Artykuł metodologiczny

Laboratoryjna chromatografia powinowactwa do immobilizowanych metali, rekonstytucja i oznaczanie metaloenzymu znakowanego polihistydyną dla laboratorium licencjackiego

DOI:

10.3791/58012

⸱

23 sierpnia 2018

 , 
1Department of Chemistry, Muhlenberg College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania metodą chromatografii z immobilizowanym metalem metodą powinowactwa do metalu, a następnie odtworzenia oznaczonej polihistydyną, niehemowej dioksygenazy wiążącej żelazo, odpowiedniej dla laboratorium nauczania na studiach licencjackich.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stacjonarna chromatografia IMAC z immobilizowanym powinowactwem do metalu (Benchtop) białek znakowanych polihistydyną jest łatwo opanowana przez studentów studiów licencjackich i stała się najczęściej stosowaną metodą oczyszczania białek we współczesnej literaturze. Jednak zastosowanie chromatografii powinowactwa do białek wiążących metale, zwłaszcza tych z metalami wrażliwymi na redoks, takimi jak żelazo, jest często ograniczone do laboratoriów z dostępem do schowka na rękawiczki - sprzętu, który nie jest rutynowo dostępny w laboratorium licencjackim. W tym artykule demonstrujemy nasze laboratoryjne metody izolacji, oczyszczania IMAC i rekonstytucji metalowo-jonowej dioksygenazy ekstratelelowej znakowanej polihistydyną, aktywnej redoks, niehemowej wiążącej żelazo dioksygenazy oraz oznaczanie dioksygenazy z różnymi stężeniami substratów i nasycaniem tlenu. Metody te są wykonywane przez studentów studiów licencjackich i wdrażane w laboratorium dydaktycznym i badawczym z oprzyrządowaniem, które jest dostępne i niedrogie głównie w instytucjach licencjackich.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwsze doniesienia o oczyszczaniu białka oznaczonego polihistydyną z ekstraktów organizmu gospodarza za pomocą chelatacji znacznika histydyny przez unieruchomiony metal weszły do literatury w 1988 roku1,2. Od tego czasu dodawanie znaczników polihistydyny do rekombinowanych białek i ich oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa do immobilizowanych metali (IMAC) stało się praktycznie wszechobecne w literaturze biochemicznej3,4,5. Metody oczyszczania IMAC mogą być wdrażane na stole laboratoryjnym, przy użyciu automatycznej chromatografii i w formatach kolumn wirowych. Podczas gdy metody oczyszczania powinowactwa, zwłaszcza IMAC, są szeroko stosowane w laboratorium badawczym, są mniej powszechne w laboratorium nauczania licencjackiego. Najczęściej używane podręczniki laboratoryjne dla laboratoriów biochemicznych nie uczą rutynowo tych metod, zamiast tego wybierają bardziej tradycyjną chromatografię jonowymienną lub chromatografię wiążącą barwnik6,7,8,9. Na przykład oczyszczanie dehydrogenazy mleczanowej przez Anderson10 wykorzystuje powinowactwo przez wiązanie barwnika, a oczyszczanie mleka krowiego α-laktoalbuminę7,11 autorstwa Boyera wykorzystuje matrycę kwasu niklowo-nitrylooctowego, ale bez rekombinowanego znacznika polihistydyny, opierając się zamiast tego na wewnętrznym powinowactwie białka do żywicy. Niektóre nowoczesne podręczniki i publikacje laboratoryjne dla studentów studiów licencjackich implementują chromatografię powinowactwa do unieruchomionych metali na celach białkowych oznaczonych polihistydyną, takich jak białka zielonej lub czerwonej fluorescencji12,13,14,15, przeciwciała16, oraz wybrane enzymy17,18,19,20, nawet niektóre z nieznanych funkcji21. Prawdopodobnie oczyszczanie enzymu jest preferowane w laboratorium dydaktycznym, ponieważ cel może być badany pod kątem aktywności w kolejnych sesjach, wzbogacając doświadczenie "prawdziwej nauki" ze strony studenta; Rzeczywiście, tego typu doświadczenia laboratoryjne zostały opublikowane, a korzystne wyniki w uczeniu się uczniów zostały zgłoszone17,18,20,21. A jednak zastosowania IMAC do oczyszczania enzymów w laboratorium nauczania biochemii pozostają rzadkie, a opublikowane metody mogą nawet zakładać dostęp do oprzyrządowania chromatograficznego, które zwykle nie jest dostępne do użytku w laboratorium klasowym20. Istnieją również ograniczenia w stosowaniu IMAC do metaloprotein, zwłaszcza tych, które wiążą wrażliwe na redoks metale dwuwartościowe, które są niezbędne do aktywności22. Często jon metalu jest tracony lub utleniany podczas oczyszczania, co daje nieaktywny enzym, który nie nadaje się do laboratorium licencjackiego.

