Zautomatyzowany, długoterminowy test behawioralny funkcji poznawczych w wielu modelach genetycznych choroby Alzheimera z wykorzystaniem IntelliCage

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokół oceny funkcji poznawczych dla modeli genetycznych choroby Alzheimera przy użyciu systemu IntelliCage, który jest wysokowydajnym zautomatyzowanym systemem monitorowania zachowań z warunkowaniem instrumentalnym.

Streszczenie

Wiele czynników - takich jak starzenie się i geny - jest często związanych ze spadkiem funkcji poznawczych. Genetycznie zmodyfikowane mysie modele pogorszenia funkcji poznawczych, takie jak choroba Alzheimera (AD), stały się obiecującym narzędziem do wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw choroby i promowania postępów terapeutycznych. Ważnym krokiem jest walidacja i charakterystyka oczekiwanych nieprawidłowości behawioralnych w modelach, w przypadku AD, pogorszenia funkcji poznawczych. Długoterminowe badania behawioralne zwierząt laboratoryjnych w celu zbadania skutków starzenia się wymagają znacznego wysiłku ze strony badaczy. System IntelliCage to wysokowydajna i ekonomiczna bateria testowa dla myszy, która eliminuje potrzebę codziennej obsługi przez człowieka. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób system jest wykorzystywany w długoterminowym fenotypowaniu genetycznego modelu choroby Alzheimera, koncentrując się w szczególności na funkcjach poznawczych. W eksperymencie wykorzystano powtarzającą się baterię testów, które oceniają uczenie się przestrzenne i funkcje wykonawcze. To opłacalne, zależne od wieku fenotypowanie pozwala nam zidentyfikować przejściowy i/lub trwały wpływ genów na różne aspekty poznawcze.

Wprowadzenie

Rozwój zwierzęcych modeli chorób neuronalnych w ciągu ostatniej dekady dostarczył mechanistycznego zrozumienia ich podstaw i w celu promowania postępu terapeutycznego^1,2,3. Zastosowanie wysokoprzepustowej baterii testów behawioralnych w genetycznych modelach zwierzęcych jest heurystycznym narzędziem badawczym służącym do badania mechanizmów leżących u podstaw chorób człowieka i identyfikacji terapii lekowych. Baterie do testów badawczych przystosowane do długotrwałej obserwacji modeli starzenia się i/lub demencji tradycyjnie zmuszały laboratoria do pochłaniania dużych ilości wyspecjalizowanej siły roboczej i czasu. System monitorowania w klatce domowej byłby opłacalną strategią, ponieważ zmniejszyłby koszty obserwacji behawioralnej przez ludzi. Niektóre zespoły badawcze opracowały zautomatyzowane narzędzia oparte na wizji, które wspomagają fenotypowanie behawioralne pojedynczego osobnika w małej klatce domowej^4,5,6. Jednak takie metody ograniczają interakcje społeczne, rozmiar środowisk testowych i różnorodność miar behawioralnych, które obejmują funkcje poznawcze. IntelliCage to system monitorowania klatki domowej drugiej generacji, przeznaczony do wykonywania różnych zadań poznawczych w domowej klatce społecznej. Co ważne, metoda ta może wyeliminować codzienną obsługę, która umożliwia nam długoterminowe monitorowanie zachowania z oceną funkcji poznawczych, a także może wyeliminować wymagania dotyczące specjalistycznej obsługi praktycznej i umożliwić wysoce powtarzalne pozyskiwanie danych⁷. W tym miejscu opisujemy długoterminowe fenotypowanie i walidację w genetycznych mysich modelach choroby Alzheimera (AD), które zostały ostatnio wygenerowane^8,9,10 przy użyciu zautomatyzowanego systemu monitorowania klatki domowej. Zestaw testów, który obejmował ocenę uczenia się przestrzennego i funkcji wykonawczych, był wielokrotnie wykonywany w różnych punktach wiekowych (9–12 i 14–17 miesięcy). To zależne od wieku fenotypowanie pozwoliło nam zidentyfikować przejściowy i/lub trwały wpływ genów na różne aspekty poznawcze. Odkryliśmy, że niektóre modele AD wykazywały zarówno przejściowe, jak i trwałe fenotypy kilku aspektów poznawczych testowanych w analizie długoterminowej przy użyciu zautomatyzowanego systemu monitorowania klatki domowej¹⁰. W związku z tym zautomatyzowane badanie z wykorzystaniem systemu monitorowania w klatce domowej jest korzystne i opłacalne dla długoterminowego fenotypowania behawioralnego i walidacji w różnych modelach dysfunkcji poznawczych.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki nad zwierzętami i ich wykorzystania, i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytutu Nauk o Mózgu RIKEN dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach.

