Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowany, długoterminowy test behawioralny funkcji poznawczych w wielu modelach genetycznych choroby Alzheimera z wykorzystaniem IntelliCage

11.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58009

⸱

4 sierpnia 2018

 ,  , 
1Laboratory for Behavioral Genetics, Center for Brain Science, RIKEN, 2Organization for Research Initiatives and Development, Doshisha University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje protokół oceny funkcji poznawczych dla modeli genetycznych choroby Alzheimera przy użyciu systemu IntelliCage, który jest wysokowydajnym zautomatyzowanym systemem monitorowania zachowań z warunkowaniem instrumentalnym.

Streszczenie

Wiele czynników - takich jak starzenie się i geny - jest często związanych ze spadkiem funkcji poznawczych. Genetycznie zmodyfikowane mysie modele pogorszenia funkcji poznawczych, takie jak choroba Alzheimera (AD), stały się obiecującym narzędziem do wyjaśnienia mechanizmów leżących u podstaw choroby i promowania postępów terapeutycznych. Ważnym krokiem jest walidacja i charakterystyka oczekiwanych nieprawidłowości behawioralnych w modelach, w przypadku AD, pogorszenia funkcji poznawczych. Długoterminowe badania behawioralne zwierząt laboratoryjnych w celu zbadania skutków starzenia się wymagają znacznego wysiłku ze strony badaczy. System IntelliCage to wysokowydajna i ekonomiczna bateria testowa dla myszy, która eliminuje potrzebę codziennej obsługi przez człowieka. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób system jest wykorzystywany w długoterminowym fenotypowaniu genetycznego modelu choroby Alzheimera, koncentrując się w szczególności na funkcjach poznawczych. W eksperymencie wykorzystano powtarzającą się baterię testów, które oceniają uczenie się przestrzenne i funkcje wykonawcze. To opłacalne, zależne od wieku fenotypowanie pozwala nam zidentyfikować przejściowy i/lub trwały wpływ genów na różne aspekty poznawcze.

Wprowadzenie

Rozwój zwierzęcych modeli chorób neuronalnych w ciągu ostatniej dekady dostarczył mechanistycznego zrozumienia ich podstaw i w celu promowania postępu terapeutycznego1,2,3. Zastosowanie wysokoprzepustowej baterii testów behawioralnych w genetycznych modelach zwierzęcych jest heurystycznym narzędziem badawczym służącym do badania mechanizmów leżących u podstaw chorób człowieka i identyfikacji terapii lekowych. Baterie do testów badawczych przystosowane do długotrwałej obserwacji modeli starzenia się i/lub demencji tradycyjnie zmuszały laboratoria do pochłaniania dużych ilości wyspecjalizowanej siły roboczej i czasu. System monitorowania w klatce domowej byłby opłacalną strategią, ponieważ zmniejszyłby koszty obserwacji behawioralnej przez ludzi. Niektóre zespoły badawcze opracowały zautomatyzowane narzędzia oparte na wizji, które wspomagają fenotypowanie behawioralne pojedynczego osobnika w małej klatce domowej4,5,6. Jednak takie metody ograniczają interakcje społeczne, rozmiar środowisk testowych i różnorodność miar behawioralnych, które obejmują funkcje poznawcze. IntelliCage to system monitorowania klatki domowej drugiej generacji, przeznaczony do wykonywania różnych zadań poznawczych w domowej klatce społecznej. Co ważne, metoda ta może wyeliminować codzienną obsługę, która umożliwia nam długoterminowe monitorowanie zachowania z oceną funkcji poznawczych, a także może wyeliminować wymagania dotyczące specjalistycznej obsługi praktycznej i umożliwić wysoce powtarzalne pozyskiwanie danych7. W tym miejscu opisujemy długoterminowe fenotypowanie i walidację w genetycznych mysich modelach choroby Alzheimera (AD), które zostały ostatnio wygenerowane8,9,10 przy użyciu zautomatyzowanego systemu monitorowania klatki domowej. Zestaw testów, który obejmował ocenę uczenia się przestrzennego i funkcji wykonawczych, był wielokrotnie wykonywany w różnych punktach wiekowych (9–12 i 14–17 miesięcy). To zależne od wieku fenotypowanie pozwoliło nam zidentyfikować przejściowy i/lub trwały wpływ genów na różne aspekty poznawcze. Odkryliśmy, że niektóre modele AD wykazywały zarówno przejściowe, jak i trwałe fenotypy kilku aspektów poznawczych testowanych w analizie długoterminowej przy użyciu zautomatyzowanego systemu monitorowania klatki domowej10. W związku z tym zautomatyzowane badanie z wykorzystaniem systemu monitorowania w klatce domowej jest korzystne i opłacalne dla długoterminowego fenotypowania behawioralnego i walidacji w różnych modelach dysfunkcji poznawczych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki i wykorzystania zwierząt i przeprowadzono je zgodnie z wytycznymi Instytutu Nauk o Mózgu RIKEN dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach.

1. Przygotowanie aparatury

UWAGA: Przegląd zautomatyzowanego systemu monitorowania klatek domowych przedstawiono na Rysunku 1. Każdy system (39 cm x 58 cm x 21 cm) zawiera jeden mikroprocesor oraz cztery komory narożne, z których każda posiada dwie butelki z wodą i antenę pierścieniową do wykrywania identyfikacji radiowej (RFID) transponderów wszczepionych zwierzętom (Rysunek 1A). Numery identyfikacyjne mikroprocesora są definiowane przez przełącznik obrotowy (adresy sprzętowe) (Rysunek 1B). Numery identyfikacyjne mikroprocesorów nie powinny się pokrywać. Dwie drzwi w każdym narożniku są sterowane przez komputery, które służą do warunkowania instrumentalnego (Rysunek 1C). Zazwyczaj w jednej klatce można monitorować do 12 myszy (patrz Rysunek 2 jako przykład zakwaterowania grupowego). Dopuszczalne jest użycie większej liczby myszy. Należy jednak upewnić się, że myszy nie wykazują nadmiernej agresji i że nie występuje przepełnienie klatki podczas wykonywania zadań wymagających silnej konkurencji.

