Artykuł metodologiczny

Wzbogacanie fosfopeptydem w połączeniu z bezznacznikową ilościową spektrometrią mas w celu zbadania fosfoproteomu w raku prostaty

14K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57996

⸱

2 sierpnia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology, School of Graduate Studies, Rutgers University, The State University of New Jersey, 2Graduate Program in Quantitative Biomedicine, School of Graduate Studies, Rutgers University, The State University of New Jersey, 3Department of Medicine, Division of Medical Oncology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 4Crump Institute for Molecular Imaging, Department of Molecular and Medical Pharmacology, Jonsson Comprehensive Cancer Center, UCLA Metabolomics Center, and California NanoSystems Institute, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 5Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Southern California, 6Pharmacology, Rutgers Robert Wood Johnson Medical School, 7Cancer Metabolism and Growth Program, Rutgers Cancer Institute of New Jersey

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje procedurę ekstrakcji i wzbogacania fosfopeptydów z linii komórkowych lub tkanek raka prostaty w celu analizy fosfoproteomu za pomocą proteomiki opartej na spektrometrii mas.

Streszczenie

Fosfoproteomika obejmuje zakrojone na szeroką skalę badania fosforylowanych białek. Fosforylacja białek jest krytycznym etapem w wielu szlakach transdukcji sygnału i jest ściśle regulowana przez kinazy i fosfatazy. W związku z tym scharakteryzowanie fosfoproteomu może dostarczyć informacji na temat identyfikacji nowych celów i biomarkerów terapii onkologicznej. Spektrometria mas umożliwia globalne wykrywanie i ilościowe określanie tysięcy unikalnych zdarzeń fosforylacji. Jednak fosfopeptydy występują znacznie rzadziej niż niefosfopeptydy, co sprawia, że analiza biochemiczna jest trudniejsza. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, wymagane są metody wzbogacania fosfopeptydów przed analizą za pomocą spektrometrii mas. Opisujemy procedurę ekstrakcji i trawienia białek z tkanki w celu uzyskania peptydów, a następnie wzbogacania w peptydy fosfotyrozyny (pY) i fosfoseryny/treoniny (pST) przy użyciu metody wzbogacania opartej na przeciwciałach i / lub dwutlenku tytanu (TiO2). Po przygotowaniu próbki i spektrometrii mas następnie identyfikujemy i oznaczamy ilościowo fosfopeptydy za pomocą oprogramowania do chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas i analizą.

Wprowadzenie

Szacuje się, że w 2018 roku wystąpi 165 000 nowych przypadków i około 29 000 zgonów z powodu raka prostaty, co stanowi najczęstszy nowotwór i drugą najczęstszą przyczynę zgonów związanych z rakiem u mężczyzn w Stanach Zjednoczonych1. Wczesne stadia raka prostaty można leczyć za pomocą resekcji lub radioterapii choroby ograniczonej do narządów, gdzie dziesięcioletni wskaźnik nawrotów wynosi od 20% do 40% dla pacjentów poddawanych prostatektomii i od 30% do 50% dla pacjentów otrzymujących radioterapię2. Ponieważ rak prostaty opiera się na sygnalizacji androgenowej dla wzrostu, chirurgiczne i chemiczne terapie kastracyjne są również stosowane u pacjentów wysokiego ryzyka. Jednak nawrót następuje wtedy, gdy rak nie reaguje już na terapię deprywacji androgenów, o czym świadczy nawrót biochemiczny, w którym antygen specyficzny dla prostaty w surowicy ponownie wzrasta. Na tym etapie progresji często wykrywa się również przerzuty. To zaawansowane stadium, zwane rakiem prostaty opornym na kastrację z przerzutami, reprezentuje śmiertelną postać choroby, w przypadku której rokowanie zakłada medianę czasu przeżycia krótszą niż dwa lata3. W późnym stadium choroby dostępnych jest niewiele opcji leczenia, w tym antyandrogeny drugiej generacji, takie jak enzalutamid i abirateron, a także chemioterapia oparta na taksanach, taka jak docetaksel. Pomimo dostępnych metod leczenia choroba często postępuje. W związku z tym odkrycie i opracowanie nowych metod leczenia jest konieczne, aby poprawić opiekę nad pacjentami z rakiem prostaty z zaawansowaną chorobą.

Metody oparte na spektrometrii mas (MS) zapewniają globalną analizę proteomu poprzez wykrycie setek do tysięcy analitów peptydowych4. W szczególności proteomika odkrywcza, znana również jako akwizycja zależna od danych (DDA), może umożliwić identyfikację i ilościowe określenie tysięcy peptydów4,5. Proteomika oparta na odkryciu MS może być dalej podzielona na proteomikę odgórną, w której scharakteryzowane są nienaruszone białka, oraz proteomikę oddolną (znaną również jako shotgun), w której peptydy są analizowane w celu scharakteryzowania białek5. Tak więc w proteomice typu shotgun etap proteolizy zachodzi w przygotowaniu próbki poprzedzający analizę MS w celu rozszczepienia białek na peptydy. Na koniec przeprowadzane jest przeszukiwanie bazy danych w celu zmapowania peptydów z powrotem do białek w celu identyfikacji. Do ilościowego porównywania peptydów między ><>np. znakowanie stabilnych izotopów za pomocą aminokwasów w hodowli komórkowej (SILAC)]. Podczas gdy techniki znakowania izotopowego są złotym standardem, metody bezznacznikowe wykazały podobną dokładność kwantyfikacji8,9 i mają porównywalne kompromisy między czułością a swoistością10. Kwantyfikacja bez etykiet zapewnia większy zasięg i umożliwia porównania między znacznie większą liczbą próbek, podczas gdy metody oparte na etykietach są ograniczone przez koszt i możliwości multipleksowania6,7,8.

Ponadto, MS typu shotgun może być również używany do badania modyfikacji potranslacyjnych (PTM), takich jak fosforylacja11. Ze względu na niższy stechiometryczny charakter fosfopeptydów w porównaniu z peptydami całkowitymi, stosuje się kilka metod wzbogacania w fosfopeptydy, w tym immunoprecypitację peptydów fosfotyrozyny (pY) na podstawie przeciwciał, dwutlenek tytanu (TiO2) i chromatografię powinowactwa do immobilizowanych metali (IMAC)5,12. Ponieważ fosforylacja białek jest kluczowym etapem w wielu szlakach sygnalizacji komórkowej, fosfoproteomika shotgun pozwala naukowcom badać zmiany sygnalizacji komórkowej w różnych nowotworach, w tym breast13, prostate14, renal15 i ovarian,16,17, aby lepiej zrozumieć biologię raka i zidentyfikować potencjalne nowe cele terapii.

Ta metoda fosfoproteomiczna bez etykiet została zbudowana i udoskonalona na podstawie wcześniejszych prac grupy Graeber18,19,20. Protokół ten rozpoczyna się od opisania ekstrakcji i trawienia białek i fosfoprotein z tkanki do peptydów. Następnie szczegółowo opisujemy wzbogacanie peptydów pY za pomocą specyficznych przeciwciał fosfotyrozynowych i TiO2. Opisujemy również wzbogacanie peptydów fosfoseryny/treoniny (pST) za pomocą silnej wymiany kationowej (SCX), a następnie TiO2. Protokół ten kończy się przekazaniem próbek do zakładu MS i wykorzystaniem oprogramowania do analizy MS w celu identyfikacji i ilościowego określenia fosfoprotein i odpowiadających im fosfoprotein. Zastosowanie tego protokołu może wykraczać poza raka prostaty i obejmować inne nowotwory i dziedziny poza onkologią.

Protokół

Eksperymenty z użyciem guzów ksenoprzeszczepu zostały zatwierdzone przez Rutgers University Institutional Animal Care and Use Committee, zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health.