1. Ustawianie aparatury

UWAGA: Przegląd automatycznego systemu monitorowania klatki domowej jest pokazany w Rysunek 1. Każdy system (39 cm x 58 cm x 21 cm) zawiera jeden mikroprocesor i cztery komory narożne, z których każda ma dwie butelki z wodą i antenę pierścieniową do wykrywania identyfikacji radiowej transponderów wszczepionych zwierzętom (Rysunek 1A). Numery identyfikacyjne mikroprocesora są definiowane przez selektor obrotowy (adresy sprzętowe) (rysunek 1B). Numery identyfikacyjne mikroprocesora nie powinny się na siebie nakładać. Dwoje drzwi w każdym rogu jest sterowanych przez komputery, które są używane do kondycjonowania instrumentalnego (Rysunek 1C). Zazwyczaj każda klatka może ocenić do 12 myszy (patrz Rysunek 2 jako przykład trzymania grupowego). Dopuszczalne jest użycie większej liczby myszy. Należy jednak zadbać o to, aby myszy nie walczyły nadmiernie i nie były przepełnione, gdy wykonują zadania mocno konkurencyjne.

1. Podłącz klatki do komputera szeregowo za pomocą CAN.
2. Podłącz akumulatora do wtyczek w mikroprocesorze (Power-on). Następnie należy włączyć na kilka sekund wszystkie diody LED i wszystkie drzwi powinny się poruszyć. Jeśli diody LED nie wyłączają się lub drzwi się nie poruszają, odłącz i ponownie podłącz przewód zasilający (złe połączenia elektryczne mogą prowadzić do nieprawidłowego działania).
3. Upewnij się, że drzwi przesuwne otwierają się i zamykają prawidłowo. Jeśli drzwi nie poruszają się prawidłowo, sprawdź małe magnesy przymocowane do czarnego ramienia. Jeśli ten problem występuje często, rozważ przyklejenie magnesu do ramienia.
4. Kontynuuj sprawdzanie stanu drzwi przez cały czas trwania eksperymentów (co najmniej raz dziennie).
5. Włącz komputer.

2. Oprogramowanie

UWAGA: Wszystkie trzy komponenty oprogramowania ("Projektant", "Kontroler" i "Analizator") dla automatycznego systemu monitorowania klatki domowej zostały zaprojektowane jako graficzne interfejsy użytkownika (Rysunek 3). Użytkownicy mogą łatwo kontrolować lub dodawać różne funkcje podczas eksperymentu.