  1. Podłącz klatki szeregowo do komputera za pomocą kabli CAN.
  2. Podłącz kable akumulatora do gniazd w mikroprocesorze (Włączenie zasilania). Wszystkie diody LED powinny wówczas zaświecić się na kilka sekund, a wszystkie drzwi powinny się poruszyć. Jeśli diody LED nie zgasną lub jeśli drzwi się nie ruszają, odłącz i ponownie podłącz kabel zasilający (złe połączenia elektryczne mogą prowadzić do nieprawidłowego działania).
  3. Upewnij się, że przesuwne drzwi otwierają się i zamykają prawidłowo. Jeśli drzwi nie poruszają się prawidłowo, sprawdź małe magnesy przymocowane do czarnego ramienia. Jeśli problem ten występuje często, rozważ przyklejenie magnesu do ramienia.
  4. Kontynuuj sprawdzanie stanu drzwi przez cały czas trwania eksperymentów (co najmniej raz dziennie).
  5. Włącz komputer.

2. Oprogramowanie

UWAGA: Wszystkie trzy komponenty oprogramowania („Designer”, „Controller” oraz „Analyzer”) dla zautomatyzowanego systemu monitorowania klatek domowych zostały zaprojektowane jako graficzne interfejsy użytkownika (Rysunek 3). Użytkownicy mogą w łatwy sposób kontrolować lub dodawać różne funkcje w trakcie eksperymentu.