Pełna jedna trzecia enzymów wiąże jon metalu23, i pomimo niemal powszechnego zapotrzebowania na żelazo we wszystkich formach życia23, żelazo jest prawdopodobnie jednym z najbardziej problematycznych jonów metali w enzymologii. Enzymy wiążąceFe2+ niehemowe są szczególnie podatne na utratę i/lub utlenianie metalu podczas IMAC; prawdopodobnie z powodu braku dedykowanego liganda organicznego, takiego jak hem, i łatwości, z jaką Fe2+ może dysocjować od ligandów aminokwasowych24. Ponadto zależne od tlenu utlenianie Fe2+ do Fe3 + jest spontaniczne w roztworze wodnym, ze względu na ujemną zmianę energii swobodnej i względną stabilność Fe3+. Często wyzwania te są pokonywane przy użyciu atmosfery beztlenowej i/lub metod chromatograficznych innych niż IMAC22. W tym artykule zademonstrujemy zastosowanie stacjonarnego IMAC do oczyszczania dioksygenazy metaloenzymu L-DOPA zależnej od Fe2 + przy użyciu prostych, niedrogich materiałów chromatograficznych, a następnie odtworzenia miejsca aktywnego Fe2 + i testu enzymatycznego. Metody te są standardem w naszym własnym laboratorium biochemii na studiach licencjackich liczącym od 6 do 12 grup studenckich i mogą być wykorzystywane do poszerzania repertuaru badań enzymatycznych na poziomie licencjackim.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie do Oczyszczenia

  1. Przygotowanie bezkomórkowego ekstraktu surowego
    1. Uzyskaj ~ 9-10 g granulki komórkowej E. coli (BL21), która wykazała nadekspresję metaloproteiny znakowanej polihistydyną25 w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    2. Dodaj 5 ml na gram buforu do lizy/wiązania w temperaturze pokojowej (50 mM fosforanu, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolu o pH 8) do ~9-10 g osadu komórkowego, aby uzyskać całkowitą objętość ~ 45-50 ml. Okresowo wiruj, aby zachęcić do rozpuszczenia. Jeśli granulka została zamrożona, rozmrozić w letniej łaźni wodnej.
    3. Używając kąpieli lodowatej wody, schłodzić zawiesinę komórek do ~3 °C w celu przygotowania do lizy komórek.
      Uwaga: W tym momencie możliwa jest liza komórek za pomocą sonikacji, mielenia perełkowego lub innej metody. Frezowanie ściegów jest tutaj pokazane, ponieważ jest szybkie, stosunkowo niedrogie i nie wymaga ochrony słuchu.
    4. Zamontuj komorę do mielenia kulek o pojemności 50 ml zgodnie z instrukcjami producenta.
    5. Napełnij komorę młynka do perełek do połowy schłodzonymi kulkami szklanymi o średnicy 0,1 mm, które były przechowywane w temperaturze -20 °C.
    6. Napełnij pozostałą część komory zawiesiną schłodzonych komórek i użyj buforu do lizy/wiązania w temperaturze 4 °C, aby całkowicie napełnić komorę.
    7. Użyj małej szpatułki, aby obrócić wałek młynka do perełek i wymieszaj zawiesinę komórek z kulkami.
    8. Usuń wszelkie duże bąbelki za pomocą pipety, a następnie zakręć pokrywkę.
    9. Osuszyć komorę z wszelkich wycieków.
    10. Dodaj około 1 szklanki lodu do przezroczystej, plastikowej osłony, odwróć napełnioną komorę o pojemności 50 ml do wypełnionej lodem kurtki i zakręć.