1. Ekstrakcja białka

  1. Przygotować bufor do lizy (Tabela 1). (Objętość zależy od liczby próbek do pobrania.) W przypadku próbek komórek in vitro przejdź do kroku 1.2. W przypadku tkanki nowotworowej przejdź do kroku 1.3.
  2. Pobieranie komórek
    1. Zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i wirować je w temperaturze 700 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i pozostawić osad na lodzie. Powtórz ten krok dla wszystkich naczyń, aby zebrać komórki w jedną granulkę. (Zazwyczaj na 5 mg białka potrzeba około 5 prawie zlewających się ze sobą 15-centymetrowych szalek komórek, ale może to być zależne od linii komórkowej i musi być określone empirycznie przez każdego badacza).
    2. Przemyć osad 30 ml schłodzonego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i wirować w temperaturze 700 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C przed zasysaniem PBS. Dodać 1,5 ml buforu do lizy na każde 5 mg użytego białka do osadu komórkowego. Pigazuj kilka razy w górę i w dół. Przejdź do kroku 1.4.
  3. Pobieranie tkanek
    1. Zważ guz i dodaj 2 ml lodowatego buforu do lizy na każde 100 mg tkanki w probówce do hodowli. (Zazwyczaj potrzeba od 50 do 150 mg mokrej masy tkanki).
  4. Homogenizować lizat za pomocą homogenizatora ręcznego lub stacjonarnego (impuls 2x przez 15 s.) Wyczyść homogenizator przed pierwszą próbką i między próbkami, używając kolejno 10% wybielacza, 70% etanolu i wody dejonizowanej.
  5. W celu redukcji i alkilacji należy podgrzewać homogenizowane próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut. Następnie schłodzić je na lodzie przez 15 minut. Na lodzie sonikować lizat 3x (tj. pulsować przez 30 s z 60-sekundowymi przerwami między impulsami). W tym momencie próbka nie powinna być lepka ani grudkowata. Podgrzewać lizat w temperaturze 95 °C przez 5 minut21.
  6. Odwirować lizat w tej samej probówce do sonikacji za pomocą obracającego się wirnika kubełkowego o temperaturze 3 500 x g w temperaturze 15 °C przez 15 minut. Zebrać supernatant i wyrzucić osad.
  7. Określ stężenie białka, wykonując test Bradforda22. W razie potrzeby rozcieńczyć lizat do 5 mg/ml za pomocą buforu do lizy. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
    Uwaga: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać. Zamrozić próbki w temperaturze -80 °C i kontynuować w późniejszym terminie.

2. Trawienie lizatu

  1. Rozcieńczyć próbkę 12-krotnie, używając 100 mM Tris (pH = 8,5) w celu zmniejszenia ilości guanidyny. Rozcieńczyć wszystkie próbki do tej samej objętości, aby zminimalizować skutki nierównomiernego trawienia. Zaoszczędź 12,5 μg niestrawionego lizatu, aby potwierdzić to na poplamionym żelem Coomassie23.
  2. Aby uzyskać 5 mg białka, dodaj 10 μg endopeptydazy lizylowej (Lys-C) i inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez 5 - 6 godzin. Dostosuj pH do 8,0, dodając 1 M niemiareczkowany Tris (pH ~11).
  3. Przygotować 1 mg/ml trypsyny poddanej działaniu L-1-tozyloamido-2-fenyloetylochlorometylowego ketonu (TPCK) w 1 mM HCl (z 20 mM CaCl2). Dodać trypsynę w stosunku 1:100 trypsyna do białka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny.
  4. Dodaj taką samą ilość świeżej trypsyny, jak w kroku 2.3. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  5. Zaoszczędź 12,5 μg strawionego lizatu, aby potwierdzić całkowite roztrawienie na barwionym żelu Coomassie23.

3. Ekstrakcja z odwróconą fazą

  1. Zapisz objętość lizatu. Przefiltrować próbkę za pomocą filtra odcinającego o pojemności 15 ml i stężeniu 10 kDa. Odwirować próbkę o stężeniu 3 500 x g za pomocą obrotowego wirnika kubełkowego (lub 3 500 x g w przypadku wirnika o stałym kącie nachylenia) w temperaturze 15 °C do momentu, gdy objętość retentatu będzie mniejsza niż 250 μl (trwa to około 45 - 60 minut). Zebrać przepływ i wyrzucić retentat.
    Uwaga: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać. Zamrozić próbki w temperaturze -80 °C i kontynuować w późniejszym terminie.
  2. Aby zakwasić próbkę, dodać około 20 μl 5% kwasu trifluorooctowego (TFA) na ml lizatu. Dobrze je wymieszaj i zmierz pH próbki za pomocą pasków pH. Dostosuj pH do 2,5 za pomocą 5% TFA.
  3. Podłącz krótszy koniec kolumny C-18 do kolektora próżniowego. Ustaw podciśnienie w zakresie od 17 do 34 kPa (lub zgodnie z instrukcjami producenta). Za pomocą szklanych pipet zwilż kolumnę 3 ml 100% acetonitrylu (ACN). Nie pozwól, aby kolumna wyschła.
  4. Za pomocą szklanych pipet zrównoważyć kolumnę z 6 ml 0,1% TFA nałożonymi jako 2x 3 ml. Zakwaszoną próbkę załadować do kolumny. Nie dodawaj jednorazowo więcej niż 3 ml. Dostosuj podciśnienie, aby celować w około 1 do 2 kropli na sekundę.
  5. Za pomocą szklanych pipet przemyć kolumnę 9 ml 0,1% TFA w postaci 3 x 3 ml. Eluować kolumnę za pomocą 2 ml 40% ACN, 0,1% TFA. Zebrać dwie frakcje o pojemności 2 ml do szklanych probówek hodowlanych. Odrzuć kolumnę.
  6. Przykryj probówki eluacyjne parafilmem i przebij 3-5 otworów w pokrywie za pomocą igły 20G. Zamrażać eluat na suchym lodzie przez co najmniej 30 minut, aż stanie się całkowicie stały.
  7. Liofilizuj frakcje przez noc. Następnego dnia upewnij się, że próbki są całkowicie suche przed zatrzymaniem liofilizatora. Przechowywać probówki w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z delikatnymi chusteczkami w temperaturze -80 °C.
    Uwaga: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać.