1. Tworzenie plików eksperymentalnych za pomocą "Projektanta"
   UWAGA: "Projektant" służy do generowania i edycji plików eksperymentalnych (programów w systemie) do wykonywania różnych protokołów eksperymentalnych oraz do testowania stanu systemu (Rysunek 3A). Jeden plik eksperymentalny zawiera listę zwierząt, ustawienia sprzętowe i wiele protokołów eksperymentalnych. Użytkownicy mogą również uzyskać opublikowane protokoły czasopism, kontaktując się z autorami.
   1. Tworzenie listy zwierząt
      1. Zdefiniuj warunki. Zbuduj wielki projekt eksperymentalny, który obejmuje następujące parametry: 1) liczbę badanych myszy, 2) liczbę linii genetycznych (lub grup terapeutycznych), 3) płeć (samce, samice lub oba) oraz 4) liczbę klatki, która ma być użyta.
      2. Wybierz odpowiedni typ transpondera (DataMars lub Trovan) na centralnym pasku narzędzi.
      3. Ustaw "Grupy". W panelu "Grupy" dodaj lub usuń grupy eksperymentalne (tj. genotypy lub zabiegi), naciskając odpowiednio przycisk "zielony plus (+)" lub "czerwony krzyżyk (x)" w oknie "Grupy".
      4. Ustaw "Klastry". Użyj funkcji "Klaster", aby równomiernie obsługiwać podgrupy, definiując poprawne, niepoprawne i neutralne narożniki i boki.
         UWAGA: Zdarzenia visit, nosepoke i lick, główne dane dla wszelkich zadań behawioralnych, są powiązane z definicją. To ustawienie jest wymagane w przypadku zadań uczenia się przestrzennego. Zdefiniowane klastry dla każdego zwierzęcia pozostają takie same przez cały czas trwania eksperymentu. Na przykład w jednym klastrze dla zadania preferencji miejsca (PP) lub odwrócenia preferencji miejsca (PPR) jeden narożnik jest zdefiniowany jako prawidłowy (dostępny dla wody), a trzy narożniki są zdefiniowane jako nieprawidłowe (niedostępne dla wody). Dodatkowo klastry można łączyć z innym za pomocą funkcji "Link".
      5. Przypisz zmienne, takie jak "Nazwa", "Tag" (identyfikator transpondera), "Płeć", "Grupa" i "Klaster
      ".
      6. Zapisz i wklej listy zwierząt, wybierając "Eksportuj zwierzęta"... i "Importuj zwierzęta"... na pasku menu "Plik", aby powielić listy zwierząt do innego eksperymentu.
   2. Skonfiguruj sprzęt w zakładce "Setup" (Konfiguracja). Skonfiguruj wszystkie systemy, używając odpowiadających im numerów identyfikacyjnych (adresu sprzętu) w zakładce "Konfiguracja". Liczbę adresów w sekcji "projektant" należy odpowiadać rzeczywistej liczbie adresów.
   3. Zbuduj protokoły eksperymentalne w zakładce "IntelliCage"
      1. Zbuduj protokoły eksperymentalne w zakładce "IntelliCage", korzystając z następujących zakładek head i inferior (zakładki "Moduł" i "Opcja").
      2. Zaprojektuj struktury eksperymentalne w "Przestrzeni modułu", klikając zakładkę "Moduł" (Rysunek 3A). Aby dodać nowe moduły, naciśnij "Dodaj" (zielony przycisk plusa w zakładce "Moduł").
         Uwaga: Istnieją cztery różne typy komponentów, a mianowicie "Zadania", "Narzędzia", "Reporterzy" i "Zdarzenia". Zazwyczaj eksperyment rozpoczyna się od zdarzenia wyzwalającego, a mianowicie "Wizyta", "Nosepoke" lub "Picie". Aby wybrać zdarzenie wyzwalające, przeciągnij odpowiednią jednostkę z sekcji Zdarzenia, aby zdefiniować znak początkowy. Następnie, aby ustawić wyjście dla niektórych siłowników (np. otwieranie drzwi), przeciągnij jednostki z sekcji "Zadania" (np. "Drzwi", "LED" i "Powietrze").
      3. Przeciągnij jednostki, pokazane w części "Jednostki", do "Przestrzeni modułu".
         UWAGA: Ponownie, użytkownicy mogą uzyskać opublikowane protokoły (jako pliki eksperymentalne) od autorów i ponownie wykorzystać pliki, importując nową listę zwierząt. Użytkownicy nie muszą tworzyć wszystkich modułów.
      4. Aby utworzyć moduł adaptacji nosepoke (NPA) (Rysunek 6A), przeciągnij jednostkę "Drzwi" z sekcji "Zadania", jednostki "Brama" i "Timer" z sekcji "Narzędzia" oraz jednostki "Wizyta" i "Nosepke" z sekcji "Zdarzenia" do "Przestrzeni modułu".
      5. Połącz "Any" w linii "ON" jednostki Nosepoke z "In" w jednostce Gate. Połącz "Wyjście" z "Zamknij" w jednostce "Brama". Połącz "Out" w "Gate" z "Activate" w jednostce "Timer". Połącz "Wyjście" w bramie, aby otworzyć w jednostce "Drzwi". Połącz "Wyjście" w module "Timer" z "Zamknij" w module "Drzwi". Ustaw "Okres" na 5,000 (ms) w sekcji Timer.