    11. Przymocuj komorę z płaszczem lodowym do silnika.
    12. Włącz silnik młynka perełkowego na 15 sekund przy 15 800 obr./min, a następnie pozostaw na 45 sekund. Powtórz 8 razy.
    13. Po zakończeniu 8 cykli zdekantować całą zawiesinę do lizy komórek do probówki o pojemności 50 ml lub większej przystosowanej do wirowania z dużą prędkością (25 000 x g lub więcej). Umieść parę zrównoważonych probówek w wirówce i wiruj w temperaturze 25 000 x g przez 40-45 minut w temperaturze 4°C, aby osadzać resztki komórek i szklane kulki.
      Uwaga: Jeśli probówki o pojemności 50 ml lub większe przeznaczone do wirowania z dużą prędkością nie są dostępne, usuń szklane kulki, odwirowując przy 1000 - 2000 x g przez 2-3 minuty w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, aby uzyskać mniejszą objętość zawiesiny komórek (~ 25 ml), którą można zdekantować do probówki o mniejszej objętości przystosowanej do wirowania z dużą prędkością.
    14. Po zakończeniu wirowania zdekantować klarowne, żółte, bezkomórkowe, surowe ekstrakty do czystej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Uważaj, aby nie przenosić żadnych resztek komórek.
    15. Pobrać małą próbkę bezkomórkowych ekstraktów surowych do późniejszej analizy oczyszczania za pomocą SDS-PAGE26.
  2. Przygotowanie kolumny IMAC
    1. Zaopatrz się w kolumnę o wymiarach 1,5 x 20 cm wyposażoną w dolny wspornik łoża zatrzymujący cząstki żywicy, wylot Luer lock i górną nasadkę, która zawiera również złączkę Luer lock. Zamontuj wylot Luer-lock w zawór odcinający, aby kontrolować przepływ.
    2. Pracując przy blacie, bezpiecznie zamontuj kolumnę na stojaku pierścieniowym.
    3. Otrzymać 50% zawiesinę żywicy kwasu nitrylooctowego na bazie niklu (Ni-NTA) w 20% etanolu, który był przechowywany w temperaturze 4 °C.
    4. Delikatnie zakręć butelką, aby równomiernie zawiesić żywicę.
    5. Pracując w temperaturze pokojowej i na blacie stołu, użyj pipety z podziałką, aby pobrać 2 ml zawiesiny, co da 1 ml osiadłej żywicy zdolnej do związania 50-60 mg białka znakowanego polihistydyną i przenieś zawiesinę do kolumny.
    6. Otwórz zawór odcinający i pozwól, aby nadmiar roztworu do przechowywania spłynął grawitacyjnie z żywicy.
    7. Dokładnie zamknij zawór odcinający
    8. Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie dodać schłodzony bufor do lizy/wiązania (50 mM fosforanu, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolu o pH 8) i do kolumny z żywicą – co najmniej 30 ml. Uważaj, aby nie naruszyć powierzchni żywicy. Poprowadź bufor w dół ścianek kolumny, aby zapobiec rozpryskiwaniu.
    9. Zrównoważyć żywicę, pozwalając buforowi do lizy/wiązania powoli spływać grawitacyjnie z kolumny do zlewki zbiorczej.
    10. Gdy bufor do lizy/wiązania zostanie w większości opróżniony, zamknij kurek, aby zatrzymać przepływ buforu, gdy ~ 5 ml buforu do lizy pozostanie nad żywicą i pozostaw kolumnę, zamontowaną pionowo, do momentu gotowości do kontynuowania lub na okres do 1 tygodnia.