  1. Tworzenie plików eksperymentu za pomocą programu „Designer”
    UWAGA: Program „Designer” służy do generowania i edycji plików eksperymentalnych (programów systemowych) w celu przeprowadzania różnych protokołów eksperymentalnych oraz testowania stanu systemu (Rycina 3A). Jeden plik eksperymentalny zawiera listę zwierząt, ustawienia sprzętowe oraz wiele protokołów eksperymentalnych. Użytkownicy mogą również uzyskać opublikowane protokoły z czasopism, kontaktując się z autorami.
    1. Utwórz listę zwierząt
      1. Zdefiniuj warunki. Opracuj ogólny plan eksperymentalny, który obejmuje następujące parametry: 1) liczbę myszy badawczych, 2) liczbę linii genetycznych (lub grup traktowanych), 3) płeć (samce, samice lub obie płcie) oraz 4) liczbę klatek do wykorzystania.
      2. W centralnym pasku narzędzi wybierz odpowiedni typ transpondera (DataMars lub Trovan).
      3. Ustaw „Grupy”. W panelu „Grupy” dodaj lub usuń grupy eksperymentalne (t. j.., genotypów lub zabiegów) poprzez naciśnięcie odpowiednio przycisku „zielonego plusa (+)” lub „czerwonego krzyżyka (x)” w oknie „Groups”.
      4. Ustaw „Klastry”. Użyj funkcji „Klaster”, aby operować na podgrupach w jednakowy sposób, definiując narożniki i krawędzie poprawne, błędne oraz neutralne.
        UWAGA: Zdarzenia takie jak wizyta, dotknięcie noskiem i lizanie, stanowiące główne dane dla każdego zadania behawioralnego, są powiązane z definicją. Ustawienie to jest wymagane w zadaniach dotyczących uczenia się przestrzennego. Zdefiniowane klastry dla każdego zwierzęcia pozostają niezmienne przez cały czas trwania eksperymentu. Na przykład w jednym klastrze w zadaniu preferencji miejsca (PP) lub odwrócenia preferencji miejsca (PPR) jeden narożnik jest zdefiniowany jako poprawny (dostęp do wody), a trzy narożniki jako niepoprawne (brak dostępu do wody). Ponadto klastry można powiązać ze sobą za pomocą funkcji „Link”.
      5. Przypisz zmienne, w tym „Imię”, „Tag” (ID transpondera), „Płeć”, „Grupę” i „Klastry”.
      6. Zapisz i wklej listy zwierząt, wybierając opcję „Export Animals”… a następnie „Import Animals”… w pasku menu „File”, aby powielić listy zwierząt dla innego eksperymentu.
    2. Skonfiguruj sprzęt w zakładce „Setup”. Skonfiguruj wszystkie systemy, używając ich odpowiednich numerów identyfikacyjnych (adresów sprzętowych) w zakładce „Setup”. Dopasuj liczbę adresów w sekcji „designer” do rzeczywistej liczby adresów.
    3. Twórz protokoły eksperymentalne w zakładce „IntelliCage”
      1. Twórz protokoły eksperymentalne w zakładce „IntelliCage”, korzystając z poniższych zakładek nadrzędnych i podrzędnych (zakładki „Module” i „Option”).
      2. Zaprojektuj struktury eksperymentalne w „Przestrzeni modułów” (Module Space), klikając kartę „Moduł” (Module) (Rysunek 3A). Aby dodać nowe moduły, naciśnij przycisk „Add” (zielony plus w karcie „Module”).
        Uwaga: Istnieją cztery różne typy komponentów, mianowicie „Zadania” (Tasks), „Narzędzia pomocnicze” (Utils), „Raporty” (Reporters) i „Zdarzenia” (Events). Zazwyczaj eksperyment rozpoczyna się od zdarzenia wyzwalającego, takiego jak „Wizyta” (Visit), „Włożenie nosa” (Nosepoke) lub „Picie” (Drinking). Aby wybrać zdarzenie wyzwalające, należy przeciągnąć odpowiednią jednostkę z sekcji Zdarzenia w celu zdefiniowania sygnału startowego. Następnie, aby ustawić wyjście dla określonych siłowników (np. otwieranie drzwi), należy przeciągnąć jednostki z sekcji „Zadania” (np.., „Drzwi”, „LED” i „Powietrze”).
      3. Przeciągnij jednostki, przedstawione w sekcji „Jednostki”, do „Przestrzeni modułu”.
        UWAGA: Użytkownicy mogą ponownie pozyskać opublikowane protokoły (w formie plików eksperymentalnych) od autorów i ponownie wykorzystać te pliki, importując nową listę zwierząt. Użytkownicy nie muszą tworzyć wszystkich modułów.
      4. Aby przygotować moduł adaptacji do wkłuć nosowych (nosepoke adaptation, NPA) (Rycina 6A), przeciągnij jednostkę „Door” z sekcji „Tasks”, jednostki „Gate” i „Timer” z sekcji „Utils” oraz jednostki „Visit” i „Nosepke” z sekcji „Events” do obszaru „Module Space”.
      5. Połącz wyjście „Any” w linii „ON” modułu Nosepoke z wejściem „In” w module Gate. Połącz wyjście „Out” z wejściem „Close” w module Gate. Połącz wyjście „Out” w module Gate z wejściem „Activate” w module Timer. Połącz wyjście „Out” w module Gate z wejściem „Open” w module Door. Połącz wyjście „Out” w module Timer z wejściem „Close” w module Door. W sekcji Timer ustaw wartość „Period” na 5 0 (ms).