         UWAGA: Jednostka "Bramka" służy do sterowania wejściem i wyjściem sekwencji. W stanie "otwartym" (stan domyślny) będzie obsługiwana sekwencja podłączona do "Wyjścia". Natomiast w stanie "Zamknij" sekwencja podłączona do wyjścia zostanie zatrzymana. Prawdopodobieństwo otwarcia kursu można określić (Rysunek 6A, Rysunek 8A, oraz Rysunek 9A). "Selektor modułów" służy do losowej lub określonej kolejności zmiany modułów w tym samym okresie eksperymentalnym. Na przykład w zadaniu Serial Reaction Time (SRT) moduły (o różnych długościach opóźnień) są losowo przełączane na każdym końcu wizyty za pomocą selektora modułów (ustaw tryb "RandomExcludeDefault") połączonego z wierszem "END" jednostki "Wizyta" (Rysunek 8A). Jednostka "Splitter" będzie używana do kierowania sygnału wejściowego na określoną stronę narożnika. Jest to wymagane w przypadku bardziej skomplikowanych modułów, takich jak te używane w zadaniu SRT lub Delay Discounting (DD), które wymagają działania określonej strony. Na przykład w zadaniu DD tylko jedna strona (słodzona) otworzy się z opóźnieniem (Rysunek 9A).
      6. Określ początkowy stan drzwi w klatkach w zakładce "Opcje". Określ wszystkie drzwi, które mają być zamknięte podczas sesji bez picia, jako typowy stan początkowy dla zadań PP lub PPR.
      7. Ustaw harmonogramy czasowe w zakładce "Opcje". Moduły są zmieniane w określonych punktach czasowych i wykonywana jest akcja zdefiniowana w oknie "Wzorce dnia".
         UWAGA: Część "Wzorce dnia" może być użyta do ustawienia eksperymentalnego okna czasowego. Zazwyczaj nocna, aktywna faza myszy jest wykorzystywana do oceny zachowania w zadaniach poznawczych. Należy zauważyć, że czas trwania zadania może mieć wpływ na ilość pobieranej wody. Jeśli czas trwania jest długi w stosunkowo łatwych zadaniach, wydajność na końcu okna czasowego może się zmniejszyć z powodu satysfakcji. W związku z tym okno czasowe musi być starannie ustawione.
2. Przeprowadzanie eksperymentu za pomocą "Kontrolera"
   1. Załaduj eksperymentalny plik, naciskając przycisk "Eksperyment"... w sekcji "Ustawienia" w "Kontrolerze".
   2. Uruchom eksperyment, naciskając przycisk "Start" na "Kontrolerze" (środkowa prawa część).
   3. Monitoruj i wizualizuj bieżący stan systemu i myszy.
      Uwaga: Zdarzenia behawioralne są wyjaśnione w następujący sposób: wizyta, wejście do rogu (wykrywane przez czujnik termiczny); nosepoke, przykładanie nosa do otworu w rogu (wykrywane przez wiązkę podczerwieni i można je podzielić na nosepokę lewą i prawą); lizanie, lizanie wykrywane przez lizkometr (liczone jako czas i częstotliwość kontaktu).
   4. Dokładnie sprawdź stan systemu, zwracając szczególną uwagę na ostrzeżenia.
      UWAGA: Błędy wynikające z nieprawidłowego identyfikatora zwierzęcia (numeru transpondera) będą zgłaszane w dzienniku, nawet jeśli rzeczywisty numer znacznika jest poprawny (np. "Niezarejestrowany znacznik ****", "Sygnał obecności bez rejestracji anteny" itp.). Może to być spowodowane użyciem transpondera, którego ważność wkrótce straci ważność. Jednak ten błąd nie jest poważnym problemem. W takim przypadku należy ponownie sprawdzić, czy zwierzę zidentyfikowane w wiadomości może zostać wykryte. Błędy spowodowane długimi okresami bez wizyty lub picia będą wyświetlane jako na przykład "**** (identyfikator zwierzęcia) nie odwiedził zwierzęcia w ciągu ostatnich 720 minut" (Rysunek 3B). Dokładnie sprawdź kilka możliwości, które mogą prowadzić do takich błędów. Najpoważniejszym przypadkiem jest to, że zwierzę jest już martwe. Drugą najpoważniejszą możliwością jest problem z systemem wykrywania zwierzęcia (transponder nie działa lub wypadł). Trzecią możliwością jest to, że zwierzę po prostu nie jest aktywne. Jeśli zwierzę nie składa żadnych wizyt przez cały okres 24 godzin, eksperymentator powinien rozważyć usunięcie zwierzęcia z klatki ze względu na jego stan zdrowia. Poważnym problemem, który nie ma wskazania błędu, jest brak zamykania drzwi (prawie zawsze z powodu problemów z magnesami na drzwiach). Skutkuje to powstaniem nieodpowiedniego kącika do picia. Aby sprawdzić ten problem, należy sprawdzać stan wszystkich drzwi podczas sesji bez picia co najmniej raz dziennie. Dane uzyskane w przypadku wystąpienia tego problemu nie mogą być wykorzystane do analizy zadań PP, PPR, SRT lub DD.
   5. Wypisz wszystkie zdarzenia behawioralne z tagiem dla czasu i informacji o zwierzęciu, naciskając przycisk "Stop" na "Kontrolerze" (Rysunek 3B).
3. Obsługa danych za pomocą "Analyzera"
   1. Korzystając z "Analyzera", analizuj i wizualizuj dane.
   2. Wyeksportuj dane z podziałem na grupy czasowe jako pliki Excela (Rysunek 3C). Wyniki graficzne wyświetlane w zakładce "Wykresy" mogą ułatwić zrozumienie danych. W zakładce "Dane" dane są ułożone w wielu kolumnach i można je sortować i filtrować za pomocą dowolnych parametrów.