2. Oczyszczanie celu oznaczonego polihistydyną przez IMAC

  1. Przygotować bufor do przemywania (50 mM fosforanu, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolu pH 8) i bufor elucyjny (50 mM fosforan, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolu, 10% glicerolu pH 8). Schłodzić w temperaturze 4°C.
  2. Przygotować kolumnę Ni-NTA do dodania bezkomórkowych ekstraktów surowych, otwierając zawór odcinający i pozwalając, aby pozostały bufor do lizy/wiązania spływał grawitacyjnie przez żywicę Ni-NTA. Gdy cały bufor zostanie opróżniony, a powierzchnia żywicy zostanie odsłonięta, zamknij kurek.
  3. Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie odpipetuj surowe ekstrakty wolne od komórek na żywicę, uważając, aby nie naruszyć powierzchni. Sprowadź surowe ekstrakty po ściankach kolumny, aby zapobiec rozpryskiwaniu. Objętość zastosowanych ekstraktów surowych zależy od poziomu ekspresji białka znakowanego polihistydyną; upewnić się, że całkowita objętość ekstraktów surowych zawiera 50-60 mg lub mniej białka docelowego na ml żywicy Ni-NTA (patrz krok 1.2.4).
  4. Gdy wszystkie ekstrakty surowe zostaną przeniesione do kolumny, otwórz kurek, aby kolumna mogła spłynąć grawitacyjnie. Przepływ ten składa się z białek, które nie związały się z żywicą – należy zebrać 100 μl do późniejszej analizy oczyszczania za pomocą SDS-PAGE. 26
  5. Lepkość bezkomórkowych ekstraktów surowych może znacznie spowolnić przepływ grawitacyjny kolumny. Aby zwiększyć natężenie przepływu, zastosuj prostą "pompę ręczną":
    1. Wziąć strzykawkę Luer-lock o pojemności 10 ml i podłączyć ją do nasadki kolumny za pomocą krótkiego odcinka plastikowej rurki i łączników Luer-lock między nasadką kolumny a strzykawką. Wyciągnąć tłok strzykawki, a następnie mocno założyć nasadkę kolumny na jej górną część.
    2. Delikatnie ścisnąć tłok strzykawki, jednocześnie ręcznie oceniając natężenie przepływu, zbierając eluent do cylindra z podziałką; dawki 1-2 ml na minutę są zgodne z żywicą i tym ustawieniem. Delikatnie zwiększać nacisk tłoka strzykawki w miarę zmniejszania się szybkości przepływu.
    3. Aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do żywicy, zdejmij nasadkę kolumny i dołączoną pompę ręczną, gdy menisk nałożonej cieczy osiągnie 5-10 mm powyżej złoża żywicy i pozwól, aby pozostała objętość spłynęła grawitacyjnie.
  6. Gdy bezkomórkowe ekstrakty surowe zakończą odsączanie, a powierzchnia żywicy zostanie ponownie odsłonięta, użyj pipety Pasteura, aby ostrożnie dodać ~30 ml schłodzonego buforu do płukania do kolumny – uważając, aby nie naruszyć powierzchni żywicy. Poprowadź bufor w dół ścianek kolumny, aby zapobiec rozpryskiwaniu.
  7. Otwórz zawór odcinający i pozwól, aby bufor płuczący spłynął przez kolumnę. Proces ten polega na usuwaniu słabo związanych białek z żywicy. Wyrzucić eluent.
  8. Podczas opróżniania buforu płuczącego przygotuj szesnaście oznakowanych probówek do mikrowirówek do zbierania frakcji o pojemności 1 ml.
  9. Gdy bufor płuczący zostanie opróżniony, a powierzchnia żywicy zostanie ponownie odsłonięta, zamknij kurek. Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie dodaj ~30 ml schłodzonego buforu elucyjnego do kolumny – uważając, aby nie naruszyć powierzchni żywicy. Poprowadź bufor w dół ścianek kolumny, aby zapobiec rozpryskiwaniu.
  10. Powoli otworzyć kran i pozwolić, aby bufor elucyjny wymył białko znakowane polihistydyną z kolumny. Zebrać 1 ml eluentu w każdej z zaznaczonych probówek do mikrowirówek, od 1 do 16.
  11. Przetestuj frakcje pod kątem białka za pomocą kolorymetrycznego testu białkowego, takiego jak test Bradforda lub spektroskopia UV-widzialna, zgodnie z metodami określonymi przez producentów odczynnika i/lub instrumentu27,28. Jak pokazano tutaj, test kolorymetryczny przy użyciu błękitu Coomassie jest skalowany w dół do objętości 100 μl, aby poświęcić tylko niewielką objętość z każdej frakcji.
  12. Zmieszać 3 μl każdej frakcji ze 100 μl odczynnika do kolorymetrycznego oznaczania białek i ręcznie obserwować tworzenie się dowolnego koloru, aby wskazać obecność białka we frakcji; wykrywanie za pomocą spektrometru nie jest konieczne.
  13. Jeśli białko zostanie znalezione we frakcji 16, kontynuuj elucję frakcji 1 ml i okresowo oznaczaj białko, aż eluowane frakcje nie będą już zawierać znacznej ilości białka.
  14. Połącz frakcje zawierające białko w czystej stożkowej probówce i pobierz próbkę o objętości 100 μl do późniejszej analizy za pomocą SDS-PAGE26.
  15. Przystąpić do rekonstytucji kofaktora jonów metalu lub zamrozić białko w 3 ml podwielokrotności w temperaturze -80°C. Upewnij się, że 10% glicerol jest zawarty w buforze elucyjnym, który jest krioprotektantem stabilizującym czyste białko podczas zamrażania.
  16. Po zakończeniu elucji kolumny Ni-NTA, to znaczy całe białko zostaje usunięte z kolumny i zebrane we frakcje, przepuść kolejne 25 ml buforu elucyjnego przez kolumnę i przechowuj kolumnę w temperaturze 4 °C w ~ 5 ml buforu elucyjnego do krótkotrwałego przechowywania lub buforu do lizy/wiązania z 20% etanolem do dłuższego przechowywania.

