Artykuł metodologiczny

Przewodnik CRISPR Klonowanie RNA dla systemów ssaków

77.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57998

⸱

2 października 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 2Department of Genetics, Harvard Medical School, 3Department of Pathology, Massachusetts General Hospital, 4Institute for Medical Engineering & Science, Massachusetts Institute of Technology, 5Synthetic Biology Center, Massachusetts Institute of Technology, 6Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 7Broad Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiono prostą, efektywną i opłacalną metodę klonowania sgRNA.

Streszczenie

Opisany protokół opisuje uproszczone metody wydajnego i opłacalnego generowania przewodników RNA związanych z Cas9. Przedstawiono dwie alternatywne strategie klonowania przewodnikowego RNA (gRNA) w oparciu o użycie enzymu restrykcyjnego typu IIS BsmBI w połączeniu z zestawem kompatybilnych wektorów. Poza dostępem do usług sekwencjonowania Sangera w celu walidacji wygenerowanych wektorów, nie jest wymagany żaden specjalny sprzęt ani odczynniki poza tymi, które są standardem w nowoczesnych laboratoriach biologii molekularnej. Opisana metoda jest przeznaczona przede wszystkim do klonowania jednego pojedynczego gRNA lub jednego sparowanego wektora wykazującego ekspresję gRNA na raz. Ta procedura nie skaluje się dobrze w przypadku generowania bibliotek zawierających tysiące gRNA. W tym celu zaleca się alternatywne źródła syntezy oligonukleotydów, takie jak synteza oligonukleotydów. Wreszcie, podczas gdy protokół ten koncentruje się na zestawie wektorów ssaków, ogólna strategia jest plastyczna i ma zastosowanie do każdego organizmu, jeśli dostępny jest odpowiedni wektor gRNA.

Wprowadzenie

Białko 9 (Cas9) związane z CRISPR jest endonukleazą kierowaną przez RNA, która jest kierowana na pożądany cel genomowy, gdy jest skompleksowana z odpowiednio zaprojektowanym małym przewodnikiem RNA (gRNA)1,2. gRNA składają się z 20-nukleotydowej sekwencji (protospacer), która jest komplementarna do genomowej sekwencji docelowej. Obok genomowej sekwencji docelowej znajduje się motyw związany z protospacerem (PAM) o długości 3', który jest niezbędny do wiązania Cas9. W przypadku Streptococcus Pyogenes Cas9 (SpCas9) ma to sekwencję NGG. Po związaniu celu DNA, Cas9 rozszczepia obie nici DNA, stymulując w ten sposób mechanizmy naprawcze, które można wykorzystać do modyfikacji miejsca zainteresowania. Aktywacja podatnego na błędy szlaku niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) może spowodować zakłócenie docelowego genu. Alternatywnie, naprawy dokonane za pomocą rekombinacji homologicznej mogą stymulować ukierunkowaną integrację pożądanej sekwencji DNA, jeśli dostarczony jest szablon dawcy6. Warianty Cas9 z martwym nukleazą (dCas9) mogą być również generowane3 poprzez mutację reszt w Cas9, które są niezbędne dla aktywności endonukleolitycznej. dCas9 pozostaje zdolny do wiązania DNA, ale nie przecina związanego celu. Łącząc różne domeny efektorowe z dCas9 i kierując je w pobliże miejsca rozpoczęcia transkrypcji genu, dCas9 może być używany do selektywnej indukcji genów lub częściowego wyciszania genów4,5.

Chociaż niezwykle potężne, możliwość użycia Cas9 do celowania w sekwencję genomową wymaga, aby użytkownik najpierw wygenerował gRNA unikalne dla docelowego miejsca (miejsc). Wcześniej opisano różne metody budowy wektorów ekspresji gRNA, wiele z nich o różnej wydajności i kosztach6,7,8. Samodzielne amplikony PCR mogą być używane jako gRNA do szybkich badań przesiewowych, przechodząc od dostarczenia oligonukleotydów do transfekcji w ciągu kilku godzin; wymaga to jednak syntezy oligo Ultramerów (ponad 100 pz), która jest kosztowna9. Możliwy jest również zakup gBlocków, które są bardziej opłacalne niż Ultramery. Ponieważ Cas9 szybko stał się integralnym elementem nowoczesnego zestawu narzędzi biologii molekularnej, prosta, niedroga i wysoce wydajna metoda klonowania gRNA byłaby dobrodziejstwem dla tej dziedziny. Opisana tutaj metoda jest stosowana w naszej grupie i współpracujących laboratoriach od kilku lat w celu wygenerowania ponad 2000 unikalnych gRNAs4.

Opisana metoda skupia się na technikach klonowania kompatybilnych wektorów lentiwirusowych zawierających pojedyncze gRNA lub co najwyżej dwa gRNA. Do generowania plazmidów zawierających więcej niż dwa gRNA lub do klonowania biblioteki gRNA zalecane są alternatywne podejścia9,10,11,12.