        UWAGA: Jednostka „Gate” służy do kontrolowania wejścia i wyjścia sekwencji. W stanie „Open” (stan domyślny) uruchomiona zostanie sekwencja podłączona do wyjścia „Output”. Z kolei w stanie „Close” sekwencja podłączona do wyjścia zostanie zatrzymana. Można określić prawdopodobieństwo częstotliwości otwarcia (Rysunek 6A, Rycina 8A, i Rysunek 9A). „Module Selector” służy do zmiany modułów w sposób losowy lub w określonej sekwencji podczas tego samego okresu eksperymentalnego. W zadaniu seryjnego czasu reakcji (SRT) moduły (o zmiennych długościach opóźnienia) są na przykład losowo przełączane na koniec każdej wizyty za pomocą Module Selectora (ustawionego w trybie „RandomExcludeDefault”) powiązanego z linią „END” jednostki „Visit” (Rycina 8A). Jednostka „Splitter” (rozdzielacz) będzie służyć do kierowania sygnału wejściowego na określoną stronę narożnika. Jest to wymagane w przypadku bardziej skomplikowanych modułów, takich jak te stosowane w SRT lub zadaniu dyskontowania opóźnionego (DD), które wymagają uruchomienia konkretnej strony. Na przykład w zadaniu DD tylko jedna strona (strona ze słodką nagrodą) otworzy się z opóźnieniem (Rysunek 9A).
      6. Zdefiniuj stan początkowy drzwi w klatkach w karcie „Opcje”. W sesji bez dostępu do wody określ wszystkie drzwi jako zamknięte, co stanowi typowy stan początkowy dla zadań PP lub PPR.
      7. Ustaw harmonogramy czasowe w karcie „Options”. Moduły są zmieniane w określonych punktach czasowych, a następnie wykonywana jest czynność zdefiniowana w oknie „Day Patterns”.
        UWAGA: Sekcję „Day Patterns” (Wzorce dobowe) można wykorzystać do ustawienia okna czasowego eksperymentu. Zazwyczaj do oceny zachowania w zadaniach poznawczych wykorzystuje się porę nocną, która jest fazą aktywności myszy. Należy zwrócić uwagę, że czas trwania zadania może wpływać na ilość przyjmowanej wody. Jeśli czas trwania stosunkowo łatwych zadań jest zbyt długi, wyniki pod koniec okna czasowego mogą ulec pogorszeniu ze względu na poczucie sytości. W związku z tym okno czasowe musi zostać starannie określone.
  2. Przeprowadzanie eksperymentu przy użyciu „Kontrolera”
    1. Wczytaj plik eksperymentu, klikając przycisk „Experiment”… w sekcji „Setting” w panelu „Controller”.
    2. Uruchom eksperyment, naciskając przycisk „Start” na sterowniku „Controller” (środkowa prawa część).
    3. Monitoruj i wizualizuj aktualny stan systemu oraz myszy.
      Uwaga: Zdarzenia behawioralne zdefiniowano w następujący sposób: wizyta – wejście do narożnika (wykrywane przez czujnik termiczny); nosepoke – włożenie nosa do otworu w narożniku (wykrywane przez wiązkę podczerwieni, z podziałem na nosepoke lewy i prawy); lizanie – lizanie wykrywane przez likometr (liczone jako czas kontaktu oraz częstotliwość).
    4. Dokładnie sprawdź stan systemu, zwracając szczególną uwagę na ostrzeżenia.
      UWAGA: Błędy wynikające z nieprawidłowego znacznika zwierzęcia (numeru transpondera) zostaną odnotowane w dzienniku zdarzeń nawet wtedy, gdy rzeczywisty numer znacznika jest poprawny (t. j.., „ niezarejestrowany znacznik ****”, „ sygnał obecności bez rejestracji anteny”, itd..). Może to wynikać z użycia transpondera, którego termin ważności dobiega końca. Błąd ten nie stanowi jednak poważnego problemu. W takim przypadku należy ponownie sprawdzić, czy zwierzę zidentyfikowane w komunikacie może zostać wykryte. Błędy wynikające z długich okresów bez wizyty lub picia będą wyświetlane na przykład jako: „**** (ID zwierzęcia) nie odbyło żadnych wizyt w ciągu ostatnich 720 minut” (Rycina 3B). Należy dokładnie sprawdzić kilka możliwości, które mogą prowadzić do takich błędów. Najpoważniejszym przypadkiem jest śmierć zwierzęcia. Drugą najpoważniejszą możliwością jest problem z systemem detekcji zwierzęcia (transponder nie działa lub wypadł). Trzecią możliwością jest fakt, że zwierzę jest po prostu nieaktywne. Jeśli zwierzę nie odwiedzi żadnego punktu przez całą dobę, eksperymentator powinien rozważyć usunięcie zwierzęcia z klatki ze względu na jego stan zdrowotny. Poważnym problemem, który nie generuje powiadomienia o błędzie, jest niedomykanie się drzwi (prawie zawsze spowodowane problemami z magnesami w drzwiach). Prowadzi to do powstania niewłaściwego punktu poboru wody. Aby zweryfikować ten problem, stan wszystkich drzwi należy sprawdzać co najmniej raz dziennie podczas sesji bez dostępu do wody. Dane pozyskane w przypadku wystąpienia tego problemu nie mogą być wykorzystane do analizy zadań PP, PPR, SRT lub DD.
    5. Wszystkie zdarzenia behawioralne wraz z tagami dotyczącymi czasu i informacji o zwierzęciu zostaną wyeksportowane po naciśnięciu przycisku „Stop” na kontrolerze („Controller”) (Rycina 3B).
  3. Przetwarzanie danych przy użyciu programu „Analyzer”
    1. Użyj narzędzia „Analyzer”, aby przeanalizować i zwizualizować dane.
    2. Wyeksportuj dane pogrupowane w przedziałach czasowych do plików Excel (Rysunek 3C). Wyniki graficzne przedstawione w zakładce „Charts” mogą ułatwić interpretację danych. W zakładce „Data” dane są rozmieszczone w wielu kolumnach i mogą być sortowane oraz filtrowane według dowolnych parametrów.