4. Immunoprecypitacja i wzbogacanie peptydów pY24

  1. Zawiesić liofilizowany proszek z 0,5 ml lodowatego buforu wiążącego immunoprecypitację (IP) w każdej frakcji. Połączyć frakcje, przenosząc objętość 0,5 ml do refuzji z drugiej frakcji do pierwszej frakcji i oszczędzając końcówkę pipety. Energicznie wirować (zamiast pipetować w górę iw dół), aby upewnić się, że próbka jest całkowicie rozpuszczona przed przeniesieniem jej do krioprobówki z zakrętką o pojemności 3,6 ml.
  2. Podobnie jak w kroku 4.1, przepłukać probówki liofilacyjne kolejnym 0,5 ml buforu wiążącego IP (Tabela 1) w każdej probówce. Przenieś roztwór do probówki z nakrętką o pojemności 3,6 ml za pomocą tej samej końcówki pipety, aby zminimalizować straty próbki. Powtórzyć płukanie jeszcze 1 raz, sprawiając, że końcowa objętość zawiesiny wynosi 2 ml (na 5 mg białka). Zmierz pH próbki, aby upewnić się, że wynosi około 7,4. Jeśli jest zbyt kwaśny, stopniowo dodaj 10 μL 1M Tris (niemiareczkowany, pH ~11). Jeśli jest zbyt zasadowy, należy dodać 10 μl rozcieńczonego HCl (1:25 lub 1:100).
  3. Umyj wstępnie kulki pY (na 5 mg początkowego lizatu)
    1. Na próbkę potrzeba 25 μg przeciwciała 4G10 i 12,5 μg przeciwciała 27B10.4. Po użyciu pipety p200 z naciętą końcówką do przeniesienia przeciwciał do oddzielnych probówek do mikrowirówek, przemyj przeciwciała 450 μl lodowatego buforu wiążącego IP 2x. Odwirować je przy sile 100 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C i odessać sklarowany nad osadem.
    2. Zawiesić kulki do stężenia podstawowego 0,5 mg/ml za pomocą buforu wiążącego IP. (Nie obracaj koralików.) Po przeniesieniu niezbędnej zawiesiny (50 μl zawiesiny przeciwciał 4G10 i 25 μl zawiesiny przeciwciał 27B10,4 na próbkę) do pojedynczej probówki, należy odwirować podstawowe probówki wirówkowe o masie 200 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C. Umyć ścianki boczne supernatantem przed powrotem koralików do przechowywania w lodówce.
  4. Dodaj wstępnie umyte kulki pY do zawieszonego roztworu próbki w krioprobówkach z nakrętką śrubową. Inkubować je w temperaturze 4 °C na rotatorze typu end-to-end przez noc.
  5. Umieść zakrętki krioprobówek w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml wyłożonej delikatną chusteczką. Odkręcaj koraliki w odległości 100 x g przez 1 min. Zachowaj supernatant, który zostanie użyty do wzbogacenia peptydów pST. (Wzbogacanie pST rozpoczyna się w kroku 7 i może być prowadzone równolegle z przetwarzaniem peptydu pY).
  6. Ponownie zawiesić kulki za pomocą 300 μl bufora wiążącego IP. Przenieść je do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml i wirować w temperaturze 100 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
  7. Przepłukać probówkę inkubacyjną 3x 200 μl buforu wiążącego IP. Za każdym razem przenosić zawartość do tej samej probówki do mikrowirówki. Następnie odkręć je w dół.
  8. Umyj kulki w probówce do mikrowirówek 3x 500 μl buforu wiążącego IP i odwiruj je w tempie 100 x g przez 1 min. Następnie umyj kulki 4x 450 μl 25 mM NH4HCO3, pH 7,5 i odwiruj je w 100 x g przez 1 min. Za każdym razem używaj świeżego 25 mM roztworu NH4HCO3 z proszku.
  9. Odwirować kulki o sile 1 500 x g przez 1 minutę. Użyj końcówki do ładowania żelem, aby całkowicie usunąć supernatant, zanurzając końcówkę końcówki ładującej żel nieco poniżej powierzchni kulek.
  10. Dodać 4 razy objętość kulki 0,1% TFA do kulek (tj. dodać 300 μl 0,1% TFA na 75 μg zawiesiny kulki pY). Dobrze je wymieszać i inkubować mieszaninę w termomikserze z prędkością 1 000 obr./min przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
  11. Przenieść zawiesinę do filtra wirowego o średnicy 0,2 μm. Szybko odwirować rurkę elucyjną i przenieść pozostałą objętość do tego samego filtra wirowego za pomocą pipety P10. Obracaj filtr wirowy przy 850 x g przez 1 minutę. Przenieść elucję do probówki mikrowirówkowej o niskim poziomie wiązania białek. Zagęścić eluat próżniowo do sucha przez noc w temperaturze 40 °C i czasie ogrzewania 300 min.
    Uwaga: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać. Zamrozić próbki w temperaturze -80 °C i kontynuować w późniejszym terminie.

5. Wzbogacanie dwutlenkiem tytanu25 peptydów pY

  1. Wysuszone fosfopeptydy zawiesić w 200 μl 50% ACN, 0,1% TFA. Wirować i odwirowywać je przy 10 000 x g przez 30 s. Powtórz to 1x, aby dobrze je zawiesić.
  2. Przygotowanie kulek TiO2 zawartych w końcówkach, które mają pojemność na 200 μL próbek.
    1. Delikatnie postukaj w małą stronę końcówki końcówki, aby przesunąć materiał na ten koniec. Opłucz końcówkę, dodając 200 μl 100% ACN, a następnie odwróć końcówkę i potrząśnij małym końcem, aby przesunąć płyn w kierunku nakrętki.
    2. Za pomocą żyletki odetnij małą końcówkę końcówki i umieść ją na probówce o niskim poziomie wiązania białka. (Unikaj używania rurek polistyrenowych, ponieważ TiO2 przyklei się do boków rurki.) Zdejmij nakrętkę i włóż mikropipetę, aby zanurzyć pozostały ACN. Powtórz pranie z 200 μL 100% ACN. Kulki TiO2 znajdują się teraz w probówce o niskim poziomie wiązania białka w kolejnych krokach.
    3. Kondycjonuj TiO2 z 500 μL 100% ACN 2x. Pipetować, aby wymieszać kulki z rozpuszczalnikiem. Odwirować je w temperaturze 100 x g przez 1 minutę.
    4. Warunek TiO2 z 500 μL 0,2 M buforu fosforanu sodu (pH ~7) 2x. Przemyć kulki 300 μL buforu równoważącego 3x. Ponieważ TiO2 jest bardzo gęsty, koraliki szybko osiadają.
  3. Dodać 400 μl 50% ACN, 0,1% TFA do probówki o niskim poziomie wiązania białka, a następnie dodać 84 μl kwasu mlekowego. Przenieść zawieszone fosfopeptydy do probówki o niskim poziomie wiązania białek i inkubować je przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej za pomocą rotatora koniec nad końcem.
  4. Odwiruj kulki o masie 100 x g przez 1 minutę, aby je ogrzać. Przemyć je 300 μl buforu równowagowego (tabela 1) 2x i odwirować w temperaturze 100 x g przez 1 min.
  5. Przepłukać kulki 300 μl buforu płuczącego 2x. Przenieść je do filtra wirowego 0,2 μm. Wiruj nimi w rozmiarze 1 500 x g przez 1 min.
  6. Przenieś jednostkę filtrującą do czystej probówki o pojemności 1,5 ml o niskiej zawartości białka. Zawartość wypłukać 2x za pomocą 200 μL 0,9%NH 3 w H2O. Zmierzyć pH za pomocą pasków pH, które powinny wynosić od 10 do 11. Zagęścić eluat próżniowo do sucha przez noc, aby odparować amoniak.

6. Odsalanie peptydów pY do analiz MS

  1. Rozpuść fosfopeptydy w 15 μl 0,1% TFA, wirując i odwirowując je w stężeniu 10 000 x g przez 30 s w celu ponownego zawieszenia. Powtórz to 1x, aby dobrze je zawiesić. Nie pipetować w górę i w dół.
  2. Oczyść próbkę za pomocą końcówki C-18 o zdolności wiązania 5 μg i postępuj zgodnie z protokołem producenta.
  3. Całkowicie wysuszyć objętość elucji przez zatężenie próżniowe. Trwa to 1 - 2 godziny. Ponownie zawiesić wysuszone fosfopeptydy w 12,5 μl roztworu spektrometrii mas (patrz Tabela 1) (lub zgodnie z zaleceniami głównego ośrodka proteomicznego MS badacza). Wirować i krótko odwirowywać roztwór przy 10 000 x g przez 30 s. Powtórz to 2 razy, aby dobrze je zawiesić. Próbki są gotowe do przekazania do zakładu spektrometrii mas (etap 11).
    Uwaga: Poniższe kroki są związane wyłącznie ze wzbogacaniem peptydów pST.