Protokół

Uwaga: Poniższy protokół opisuje sposób projektowania gRNA przy użyciu narzędzi online (kroki 1.1 - 1.4), które są wspólne dla wszystkich metod konstrukcji plazmidów gRNA szczegółowo opisanych w niniejszym opracowaniu. Po zidentyfikowaniu pożądanych gRNA opisano kroki zamawiania niezbędnych oligonukleotydów wraz z kilkoma różnymi metodami wprowadzania oligonukleotydów do wektorów ekspresyjnych (np., pSB700). Przedstawiono dwie metody klonowania wektorów wykazujących ekspresję pojedynczego przewodnika, opierające się odpowiednio na ligacji do uprzednio przetrawionego wektora ekspresyjnego (kroki 2 - 7.3) lub klonowaniu Golden Gate (kroki 8 - 8.4). Dalsza część opisuje strategię klonowania wektorów wykazujących ekspresję sparowanych przewodników z wykorzystaniem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), a następnie klonowania Golden Gate (kroki 11 - 16). Na koniec przedstawiono powszechne metody przeprowadzania transformacji chemicznej E. coli (kroki 9 - 9.6) oraz walidacji sekwencji wektora ekspresyjnego (kroki 10 do 10.2.3).

  1. Zaprojektuj oligonukleotydy gRNA za pomocą narzędzi online w następujący sposób.
    1. Zaprojektuj gRNA korzystając z narzędzi online, takich jak sgRNA Scorer 2.0 (https://crispr.med.harvard.edu/sgRNAScorerV2/)13 lub alternatyw, takich jak narzędzie Broad sgRNA design (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design)14 oraz kilku innych15.
    2. Użyj nazwy genu, symbolu lub surowych sekwencji docelowych DNA, aby wygenerować potencjalne sekwencje gRNA.
      Uwaga: Tworzony jest plik arkusza kalkulacyjnego (.csv/.xls) ze wszystkimi potencjalnymi gRNA przeciwko danemu genowi lub dostarczonej sekwencji. Jakość potencjalnych gRNA będzie raportowana jako Score w przypadku użycia narzędzia sgRNA Scorer 2.0 lub jako % on-target efficiency w przypadku użycia narzędzia Broad sgRNA design. Oba parametry są oparte na aktywności cięcia w miejscu docelowym.
    3. Podczas rankingu gRNA w procesie ich selekcji weź pod uwagę Off-target activity.
      Uwaga: Optymalne przewodniki to takie, które wykazują największą wydajność w miejscu docelowym (on-target efficiency) i najmniejszą aktywność poza celem (off-target activity). Dla aktywacji (CRISPRa) gRNA projektuje się tak, aby celowały w region od 1 do 200 bp powyżej miejsca startu transkrypcji (TSS)4,15. Dla inhibicji (CRISPRi) gRNA projektuje się tak, aby celowały w region od 50 bp powyżej TSS do 300 bp poniżej TSS5. Aby wyłączyć gen za pomocą cięcia Cas9, gRNA projektuje się tak, aby celowały w pierwsze 10-50% sekwencji kodującej poniżej kodonu startowego (ponieważ wykazano, że gRNA celujące w koniec 3’ genu są mniej skuteczne)13.
    4. Upewnij się, że nie występują wewnętrzne miejsca BsmBI, jeśli oligonukleotydy są używane do klonowania Golden Gate, ponieważ spowoduje to trawienie zdenaturowanych oligonukleotydów13.
  2. Wybierz genomowe sekwencje docelowe i usuń 3’ NGG PAM (pozostawiając tylko sekwencję protospacera) dla modyfikacji sekwencji pojedynczego oligonukleotydu gRNA (np. sekwencja startowa: CGCGTGCTCTCCCTCATCCATGG).
    Uwaga: W przypadku użycia arkusza kalkulacyjnego następująca formuła usunie 3’ NGG: =LEFT(A2,LEN(A2)-3), gdzie A2 jest komórką zawierającą sekwencję docelową i PAM.
    1. Dopisz CACCG do końca 5’ oligo.
      Uwaga: Po ligacji do szkieletu pSB700 sekwencja ta będzie stanowić koniec 3’ promotora U6 sterującego transkrypcją gRNA. Sekwencja „CACC” zapewnia kompatybilność oligo z nawisami wektora pSB700 trawionego przez BsmBI. „G” jest wymagane przez promotory polimerazy III i zapewnia efektywne zainicjowanie transkrypcji gRNA. Aby wykonać to zadanie w arkuszu kalkulacyjnym, użyj następującej formuły: =CONCATENATE(“CACCG”,(B2)), gdzie B2 jest komórką zawierającą sekwencję protospacera [np. dodanie sekwencji 5’ CACCG do protospacera: CACCGCGCGTGCTCTCCCTCATCCA (jest to końcowy oligo forward, który należy zamówić)].
    2. Utwórz komplementarną odwróconą sekwencję (rc) protospacera.
      Uwaga: Na przykład komplementarna odwrócona sekwencja wspomnianego protospacera to TGGATGAGGGAGAGCACGCG.