3. Przygotowanie zwierząt

  1. Należy użyć zwierząt o masie powyżej 15 g (w wieku 2 miesięcy lub starszych).
    UWAGA: Jeśli zwierzęta ważą mniej niż 15 g, kilka myszy może jednocześnie przebywać w jednym narożniku, co prowadzi do błędów w gromadzeniu danych. Zwierzęta w starszym wieku powinny być uważnie monitorowane, aby upewnić się, że są w stanie wskoczyć do narożników i wspiąć się do podajnika. Niektóre starsze myszy lub myszy z mutacjami genetycznymi wykazujące upośledzenie funkcji motorycznych mogą zginąć z powodu braku dostępu do wody lub pokarmu.
  2. Zredukuj potencjalne ryzyko agresji.
    UWAGA: Nawet w przypadku użycia samic myszy, zaleca się rozpoczęcie wspólnego trzymania wszystkich myszy w jednej klatce w młodym wieku (t. j., w wieku 1 miesiąca) przed rozpoczęciem eksperymentu. W przypadku wykorzystania samców myszy w klatce należy uzyskać profil danej linii myszy, szczególnie pod kątem agresywności.
  3. Zaimplantuj podskórnie myszom w okolicy grzbietowo-szyjnej transpondery identyfikacji radiowej (sterylizowane, wraz z igłą), stosując znieczulenie wziewne izofluranem (Rysunek 4).
    1. Umieść mysz w komorze w celu indukcji znieczulenia.
    2. Ustaw przepływomierz tlenu na wartość od 0,8 do 1,5 l/min, a parownik izofluranu na 2,0–2,5%.
    3. Zwolnij mysz z komory indukcyjnej po spowolnieniu częstości oddechów (spadek o około 5%).
    4. Utrzymać znieczulenie za pomocą maski twarzowej.
    5. Nanieść maść oftalmiczną do oczu w celu zapobiegania ich wysuszeniu.
    6. Uściśnij i unieś skórę wokół tylnej części łopatek, aby utworzyć kieszeń.
    7. Obmyj miejsce wstrzyknięcia 70% etanolem, aby zminimalizować przedostanie się włosów do przestrzeni podskórnej. Następnie wprowadź igłę wstrzykującą przez skórę równolegle do kręgosłupa.
    8. Wprowadzić mikrochip podskórnie.
    9. Przesuń mikroczip przez skórę, aby umieścić go w przestrzeni między łopatkami.
    10. Powoli wycofaj igłę. Kontynuuj uciskanie tego obszaru przez kilka sekund w celu uzyskania hemostazy.
    11. W przypadku nieprawidłowego wprowadzenia igły należy zastosować środki przeciwbólowe po zabiegu.
    12. Wybudź mysz z narkozy.
    13. Umieść mysz w klatce regeneracyjnej i monitoruj ją do momentu wybudzenia się i rozpoczęcia poruszania. Unikaj pozostawiania myszy bez nadzoru.
    14. Przenieś mysz do klatki macierzystej, gdy odzyska ona pełną zdolność poruszania się.
    15. Sprawdzać wszczepiony transponder za pomocą czytnika transponderów przez co najmniej 1 tydzień.
      UWAGA: Położenie zaimplantowanych transponderów ma krytyczne znaczenie dla identyfikacji (patrz Rycina 2). Nie należy wprowadzać transpondera pionowo w okolice karku; może to spowodować poważne obrażenia rdzenia kręgowego zwierzęcia. Transpondery czasami wypadają po kilku godzinach lub dniach. Należy sprawdzić, czy transponder działa, używając czytnika transponderów. W razie potrzeby można ponownie zaimplantować transponder, jeśli wypadnie; należy jednak pamiętać, że ponowna implantacja może spowodować sztuczne zmiany w zachowaniu. Należy sprawdzić datę ważności. Przeterminowane transpondery często przesyłają błędne sygnały, co skutkuje utratą danych.
  4. Umieść zwierzęta w klatce i sprawdź transpondery wszczepione myszom za pomocą czytników transponderów. Usuń myszy, w których nie wykryto transponderów.