7. Ekstrakcja peptydów pST w odwrotnej fazie

  1. Zmierzyć stężenie peptydów w supernatancie uzyskanym z kroku 4.6, wykonując test peptydowy. Ilość wystarczająca do spektrometrii mas pST wynosi 2,5 mg.
  2. Dostosuj pH do 3,5 z 5% TFA.
  3. Podłącz krótszy koniec kolumny C-18 do kolektora próżniowego. Ustaw podciśnienie w zakresie od 17 do 34 kPa (lub zgodnie z instrukcjami producenta). Zwilż kolumnę 3 ml 100% ACN. Nie pozwól, aby kolumna wyschła.
  4. Zrównoważyć kolumnę z 6 ml 0,1% TFA nałożonymi jako 2x 3 ml. Zakwaszoną próbkę załadować do kolumny. Nie dodawaj jednorazowo więcej niż 3 ml. Dostosuj podciśnienie, aby celować w około 1-2 krople na sekundę.
  5. Przemyć kolumnę 9 ml 0,1% TFA nałożonym w postaci 3 x 3 ml. Eluować kolumnę za pomocą 2 ml 40% ACN, 0,1% TFA. Zebrać dwie frakcje o pojemności 2 ml do szklanych probówek hodowlanych. Odrzuć kolumnę.
  6. Przykryj probówki eluacyjne parafilmem i przebij 3-5 otworów w pokrywie za pomocą igły 20G. Zamrażać eluat na suchym lodzie przez co najmniej 30 minut, aż stanie się całkowicie stały.
  7. Liofilizuj wybrane frakcje przez noc. Następnego dnia upewnij się, że próbki są całkowicie suche przed zatrzymaniem liofilizatora. Przechowywać probówki w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z delikatnymi chusteczkami w temperaturze -80 °C.
    Uwaga: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać.

8. Silna wymiana kationowa (SCX) peptydów pST

  1. Ponownie zawiesić liofilizowane peptydy w 2 ml buforu A (Tabela 1). Zebrać frakcje dla każdej próbki. (Roztwór będzie mętny.)
  2. Przygotuj kolektor próżniowy. Podłączyć kolumnę SCX do strzykawki o pojemności 3 ml z usuniętym tłokiem. Ustaw podciśnienie w zakresie od 17 do 34 kPa (lub zgodnie z instrukcjami producenta).
  3. Kondycjonować kolumnę SCX 4 ml ACN, a następnie 4 ml buforu A.
  4. Załadować 2 ml próbki z kroku 8.1 i natychmiast zebrać eluat. Załadować 3 ml buforu A:B (80,9:19,1) i zebrać eluat. Zebrać eluaty z każdej próbki i podzielić je na 2 ml probówek o niskiej zawartości wiązania białka.
  5. Zagęścić próżniowo wszystkie próbki, aż pozostanie około 30% objętości. (Ten krok zajmuje około 2 - 4 godzin.) Połączyć podwielokrotności w 1 probówce o niskim poziomie wiązania białka dla każdej próbki.
  6. Podłącz krótszy koniec kolumny C-18 do kolektora próżniowego. Ustaw podciśnienie w zakresie od 17 do 34 kPa (lub zgodnie z instrukcjami producenta). Zwilż kolumnę 3 ml 100% ACN 2x. Nie pozwól, aby kolumna wyschła.
  7. Zrównoważyć kolumnę z 3 ml 0,1% TFA 2x. Załadować próbkę do kolumny. Nie dodawaj jednorazowo więcej niż 3 ml. Dostosuj podciśnienie, aby celować w około 1-2 krople na sekundę.
  8. Przepłukać kolumnę 3 ml 0,1% TFA 2x. Usunąć kolumnę 4 ml 50% ACN, 0,1% TFA.

9. Wzbogacanie peptydów pST w dwutlenek tytanu

  1. Przygotowanie kulek TiO2 zawartych w końcówkach o pojemności 200 μL próbek
    1. Delikatnie dotknij małej końcówki końcówki, aby przesunąć koraliki na ten koniec. Zdejmij nakrętkę i wlej koraliki do stożkowej probówki z polipropylenu o pojemności 15 ml.
    2. Opłucz końcówkę, dodając 200 μl 100% ACN, kilkakrotnie odwracając końcówkę i przesuwając małą końcówkę, aby przesunąć płyn w kierunku nakrętki. Za pomocą żyletki odetnij małą końcówkę końcówki i umieść ją na stożkowej tubie z polipropylenu o pojemności 15 ml. Zdejmij nakrętkę i włóż mikropipetę, aby zanurzyć pozostały ACN. Powtórz pranie z 200 μL 100% ACN. Koraliki TiO2 znajdują się teraz w stożkowej probówce o pojemności 15 ml w celu wykonania następujących czynności.
    3. Kondycjonuj TiO2 z 500 μL 100% ACN 2x. Pipetować, aby wymieszać kulki z rozpuszczalnikiem. Odwirować je w temperaturze 100 x g przez 1 minutę.
    4. Warunek TiO2 z 500 μL 0,2 M buforu fosforanu sodu (pH ~7) dwukrotnie. Przemyć kulki 300 μl buforu równoważącego 3x.
  2. Przenieść eluowane fosfopeptydy do stożkowej probówki z polipropylenu o pojemności 15 ml. Dodać 560 μl kwasu mlekowego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej za pomocą rotatora typu end-over-end.
  3. Odwirować mieszaninę przy 100 x g przez 1 minutę, aby granulować kulki. Przemyć je 300 μl buforu wyrównawczego (tabela 1) 3x. Wiruj je w tempie 100 x g przez 1 min.
  4. Przepłukać kulki 300 μl buforu płuczącego 2x. Przenieść je do filtra wirowego 0,2 μm. Obracaj je w tempie 1 500 x g przez 1 min.
  5. Przenieś jednostkę filtrującą do czystej probówki o pojemności 1,5 ml o niskiej zawartości białka. Zawartość wypłukać 2x za pomocą 200 μL 0,9% NH3 w H2O. Pozostaw roztwór na fosfopeptydach na 2 minuty przed ich wyluceniem. Zmierz pH, które powinno wynosić od 10 do 11.
  6. Zagęścić eluat próżniowo do sucha przez noc, aby odparować amoniak.

10. Odsalanie peptydów pST do analiz MS

  1. Delikatnie postukaj w małą stronę końcówki końcówki, aby przesunąć materiał na ten koniec. Opłucz końcówkę, dodając 200 μl 100% ACN, a następnie odwróć końcówkę i potrząśnij małym końcem, aby przesunąć płyn w kierunku nakrętki.
  2. Za pomocą żyletki odetnij małą końcówkę końcówki i umieść ją na stożkowej tubie z polipropylenu o pojemności 15 ml. Zdejmij nakrętkę i włóż mikropipetę, aby zanurzyć pozostały ACN. Powtórz pranie z 200 μL 100% ACN. Kulki TiO2 znajdują się teraz w stożkowej probówce z polipropylenu o pojemności 15 ml w celu wykonania następujących czynności.
  3. Oczyść próbkę za pomocą końcówki C-18 o zdolności wiązania 100 μg. (Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta).
  4. Całkowicie wysuszyć objętość elucji przez zatężenie próżniowe. Trwa to 1 - 2 godziny.
  5. Ponownie zawiesić wysuszone fosfopeptydy w 12,5 μl roztworu spektrometrii mas (lub zgodnie z zaleceniami głównego ośrodka proteomiki MS badacza). Wirować i odwirowywać je przy 10 000 x g przez 30 s. Powtórz 2 razy, aby dobrze je zawiesić. (Nie pipetować w górę i w dół.)