3. Przygotowanie zwierząt

1. Stosować zwierzęta o wadze powyżej 15 g (w wieku 2 miesięcy lub starsze).
   UWAGA: Jeśli zwierzęta są mniejsze niż 15 g, wiele myszy może jednocześnie odwiedzić róg, co prowadzi do niepowodzenia w zbieraniu danych. Starzejące się zwierzęta powinny być dokładnie monitorowane, aby upewnić się, że są w stanie wskoczyć w rogi i wspiąć się na karmnik. Niektóre starsze myszy lub myszy z mutacjami genetycznymi wykazującymi upośledzenie motoryczne mogą umrzeć, ponieważ nie mają dostępu do wody lub pożywienia.
2. Zmniejsz potencjalne ryzyko agresji.
   UWAGA: Nawet w przypadku korzystania z samic myszy, lepiej jest zacząć trzymać wszystkie myszy razem w klatce w młodym wieku (tj. w wieku 1 miesiąca) przed rozpoczęciem eksperymentu. Profil linii myszy, szczególnie w odniesieniu do agresywności, powinien być uzyskany przy użyciu samców myszy w klatce.
3. Wszczepić podskórnie transpondery identyfikacyjne o częstotliwości radiowej (sterylizowane, igła w zestawie) myszom w okolicy grzbietowo-szyjnej w znieczuleniu wziewnym izofluranem (Rysunek 4).
   1. Umieść mysz w komorze w celu indukcji znieczulenia.
   2. Ustaw przepływomierz tlenu na 0,8 do 1,5 l/min, a parownik izofluranu na 2,0 do 2,5%.
   3. Zwolnij mysz z komory indukcyjnej, gdy częstość oddechów zmniejszy się (około 5% spadku).
   4. Utrzymuj znieczulenie za pomocą maski na twarz.
   5. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
   6. Ściśnij i unieś skórę wokół tylnej części łopatek, aby utworzyć kieszonkę.
   7. Spoleć miejsce wstrzyknięcia 70% etanolem, aby zminimalizować wprowadzanie włosów do przestrzeni podskórnej. Następnie należy wprowadzić igłę do wstrzykiwań przez skórę równolegle do kręgosłupa.
   8. Wysuń mikroczip podskórnie.
   9. Ściśnij mikroczip przez skórę, aby zachować przestrzeń między łopatkami.
   10. Powoli wyjmować igłę. Kontynuuj szczypanie obszaru przez kilka sekund, aby zapewnić hemostazę.
   11. Stosować środek przeciwbólowy po podaniu, jeśli igła jest nieprawidłowo włożona.
   12. Uwolnij mysz ze znieczulenia.
   13. Umieść mysz w klatce odzyskiwania i monitoruj ją, aż się obudzi i zacznie się poruszać. Unikaj pozostawiania myszy bez nadzoru.
   14. Przywróć mysz do klatki domowej, gdy stanie się w pełni zdolna do poruszania się.
   15. Sprawdzaj wszczepiony transponder za pomocą czytnika transponderów przez co najmniej 1 tydzień.
       UWAGA: Pozycja wszczepionych transponderów jest absolutnie krytyczna dla identyfikacji (patrz Rysunek 2). Nie wkładaj transpondera pionowo do szyi; Może to spowodować, że zwierzęta doznają poważnego urazu rdzenia kręgowego zwierzęcia. Transpondery czasami wypadają po kilku godzinach lub dniach. Sprawdź, czy transponder działa, używając czytnika transponderów. Opcjonalnie, wszczepić transponder ponownie, jeśli wypadnie; Jednak wielokrotne ponowne wszczepianie implantu może powodować sztuczne zmiany w zachowaniu. Sprawdź datę ważności. Wygasłe transpondery często przesyłają nieprawidłowe sygnały, co skutkuje brakiem danych.
4. Wprowadź zwierzęta do klatki i sprawdź transpondery wszczepione myszom za pomocą czytników transponderów. Usuń myszy, jeśli transpondery nie zostaną wykryte.

4. Przeprowadzanie eksperymentów

UWAGA: Myszy są karmione ad libitum standardową karmą dla myszy i utrzymywane za pomocą syntetycznej ściółki, która jest zmieniana co 1 lub 2 tygodnie, w zależności od harmonogramu zadań. Unikaj zmiany ściółki podczas zadania uczenia się przestrzennego, zwłaszcza przez pierwsze 1-2 dni. Światła są włączone od 08:00 do 20:00. Moduły eksperymentalne są wykonywane sekwencyjnie zgodnie z pytaniami naukowymi. Harmonogram eksperymentu jest zilustrowany w Rysunek 5.