    3. Dopisz AAAC do końca 5’ rc protospacera. Dopisz dodatkowe C do końca 3’ rc protospacera (oligo reverse).
      Uwaga: Sekwencja „AAAC” zapewnia kompatybilność oligo do klonowania w wektorze pSB700 trawionym przez BsmBI. Dodatkowe „C” na końcu 3’ jest niezbędne do sparowania sekwencji z inicjującym „G” dodanym do oligo forward. Aby wykonać to zadanie w arkuszu kalkulacyjnym, użyj następującej formuły =CONCATENATE(“AAAC”,(C2),”C”), gdzie C2 jest komórką zawierającą sekwencję komplementarną odwróconą [np. AAACTGGATGAGGGAGAGCACGCGC (jest to końcowy oligo reverse, który należy zamówić)].
  3. Zamów oligonukleotydy bez żadnych dodatkowych modyfikacji.
    1. Zamów minimalną wymaganą ilość oligo, ponieważ do reakcji klonowania potrzebne są jedynie bardzo małe ilości.
  4. Rozcieńcz liofilizowane primery do końcowego stężenia 100 μM w buforze 1x TE (10 mM Tris-Cl, pH 7.5 z 1 mM EDTA).
  5. Rozdziel oligonukleotydy forward i reverse w stosunku 1:1 (np. po 10 μL każdego) do probówek PCR typu strip-cap.
    Uwaga: Pozwoli to na szybkie klonowanie wielu gRNA jednocześnie przy użyciu pipety wielokanałowej.
    1. Wymieszaj na wirówce (vortex) i odwirowuj mieszaniny oligo (100 x g przez 15 s). Inkubuj reakcję w temperaturze pokojowej przez 5 min przed przygotowaniem ligacji.
      Uwaga: Nie ma potrzeby podgrzewania, a następnie chłodzenia mieszanin oligo w celu ułatwienia ich hybrydyzacji. Warto zauważyć, że 3-4 pary oligonukleotydów gRNA mogą być połączone i poddane hybrydyzacji w jednej reakcji (np. zmieszaj 3 μL oligonukleotydów forward i 3 μL reverse z maksymalnie 4 par oligo gRNA, co da całkowitą objętość 24 μL). Objętość oligonukleotydów użytych do hybrydyzacji można dostosować do potrzeb użytkownika.
      Uwaga: Kroki 6-7.3 opisują wstępne trawienie pSB700. Alternatywną metodę opisano w kroku 8, który dotyczy jednoczesnej restrykcji BsmBI i ligacji.
  6. Przetraw 1-5 μg wybranego wektora ekspresyjnego przewodnika pSB700 za pomocą BsmBI (0,5 μL na 1 μg) przez 1 h w 55 °C15. Trawienie wektora ekspresyjnego gRNA pSB700 przeprowadź w całkowitej objętości 40 μL (Tabela 1).
    1. Rozdziel produkty trawienia na żelu agarozowym 1,5% (mas/obj) o niskiej temperaturze topnienia.
    2. Wytnij prążek trawionego szkieletu wektora odpowiadający fragmentowi o wielkości ~9 kb i umieść wycinek żelu w probówce mikrocentryfugowej 1,5 mL (Rysunek 1).
    3. Użyj komercyjnego zestawu do oczyszczania żelu, aby wyekstrahować DNA z żelu agarozowego zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Eluuj DNA do 10-15 μL buforu TE (10 mM Tris, pH 7.5; 10 mM Tris, pH 8.0), aby uzyskać skoncentrowany eluat.
  7. Przeprowadź ligację zhybrydyzowanych oligonukleotydów gRNA z kroku 4 do wektora ekspresyjnego pSB700 trawionego przez BsmBI w reakcji 20 μL (Tabela 2) w celu klonowania oligonukleotydów gRNA do wstępnie przetrawionego wektora ekspresyjnego pSB700.
    1. Najpierw dodaj wodę, bufor i DNA, następnie wymieszaj mieszaninę na vortexie i dodaj enzym, ponownie wymieszaj na vortexie po dodaniu enzymu i odwirowuj roztwór (100 x g przez 15 s). Inkubuj reakcje w temperaturze pokojowej przez noc.
    2. Dołącz reakcję kontrolną negatywną bez wkładki, zawierającą jedynie wektor trawiony przez BsmBI, bez zhybrydyzowanego wkładu oligo gRNA. Zamiast 1 μL oligonukleotydów gRNA w kontroli negatywnej można użyć 1 μL wody.
    3. Przejdź do transformacji (krok 9).
      Uwaga: Krok 8 jest alternatywną metodą względem wstępnego trawienia pSB700 opisanego w krokach 6-7.3.
  8. Wprowadź oligonukleotydy gRNA (opisane w krokach 1-5.1) do wektora pSB700 za pomocą klonowania Golden Gate dla jednoczesnej restrykcji BsmBI i ligacji.
    1. Przygotuj master mix (1x) — jeśli klonowanych jest wiele gRNA, przygotuj master mix bez dodatku oligonukleotydów wkładki (Tabela 3). Rozdziel master mix do probówek PCR i użyj pipety wielokanałowej, aby dodać oligonukleotydy gRNA z kroku 4.2. Dołącz kontrolę bez wkładki, używając 1 μL wody.
    2. Poprzez umieszczenie enzymu BsmBI i ligazy DNA T4 w tej samej reakcji uzyskuje się jednoczesne trawienie restrykcyjne i ligację (tj. klonowanie Golden Gate). Użyj następującego protokołu Simple Gate, aby przetrawić wektor i zligować wkładki w jednej reakcji: utrzymuj reakcję w 37 °C przez 2 h, w 50 °C przez 10 min, w 65 °C przez 15 min, w 80 °C przez 15 min, a na koniec w 4 °C.