11. Analiza spektrometrii mas

  1. Prześlij próbki do głównego zakładu proteomiki MS w celu przeprowadzenia chromatografii cieczowej w tandemie MS (LC-MS/MS) przy użyciu zalecanych ustawień. Przykładowe ustawienia są następujące (podsumowanie znajduje się w tabeli 2):
    1. Załadować 5 μl próbek do kolumny pułapkowej (2 cm długości x 75 μm średnicy) i przemywać je 0,1% TFA przez 5 minut przy natężeniu przepływu 5 μl/min.
    2. Ustawić pułapkę w jednej linii z nanokolumną analityczną (20 cm x 75 μm) o natężeniu przepływu 300 nL/min.
    3. Segmentowe gradienty liniowe (procent 0,16% kwasu mrówkowego, 80% ACN w 0,2% kwasie mrówkowym) różnią się między próbkami pY i pST:
      1. W przypadku próbek pY należy je eluować za pomocą gradientu 4 - 15% w ciągu 5 minut, 15 - 50% w 40 minut i 50 - 90% w ciągu 5 minut.
      2. W przypadku próbek pST należy je eluować za pomocą gradientu 4 - 15% w 30 min, 15 - 25% w 40 min, 25 - 50% w 44 min i 50 - 90% w 11 min.
    4. Pozyskiwanie danych MS w trybie akwizycji zależnej od danych z cykliczną serią pełnego skanowania z rozdzielczością 120 000, po którym następuje MS/MS (HCD, względna energia zderzenia 27%) 20 najbardziej intensywnych jonów i dynamiczny czas trwania wykluczenia wynoszący 20 s.
  2. Po zakończeniu przebiegu MS zaimportuj surowe pliki MS do oprogramowania do analizy MS w celu identyfikacji i ilościowego określenia fosfopeptydów. (W tym eksperymencie użyto oprogramowania MaxQuant software8,26,27. O ile nie określono inaczej w tabeli 3, użyto ustawień domyślnych).

Wyniki

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje metodę ekstrakcji i trawienia białek, a następnie wzbogacania fosfopeptydów i późniejszej analizy MS (Rysunek 1). Składy wszystkich buforów i roztworów użytych w tym protokole wymieniono w Tabeli 1. Sekwencyjne zastosowanie Lys-C i trypsyny zapewnia efektywne trawienie. Żel z lizatu przed trawieniem, barwiony Coomassie, potwierdza obecność białek, natomiast barwienie lizatu po trawieniu potwierdza jego całkowite przeprowadzenie (Rysunek 2A). W przypadku pełnego trawienia nie powinny pojawić się żadne prążki powyżej 15 kDa, z wyjątkiem prążków 30 kDa i 23,3 kDa odpowiadających odpowiednio Lys-C i trypsynie. Dodatek Lys-C zmniejsza również liczbę pominiętych miejsc cięcia (Rysunek 2B). Ponieważ peptydy pY stanowią jedynie 2% fosfoproteomu28, immunoprecypitacja peptydów pY przy użyciu przeciwciała specyficznego dla pY jest pierwszym krokiem wzbogacania peptydów pY. Otrzymany supernatant stanowi materiał wyjściowy do wzbogacania peptydów pST. Immunoprecypitacja pY skutecznie oddziela peptydy pY od peptydów pST; średnio 85% fosfopeptydów zidentyfikowanych w preparacie pY to pY (Rysunek 3A), a ponad 9% fosfopeptydów zidentyfikowanych w preparacie pST to pST (Rysunek 3B). Do wzbogacania fosfopeptydów w obu preparatach stosuje się dwutlenek tytanu. Oczekiwany procent fosforylowanych peptydów w preparacie gotowym do analizy MS wynosi od 30 do 50% (Rysunek 4A). Zmienność procentowego wzbogacenia fosfopeptydów może być większa w preparacie pY ze względu na znacznie mniejszą liczbę peptydów pY w porównaniu do peptydów pST. Pod względem rodzaju fosfopeptydów, większość wykrytych fosfopeptydów posiada jedną lub dwie grupy fosforanowe (Rysunek 4B).

Po przeprowadzeniu spektrometrii mas pliki surowe MS są wczytywane do oprogramowania do analizy MS. Ustawienia parametrów zastosowane w eksperymencie wymieniono w Tabeli 3, jednak różnią się one w zależności od oprogramowania i wersji. Parametry niewymienione pozostawiono w ustawieniach domyślnych, w tym próg FDR wynoszący 1% dla dopasowania widm do peptydów (PSM) przy minimalnym wyniku Andromeda równym 40 dla identyfikacji peptydów zmodyfikowanych27. Ustalenie progu prawdopodobieństwa lokalizacji powyżej 0,75 odfiltrowuje około 5% peptydów pY oraz odpowiednio 15% i 34% peptydów pS i pT (Rysunek 5A). Po zastosowaniu tych filtrów oczekiwana liczba identyfikacji fosfopeptydów na koniec analizy MS wynosi około 30 peptydów pY (dla 5 mg białka wyjściowego) oraz około 7 50 peptydów pS i 640 peptydów pT (dla 2,5 mg ilości peptydów wyjściowych) z odpowiednich preparatów wzbogaconych (Rysunek 5B). Liczba powtórzeń oraz zmienność natężenia sygnału fosfopeptydów określają odpowiednią moc dla porównań statystycznych. W czterech oddzielnych eksperymentach z grupami zawierającymi duplikaty lub triplikaty biologiczne obliczono procentowe współczynniki zmienności (%CV) dla wykrytych fosfopeptydów. Rozkłady o niższej zmienności (np. grupy pST 1–5 na Rysunku 5C) wskazują, że pobieranie próbek, ich przygotowanie oraz przebiegi spektrometrii mas były spójne. Z kolei rozkłady o wyższej zmienności (np. grupa pST 6 na Rysunku 5C) wskazują na bardziej zaszumione dane, które wymagałyby większych krotności zmian (fold-changes) w celu wykrycia istotnych różnic w późniejszych analizach różnicowych.