4. Przeprowadzanie eksperymentów

UWAGA: Myszy są karmione ad libitum standardową karmą dla myszy i utrzymywane na syntetycznej ściółce, którą wymienia się co 1 lub 2 tygodnie, w zależności od harmonogramu zadań. Należy unikać wymiany ściółki podczas zadania uczenia przestrzennego, zwłaszcza w ciągu pierwszych 1–2 dni. Światło jest włączone między 08:0 a 20:0. Moduły eksperymentalne są wykonywane sekwencyjnie, zgodnie z pytaniami badawczymi. Harmonogram eksperymentalny został przedstawiony na Rysunku 5.

  1. Aktywność ogólna
    UWAGA: Myszy są sekwencyjnie adaptowane do środowiska w klatce z wykorzystaniem trzech warunków eksperymentalnych: wolnej adaptacji (Free Adaptation), w której zwierzęta mają stały i swobodny dostęp do butelek z wodą w narożnikach (zazwyczaj uznaje się, że od jednego dnia do jednego tygodnia habituacji jest wystarczające); NPA, w której myszy mogą mieć dostęp do butelek z wodą przez 5 s po każdym włożeniu nosa w otwory znajdujące się przed drzwiami w narożnikach (zazwyczaj uznaje się, że od 3 dni do jednego tygodnia habituacji jest wystarczające); oraz adaptacji do sesji picia (Drinking Session Adaptation), w której myszy mają dostęp do butelek z wodą o określonej porze dnia.
    1. Przygotuj pliki eksperymentu dla zadań FA, NPA i DSA.
    2. Uruchom zadanie FA w module „Controller”.
    3. Należy codziennie mierzyć liczbę wizyt, wkłuć nosa (nosepokes) i/lub epizodów lizania lub okresowo mierzyć aktywność okołodobową jako wskaźnik ogólnej aktywności.
    4. Uruchom zadanie NPA w „Kontrolerze”.
    5. Uruchom zadanie DSA w „Kontrolerze”.
      Uwaga: Wiele paradygmatów uczenia się wymaga dostosowania do sesji picia. Aby ustawić harmonogram czasowy dla DSA, należy użyć dwóch różnych modułów eksperymentalnych: domyślnej sesji (w przypadku deprywacji wodnej) oraz sesji picia. Myszy nie mają dostępu do butelek z wodą, ponieważ w module domyślnym po włożeniu nosa do otworu (nosepoke) nie następuje żadna reakcja. Sesja picia jest identyczna z modułem NPA. Harmonogram czasowy zdefiniowany w zakładce „Options” w oknie „Designer” może następnie przechodzić do sesji bez picia, zdefiniowanej przez inny moduł.
  2. Zadania uczenia się przestrzennego i pamięci przestrzennej
    UWAGA: Zadanie PP jest wykorzystywane do oceny uczenia się przestrzennego (zazwyczaj 5–7 dni). W zadaniu PP myszy mają ograniczony dostęp do wody w trzech z czterech narożników (jeden narożnik poprawny i trzy narożniki niepoprawne). W związku z tym zwierzęta muszą udać się do określonego narożnika, aby wypić wodę podczas sesji pojenia. Zadanie PPR jest wykorzystywane do oceny elastyczności lub kompulsywności oraz zdolności do płynnej zmiany zachowania (zazwyczaj 5–7 dni). W zadaniu PPR myszy mają dostęp do wody wyłącznie w narożnikach przeciwległych do tych, które służyły jako narożniki poprawne w zadaniu PP.
    1. Przygotuj pliki eksperymentu dla zadań PP i PPR. Zdefiniuj właściwe narożniki dla myszy, ustawiając „Klastry” (zazwyczaj od 1 do 4 narożników dla każdego zwierzęcia) w zakładce „Zwierzę” (Animal) w module „Projektant” (Designer) (patrz Rycina 6A, dół). Aby uniknąć nadmiernego ruchu w jednym narożniku, należy równomiernie przydzielić wszystkie cztery narożniki wszystkim myszom.
    2. Uruchom zadanie PP w kontrolerze.
    3. Oceń wydajność uczenia się przestrzennego w odniesieniu do przebiegu czasowego, liczby oraz procentowej zawartości poprawnych wbić nosa.
      Uwaga: Obecna wersja zadania PP skupia się bardziej na uczeniu przestrzennym niż na pamięci przestrzennej, ponieważ zadanie to nie wymaga przerwy czasowej między poszczególnymi próbami. Aby bardziej skoncentrować się na pamięci przestrzennej, należy rozważyć zastosowanie zadania unikania miejsca (PA) lub nowej, nieokreślonej wersji zadania przestrzennego, która wykorzystuje określone przerwy czasowe między próbami.
    4. Uruchom zadanie PPR w „Kontrolerze”.
    5. Oceniać elastyczność lub kompulsywność na podstawie przebiegu czasowego, liczby oraz procentowej zawartości prawidłowych wbić nosa (nosepokes).
      Uwaga: Interpretacja danych PPR wymaga kilku uważnych ocen. Początkowe wyniki w zadaniu PPR są silnie zależne od wyników w zadaniu PP. Wynika to z faktu, że zadanie PPR opiera się na interferencji lub konieczności zmiany zachowania. W związku z tym wyniki w zadaniu PPR mogą być szczególnie słabe, jeśli poprawność wykonania zadania PP jest bliska 10%. Elastyczność można uznać za jedną z funkcji wykonawczych.11,12,13.
    6. Ocena przestrzennej pamięci lękowej w obszarze PA.
      Uwaga: zadanie PA składa się z 4 ciągłych sesji: habituacji (dzień 1); warunkowania (podmuch powietrza jest wprowadzany po włożeniu nosa w dowolną stronę zdefiniowanego narożnika [błędne włożenie nosa], dzień 2); 24-godzinnej przerwy poza klatką testową (myszy są przenoszone z powrotem do swoich standardowych klatek domowych, dzień 3); ponownego umieszczenia myszy w klatce testowej bez podmuchu powietrza (dni 4–10).
      1. Przygotuj pliki eksperymentalne do analizy białek (PA).
      2. Przeprowadzenie habituacji (dzień 1).
      3. Trening kondycyjny (dzień 2).
      4. Przenieść myszy do zwykłych klatek domowych i utrzymywać przez 24 h (dzień 3).
      5. Przenieście myszy z powrotem do klatki testowej i przeprowadźcie protokół testowy (dni 4–10).
      6. Ocenić awersyjną naukę przestrzenną na podstawie stosunku błędnych wkładnięć nosa w dniu warunkowania (dzień 2.), awersyjną pamięć przestrzenną na podstawie tego stosunku w dniu powrotu do klatki testowej (dzień 3.) oraz proces wygaszania nauki na podstawie wartości z dni 4–10.
  3. Ocena funkcji wykonawczych (impulsywności, uwagi i kompulsywności)
    1. zadania SRT
      UWAGA: Ta procedura została wcześniej opisana bardziej szczegółowo10,14W tym zestawie zadań wszystkie cztery narożniki są obsługiwane w ten sam sposób, 24 godziny na dobę. SRT składa się z dwóch sesji treningowych (SRT-Trening 1 i 2) oraz dwóch sesji testowych (SRT-Test 1 i 2). W pierwszej sesji treningowej (SRT-Trening 1) zwierzęta są szkolone, aby nauczyć się, że żółte światło LED jest sygnałem startowym do włożenia nosa do otworu (nosepoke). Diody LED zawsze migają natychmiast po początkowym włożeniu nosa do otworu (opóźnienie ustawiono na 0 s).