3. Rekonstytucja docelowego białka za pomocąFe2+

  1. Dodatek Fe2 +
    Uwaga: Enzym wiążący żelazo (II) niehemowy, taki jak dioksygenaza L-DOPA w tym przykładzie, wymaga do działania jonuFe2+; jednak żelazo (II) łatwo utlenia się do żelaza (III), które jest nieaktywne, a część białka oczyszcza się bez żadnego żelaza.
    1. Aby rozpocząć rozpuszczanie metalu, należy otrzymać 3 ml oczyszczonego enzymu zawieszonego w buforze elucyjnym. W przypadku zamrożenia szybko rozmrozić w letniej kąpieli wodnej, a po rozmrożeniu umieścić białko na lodzie.
    2. Korzystając z objętości białka w probówce, obliczyć ilość askorbinianu sodu (198,1 g/mol) niezbędną do uzyskania końcowego stężenia 12,5 mM w próbce. Należy również obliczyć ilość ditiotreitolu (DTT, 154,25 g/mol) niezbędną do uzyskania końcowego stężenia 12,5 mM w próbce.
    3. Dodaj stały askorbinian sodu i DTT i delikatnie, ale dokładnie wymieszaj, aż do całkowitego rozpuszczenia. Uważaj, aby nie spowodować wytrącania się białka przy zbyt agresywnym mieszaniu. Dodać niewielką ilość siedmiowodnego siarczanu żelaza (II) (MW 278,01 g/mol) do próbki białka.
    4. W celu uzyskania wystarczająco małej ilości soli żelaza, należy wystukać kilka 1 mm granulek FeSO4•7H2O w postaci stałej na kawałku papieru wagowego, złożyć papier na granulce i rozgnieść go płaską stroną metalowej szpatułki.
    5. Dodaj ziarno powstałego proszku do probówki z białkiem.
    6. Wir do wymieszania, a w tubie pojawi się różowo-różowy kolor.
    7. Inkubować różowy roztwór białka, pod nakrętką, przez 10-30 minut na lodzie. Różowy kolor z czasem powoli blaknie.
  2. Filtracja żelowa
    1. Użyj żelowej kolumny filtracyjnej wypełnionej 10 ml sferycznego żelu poliakrylamidowego o limicie wyłączenia masy cząsteczkowej około 6 000 i uwodnionym zakresie wielkości cząstek 90–180 μm w kolumnie o wymiarach 1,5 x 12 cm, która jest również wyposażona w zbiornik o pojemności 10 ml. Upewnij się, że kolumna jest wyposażona w dolne i górne wsporniki łoża w postaci porowatych krążków polietylenowych o średnicy 30 μm, aby zatrzymać żywicę w kolumnie i zapobiec wysychaniu złoża żywicy. Zamontuj kolumnę filtracyjną żelu na stojaku pierścieniowym.
    2. Jeśli używasz wstępnie zapakowanej żelowej kolumny filtracyjnej, zdejmij nakrętkę i odlej nadmiar buforu powyżej górnego wspornika łoża.
    3. Aby zrównoważyć kolumnę, należy rozpocząć od napełnienia zbiornika buforem zgodnym z późniejszym oznaczaniem i przechowywaniem, na przykład 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10% glicerolu o pH 8,0.
    4. Jeśli używasz wstępnie zapakowanej żelowej kolumny filtracyjnej, oderwij dolną końcówkę żelowej kolumny filtracyjnej, aby rozpocząć przepływ bufora i odsłonić złączkę Luer slip. Zamontuj kran na końcu Luer slip kolumny, ale pozostaw go otwartym i pozwól, aby kolumna kapała grawitacyjnie.
    5. Gdy bufor spuści się z kolumny, a górna podpora łoża zostanie odsłonięta, zamknij zawór odcinający i dodaj ~ 3 ml metaloenzymu odtworzonego w Fe (II) do kolumny, pipetując roztwór na odsłonięty górny wspornik łoża.
    6. Otworzyć zawór odcinający i pozwolić, aby cała próbka o objętości 3,0 ml dostała się grawitacyjnie do kolumny. Wyrzuć te pierwsze 3 ml eluentu. Każdy różowy kolor, który utworzy się podczas obchodzenia się z roztworem, zostanie uwięziony w górnej części kolumny.
    7. Gdy kolumna przestanie kapać, a górny wspornik złoża zostanie odsłonięty, dodać 4 ml żelowego buforu filtracyjnego (np. 50 mM NaH2PO4, 200 mM NaCl, 10% glicerolu o pH 8,0) do kolumny. Otwórz zawór odcinający i zbierz eluent do probówek mikrowirówek o objętości ponad 8,5 ml frakcji.
    8. Przetestuj frakcje pod kątem białka za pomocą kolorymetrycznego testu białkowego lub UV-Vis27,28, jak opisano wcześniej.
    9. Połącz frakcje zawierające białko.
    10. Pobrać próbkę do analizy SDS-PAGE26.
    11. Przystąpić do oznaczania lub przechowywania próbki.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Te reprezentatywne wyniki zostały zebrane przez studentów studiów licencjackich, którzy wykonywali ten protokół podczas dwóch okresów laboratoryjnych BCM 341: Biochemia eksperymentalna w Mühlenberg College. Rysunek 1 przedstawia wyniki oczyszczania 20 kDa metaloenzymu oznaczonego polihistydyną, dioksygenazy L-DOPA, przeprowadzonego przez dwóch studentów studiów licencjackich podczas 4-godzinnego okresu laboratoryjnego w klasie i analizowanego przez SDS-PAGE przez tych samych studentów podczas kolejnego okresu laboratoryjnego. Białko znakowane polihistydyną jest skutecznie oczyszczane (Rysunek 1, linia 2). Immunoblot żelu przy użyciu przeciwciała przeciwko znacznikowi polihistydyny wskazuje, że niewielka ilość białka docelowego znakowanego polihistydyną jest tracona w przepływie (dane nie pokazane), prawdopodobnie dlatego, że większa niż 100 mg ilość białka docelowego w lizacie przekroczyła zdolność wiązania żywicy.

Rysunek 2 przedstawia zebrane przez studentów dane dotyczące aktywności reakcji enzymatycznej celu metaloenzymu znakowanego polihistydyną, dioksygenazy L-DOPA, po rozpuszczeniu w żelazie (II) i późniejszej filtracji żelowej, zgodnie z opisem w niniejszym protokole. Pięciosekundowy czas martwy przed rozpoczęciem zbierania danych jest typowy dla studentów wykonujących tę technikę po raz pierwszy. Silna aktywność metaloenzymu została wykryta za pomocą opublikowanego testu i uzyskała parametry kinetyczne w stanie ustalonym zgodne z opublikowanymi wynikami29. Parametry kinetyczne w stanie ustalonym zostały określone poprzez dopasowanie krzywych postępu30 pokazanych w Rysunek 2; Jednak nieliniowe dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów do początkowych dawek zebranych dla serii stężeń substratu jest równie możliwe31.

