zabierz królika z klatki na ławkę i rozepnij kurtkę.
- Delikatnie przytrzymuj królika rękami. Otwórz kapsułkę, odpinając taśmę z rzepem (Rysunek 2K i 2L) i zbierz kleszcze, szczotkując nabrzmiałe larwy (Rysunek Uzupełniający 1) lub nimfy do plastikowego naczynia lub używając kleszczy dla dorosłych (Rysunek 2L). Jeśli wymagane są częściowo odżywione (nie pełne) kleszcze, użyj wykrętki do kleszczy lub kleszczy, aby je odczepić.
UWAGA: W przypadku utrzymywania kolonii kleszczy należy zapoznać się z uwagą w kroku 3.1. Utrzymuj nabrzmiałe kleszcze w odpowiednich warunkach wilgotności i temperatury, w zależności od konkretnego gatunku kleszcza. - W razie potrzeby ponownie zapnij taśmę na rzep, aby zamknąć kapsułkę.
5. Odzyskanie królika
- Całkowicie usuń moskitierę z kapsułki i pozostaw kurtkę na króliku (Rysunek 2M).
- Odczekaj 3-4 tygodnie i spróbuj wyjąć kapsułkę, delikatnie przycinając jeden z rogów (Rysunek 2N). Jeśli kapsułka jest nadal mocno przymocowana, powtórz ten krok tydzień później.
- Zdejmij kurtkę i pozwól królikowi dojść do siebie w klatce.
UWAGA: Po zdjęciu kapsułki sprawdź skórę królika pod kątem nieprawidłowych reakcji. Chociaż zwykle nie jest wymagane żadne leczenie, w przypadku podrażnienia można zastosować balsam emolientowy. - Jeśli protokół i eksperymenty na to pozwalają, odzyskany królik (Rysunek 2O) może być ponownie wykorzystany lub zaoferowany do adopcji.
UWAGA: Wykazano, że króliki nabywają odporności na kleszcze po wystawieniu na powtarzające się inwazje kleszczy13; Dlatego nie zaleca się ponownego nawożenia, chyba że wymaga tego eksperyment.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszym opracowaniu po raz pierwszy proponujemy szczegółową metodę krok po kroku karmienia kleszczy twardych w kapsułkach z pianki EVA przymocowanych do wygolonego grzbietu królika i przykrytych kamizelką (Rysunek 1 oraz Rysunek 2). Protokół ten jest odpowiedni do różnych rodzajów eksperymentów, w których wymagane jest zastosowanie różnych grup kleszczy na tym samym żywicielu, i może być również wykorzystyw...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Najważniejszym krokiem w całym tym protokole jest mocne przyklejenie kapsułki do ogolonej skóry. Z tego powodu kluczowe znaczenie ma stałe ciśnienie przez co najmniej 3 minuty, zwłaszcza na zakrętach. Podczas zaszczepiania kleszczy do kapsułki ważne jest, aby umieścić je głęboko w przeciwległym rogu niż otwarty, aby uniknąć ucieczki kleszcza podczas uszczelniania. Planując eksperymenty, upewnij się, że wszystkie kapsułki są zakryte kurtką, aby uniknąć uszkodzeń spowodowanych żuciem lub drapaniem. Upewnij się, że obszar s...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy za pomoc techniczną Evelyne Le Naour, Francuskiemu Narodowemu Instytutowi Badań Rolniczych (INRA), Alainowi Bernierowi (INRA) i Océane Le Bidel (ANSES). Consuelo Almazán otrzymała stypendium z Laboratorium Doskonałości, Biologii Integracyjnej Pojawiających się Chorób Zakaźnych (LabEx IBEID) w Instytucie Pasteura. Króliki i owce zostały zakupione przez ANSES. Część tych prac została sfinansowana z grantu National Institutes of Health RO1AI090062 dla Y. Parka. Dr Jeffrey L. Blair jest autorem recenzji manuskryptu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Króliki nowozelandzkie (2,5-3,5 kg) | Charles River | Kod szczepu 571 | |
| Owce Rambouillet | Lokalny dostawca - gospodarstwo wolne od kleszczy | Suczka 6 miesięcy | |
| Pianka EVA o grubości 5 mm | Sklep Cosplay | EVA-PE451kg (950mm x 450mm) | 10 mm Pianka PE45 kg ze Sklepu Cosplay może być używana do dużych dorosłych gatunków kleszczy |