      1. Należy zweryfikować, czy oligonukleotydy nie zawierają miejsc BsmBI przed zastosowaniem tej metody. Jeśli klonowane gRNA zawierają miejsca restrykcyjne BsmBI, zostaną one przetrawione po dodaniu BsmBI. Uniemożliwi to uzyskanie jakichkolwiek transformantów.
    3. Po wstępnej reakcji Simple Gate dodaj do każdej reakcji dodatkowe 0,5 μL enzymu BsmBI i inkubuj je ponownie w 55 °C przez 1 h. Po trawieniu utrzymuj reakcję w 4 °C lub zamroź do czasu transformacji. Ta druga runda inkubacji z enzymem restrykcyjnym usuwa z mieszaniny reakcyjnej wszelkie nietrawione lub religowane wektory pSB700 typu dzikiego, tak aby nienaruszone pozostały tylko wektory, które otrzymały wkładki oligo, i które dadzą transformanty.
    4. Przejdź do transformacji (krok 9).
  9. Transformuj 0,5 μL mieszaniny reakcyjnej do 8 μL kompetentnych komórek E. coli [np. NEB DH5a (1-3 x 109 cfu/µg DNA pUC19) lub NEB Stable 1-3 x 109 cfu/µg DNA pUC19). W przypadku plazmidów lentiwirusowych komórki NEB Stable zapewnią bardziej powtarzalne wydajności plazmidu.
    1. Wyjmij E. coli z przechowywania w -80 °C i rozmrażaj na lodzie przez 5-10 min.
    2. Dodaj 0,5 μL mieszaniny reakcyjnej do 8 μL kompetentnych E. coli i trzymaj mieszaninę na lodzie przez 30 min.
    3. Przeprowadź szok termiczny mieszaniny w 42 °C przez 45 s.
    4. Pozostaw na lodzie przez 2 min.
    5. Regeneruj kulturę na wytrząsarce obrotowej w 250 μL pożywki SOC przez 1 h w 37 °C dla NEB DH5a i w 30 °C dla NEB Stables.
    6. Wysiej 80 μL kultury na odpowiednią płytkę z pożywką Lysogeny Broth (LB) z antybiotykiem i inkubuj przez noc w 37 °C dla NEB DH5a i w 30 °C dla NEB Stables [np. pSB700 wysiewa się na płytki LB z ampicyliną (100 μg/mL)] (Rysunek 3).
  10. Zwaliduj sekwencję plazmidu ekspresyjnego gRNA: zweryfikuj sekwencję każdej kolonii za pomocą sekwencjonowania Sangera, używając primera 5’-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3’, który wiąże się z promotorem U6 powyżej wkładki oligo gRNA.
    1. Wybierz 2-3 kolonie z reakcji do sekwencjonowania (Tabela 4).
      Uwaga: Kilku dostawców sekwencjonowania oferuje obecnie usługi sekwencjonowania Sangera bezpośrednio z kolonii bakteryjnych, co znacznie skraca czas i obniża koszty poprzez wyeliminowanie konieczności oczyszczania plazmidów przed sekwencjonowaniem. Alternatywnie można użyć zestawu do izolacji plazmidów, aby odzyskać plazmidowe DNA z poszczególnych klonów bakteryjnych. Oczyszczone plazmidy można następnie przekazać do sekwencjonowania. W przypadku przeprowadzenia połączonej reakcji ligacji, użyj Tabeli 4 jako wskazówki co do liczby kolonii, które należy wybrać i przekazać do sekwencjonowania.
    2. Po potwierdzeniu sekwencji wyizoluj plazmidy ekspresyjne gRNA.
      1. Użyj sterylnego końcówki do pipety, aby zaszczepić wybraną kolonię do 5 mL kultury pożywki LB zawierającej 100 μg/mL ampicyliny dla wektorów ekspresyjnych pSB700.
      2. Hoduj komórki w inkubatorze obrotowym przy 100 obr/min w 37 °C przez noc (30 °C w przypadku użycia NEB Stables).
      3. Wyizoluj plazmidowe DNA z kultur za pomocą zestawu do preparatyki plazmidów, zgodnie z protokołem producenta.
        Uwaga: Chociaż powyższe metody umożliwiają użytkownikom tworzenie wektorów zawierających pojedyncze gRNA, niniejszy protokół pozwoli na tworzenie wektorów zawierających 2 gRNA, z których każdy jest sterowany przez własny promotor polimerazy RNA III.
  11. W przypadku projektusparowanego gRNA użyj pliku wynikowego z narzędzi do projektowania sgRNA opisanych powyżej (kroki 1.1-1.4) i wybierz 2 interesujące przewodniki.
    1. W przypadku aktywacji lub represji wybierz pary przewodników oddalonych od siebie o co najmniej 30 nt.
    2. Dla gRNA używanych do cięcia wybierz przewodniki celujące w 2 różne eksony w obrębie genu.
  12. W instrukcjach poniżej określ pierwsze gRNA w macierzy jako gRNA-A, a drugie gRNA w macierzy jako gRNA-B, aby stworzyć modyfikację sekwencji sparowanych oligonukleotydów gRNA.