      W drugiej sesji treningowej (SRT-Training 2) opóźnienie jest ustawione tak, aby zmieniało się losowo w przedziale 0,5, 1,0, 2,0 i 4,0 s. W tym okresie odpowiedzi przedwczesne nie niosą za sobą żadnych konsekwencji (trening wstępny). Każde włożenie nosa do otworu (nosepoke) podczas okresu opóźnienia jest uznawane za odpowiedź przedwczesną, natomiast pierwsze włożenie nosa po otwarciu drzwiczek (5 s) jest uznawane za odpowiedź prawidłową. W pierwszej sesji testowej (SRT-Test 1, służącej do oceny impulsywności) pierwsze włożenie nosa określa prawidłową stronę i inicjuje okres opóźnienia (0,5–4,0 s, w zależności od fazy zadania), po którym przez określony czas zapalają się żółte diody LED (czas trwania bodźca = 2,0 s, w zależności od fazy zadania). Następnie drzwiczki zostają otwarte. Pierwsze włożenie nosa po okresie opóźnienia otwiera drzwiczki (5 s) i jest liczone jako prawidłowe włożenie nosa, podczas gdy każde włożenie nosa podczas okresu opóźnienia jest uznawane za przedwczesne włożenie nosa. W drugiej sesji testowej (SRT-Test 2, służącej do oceny uwagi) wprowadzono kilka modyfikacji. Po uruchomieniu bodźca (0,2–1,0 s, nieco krócej niż w pierwszym teście), myszy otrzymują okres czasu, w którym dozwolone jest wkładanie nosa do otworu (tzw. ograniczony czas oczekiwania, zazwyczaj 2 s). Drzwiczki otwierają się (5 s) tylko po prawidłowym włożeniu nosa, którym jest pierwsze włożenie nosa w czasie ograniczonego czasu oczekiwania. Włożenia nosa po upływie ograniczonego czasu oczekiwania są uznawane za pominięte włożenie nosa i nie prowadzą do żadnych zmian w wyniku. Błędy dzielą się na trzy typy: przedwczesne włożenie nosa, pominięte włożenie nosa oraz pominięcie (dotyczy tylko pierwszego włożenia nosa). Test uwagi wymaga zdolności do zauważenia błysku diody LED (definiowanej przez czas trwania bodźca) oraz umiarkowanie szybkiej reakcji (definiowanej przez czas trwania ograniczonego czasu oczekiwania). Przebieg czasowy próby przedstawiono na Rysunek 7.
      1. Przygotuj pliki eksperymentalne do zadań SRT.
      2. Przeprowadzić trening SRT-Training 1 przez 3 dni.
      3. Przeprowadzić trening SRT-Training 2 przez 7 dni.
      4. Przeprowadzić test SRT-Test 1 (impulsywność) przez 7 dni. Obliczyć impulsywność na podstawie następującego wzoru:
        Wzór na obliczenie impulsywności; równanie matematyczne; analiza badań edukacyjnych.
        gdzie P to liczba prób z przedwczesnym włożeniem nosa (lub liczba błędnych włożeń nosa), a T to łączna liczba prób (liczba pierwszych włożeń nosa).
      5. Przeprowadź test SRT-Test 2 (uwaga) przez 7 dni. Oblicz dokładność (która jest uznawana za wskaźnik wydajności uwagi), stosując następujący wzór:
        Wzór na obliczanie dokładności; równanie matematyczne; badania, statystyka, analiza danych.
        gdzie C to liczba poprawnych prób wkładania nosa (liczba poprawnych drugich wkładnięć nosa), T to łączna liczba prób (liczba pierwszych wkładnięć nosa), O to liczba prób z pominięciem (liczba prób bez drugiego wkładnięcia nosa), a P to liczba prób przedwczesnego wkładania nosa (lub liczba błędnych drugich wkładnięć nosa przed upływem czasu oczekiwania).
    2. Zadanie DD
      UWAGA: Jest to proste zadanie z wyboru, w którym zwierzęta decydują, czy poczekać na możliwość wypicia słodkiej wody (SW, 0,5% sacharyny lub 10% sacharozy) z opóźnieniem, czy wypić zwykłą wodę bez opóźnienia. Drzwi po wybranej stronie otwierają się, podczas gdy drzwi po stronie przeciwnej pozostają zamknięte. SW i zwykła woda są rozmieszczone po prawych lub lewych stronach we wszystkich narożnikach w identyczny sposób. Harmonogram zadania DD obejmuje sesje treningowe i testowe. W sesji treningowej myszy mają dostęp zarówno do SW, jak i wody bez czasu oczekiwania. W ten sposób myszy wypracują preferencję do strony z SW. W sesjach testowych czas oczekiwania wzrasta codziennie (t.j.., 0, 1, 2, …, 8 s). Opóźnienia zwiększają się każdego dnia sekwencyjnie poprzez tworzenie wielu modułów o różnych długościach opóźnienia (0, 1, 2, …, 8 s) i ustawienie funkcji „Link” w obszarach „Module” oraz „Options” (Wzorce dobowe). W tym zadaniu wszystkie cztery narożniki działają w ten sam sposób przez 24 h na dobę.
      1. Przygotuj plik eksperymentalny dla zadania DD.
      2. Określ stronę SW (prawa lub lewa strona we wszystkich narożnikach).
      3. Zastąp butelki z wodą w określonych miejscach butelkami zawierającymi SW.
      4. Przeprowadzać sesje treningowe przez 5–7 dni, aby nauczyć zwierzęta picia wody (SW) po wyznaczonych stronach bez opóźnienia.
      5. Oblicz indeks preferencji, który definiuje się jako stosunek liczby polizań lub wkładania nosa (nosepoking) po stronie SW do całkowitej liczby polizań lub wkładania nosa. Indeks preferencji dla strony zawierającej SW oblicza się zatem w następujący sposób:
        Wzór indeksu preferencji: stosunek liczby polizań; badanie behawioralne; schemat analizy danych.
        lub
        Wzór indeksu preferencji; równanie do analizy eksperymentów behawioralnych z wykorzystaniem wkładania nosa do otworów (nosepoke); analiza danych.
        Pierwszy wskaźnik koncentruje się bardziej na wynikach działań, podczas gdy drugi skupia się w większym stopniu na zachowaniach związanych z dokonywaniem wyborów.
        UWAGA: Należy upewnić się, że większość myszy preferuje strony z SW (>90% dla indeksu opartego na liczbie polizań, >80% dla pierwszego indeksu opartego na naciskaniu nosa) pod koniec treningu.
      6. Następnie przeprowadź sesję testową zadania DD przez 9 dni (opóźnienie od 0 do 8 s).
      7. Oceń przebieg czasowy zmiany preferencji strony z SW w celu oceny kompulsywności.
  4. Analiza danych
    1. Otwórz archiwa za pomocą programu „Analyzer” i wyeksportuj wszystkie dane do plików Excel. Jeśli ilość danych jest bardzo duża, zaleca się ich przefiltrowanie (t. j.., wyodrębnić sesję picia dla zadań przestrzennych oraz wyodrębnić pierwsze i drugie uderzenia nosem dla zadań SRT).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W naszym poprzednim badaniu deficyty poznawcze zależne od wieku w modelach AD wykryto za pomocą eksperymentów z wykorzystaniem zautomatyzowanego systemu monitorowania klatek domowych10. Wyniki modeli AD w teście PP były prawidłowe zarówno u młodych dorosłych, jak i u starszych osobników; jednakże wyniki w teście PPR były znacząco i progresywnie zaburzone (Rysunek 6). Ważne jest również obserwowanie ogólnego zachowania lub lęku w fazie ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W artykule opisano metodę wykorzystującą zautomatyzowany system monitorowania w klatce domowej do długoterminowych testów poznawczych i behawioralnych w genetycznie zmodyfikowanych modelach AD. Najważniejszym krokiem jest zagnieżdżenie transpondera w odpowiedniej pozycji. Przed wykonaniem implantacji należy upewnić się, że nie upłynął termin ważności transpondera. Drugą ważną kwestią jest codzienne sprawdzanie funkcjonowania systemu, zwłaszcza że drobny problem może później przerodzić się w poważniejszy w trakcie badania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Reiko Ando za pomoc w fotografowaniu materiałów. Badania te były wspierane przez Grant-in-Aid for Exploratory Research (JSPS KAKENHI Grant Number 16K15196).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
IntelliCageTSESystems-Parchased w 2011 roku lub później
PCDell Inspiron 580s-Display
DellSI75T-WL-ALPHA-dri
Shepherd SpecialtyPapers-Standardowa pościel
Aron Alpha (Krasy Glue) 2 gToagosei (Krasy Glue)#04612Cyjanoakrylany do klejenia magnesu i ramienia blak
Ręczny czytnik transponderówBTS-IDR-560Czytnik transponderów, który odczytuje zarówno transponder Trovan, jak i DataMars
TransponderDataMarsT-VA, T-VA, T-VAS lub innej seriiPodstawowy pakiet transponderów i implanterów
Diamond Grip PlusAnsel MicroflexDGP-INT-MRękawica eksperymentalna
IsofluranePfizer1119701G1092-
Waporyzator dla małych zwierzątDS Pharma BiomedicalSF-B01Maska na twarz w zestawie
Neo-MedrolPfizer006472-001Maść do oczu
Etanol (70%)---
ExcelMicrosoft00202-51382-15524-AA928Do analizy danych