1. Ogólna działalność
   UWAGA: Myszy są sekwencyjnie przystosowane do środowiska w klatce przy użyciu trzech warunków eksperymentalnych: swobodnej adaptacji, w której zwierzęta zawsze mają swobodny dostęp do butelek z wodą w rogach (jeden dzień do 1 tygodnia przyzwyczajenia jest zwykle uważany za odpowiedni); NPA, w którym myszy mogą uzyskać dostęp do butelek z wodą przez 5 sekund po każdym nosestanie w otworach przed drzwiami w rogach (przyzwyczajenie od 3 dni do 1 tygodnia jest zwykle uważane za wystarczające); oraz Adaptacja Sesji Picia, w której myszy mogą uzyskać dostęp do butelek z wodą o określonej porze dnia.
   1. Przygotuj pliki eksperymentu dla zadań FA, NPA i DSA.
   2. Uruchom zadanie FA w "Kontrolerze".
   3. Mierz liczbę wizyt, epizodów lizania i/lub epizodów lizania dziennie lub okresowo aktywność okołodobową jako wskaźnik ogólnej aktywności.
   4. Uruchom zadanie NPA w "Kontrolerze".
   5. Uruchom zadanie DSA w folderze "Controller".
      Uwaga: Wiele paradygmatów uczenia się wymaga adaptacji do sesji picia. Aby ustawić harmonogram DSA, użyj dwóch różnych modułów eksperymentalnych: sesji domyślnej (w przypadku braku wody) i sesji picia. Myszy nie mogą uzyskać dostępu do butelek z wodą, ponieważ nic się nie dzieje po nosepce w domyślnym module. Sesja picia jest identyczna jak w module NPA. Harmonogram czasowy zdefiniowany w zakładce "Opcje" w "Projektancie" może następnie przesunąć się na sesję bez picia zdefiniowaną przez inny moduł.
2. Zadania związane z uczeniem się przestrzennym i pamięcią
   UWAGA: Zadanie PP służy do oceny uczenia się przestrzennego (zwykle 5–7 dni). W zadaniu PP myszy mają ograniczony dostęp do wody w trzech z czterech rogów (jeden prawidłowy róg i trzy nieprawidłowe rogi). W związku z tym zwierzęta musiałyby odwiedzić określony zakątek, aby napić się wody podczas sesji picia. Zadanie PPR służy do oceny elastyczności lub kompulsywności oraz zdolności do płynnej zmiany zachowania (zwykle 5-7 dni). W zadaniu PPR myszy mają dostęp do wody tylko w przeciwległych rogach używanych jako właściwy róg w zadaniu PP.
   1. Przygotuj pliki eksperymentu dla zadań PP i PPR. Zdefiniuj odpowiednie rogi dla myszy, ustawiając "Klastry" (zwykle po 1-4 rogi) w zakładce "Zwierzę" w "Projektancie" (patrz Rysunek 6A, na dole). Aby uniknąć dużego ruchu w jednym rogu, przydziel cztery rogi równomiernie do wszystkich myszy.
   2. Uruchom zadanie PP w kontrolerze.
   3. Oceń wyniki uczenia się przestrzennego w kursie czasowym, liczby i procent poprawnych noszaków.
      Uwaga: Obecna wersja zadania PP skupia się bardziej na uczeniu się przestrzennym niż na pamięci przestrzennej, ponieważ zadanie nie wymaga przerwy czasowej między różnymi próbami. Aby skupić się bardziej na pamięci przestrzennej, rozważ użycie zadania unikania miejsc (PA) lub niezdefiniowanej nowej wersji zadania przestrzennego, która wykorzystuje określone odstępy czasu między próbami.
   4. Uruchom zadanie PPR w "Kontrolerze".
   5. Oceń elastyczność lub kompulsywność na podstawie przebiegu czasowego, liczby i procentu prawidłowych nosepoków.
      Uwaga: Interpretacja danych PPR wymaga kilku starannych osądów. Początkowe wykonanie zadania PPR jest silnie uzależnione od wykonania zadania PP. Dzieje się tak, ponieważ zadanie PPR opiera się na zakłóceniach lub konieczności zmiany zachowania. W związku z tym wydajność PPR może być szczególnie słaba, jeśli wykonanie zadania PP jest bliskie 100% poprawności. Elastyczność można uznać za jedną z funkcji wykonawczych^11,12,13.
   6. Oceń pamięć strachu przestrzennego w PA.