    Uwaga: Oligo użyte do stworzenia gRNA-A będzie nazywane fA, a oligo reverse użyte do wprowadzenia gRNA-B będzie określane jako rB. Poniższa metoda klonowania automatycznie dopisuje inicjujące G na końcu 5’ każdego z gRNA.
    1. Utwórz odpowiednie oligo fA w następujący sposób.
      Uwaga: 20 nukleotydów stanowiących sekwencję celującą gRNA dla gRNA-A będzie stanowić początkową sekwencję fA, na której będą budowane następne kroki (np. protospacer - aggggctacaccactcattg).
      1. Dopisz TTTTCGTCTCTCACCG do końca 5’ fA (np. do sekwencji TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattg).
      2. Dopisz GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA do końca 3’ fA (np. do sekwencji TTTTCGTCTCTCACCGaggggctacaccactcattgGTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA). Jest to końcowa wersja oligo fA, którą należy zamówić.
    2. Utwórz niezbędne oligo rB w następujący sposób.
      Uwaga: 20 nukleotydów stanowiących sekwencję celującą gRNA dla gRNA-B będzie stanowić początkową sekwencję rB, na której będą budowane następne kroki (np. z sekwencji startowej gtcccctccaccccacagtg).
      1. Wyznacz komplementarną odwróconą sekwencję rB =(revcom)rB (np. cactgtggggtggaggggac).
      2. Dopisz TTTTCGTCTCTAAAC do końca 5’ (revcom)rB (np. TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggac).
      3. Dopisz CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG do końca 3’ (revcom)rB (np. TTTTCGTCTCTAAACcactgtggggtggaggggacCGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG). Jest to końcowa wersja oligo rB, którą należy zamówić.
        Uwaga: Do automatycznej edycji sekwencji oligo w popularnych programach do arkuszy kalkulacyjnych można użyć następujących formuł: =CONCATENATE("TTTTCGTCTCTCACCG",(A2)," GTTTTAGAGCTATGCTGAAAAGCA"), gdzie A2 jest komórką zawierającą sekwencję fA, oraz =CONCATENATE("TTTTCGTCTCTAAAC",(B2)," CGGTGACCCAGGCGGCGCACAAG"), gdzie B2 jest komórką zawierającą sekwencję (revcom)rB.
  13. Zamów oligonukleotydy u wybranego dostawcy syntezy. Żadne dodatkowe modyfikacje nie są wymagane.
  14. Użyj przygotowanego plazmidowego DNA do przeprowadzenia PCR z użyciem primerów fA i rB. Pozwoli to na przyłączenie obu gRNA (forward i reverse) do fragmentu PCR pSN007 wygenerowanego z tego plazmidu i umożliwi ekspresję każdego z nich z własnego promotora (promotory U6 i 7SK — w tym projekcie zastosowano różne promotory, aby zapobiec rekombinacji wirusowej).
    1. Użyj protokołu Phusion GC Special PCR w celu utworzenia wymaganego fragmentu: utrzymuj mieszaninę w 98 °C przez 1 min (1 cykl), w 98 °C przez 15 s, w 53 °C przez 15 s, w 65 °C przez 2 min i w 72 °C przez 4 min (30 cykli), a następnie w 4 °C (Tabela 5).
    2. Rozdziel produkt PCR na 1% żelu agarozowym i zweryfikuj, czy widoczny jest 1 prążek przy ~490 bp (Rysunek 2).
    3. Wytnij i wyekstrahuj ten produkt PCR za pomocą wybranego zestawu do ekstrakcji z żelu. Eluuj DNA do 15 μL buforu TE (10 mM Tris, pH 7.5; 10 mM Tris, pH 8.0) lub wody destylowanej.
    4. Zmierz stężenie wyekstrahowanego produktu oraz wektora pSB700 za pomocą spektrofotometru w celu obliczenia molarności DNA. Znormalizuj zarówno produkt PCR, jak i wektor do stężenia 40 femtomoli/μL.
      Uwaga: Dostępnych jest kilka stron internetowych pomagających w obliczaniu molarności danego roztworu DNA na podstawie długości DNA i jego stężenia w roztworze (np. Promega: http://www.promega.com/a/apps/biomath/index.html?calc=ugpmols). Kalkulator wykorzystuje formułę:
      figure-protocol-1
      Gdzie N to długość sekwencji nukleotydowej.
  15. Przygotuj reakcję jednoczesnego trawienia restrykcyjnego i ligacji zgodnie z protokołem opisanym w krokach 8-8.4, aby sklonować fragment PCR pSN007 do wektora pSB700.
    1. Zamiast dodawać 1 μL roztworu primera do reakcji, dodaj 1 μL produktu PCR o stężeniu 40 fmole/μL. Dodatkowo użyj 1 μL wektora pSB700 o stężeniu 40 fmole/μL.
      Uwaga: Równe stosunki molowe prowadzą do powtarzalnych wyników, choć kolonie można uzyskać nawet w przypadkach, gdy dokładne stosunki nie są zachowane.
  16. Po zakończeniu procesu reakcji Golden Gate (kroki 8-8.4) przejdź do transformacji i weryfikacji sekwencji (kroki 9-10.2.3).