Bibliografia

  1. Bryan, K. J., Lee, H., Perry, G., Smith, M. A., Casadesus, G. Transgenic Mouse Models of Alzheimer's Disease: Behavioral Testing and Considerations. Methods of Behavior Analysis in Neuroscience. , CRC Press/Taylor & Francis. (2009).
  2. Nestler, E. J., Hyman, S. E. Animal models of neuropsychiatric disorders. Nature Neuroscience. 13 (10), 1161-1169 (2010).
  3. Crawley, J. N. Behavioral Phenotyping Strategies for Mutant Mice. Neuron. 57 (6), 809-818 (2008).
  4. Zarringhalam, K., Ka, M., et al. An open system for automatic home-cage behavioral analysis and its application to male and female mouse models of Huntington's disease. Behavioural Brain Research. 229 (1), 216-225 (2012).
  5. Prusiner, S. B., Jackson, W. S., King, O. D., Lindquist, S. The power of automated high-resolution behavior analysis revealed by its application to mouse models of Huntington's and prion diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (23), 13363-13383 (1998).
  6. Jhuang, H., Garrote, E., et al. Automated home-cage behavioural phenotyping of mice. Nature Communications. 1 (6), 1-9 (2010).
  7. Krackow, S., Vannoni, E., et al. Consistent behavioral phenotype differences between inbred mouse strains in the IntelliCage. Genes, brain, and behavior. 9 (7), 722-731 (2010).
  8. Nilsson, P., Saito, T., Saido, T. C. New mouse model of Alzheimer's. ACS chemical. 5 (7), 499-502 (2014).
  9. Saito, T., Matsuba, Y., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 17 (5), 661-663 (2014).
  10. Masuda, A., Kobayashi, Y., Kogo, N., Saito, T., Saido, T. C., Itohara, S. Cognitive deficits in single App knock-in mouse models. Neurobiology of Learning and Memory. , (2016).
  11. Chan, R. C. K., Shum, D., Toulopoulou, T., Chen, E. Y. H. Assessment of executive functions: Review of instruments and identification of critical issues. Archives of Clinical Neuropsychology. 23 (2), 201-216 (2008).
  12. Jurado, M. B., Rosselli, M. The Elusive Nature of Executive Functions: A Review of our Current Understanding. Neuropsychology Review. 17 (3), 213-233 (2007).
  13. Diamond, A. Executive Functions. Annual Review of Psychology. 64 (1), 135-168 (2013).
  14. Kobayashi, Y., Sano, Y., et al. Genetic dissection of medial habenula-interpeduncular nucleus pathway function in mice. Frontiers in behavioral neuroscience. 7, 17(2013).
  15. Robinson, O. J., Vytal, K., Cornwell, B. R., Grillon, C. The impact of anxiety upon cognition: perspectives from human threat of shock studies. Frontiers in human neuroscience. 7, 203(2013).
  16. Robbins, T. The 5-choice serial reaction time task: behavioural pharmacology and functional neurochemistry. Psychopharmacology. (3-4), 362-380 (2002).
  17. Asinof, S. K., Paine, T. A. The 5-Choice Serial Reaction Time Task: A Task of Attention and Impulse Control for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (90), e51574(2014).
  18. Codita, A., Gumucio, A., et al. Impaired behavior of female tg-ArcSwe APP mice in the IntelliCage: A longitudinal study. Behavioural brain research. 215 (1), 83-94 (2010).
  19. Blumstein, D. T. Habituation and sensitization: new thoughts about old ideas. Animal Behaviour. 120, 255-262 (2016).
  20. Endo, T., Maekawa, F., et al. Automated test of behavioral flexibility in mice using a behavioral sequencing task in IntelliCage. Behavioural brain research. 221 (1), 172-181 (2011).
  21. Voikar, V., Colacicco, G., Gruber, O., Vannoni, E., Lipp, H. -P., Wolfer, D. P. Conditioned response suppression in the IntelliCage: assessment of mouse strain differences and effects of hippocampal and striatal lesions on acquisition and retention of memory. Behavioural brain research. 213 (2), 304-312 (2010).
  22. Puścian, A., Łęski, S., Górkiewicz, T., Meyza, K., Lipp, H. -P., Knapska, E. A novel automated behavioral test battery assessing cognitive rigidity in two genetic mouse models of autism. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, 140(2014).
  23. Voikar, V., Colacicco, G., Gruber, O., Vannoni, E., Lipp, H. -P., Wolfer, D. P. Conditioned response suppression in the IntelliCage: assessment of mouse strain differences and effects of hippocampal and striatal lesions on acquisition and retention of memory. Behavioural brain research. 213 (2), 304-312 (2010).
  24. Harda, Z., Dzik, J. M., et al. Autophosphorylation of αCaMKII affects social interactions in mice. Genes, Brain and Behavior. , e12457(2018).
  25. Aarts, E., Maroteaux, G., et al. The light spot test: Measuring anxiety in mice in an automated home-cage environment. Behavioural Brain Research. 294, 123-130 (2015).
  26. Safi, K., Neuhäusser-Wespy, F., et al. Mouse anxiety models and an example of an experimental setup using unconditioned avoidance in an automated system -IntelliCage. Cognition Brain & Behavior. 10 (4), 475-488 (2006).
  27. Dzik, J. M., Puścian, A., Mijakowska, Z., Radwanska, K., Łęski, S. PyMICE: APython library for analysis of IntelliCage data. Behavior Research Methods. 50 (2), 804-815 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

System IntelliCagetestowanie funkcji poznawczychmodele choroby Alzheimeraocena uczenia si przestrzennegoanaliza funkcji wykonawczychgenetyczne modele mysieidentyfikacja radiowa RFIDmodel adaptacji do wk adania nosa w otworyodwr cenie preferencji miejsca
Zautomatyzowany, długoterminowy test behawioralny funkcji poznawczych w wielu modelach genetycznych choroby Alzheimera z wykorzystaniem IntelliCage
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.