figure-results-1
Rysunek 1. SDS-PAGE26 analiza białka znakowanego polihistydyną przed, w trakcie i po oczyszczeniu. Pasy 1 - Markery masy cząsteczkowej, 2-oczyszczone białko (20 kDa) po Ni-NTA, 3-Ni-NTA przepływ, 4 - bezkomórkowe ekstrakty surowe przed oczyszczaniem, 5 - granulki resztek komórkowych po lizie. Próbki przygotowano przy użyciu 5x bufora próbkowego/ładującego i rozdzielono na prefabrykowanych 4-20% żelach poliakrylamidowych za pomocą systemu elektroforezy żelowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Test w stanie stacjonarnym metaloenzymu odtworzonego żelaza (II) (tj. dioksygenazy L-DOPA, 10 μM) z substratem (L-DOPA - 5 μM (czerwony), 25 μM (zielony), 50 μM (niebieski)) w buforze (50 mM fosforan, 200 mM NaCl, pH 8). Ślady obrazują formowanie się produktu przy długości fali 414 nm. Dane dotyczące absorbancji były stale zbierane przy użyciu kuwet metakrylanowych o pojemności 1 ml w spektrometrze UV-Visible ze skanowaniem z podzieloną wiązką29. Surowe dane są dopasowane do modelu aproksymacji stanu ustalonego Michaelisa-Mentena (KM 30,8 μM ± 14,4, kcat pozorny 2,3 s-1 ± 0,05)30. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas gdy dodawanie znaczników polihistydynowych do białek rekombinowanych i ich oczyszczanie za pomocą IMAC stało się praktycznie wszechobecne w literaturze biochemicznej 3,4,5, zastosowania IMAC do oczyszczania enzymów w laboratorium dydaktycznym biochemii pozostają rzadkie, a opublikowane metody nie zawsze uwzględniają ograniczenia zasobów laboratorium dydaktycznego20. Co więcej, zastosowanie IMAC w laboratorium dydaktycznym jest najbardziej efektywne w połączeniu z eksperymentami, które oceniają aktywność i czystość, co sprawia, że oczyszczanie enzymu przez IMAC jest idealną czynnością instruktażową. Aby rozszerzyć zastosowanie IMAC na oczyszczanie enzymów, w tym metaloenzymów, w laboratorium dydaktycznym, potrzebne są niezawodne i niedrogie metody. W tym protokole demonstrujemy stacjonarny IMAC przy użyciu łatwo dostępnych i niedrogich materiałów laboratoryjnych, jednocześnie odnosząc się do ograniczeń w stosowaniu IMAC do metaloprotein22, poprzez odtworzenie metaloenzymu zależnego od żelaza(II), dioksygenazy L-DOPA, po oczyszczeniu. Korzystając z opisanych odczynników i materiałów, szacujemy, że koszt materiałów eksploatacyjnych dla ośmiu grup studenckich wynosi od 500 do 600 USD za semestr w celu uruchomienia tego protokołu, w tym kroków analizy przedstawionych na rysunku 1 i rysunku 2.

Ze względu na łatwość, z jaką Fe2+ może dysocjować od ligandów aminokwasowych24 i łatwe utlenianie Fe2+ przez O2 do Fe3+, rekonstytucja niehemowego, chelatowanego aminokwasami żelaza(II) do rekombinowanego metaloenzymu jest typowym składnikiem oczyszczania enzymatycznego. Gdy stosuje się chromatografię klasyczną, w niektórych przypadkach można uniknąć całkowitej utraty żelaza32, ale częściej żelazo (II) jest dodawane z powrotem w obecności czynników redukujących 33,34,35,36 często w atomosferze beztlenowej 37,38,39, a w niektórych przypadkach nadmiar żelaza nie jest usuwany 33, 34,36, co komplikuje wszelkie późniejsze testy. Następujące po sobie etapy klasycznej chromatografii i atmosfery beztlenowej nie są realistyczne dla laboratorium licencjackiego, co skłoniło do opracowania tego protokołu.