Wyniki

Metody przedstawione w niniejszym protokole służą do tworzenia wektorów ekspresyjnych dla pojedynczego lub sparowanego gRNA. Wektory ekspresyjne dla pojedynczego gRNA można stworzyć poprzez wcześniejsze trawienie szkieletu wektora (Rycina 1), a następnie ligację z serią krótkich oligonukleotydów, lub wykorzystując klonowanie Golden Gate w celu jednoczesnego trawienia szkieletu wektora i ligacji z serią krótkich oligonukleotydów w jednej reakcji. Przedstawiono również metodę wytwarzania wektorów zawierających 2 gRNA, z których każdy jest sterowany przez własny, niezależny promotor, poprzez klonowanie odpowiedniego fragmentu PCR pSN007  (Rycina 2).

Pomyślne klonowanie w przypadku każdego z opisanych protokołów objawi się pojawieniem znacznie większej liczby kolonii w transformacjach z odpowiednim wstawionym DNA niż na płytce kontrolnej bez wstawki (Rysunek 3).

figure-results-1
Rysunek 1: Trawienie wektora ekspresyjnego gRNA pSB700. Zastosowano 1% żel agarozowy. Ścieżka 1: niepocięty pSB700. Ścieżka 2: pSB700 pocięty enzymem BsmBI.

figure-results-2
Rycina 2: PCR dla sparowanych gRNA. Zastosowano żel agarozowy 1%. Ścieżka 1: fragment PCR sparowanego przewodnika pSN007  o długości ~490 bp.

figure-results-3
Rysunek 3: Pomyślne klonowanie i transformacja plazmidu gRNA. Lewy panel przedstawia płytkę LB z ampicyliną z pomyślnie transformowanymi koloniami. Prawy panel przedstawia płytkę kontrolną bez insertu, na której nie wyrosły żadne kolonie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający.  Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

wektor ekspresyjny guide pSB7001-5 μg
Bufor NEB 3.14 μL
BsmBI1 μL
Woda destylowanado 40 μL
Objętość całkowita40 μL

Tabela 1: Trawienie restrykcyjne wektora ekspresyjnego gRNA pSB700 za pomocą BsmBI.

Wygrzane oligos gRNA (reakcja pojedyncza lub w puli)1 μL
Wektor ekspresyjny pSB700 przetrawiony BsmBI1 μL (~100-250 ng)
10x Bufor do reakcji ligazy T4 DNA2 μL (stężenie końcowe 1x)
Ligaza T4 DNA1 μL (120 units)
Woda destylowana15 μL
Objętość całkowita20 μl

Tabela 2: Reakcja ligacji oligonukleotydów gRNA do uprzednio trawionego wektora ekspresyjnego pSB700 gRNA.

OdczynnikObjętość (1x)
H2O6 μL
Ligaza T40.5 μL
ATP1 μL
BsmBI0.5 μL
Bufor NEB 3.11 μL
Wektor (np., pSB700) (40 fmol)1 μlL
Wstawka – oligos forward i reverse lub pSN007 Fragment PCR dla podwójnego przewodnika (40 fmol)1 μL (0.5 μL do przodu i 0.5 μL odwrócenie

Tabela 3: Mieszanina reakcyjna do jednokrokowego trawienia enzymem restrykcjnym BsmBI i ligacji gRNA.

Dla 1 prowadzącegosekwencjonuj 3 kolonie
Dla 2 prowadnikówzsekwencjonuj 5–10 kolonii
Dla 3 prowadnikówzsekwencjonuj 10-15 kolonii
Dla 4 przewodnikówwysekwencjonuj 15–20 kolonii

Tabela 4: Zalecana liczba kolonii do sekwencjonowania dla reakcji klonowania pul gRNA.

Komponenty PCR50 µL reakcja
10 µM Starter bezpośredni2.5 µL
10 µM Starter odwrotny2.5 µL
5x bufor Phusion HF lub GC10 µL
10 mM dNTP1 µL
Matryca DNA100 ng
Polimeraza DNA Phusion0.5 µL
Woda wolna od nukleazDo 50 µL

Tabela 5: Mieszanina do PCR dla sparowanego gRNA.

Dyskusja

Wprowadzono szereg modyfikacji, które pozwoliły zaoszczędzić czas i koszty w konstrukcji wektora ekspresji gRNA. Przedstawiono jednoetapowy protokół restrykcji i ligacji, a także metodę konstruowania sparowanego wektora ekspresji gRNA. Sparowaną ekspresję gRNA uzyskuje się poprzez amplifikację PCR przy użyciu oligonukleotydów zawierających zarówno sekwencję docelową gRNA do przodu (n20), jak i odwrotny dopełniacz innego celu (n20). To następnie wprowadza drugorzędowy promotor RNA Pol III (7SK), a także ogon sgRNA do konwencjonalnie eksprymujących plazmidy ekspresyjne pojedynczego gRNA.