| Arkusz pianki 9" X 12" 6 mm-Biały | Amazon | FOAMSHT6-20 | 6 mm-pianka EVA można zamówić przez Amazon jako alternatywę dla pianki ze sklepu Cosplay |
| Kurtki królika na całej długości | Aparatura Harvarda, Inc. | 620077- średnie, 6270078 - duże | |
| Nietoksyczny klej lateksowy | Środek do naprawy łez | Tkaniny & Pończocha ortopedyczna skórzana samoprzylepna | |
| bawełniana | BSN Medical | 9076 (szerokość 12-15 cm) | |
| Siatka przeciw komesrom | Loisirs Creatifs | Bardzo cienka tkanina nylonowa z filtrem | Dowolna siatka przeciw komarom lub materiał zasłonowy o rozmiarze oczek mniejszym niż 50 μ m jest odpowiedni. |
| Leukoplast | BSN medical S.A.S | LF 72361-02 | |
| Taśma samoprzylepna na rzep | AIEX store | AIEX 39,37 stóp/12 m Taśma samoprzylepna w rolce, szerokość 20 mm, kolor biały | Wypełnione przez Amazon |
| Szybkoschnący klej | Fixtout | Klej Superglue |
Bibliografia
- Sonenshine, D. E., Roe, M. Ticks, People and Animals. Biology of Ticks, Vol I. , Oxford University Press. (2014).
- Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
- Bonnet, S., Jouglin, M., Malandrin, L., Becker, C., Agoulon, A., L'hostis, M., Chauvin, A. Transstadial and transovarial persistence of Babesia divergens DNA in Ixodes ricinus.ticks fed on infected blood in a new skin-feeding technique. Parasitology. 134 (2), 197-207 (2007).
- Bonnet, S., Liu, X. Laboratory artificial infection of hard ticks: A tool for the analysis of tick-borne pathogen transmission. Acarologia. 52 (4), 453-464 (2012).
- Khols, G. M. Tick rearing methods with special reference to the Rocky Mountain Wood Tick, Dermacentor andersoni Stiles. Culture methods for invertebrate animals. , Dover Pubs. New York. (1937).
- Faccini, J. L. H., Chacon, S. C., Labruna, M. B. Rabbits (Oryctolagus cuniculus) as experimental hosts for Amblyomma dubitatum Neumann (Acari: Ixodidae) [Coelhos (Oryctolagus cuniculus) como hospedeiros experimentais de Amblyomma dubitatum Neumann (Acari: Ixodidae). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 58 (6), 1236-1239 (2006).
- Chacon, S. C., Freitas, L. H. T., Barbieri, F. S. Relationship between weight and number of engorged Amblyomma cooperi. Nuttal (sic) and Warburton, 1908 (Acari: Ixodidae) larvae and nymphs and eggs from experimental infestations on domestic rabbits. Brazilian Journal of Veterinary Parasitology. 13, 6-12 (2004).
- Sonenshine, D. E. Maintenance of ticks in the laboratory. Maintenance of Human, Animal, and Plant Pathogen Vectors. , Science Publishers Inc. Enfield. (1999).
- Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory. Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).
- Bouchard, K. R., et al. Maintenance and experimental infestation of ticks in the laboratory setting. Biology of Disease Vectors. , Elsevier. San Diego. (2005).
- Jones, L. D., Davies, C. R., Steele, G. M., Nutall, P. A. The rearing and maintenance of ixodid and argasid ticks in the laboratory. Animal Technology. 39, 99-106 (1988).
- Slovák, M., Labuda, M., Marley, S. E. Mass laboratory rearing of Dermacentor reticulatus ticks (Acarina, Ixodidae). Biologia, Bratislava. 57 (2), 261-266 (2002).
- Rechav, Y., Dauth, J. Development of resistance in rabbits to immature stages of the Ixodid tick Rhipicephalus appendiculatus. Medical and Veterinary Entomology. 1, 177-183 (1987).
- Zacarias do Amaral, M. A., Azevedo Prata, M. C., Daemon, E., Furlong, J. Biological parameters of cattle ticks fed on rabbits. Brazilian Journal of Veterinary Parasitology. 21 (1), 22-27 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