      Uwaga: Zadanie PA składa się z 4 ciągłych sesji: habituacja (dzień 1); kondycjonowanie (zaciągnięcie powietrzem wprowadza się po nospoke z dowolnej strony predefiniowanego narożnika [nieprawidłowa nosepoka], dzień 2); 24-godzinna przerwa poza klatką testową (myszy są umieszczane z powrotem w swoich normalnych klatkach domowych, dzień 3); Umieszczanie myszy z powrotem w klatce testowej bez zaciągania się powietrzem (dni 4-10).
      1. Przygotuj pliki eksperymentu dla PA.
      2. Przyzwyczajenie do biegania (dzień 1).
      3. Kondycjonowanie biegowe (dzień 2).
      4. Umieść myszy w normalnych klatkach domowych i trzymaj je przez 24 godziny (dzień 3).
      5. Zabierz myszy z powrotem do klatki testowej i uruchom protokół testowy (dzień 4-10).
      6. Oceń awersyjne uczenie się przestrzenne na podstawie stosunku nieprawidłowych noseczków w dniu warunkowania (dzień 2), awersyjnej pamięci przestrzennej opartej na tym w dniu powrotu do klatki testowej (dzień 3) i uczenia się wymierania na podstawie tego w dniach 4-10.
3. ocena funkcji wykonawczych (impulsywność, uwaga i kompulsywność)
   1. SRT tasks
      UWAGA: Ta procedura została wcześniej opisana bardziej szczegółowo^10,14. W tym zestawie zadań wszystkie cztery kąty są obsługiwane w ten sam sposób, 24 godziny na dobę. SRT składa się z dwóch sesji szkoleniowych (SRT-Training 1 i 2) oraz dwóch sesji testowych (SRT-Test 1 i 2). Podczas pierwszej sesji treningowej (SRT-Training 1) zwierzęta uczą się, że żółte światło LED jest sygnałem startowym dla nosepoke. Diody LED zawsze natychmiast po początkowym sygnezie (opóźnienie jest ustawione na 0 s).
      W drugiej sesji treningowej (SRT-Training 2) opóźnienie jest ustawione tak, aby zmieniało się losowo w zakresie 0,5, 1,0, 2,0 i 4,0 s. W tym okresie przedwczesne reakcje nie mają żadnych konsekwencji (trening wstępny). Każdy nosepoke w okresie opóźnienia jest uważany za przedwczesną reakcję, podczas gdy pierwszy nosepoke po otwarciu drzwi (5 s) jest uważany za prawidłową reakcję. W pierwszej sesji testowej (SRT-Test 1, służący do oceny impulsywności) pierwsza nosepoka określa właściwą stronę i inicjuje okres opóźnienia (0,5–4,0 s, w zależności od fazy zadania), po którym włączają się żółte diody LED na określony czas (czas trwania bodźca = 2,0 s, w zależności od fazy zadania). Następnie drzwi są otwierane. Pierwszy nosepoke po okresie opóźnienia otwiera drzwi (5 s) i jest liczony jako prawidłowy nosepoke, podczas gdy każdy nosepoke w okresie opóźnienia jest uważany za przedwczesny nosepoke. W drugiej sesji testowej jest kilka modyfikacji (SRT-Test 2, używany do oceny uwagi). Po rozpoczęciu bodźca (0,2–1,0 s, nieco krócej niż w pierwszym teście), myszom zapewnia się okres czasu, w którym dozwolone są nozaury (ograniczone trzymanie, zwykle 2 s). Drzwi otwierają się (5 s) dopiero po prawidłowym nosedzie, który jest pierwszym nosepoke podczas ograniczonego trzymania. Nosepoki po ograniczonym wstrzymaniu są uważane za pominięte nosepoki i nie prowadzą do żadnych zmian w wyniku. Błędy dzielą się na trzy typy: przedwczesna nosepoke, pominięta nosepoka i pominięcie (tylko pierwsza nosepoka). Test uwagi wymaga zdolności do zauważenia błysku diody LED (zdefiniowanej przez czas trwania bodźca), a także umiarkowanie szybkiej reakcji (zdefiniowanej przez czas ograniczonego zatrzymania). Przebieg czasowy próby zilustrowano na rysunku Rysunek 7.
      1. Przygotuj pliki eksperymentu dla zadań SRT.
      2. Uruchom szkolenie SRT 1 przez 3 dni.
      3. Uruchom SRT-Training 2 przez 7 dni.
      4. Uruchom test SRT 1 (impulsywność) przez 7 dni. Oblicz impulsywność na podstawie następującego wzoru:
         