Staranna konstrukcja oligonukleotydu zapewni udany PCR dla sparowanej konstrukcji gRNA, a także ligację lepkiego końca. Po jednoetapowej reakcji restrykcji i ligacji, dodanie kolejnego BsmBI zapewni, że wszystkie niezmodyfikowane wektory ekspresyjne w reakcji zostaną wycięte. To znacznie zmniejszy tło transformacji. Stosowanie NEB-Stable competent E. coli i wzrostu w temperaturze 30 °C zwiększy plony udanej transformacji.

Zalety tej techniki w porównaniu z powszechnymi praktykami obejmują uproszczenie procesu wyżarzania oligonukleotydów, jednoetapowe ograniczenie wektora ekspresji gRNA i ligację oligonukleotydów oraz możliwość wykorzystania konwencjonalnych wektorów ekspresji pojedynczego gRNA do ekspresji sparowanych przewodników. Podczas gdy opisany tutaj protokół koncentruje się na zestawie wektorów ssaków, ogólna strategia jest plastyczna i ma zastosowanie do każdego organizmu, pod warunkiem, że dostępny jest odpowiedni wektor gRNA. Ogólnie rzecz biorąc, opisany protokół oszczędza czas i koszty.

Należy jednak zauważyć, że nakreślona procedura zakupu pojedynczych oligonukleotydów nie skaluje się dobrze do generowania bibliotek zawierających tysiące gRNA. W tym celu zalecane są alternatywne źródła syntezy oligonukleotydów, takie jak synteza oligonukleotydów.

Korzystne jest włączenie kontroli bez wstawiania podczas klonowania gRNA. Reakcję tę można łatwo ustawić równolegle z reakcjami będącymi przedmiotem zainteresowania i można ją wykorzystać do określenia, czy niepełne trawienie wektora wyjściowego przyczyniło się do powstania kolonii obserwowanych pod koniec procedury. Ponadto, jeśli jeden z powyższych protokołów klonowania nie powiódł się z powodu nie do końca strawionego szkieletu wektora lub słabej wydajności ligacji, sugerujemy wypróbowanie alternatywnej metody klonowania, którą opisaliśmy.

W przypadku stosowania klonowania Golden Gate do jednoczesnego trawienia wektora i ligacji małych oligonukleotydów w ramach jednej reakcji, ważne jest, aby sprawdzić, czy gRNA, które są klonowane do wektora, nie ma w sobie miejsca BsmBI, ponieważ doprowadzi to do przecięcia gRNA i braku kolonii po transformacji.

Przedstawiona przez nas strategia klonowania gRNA umożliwia szybkie i opłacalne generowanie gRNA za ~10 USD za przewodnik, przy czym większość kosztów pochodzi z syntezy oligonukleotydów i weryfikacji sekwencji. Podczas gdy opisana metoda została zaprojektowana, aby umożliwić użytkownikom generowanie gRNA do użytku ze SpCas9, protokół można łatwo dostosować do użycia z ortologiami Cas9 lub innymi endonukleazami kierowanymi przez RNA, takimi jak Cpf1 lub C2C2, z niewielkimi modyfikacjami szkieletu wektora i sekwencji zwisu oligonukleotydowego16,17.

Opisany powyżej protokół zapewni zweryfikowane sekwencyjnie plazmidy ekspresji gRNA w 3 d (zaczynając od odpowiednio zaprojektowanych oligonukleotydów), co jest znacznie szybsze niż obecne metody. Obejmuje to projektowanie gRNA przez 1 godzinę (kroki 1 - 2.3), rozcieńczanie i porcjowanie oligonukleotydów przez 10 minut (kroki 3 - 5.1), trawienie i oczyszczanie wektora ekspresyjnego gRNA pSB700 przez 2 godziny (kroki 6 - 6.4), klonowanie oligonukleotydów gRNA do wstępnie strawionego wektora ekspresji gRNA pSB700 przez noc w temperaturze pokojowej (kroki 7 - 7.3), jednoetapowa ligacja restrykcyjna BsmBI trwająca 3 godziny i 40 minut (kroki 8 - 8.4), transformacja trwająca 16 godzin (kroki 9 - 9.6) oraz walidacja sekwencji plazmidu ekspresji gRNA trwająca 24 godziny (z czasem trwania zależnym od dostępności sekwencjonowania Sangera i prędkości po złożeniu kolonii bakteryjnej; krok 10). Sparowany projekt gRNA i modyfikacja sekwencji trwa 1 godzinę (kroki 11 - 13). Sparowany gRNA PCR trwa 3,5 godziny (kroki 14 - 14,4). Klonowanie fragmentu pSN007 PCR do wektora pSB700 trwa 3h i 40 min (krok 15 - 16).