Podczas gdy ręczne przygotowanie kolumny Ni-NTA i przetwarzanie próbek w dużej mierze grawitacyjnie wymaga dodatkowego czasu i wysiłku w porównaniu z wstępnie zapakowanymi kolumnami i automatycznym oprzyrządowaniem chromatograficznym, kroki ręczne pozwalają na praktyczną naukę przez ucznia, która skutkuje lepszym zrozumieniem nauki stojącej za tym procesem. Dodanie soli żelaza (II) w warunkach opisanych tutaj jest szczególnie wrażliwe na nadmiar ditiotreitolu. Jeśli uczeń omyłkowo doda nadmiar ditiotreitolu, prawdopodobne jest wystąpienie opadów. Stwierdziliśmy, że pomocne jest wymaganie od studentów wykonania obliczeń ilości odczynników przed przybyciem do laboratorium, aby czas laboratoryjny mógł być jak najefektywniej wykorzystany na stanowisku laboratoryjnym. Całe oczyszczanie IMAC na stole - od lizy komórek do elucji białek - można przeprowadzić w jednym 4-godzinnym okresie laboratoryjnym, a następnie w kolejnym okresie laboratoryjnym rekonstytucji i testie.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta publikacja jest oparta na pracy wspieranej przez National Science Foundation w ramach grantu nr CHE 1708237.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
materiały eksploatacyjne
BeadBeater Koraliki szklane 0,1 mmProdukty BioSpec110791011 funt każda
50 ml Probówki stożkowe z nakrętkami, sterylneVWR21008-178
Chlorek soduFisher BioreagentsBP358-1
Fosforan potasu, jednozasadowyAcros (Fisher)AC42420-5000
Askorbinian soduAcros (Fisher)AC35268-1000 
DTT (Dithiothreitol)Lab ScientificD-115
Siarczan żelaza(II) siedmiowodnySigmaaldrich310077
żywicy HisPur NiNTA Fisher (pierce)PI88221
Kolumny do chromatografii ekonomiczno-kolumnowej - 1,5 x 20cmBio-Rad737-1522 1,5 x 20 cm, 35 ml, 2 szt.
Zawór odcinający, jednokierunkowy, żeński na męski luerKimble420163-0000opakowanie 50
strzykawek BD 10 ml luer-loc (niesterylne, bez igły)VWR301029
Złączka do rurki: 1,6 mm Barb do żeńskiej LuerBiorad7318222
Złączka do rurki: 1,6 mm Barb do męskiego Luer Rurka silikonowa Biorad7318225
(ścianka 1,6 mm ID/0,8 mm, do 0,2-5 ml/min na pompie perystaltycznej)Bio-Rad7318211Opakowanie 1,1,6 mm ID/0,8 mm ścianka, 10 m, niskociśnieniowe rurki do pracy z cieczami
GlycerolFisher (Pierce)17904
Coomassie Plus (Bradford) Test białkaThermo Scientitic23236
Probówki do mikrowirówek, zatrzask, 1,5 mlVWR89000-028
Polistyrenowe jednorazowe pipety serologiczne FisherbrandFisher13-676-10F
Uniwersalna pompa do pipet FiserbrandFisher 14-955-110
Pipety transferowe FisherbrandFisher 13-711-9AM
Kolumny odsalające Econo-Pac 10DGBio-Rad732-2010pudełko 30
ExpressPlus PAGE 5x bufor do próbekGenscriptMB010155mL (Rozcieńczyć 1:5 z próbką)
ExpressPlus PAGE Gel, 4-20%, 12 dołkówGenscriptM4201220 żeli
Kuwety jednorazowe Fisherbrand, MetylakrylanFisher14-955-128 Przypadek 500
Nasadki kuwetowe Kwadratowe jednorazoweFisher14-385-999
L-DOPA (3,4-dihydroksyfenyloalanina)AcrosD9628-5G
Stałe wyposażenie: 
Komora BeadBeater 50mL BioSpec Products110803-50SS1-komorowy
BeadBeaterBioSpec Products1107900-101350 ml komora z poliwęglanu, zespół wirnika, podstawa silnika, płaszcz chłodzący lodowato i woda lodowata i jeden funt szklanych kulek.
Probówki wirówkowe, szybkoobrotowe PPCO, 50mLFisher3119-0050PK
Pionowe ogniwo do elektroforezy Mini-PROTEAN Tetra do mini żeli prefabrykowanych, 4-żeloweBio-Rad1658004  4-żelowy system elektroforezy pionowej, zawiera zespół elektrod, towarzyszący moduł jezdny, zbiornik, pokrywę z zasilającymi, mini zaporę buforową ogniw
PowerPac HC ZasilaczBio-Rad1645052100– 120/220– 240 V, zasilacz do zastosowań wysokoprądowych, zawiera przewód zasilający
UV-1800 z oprogramowaniem UV-ProbeShimadzuUV-1800
Kintek Global Kinetic ExplorerKintekCorp wersja 6https://www.kintekexplorer.com/downloads/