Schemat procesu ekstrakcji białek i spektrometrii mas; obejmuje SPE, SCX oraz wzbogacanie pY i pST.
Rysunek 1: Schemat przepływu pracy. Białka z próbek są ekstrahowane i trawione. Peptydy są izolowane za pomocą ekstrakcji do fazy stałej (SPE), a peptydy z fosfotyrozyną (pY) są poddawane immunoprecypitacji. Równolegle z supernatantu po etapie immunoprecypitacji pY wzbogacane są peptydy z fosfoseryną/treoniną (pST). W celu usunięcia silnie naładowanych peptydów i ograniczenia supresji jonów, supernatant poddawany jest silnie kationowym wymienianiu jonowemu (SCX).12Oba preparaty poddawane są wzbogacaniu w fosfopeptydy. poprzez dwutlenek tytanu (TiO2)2). Po oczyszczeniu próbek przeprowadzono analizę za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) w celu pomiaru zawartości fosfopeptydów. Następnie surowe dane wprowadzono do oprogramowania do analizy MS w celu identyfikacji fosfopeptydów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Elektroforeza białek po trawieniu za pomocą Lys-C i trypsyny; wykres słupkowy analizy wzbogacenia fosforylacji.
Rysunek 2: Ocena trawienia. (A) Trzy próbki z 12.5 µg przedstawiły lizat przed trawieniem, po trawieniu Lys-C oraz po trawieniu trypsyną. Test z barwieniem żelu Coomassie wykazuje prawidłowe trawienie po sekwencyjnym użyciu Lys-C i trypsyny. Markery masy cząsteczkowej (MW) podano w kilodaltonach (kDa). (B) A obserwuje się zmniejszenie liczby pominiętych cięć po dodaniu Lys-C do protokołu. Odsetek fosfopeptydów bez pominiętych cięć wzrósł średnio z 48% do 64% dla preparatów wzbogaconych o pY oraz z 60% do 84% dla preparatów wzbogaconych o pST. Wykresy podsumowują dane uzyskane z dwóch eksperymentów przeprowadzonych bez użycia Lys-C oraz pięciu eksperymentów przeprowadzonych z użyciem Lys-C. Słupki błędów przedstawiają odchylenia standardowe dla 38 próbek pY i 38 próbek pST z 2 oddzielnych eksperymentów (bez Lys-C) oraz 62 próbek pY i 60 próbek pST z 5 oddzielnych eksperymentów (z Lys-C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy kołowe wzbogacenia fosforylacji; stosunki porównawcze pY, pS, pT; wyniki eksperymentalne.
Rysunek 3: Wzbogacanie fosfopeptydów pY i pST. Panele te przedstawiają procentową zawartość fosfopeptydów pSTY pochodzących z albo (A) pY lub (B) preparacje wzbogacania pST. Wzbogacenie pY za pomocą immunoprecypitacji pY i dwutlenku tytanu doprowadziło do uzyskania 85% fosfopeptydów będących peptydami pY, podczas gdy jedynie 0,1% fosfopeptydów w wzbogaceniu pST to pY. Wartości te uzyskano na podstawie analizy pliku Phospho (STY)Sites.txt z jednego reprezentatywnego eksperymentu po odfiltrowaniu zanieczyszczeń, sekwencji odwróconych oraz fosfopeptydów z prawdopodobieństwem lokalizacji mniejszym niż 0,75. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza fosforylacji białek; wykresy rozproszenia i wykresy kołowe porównujące stosunki pY do pST, analiza danych.
Rycina 4: Wzbogacanie fosfopeptydów za pomocą dwutlenku tytanu. (A) Przedstawiono procent wykrytych fosfopeptydów (w stosunku do całkowitej liczby peptydów) z próbek pochodzących z czterech oddzielnych eksperymentów. (B) Ten panel przedstawia średni skład peptydów monofosforylowanych, difosforylowanych i wielofosforylowanych w czterech oddzielnych eksperymentach. Słupki błędów w panelu A Są to odchylenia standardowe. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykresy słupkowe i rozproszenia analizujące procentową zawartość i identyfikację pY, pS, pT; wykresy skrzypcowe przedstawiają %CV.
Rysunek 5: Przewidywane identyfikacje reszt fosforylowanych. (A) Panel ten przedstawia prawdopodobieństwa lokalizacji fosforylacji dla identyfikatorów (ID) z wzbogacania pY (po lewej) oraz wzbogacania pST (po prawej). Średni procent ID, które spełniają > Przy progu prawdopodobieństwa 0,75 wartości wynoszą odpowiednio 93%, 75% i 52% dla pY, pS i pT. (B) średnia liczba identyfikatorów z a >Prawdopodobieństwo lokalizacji na poziomie 0,75 wynosi 30 dla pY, 7 50 dla pS oraz 640 dla pT.C) Ten panel przedstawia wykresy skrzypcowe procentowego współczynnika zmienności (%CV) fosfopeptydów. Ocena %CV była przeprowadzana wyłącznie w przypadku, gdy wartość natężenia sygnału została wykryta w każdej powtórzeniu biologicznym lub w grupie trzech powtórzeń. Dane pochodzą z czterech oddzielnych eksperymentów. Słupki błędów w panelach A i B Są to odchylenia standardowe z próbek 34 pY oraz 34 pST pochodzących z 4 oddzielnych eksperymentów. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

BuforObjętośćSkład
Bufor lizujący z 6 M chlorkiem guanidynium50 mL6 M chlorek guanidynium, 10 mM tris pH 8.5, 10 mM tris (2-karboksyetylo) fosfina, 40 mM chloroacetamid, 2 mM ortowanadan sodu, 2.5 mM pirofosforan sodu, 1 mM β-glicerofosforan, 50 mg n-oktyloglikozyd, woda ultra-czysta do osiągnięcia objętości
10 mM pirofosforan sodu50 mL2.23 g dekahydratu pirofosforanu sodu, woda ultra-czysta do osiągnięcia objętości
1M β-glicerofosforan50 mL15.31 g β-glicerofosforanu, woda ultra-czysta do osiągnięcia objętości
5% kwas trifluorooctowy20 mLDodać 1 mL 10% kwasu trifluorooctowego do 19 mL wody ultra-czystej
0.1% kwas trifluorooctowy250 mLDodać 5 mL 5% kwasu trifluorooctowego do 245 mL wody ultra-czystej
Bufor elucyjny pY250 mL0.1% kwas trifluorooctowy, 40% acetonitryl, woda ultra-czysta do osiągnięcia objętości
Bufor elucyjny pST250 mL0.1% kwas trifluorooctowy, 50% acetonitryl, woda ultra-czysta do osiągnięcia objętości
Bufor wiążący IP20 mL50 mM tris pH 7.4, 50 mM chlorek sodu, woda ultra-czysta do osiągnięcia objętości
25 mM wodorowęglan amonu, pH 7.510 mLRozpuścić 19.7 mg w 10 mL sterylnej wody ultra-czystej, dostosować pH do 7.5 za pomocą 1 N kwasu solnego (~10-15 µL/10 ml roztworu), przygotować świeżo
1M bufor fosforanowy, pH 71,0 mL423 mL 1 M wodorofosforanu sodu, 577 mL 1 M wodorofosforanu sodu
Bufor równoważący14 mL6.3 mL acetonitrylu, 280 µL 5% kwasu trifluorooctowego, 1740 µL kwasu mlekowego, 5.68 mL wody ultra-czystej
Bufor płuczący20 mL9 mL acetonitrylu, 40 µL 5% kwasu trifluorooctowego, 10.6 mL wody ultra-czystej
Roztwór do spektrometrii mas10 mL50 µL acetonitrylu, 20 µL 5% kwasu trifluorooctowego, 9.3 mL wody ultra-czystej
Bufor A250 mL5 mM fosforan monopotasu (pH 2.65), 30% acetonitryl, 5 mM chlorek potasu, woda ultra-czysta do osiągnięcia objętości
Bufor B250 mL5 mM fosforan monopotasu (pH 2.65), 30% acetonitryl, 350 mM chlorek potasu, woda ultra-czysta do osiągnięcia objętości
0.9% wodorotlenek amonu10 mL30 μL 29.42% wodorotlenku amonu, 9.7 mL wody ultra-czystej

Tabela 1: Bufor i roztwory. W tej tabeli przedstawiono składy buforów i roztworów wykorzystanych w niniejszym protokole.

Ustawienia LC-MS/MS
ParametrUstawienie pYKonfiguracja pST
Nakładanie próbek (µL)5
Szybkość przepływu podczas ładowania (µL/min)5
Przepływ gradientu (nL/min)300
Gradient liniowy (procentowo 0,16% kwasu mrówkowego, 80% ACN w 0,2% kwasie mrówkowym)4–15% przez 5 min4–15% przez 30 min
15–50% przez 40 min15–25% przez 40 min
50–90% przez 5 min25–50% przez 4 min
50–90% przez 1 min
Rozdzielczość pełnego skanowania120,000
Liczba wybranych jonów o największej intensywności20
Względna energia kolizji (%) (HCD)27
Dynamiczne wykluczanie (s)20

Tabela 2: Ustawienia LC-MS. Jest to przykład ustawień LC-MS w typowym eksperymencie fosfoproteomicznym typu shotgun. Próbki zostały naniesione na kolumnę pułapkującą. Kolumna pułapkująca została połączona szeregowo z kolumną analityczną. Ustawienia te zostały zoptymalizowane dla systemu LC-MS wymienionego w Tabeli materiałów i odczynników. W przypadku innych systemów LC-MS ustawienia te wymagałyby dostosowania.