Najbardziej prawdopodobne problemy, z którymi można się spotkać w związku z tym protokołem, dotyczą nieefektywności w montażu i transformacji Golden Gate. Uwzględnij kontrolę bez wkładania podczas montażu Golden Gate, aby zwizualizować wydajność montażu. Podczas transformacji kontrola pozytywna puc19 zapewni kontrolę wydajności transformacji. Stabilna dla NEB-Stable E. coli powinna być stosowana do plazmidów zgodnych z lentiwirusem i często wymaga do > 16 godzin w temperaturze 30 °C, aby uzyskać widoczne kolonie.

Oświadczenia

George M. Church posiada udziały w firmach Editas i Caribou Biosciences, których celem jest komercjalizacja technologii edycji genomu CRISPR-Cas9 (pełna lista ujawnień znajduje się na stronie http://arep.med.harvard.edu/gmc/tech.html).

Podziękowania

Sathiji Nageshwaran jest wspierany przez Friedreich's Ataxia Research Alliance (07340305-01) oraz National Ataxia Foundation Fellowships (7355538-01). Alejandro Chavez został sfinansowany z grantu National Cancer Institute 5T32CA009216-34 oraz Burroughs Wellcome Fund Career Award for Medical Scientists. George M. Church jest wspierany przez amerykańskie Narodowe Instytuty Zdrowia (NIH), grant RM1 HG008525 Narodowego Instytutu Badań nad Ludzkim Genomem oraz Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering. James J. Collins dziękuje za wsparcie ze strony Agencji ds. Redukcji Zagrożeń Obronnych (Defense Threat Reduction Agency) w ramach grantu HDTRA1-14-1-0006 oraz Paul G. Allen Frontiers Group. Alejandro Chavez opracował metodę klonowania opartego na podwójnym przewodniku. Sathiji Nageshwaran, Alejandro Chavez i Nan Cher Yeo napisali manuskrypt przy udziale wszystkich autorów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BsmBINew England BiolabsR0580L
T4 Ligaza DNAEnzymatyczna / New England BiolabsL6030-LC-L / M0202S
Bufor 3.1New England BiolabsB7203S
Adenozyno-5'-trifosforan (ATP)New England BiolabsP0756S
QIAprep spin miniprepkit Qiagen27104
Kompetentne chemicznie E. coliNew England BiolabsC3019l, C2987l lub C3040H
Standardowe probówki do mikrowirówek, 1,5 mlEppendorf0030 125.150
Axygen 8-paskowe probówki do PCRFischer Scientific14-222-250
Termocykler z programowalną regulacją krokową temperaturyBioRad,1851148
UV spektrofotometr (NanoDrop 2000c)Thermo Scientific
plazmid plazmidowy pSB700Addgene#64046
NEB Stabilny kompetentny E. coli (wysoka wydajność)New England Biolabsc3040
Rosół lizogeniczny (LB)
Bufor ampicyliny
TE (1 mM EDTA, 10 mM Tris-Cl, pH 7,5)
pSN007 plazmidAddgene102440

Bibliografia

  1. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (39), E2579-E2586 (2012).
  2. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J., Charpentier, E. A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  3. Shalem, O., Sanjana, N., Zhang, F. High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 299-311 (2015).
  4. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
  5. Gilbert, L., et al. CRISPR-Mediated Modular RNA-Guided Regulation of Transcription in Eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  6. Yang, L., Yang, J., Byrne, S., Pan, J., Church, G. CRISPR/Cas9-Directed Genome Editing of Cultured Cells. Current Protocols in Molecular Biology. , 31.1.1-31.1.17 (2014).
  7. Yang, L., Mali, P., Kim-Kiselak, C., Church, G. CRISPR-Cas-Mediated Targeted Genome Editing in Human Cells. Methods in Molecular Biology. 1114, 245-267 (2014).
  8. Vidigal, J., Ventura, A. Rapid and efficient one-step generation of paired gRNA CRISPR-Cas9 libraries. Nature Communications. 6, 8083(2015).
  9. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nature Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
  10. Kabadi, A., Ousterout, D., Hilton, I., Gersbach, C. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), e147(2014).
  11. Sakuma, T., Nishikawa, A., Kume, S., Chayama, K., Yamamoto, T. Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9 vector system. Scientific Reports. 4 (1), (2014).
  12. Chari, R., Yeo, N., Chavez, A., Church, G. sgRNA Scorer 2.0: A Species-Independent Model To Predict CRISPR/Cas9 Activity. ACS Synthetic Biology. 6 (5), 902-904 (2017).
  13. Doench, J., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  14. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2014).
  15. The CRISPR Software Matchmaker: A New Tool for Choosing the Best CRISPR Software for Your Needs. , Available from: http://blog.addgene.org/the-crispr-software-matchmaker-a-new-tool-for-choosing-the-best-crispr-software-for-your-needs (2015).
  16. Engler, C., Marillonnet, S. Golden Gate Cloning. DNA Cloning and Assembly Methods. Valla, S., Lale, R. , Humana Press. New York, NY. 119-131 (2013).
  17. Zetsche, B., et al. Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  18. Abudayyeh, O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

enzym restrykcyjny BsmBIklonowanie Golden Gatewektor PSB700pojedyncze przewodnie RNAsparowane przewodnie RNAtransformacja plazmidowaelektroforeza w elu agarozowym
Przewodnik CRISPR Klonowanie RNA dla systemów ssaków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.