         gdzie P jest liczbą prób przedwczesnej nozerii (lub liczbą prób nieprawidłowych nozerek), a T jest liczbą wszystkich prób (liczba pierwszych prób nozerii).
      5. Uruchom SRT-Test 2 (Uwaga) przez 7 dni. Oblicz dokładność (która jest uważana za wskaźnik wydajności uwagi) za pomocą następującego wzoru:
         
         gdzie C jest liczbą prawidłowych prób nozadekulacyjnych (liczba prawidłowych drugich prób), T jest liczbą wszystkich prób (liczba pierwszych prób nozagłębi), O jest liczbą prób pominięcia (liczba prób bez drugiej nozyepoki), a P jest liczbą przedwczesnych prób nozaepokowych (lub liczbą drugich prób nieprawidłowych nozerek przed ograniczonym wstrzymaniem).
   2. DD zadanie
      UWAGA: Jest to proste zadanie, w którym zwierzęta wybierają, czy chcą poczekać z wypiciem słodzonej wody (SW, 0,5% sacharyny lub 10% sacharozy) z opóźnieniem, czy wypić normalną wodę bez opóźnienia. Drzwi po wybranej stronie otwierają się, podczas gdy drzwi po przeciwnej stronie pozostają zamknięte. SW i normalna woda są rozmieszczone po prawej lub lewej stronie wszystkich rogów identycznie. Harmonogram zadań DD obejmuje sesje szkoleniowe i testowe. Podczas sesji treningowej myszy mają dostęp zarówno do oprogramowania, jak i wody bez czasu oczekiwania. W ten sposób myszy będą preferować stronę SW. W sesjach testowych czas oczekiwania wydłuża się codziennie (tj. 0, 1, 2, ..., 8 s). Opóźnienia zwiększają się sekwencyjnie codziennie poprzez tworzenie wielu modułów o różnej długości opóźnienia (0, 1, 2, ..., 8 s) i ustawienie "Link" w obszarach "Moduł" i "Opcje" (wzorce dnia). W tym zadaniu wszystkie cztery rogi działają w ten sam sposób, 24 godziny na dobę.
      1. Przygotuj plik eksperymentalny do zadania DD.
      2. Określ stronę SW (prawa lub lewa strona we wszystkich rogach).
      3. Zastąp butelki z wodą po określonych stronach butelkami zawierającymi SW.
      4. Przeprowadź sesję treningową, aby nauczyć zwierzęta pić SW po określonych stronach bez opóźnień przez 5-7 dni.
      5. Oblicz wskaźnik preferencji, który definiuje się jako stosunek lizania lub szturchania nosem z boku SW do całkowitej liczby liźnięć lub nosepoków. Wskaźnik preferencji dla strony zawierającej SW oblicza się zatem jako:
         
         lub
         
         Pierwszy indeks skupia się bardziej na wynikach działania, podczas gdy drugi skupia się bardziej na zachowaniach związanych z wyborem.
         UWAGA: Upewnij się, że większość myszy preferencyjnie wybiera strony z SW (>90% dla wskaźnika opartego na liczbach lizania, >80% dla pierwszego wskaźnika opartego na nosepkach) pod koniec treningu.
      6. Następnie uruchom sesję testową zadania DD przez 9 dni (opóźnienie od 0 do 8 s).
      7. Oceń przebieg w czasie zmiany preferencji w stronę z SW, aby ocenić kompulsywność.
4. analiza danych
   1. Otwórz archiwa za pomocą "Analyzera" i wyeksportuj wszystkie dane do plików Excel. Jeśli ilość danych jest dość duża, lepiej jest przefiltrować dane (tj. wyodrębnić sesję picia dla zadań przestrzennych i wyodrębnić pierwszą i drugą nozurę dla zadań SRT).

Wyniki

W naszym poprzednim badaniu, zależne od wieku deficyty poznawcze w modelach AD zostały wykryte przez eksperymenty przy użyciu automatycznego systemu monitorowania klatki domowej¹⁰. Ich wydajność modeli AD w PP była nienaruszona zarówno u młodych dorosłych, jak i u osób starszych; jednak wydajność w PPR była znacznie i stopniowo pogarszana (Rysunek 6). Ważne jest również, aby obserwować ogólne zachowanie lub lęk w fazie adaptacji, ponieważ takie ...

Dyskusja

W artykule opisano metodę wykorzystującą zautomatyzowany system monitorowania w klatce domowej do długoterminowych testów poznawczych i behawioralnych w genetycznie zmodyfikowanych modelach AD. Najważniejszym krokiem jest zagnieżdżenie transpondera w odpowiedniej pozycji. Przed wykonaniem implantacji należy upewnić się, że nie upłynął termin ważności transpondera. Drugą ważną kwestią jest codzienne sprawdzanie funkcjonowania systemu, zwłaszcza że drobny problem może później przerodzić się w poważniejszy w trakcie badania...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
IntelliCage	TSE		Systems-Parchased w 2011 roku lub później
PC		Dell Inspiron 580s-Display
	Dell	SI75T-WL-ALPHA-dri
	Shepherd Specialty	Papers-Standardowa pościel
Aron Alpha (Krasy Glue) 2 g	Toagosei (Krasy Glue)	#04612	Cyjanoakrylany do klejenia magnesu i ramienia blak
Ręczny czytnik transponderów	BTS-ID	R-560	Czytnik transponderów, który odczytuje zarówno transponder Trovan, jak i DataMars
Transponder	DataMars	T-VA, T-VA, T-VAS lub innej serii	Podstawowy pakiet transponderów i implanterów
Diamond Grip Plus	Ansel Microflex	DGP-INT-M	Rękawica eksperymentalna
Isoflurane	Pfizer	1119701G1092	-
Waporyzator dla małych zwierząt	DS Pharma Biomedical	SF-B01	Maska na twarz w zestawie
Neo-Medrol	Pfizer	006472-001	Maść do oczu
Etanol (70%)	-	--
Excel	Microsoft	00202-51382-15524-AA928	Do analizy danych