Ustawienia parametrów programu MaxQuant
Warunki doświadczalneDziałanie
Parametry specyficzne dla grupy
TypTypWybierz standard
Krotność infekcjiUstawiono na 1
Tryb trawieniaEnzymWybierz Trypsynę/P
Maks. liczba pominiętych cięćUstawić na 2
ModyfikacjeModyfikacje zmiennychDodaj Phospho (STY)
Kwantyfikacja bez użycia znacznikówKwantyfikacja bez użycia znacznikówWybierz LFQ
minimalny licznik stosunku LFQUstawić na 1
Szybka kwantyfikacja bezetykietowa (Fast LFQ)Odznacz
RóżnorodnePonowne oznaczanie ilościoweZaznacz
Parametry globalne
Sekwencjepliki FASTAWybierz plik fasta pobrany z UniProt
Modyfikacje stałeDodanie grupy karbamidometylowej (C)
Zaawansowana identyfikacjaZgodność między seriami pomiarowymiOdznacz
Okno dopasowania czasowegoUstawić na 5 min
Okno czasowe dopasowaniaUstawić na 20 min
Dopasowanie niezidentyfikowanych cechZaznacz
Oznaczanie ilości białkaMinimalna liczba zliczeń w stosunkuUstawiono na 1
Lokalizacje folderówZmodyfikować odpowiednio

Tabela 3: Ustawienia oprogramowania do analizy MS. W programie MaxQuant wybrano lub dostosowano parametry specyficzne dla grup oraz parametry globalne przedstawione w tej tabeli. Wszystkie pozostałe parametry pozostały ustawione domyślnie. Eksperymenty przeprowadzono przy użyciu wersji 1.5.3.30. Parametry mogą różnić się w zależności od wersji i oprogramowania.

Dyskusja

Przed zastosowaniem tego protokołu do wzbogacenia o fosfopeptydy, kluczowe znaczenie ma dokładne rozważenie projektu eksperymentalnego. Stosowanie kontrprób biologicznych jest bardziej opłacalnym wykorzystaniem zasobów spektrometrii mas niż kontrprób technicznych. Liczba powtórzeń, które są niezbędne, będzie częściowo zależeć od zmienności danych. Niedawne badanie wykazało, że podczas gdy zwiększenie liczby powtórzeń powyżej trzech tylko nieznacznie zwiększa liczbę identyfikacji, liczba znaczących identyfikacji między grupami wzrasta wraz ze wzrostem liczby powtórzeń10.

Ze względu na mniejszą obfitość fosfoprotein w komórce, wystarczające początkowe ilości białka są niezbędne do uzyskania globalnego fosfoproteomu z próbek raka prostaty w trybie odkrywania. W tych eksperymentach użyto 5 mg białka. Około pięciu prawie zlewających się 15-centymetrowych szalek komórek dostarcza wystarczającą ilość białka jako dane wejściowe do tego protokołu, chociaż będzie to zależne od linii komórkowej. Jeśli chodzi o tkankę nowotworową, oczekiwany uzysk białka wynosi około 6 - 8% masy tkanki. W warunkach in vitro dodatnią próbą kontrolną, którą należy wziąć pod uwagę, jest dodanie 1 mM wanadanu na 30 minut przed pobraniem komórek. Wanadan, kompetycyjny inhibitor fosfatazy fosfatazy fosfotyrozylowej białka, zachowa fosforylację tyrozyny, zwiększając w ten sposób liczbę identyfikacji peptydów pY29.

Czyste trawienie jest kluczowym krokiem do maksymalizacji identyfikacji fosfopeptydu. Oprócz testu barwienia Coomassie, procent pominiętych rozszczepień w danych może być wykorzystany do oceny efektywności trawienia (ryc. 2). Dostępne jest oprogramowanie do kontroli jakości, które analizuje pominięte rozszczepienia i inne wskaźniki w celu oceny jakości danych MS30. Chociaż trypsyna jest najpowszechniejsza, dostępne są alternatywne proteazy5 w celu wypełnienia luk w pokryciu w proteomie, w których nie można wytworzyć optymalnych peptydów tryptycznych31. Ustawienia oprogramowania do analizy stwardnienia rozsianego musiałyby zostać odpowiednio zmodyfikowane, aby dostosować się do zmian w proteazach.

W protokole stosuje się immunoprecypitację (w celu wzbogacenia pY), a także dwutlenek tytanu (TiO2) w celu wzbogacenia w fosfopeptydy. Alternatywne podejścia do wzbogacania peptydów obejmują chromatografię powinowactwa do unieruchomionych metali (IMAC), inne tlenki metali do chromatografii powinowactwa tlenków metali (MOAC), takie jak wodorotlenek glinu, oraz wychwytywanie powinowactwa jonów metali na bazie polimerów (PolyMAC)5,12. Wcześniejsze badania wykazały, że różne metody wzbogacania wzbogacają fosforeptydy w różnych populacjach32. Na przykład IMAC wzbogaca więcej peptydów wielofosforylowanych, podczas gdy MOAC korzystnie wzbogaca peptydy monofosforylowane33. Reprezentatywne wyniki tego protokołu odzwierciedlają tę obserwację (rysunek 4B). Niedawna publikacja wykazała, że połączenie IMAC i MOAC przy użyciu materiału hybrydowego może potencjalnie zapewnić większe pokrycie gatunkami fosfopeptydów34. W związku z tym protokół ten może zostać zmodyfikowany w celu równoległego wykorzystania innych metod wzbogacania, aby umożliwić jeszcze bardziej kompleksowe analizy fosfoproteomiczne.

Pakiet oprogramowania MaxQuant26 służy do analizy danych MS w tym protokole, ale dostępne są również aplikacje komercyjne35 do identyfikacji i kwantyfikacji fosfopeptydów. Do identyfikacji fosfopeptydu stosuje się punkt odcięcia prawdopodobieństwa lokalizacji. Filtr ten przeprowadza się w celu selekcji fosfopeptydów z dużą pewnością (tj. większą niż 0,75) w identyfikacji fosforeszt10,28. Innymi słowy, zsumowane prawdopodobieństwo wszystkich innych reszt, które mogą potencjalnie zawierać fosfogrupę, jest mniejsze niż 0,25. To odcięcie może zostać podniesione, aby zwiększyć rygorystyczność selekcji fosfopeptydów. Jeśli chodzi o liczbę identyfikacji, oczekiwana liczba peptydów pY wynosi setki, podczas gdy oczekiwana liczba peptydów pST wynosi tysiące metrów. Wartości te odzwierciedlają wcześniej obserwowany rozkład fosfoproteomu, gdzie około 2%, 12% i 86% fosfozytów to odpowiednio pY, pT i pS28.

Jeśli etapy wzbogacania pY i pST są wykonywane równolegle, etapy przygotowania próbki w protokole mogą zostać zakończone w ciągu sześciu dni. W połączeniu z potężnym narzędziem, jakim jest stwardnienie rozsiane, protokoły wzbogacania fosfopeptydów, takie jak ten, zapewniają naukowcom globalne podejście do gromadzenia danych do analizy fosfoproteomu w ich odpowiednich dziedzinach badawczych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy członkom laboratorium Drake'a za udzielanie porad i wkład w manuskrypt. Dziękujemy również członkom Zakładu Biologicznej Spektrometrii Mas Szkoły Medycznej Roberta Wooda Johnsona i Rutgers, Uniwersytetu Stanowego New Jersey za udzielanie porad i wykonywanie spektrometrii mas na naszych próbkach. Larry C. Cheng jest wspierany przez Narodowy Instytut Ogólnych Nauk Medycznych Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach nagrody o numerze T32 GM008339. Thomas G. Graeber jest wspierany przez NCI/NIH (SPORE in Prostate Cancer P50 CA092131; P01 CA168585) oraz nagrodę American Cancer Society Research Scholar Award (RSG-12-257-01-TBE). Justin M. Drake jest wspierany przez Program Badań nad Rakiem Prostaty Departamentu Obrony W81XWH-15-1-0236, Nagrodę Młodego Badacza Fundacji Raka Prostaty, New Jersey Health Foundation oraz Nagrodę Pilotażową Inicjatywy Medycyny Precyzyjnej przyznaną przez Rutgers Cancer Institute w New Jersey.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zamrażarka niskotemperaturowaZamrażarka PanasonicMDF-U76V
-20 & CVWRscpmf-2020
Łyżka z wirnikiem obrotowymThermoFisher Scientific75004377
Kolektor próżniowyRestek26080
LiofilizatorLabconco7420020
Koncentrator próżniowy stołowy CentriVapLabconco7810010
Rotator end-over-endThermoFisher Scientific415110Q
ŻyletkaFisher Scientific620177
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15Millipore SigmaUFC901024
Szklane probówki hodowlaneFisher Scientific14-961-26
ParafilmFisher Scientific13-374-12
Igła 20GBDB305175
KimwipesFisher Scientific06-666A
ThermoFisher Scientific379189
Nunc 15 mL rurki stożkoweThermoFisher Scientific12-565-268
Końcówki do ładowania żelemFisher Scientific02-707-181
Milipory 0,2 i mikro; m filtr spinowyMillipore SigmaUFC30GVNB
Probówki Eppendorfa o niskim poziomie wiązania białekEppendorf 22431081
anty-fosfotyrozyna, agaroza, klon: 4G10Przeciwciało Millipore Sigma16101
27B10.4CytoszkieletAPY03-kulki
Zestaw do oznaczania peptydówThermo Scientific23275Krok 7
TopTipPolyLC IncTT200TIO.96Kroki 5 i 9
Kolumny SCX (PoliSULFOETYL A)PolyLC IncSPESE1203
3 ml strzykawkaBD309657
Kwas trifluorooctowy (TFA)Fisher ScientificPI-28904
Acetonitryl (ACN)Fisher ScientificA21-1
Kwas mlekowy Sigma-Aldrich69785-250ML
Wodorotlenek amonuFisher ScientificA669S-500
Jednozasadowy fosforan potasuFisher ScientificBP362-500
Chlorek potasuFisher ScientificBP366-500
Dwuwodny chlorek wapniaFisher ScientificBP510-500
Tris BaseFisher ScientificBP152-5
Trypsyna, TPCK traktowaneWorthington BiochemicalsLS003740
Lysyl EndopeptidazaWako Pure Chemical Industries, Ltd.125-05061
MonoTipPolyLC IncTT200TIO.96Krok 10
ZipTipMilliporeSigmaZTC18S096Krok 6
nanoEase, MZ peptyd BEH C18, 130A, 1.7 μ m, 75 i mu; m x 20 cmWody186008794Krok 11: kolumna analityczna
Uznanie PepMap 100 C18 LC Kolumny ThermoFisherScientific164535 Krok 11: kolumna pułapkowa
Ultimate 3000 RLSCnano SystemDionexULTIM3000RSLCNANOStep 11
Q Exactive HFThermoFisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBFZKrok 11
WodaMilliQwoda dejonizowana używana do przygotowania wszystkich roztworów i
Dysmembrator sonicznyFisher ScientificHomogenizator FB-120
Polytron System PTKinematica AGPT 10-35 GT
Zakrętka kriorurka

Bibliografia

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  2. Paller, C. J., Antonarakis, E. S. Management of biochemically recurrent prostate cancer after local therapy: evolving standards of care and new directions. Clinical Advances in Hematology & Oncology. 11 (1), 14-23 (2013).
  3. Lowrance, W. T., Roth, B. J., Kirkby, E., Murad, M. H., Cookson, M. S. Castration-resistant prostate cancer: AUA guideline amendment 2015. The Journal of Urology. 195 (5), 1444-1452 (2016).
  4. Domon, B., Aebersold, R. Options and considerations when selecting a quantitative proteomics strategy. Nature Biotechnology. 28 (7), 710-721 (2010).
  5. Zhang, Y. Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chemical Reviews. 113 (4), 2343-2394 (2013).
  6. Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389 (4), 1017-1031 (2007).
  7. Bantscheff, M., Lemeer, S., Savitski, M. M., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: critical review update from 2007 to the present. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (4), 939-965 (2012).
  8. Cox, J., et al. Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).
  9. Rubbi, L., et al. Global phosphoproteomics reveals crosstalk between Bcr-Abl and negative feedback mechanisms controlling Src signaling. Science Signaling. 4 (166), ra18(2011).
  10. Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045(2018).
  11. Rush, J., et al. Immunoaffinity profiling of tyrosine phosphorylation in cancer cells. Nature Biotechnology. 23 (1), 94-101 (2005).
  12. Fila, J., Honys, D. Enrichment techniques employed in phosphoproteomics. Amino Acids. 43 (3), 1025-1047 (2012).
  13. Mertins, P., et al. Proteogenomics connects somatic mutations to signalling in breast cancer. Nature. 534 (7605), 55-62 (2016).
  14. Drake, J. M., et al. Phosphoproteome integration reveals patient-specific networks in prostate cancer. Cell. 166 (4), 1041-1054 (2016).
  15. Lue, H. W., et al. Metabolic reprogramming ensures cancer cell survival despite oncogenic signaling blockade. Genes & Development. 31 (20), 2067-2084 (2017).
  16. Francavilla, C., et al. Phosphoproteomics of primary cells reveals druggable kinase signatures in ovarian cancer. Cell Reports. 18 (13), 3242-3256 (2017).
  17. Zhang, H., et al. Integrated proteogenomic characterization of human high-grade serous ovarian cancer. Cell. 166 (3), 755-765 (2016).
  18. Skaggs, B. J., et al. Phosphorylation of the ATP-binding loop directs oncogenicity of drug-resistant BCR-ABL mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (51), 19466-19471 (2006).
  19. Zimman, A., et al. Activation of aortic endothelial cells by oxidized phospholipids: a phosphoproteomic analysis. Journal of Proteome Research. 9 (6), 2812-2824 (2010).
  20. Zimman, A., Berliner, J. A., Graeber, T. G. Phosphoproteomic analysis of aortic endothelial cells activated by oxidized phospholipids. Methods in Molecular Biology. , 53-69 (2013).
  21. Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
  22. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  23. Meyer, T. S., Lamberts, B. L. Use of coomassie brilliant blue R250 for the electrophoresis of microgram quantities of parotid saliva proteins on acrylamide-gel strips. Biochimica el Biophysica Acta. 107 (1), 144-145 (1965).
  24. Bergstrom Lind, S., et al. Immunoaffinity enrichments followed by mass spectrometric detection for studying global protein tyrosine phosphorylation. Journal of Proteome Research. 7 (7), 2897-2910 (2008).
  25. Pinkse, M. W., Uitto, P. M., Hilhorst, M. J., Ooms, B., Heck, A. J. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns. Analytical Chemistry. 76 (14), 3935-3943 (2004).
  26. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  27. Cox, J., et al. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment. Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).
  28. Olsen, J. V., et al. Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks. Cell. 127 (3), 635-648 (2006).
  29. Huyer, G., et al. Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate. The Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).
  30. Bielow, C., Mastrobuoni, G., Kempa, S. Proteomics quality control: quality control software for MaxQuant results. Journal of Proteome Research. 15 (3), 777-787 (2016).
  31. Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics. Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).
  32. Bodenmiller, B., Mueller, L. N., Mueller, M., Domon, B., Aebersold, R. Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome. Nature Methods. 4 (3), 231-237 (2007).
  33. Leitner, A., Sturm, M., Lindner, W. Tools for analyzing the phosphoproteome and other phosphorylated biomolecules: a review. Analytica Chimica Acta. 703 (1), 19-30 (2011).
  34. Yang, D. S., et al. Design and synthesis of an immobilized metal affinity chromatography and metal oxide affinity chromatography hybrid material for improved phosphopeptide enrichment. Journal of Chromatography A. 1505, 56-62 (2017).
  35. Al Shweiki, M. R., et al. Assessment of label-free quantification in discovery proteomics and impact of technological factors and natural variability of protein abundance. Journal of Proteome Research. 16 (4), 1410-1424 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fosfoproteom raka prostatytrawienie bia ekimmunoprecypitacjawzbogacanie dwutlenkiem tytanuchromatografia cieczowa sprz ona z spektrometri maswzbogacanie fosfotyrozynywzbogacanie fosfoseryny i fosfotreoninyanaliza spektrometryczna

Powiązane artykuły