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nature Biotechnology. 6 (11), 1321(1988).
  2. Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).
  3. Block, H., et al. Chapter 27 Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review. Methods in Enzymology. , 439-473 (2009).
  4. Derewenda, Z. S. The use of recombinant methods and molecular engineering in protein crystallization. Methods. 34 (3), 354-363 (2004).
  5. Gräslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  6. Switzer, R. L., Garrity, L. F. Experimental Biochemistry. , Macmillan. (1999).
  7. Boyer, R. Modern Experimental Biochemistry, 3rd Edition. , (2001).
  8. le Maire, M., Chabaud, R., Hervé, G. Laboratory Guide to Biochemistry, Enzymology, and Protein Physical Chemistry: A Study of Aspartate Transcarbamylase. , Springer Science & Business Media. (2012).
  9. Bettelheim, F. A., Landesburg, J. M. Laboratory Experiments for General, Organic, and Biochemistry. , Thomson Brooks/Cole. (2013).
  10. Anderson, A. J. Affinity chromatography of lactate dehydrogenase: An experiment for the undergraduate biochemistry laboratory. Journal of Chemical Education. 65 (10), 901(1988).
  11. Boyer, R. F. Purification of milk whey α-lactalbumin by immobilized metal-ion affinity chromatography. Journal of Chemical Education. 68 (5), 430(1991).
  12. Moffet, D. A. From gene mutation to protein characterization. Biochemistry and Molecular Biology Education. 37 (2), 110-115 (2009).
  13. Sommer, C. A., Silva, F. H., Novo, M. T. M. Teaching molecular biology to undergraduate biology students: An illustration of protein expression and purification*. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (1), 7-10 (2004).
  14. Wu, Y., Zhou, Y., Song, J., Hu, X., Ding, Y., Zhang, Z. Using green and red fluorescent proteins to teach protein expression, purification, and crystallization. Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (1), 43-54 (2008).
  15. Ward, W. W., Swiatek, G. C., Gonzalez, D. G. Green fluorescent protein in biotechnology education. Methods in enzymology. 305, 672-680 (2000).
  16. Kay, B. K., Winter, J., McCafferty, J. Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual. , Elsevier. (1996).
  17. Arkus, K. A. J., Jez, J. M. An integrated protein chemistry laboratory. Biochemistry and Molecular Biology Education. 36 (2), 125-128 (2008).
  18. Crowley, T. E. Expression, purification, and characterization of a recombinant flavin reductase from the luminescent marine bacterium Photobacterium leiognathi. Biochemistry and Molecular Biology Education. 38 (3), 151-160 (2010).
  19. Colabroy, K. L. A writing-intensive, methods-based laboratory course for undergraduates. Biochemistry and Molecular Biology Education: A Bimonthly Publication of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology. 39 (3), 196-203 (2011).
  20. Kreiling, J. L., Brader, K., Kolar, C., Borgstahl, G. E. A real-time and hands-on research course in protein purification and characterization: Purification and crystal growth of human inosine triphosphate pyrophosphatase. Biochemistry and Molecular Biology Education. 39 (1), 28-37 (2011).
  21. Gray, C., et al. Known structure, unknown function: An inquiry-based undergraduate biochemistry laboratory course. Biochemistry and Molecular Biology Education. 43 (4), 245-262 (2015).
  22. Kocabas, E., Hernick, M. Metalloenzymes: Use of Recombinant Protein Expression and Affinity Tags to Aid Identification of Native Metal Ion Cofactors. Biochemistry & Analytical Biochemistry. 2 (2), 1-3 (2013).
  23. Ellis, W. R. Metalloenzymes. Reviews in Cell Biology and Molecular Medicine. , (2006).
  24. Williams, R. J. P., Begley, T. P. Metallo-Enzymes and Metallo-Proteins, Chemistry of. Wiley Encyclopedia of Chemical Biology. , (2007).
  25. Mierendorf, R. C., Morris, B. B., Hammer, B., Novy, R. E. Expression and Purification of Recombinant Proteins Using the pET System. Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. , 257-292 (1998).
  26. He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
  27. He, F. Bradford Protein Assay. BIO-PROTOCOL. 1 (6), (2011).
  28. Johnson, M. Protein Quantitation. Materials and Methods. , (2017).
  29. Colabroy, K. L., Hackett, W. T., Markham, A. J., Rosenberg, J., Cohen, D. E., Jacobson, A. Biochemical characterization of L-DOPA 2,3-dioxygenase, a single-domain type I extradiol dioxygenase from lincomycin biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 479 (2), 131-138 (2008).
  30. Johnson, K. A. Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer. Methods in Enzymology. , 601-626 (2009).
  31. Kemmer, G., Keller, S. Nonlinear least-squares data fitting in Excel spreadsheets. Nature Protocols. 5 (2), 267-281 (2010).
  32. Wang, Y. Z., Lipscomb, J. D. Cloning, overexpression, and mutagenesis of the gene for homoprotocatechuate 2,3-dioxygenase from Brevibacterium fuscum. Protein Expr Purif. 10 (1), 1-9 (1997).
  33. Amaya, A. A., Brzezinski, K. T., Farrington, N., Moran, G. R. Kinetic analysis of human homogentisate 1,2-dioxygenase. Archives of Biochemistry and Biophysics. 421 (1), 135-142 (2004).
  34. Johnson-Winters, K., Purpero, V. M., Kavana, M., Nelson, T., Moran, G. R. 4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase from Streptomyces avermitilis: The Basis for Ordered Substrate Addition. Biochemistry. 42 (7), 2072-2080 (2003).
  35. Bugg, T. D. H. Overproduction, purification and properties of 2,3-dihydroxyphenylpropionate 1,2-dioxygenase from Escherichiacoli. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Protein Structure and Molecular Enzymology. 1202 (2), 258-264 (1993).
  36. Mendel, S., Arndt, A., Bugg, T. D. H. Acid-Base Catalysis in the Extradiol Catechol Dioxygenase Reaction Mechanism Site-Directed Mutagenesis of His-115 and His-179 in Escherichia coli 2,3-Dihydroxyphenylpropionate 1,2-Dioxygenase (MhpB). Biochemistry. 43 (42), 13390-13396 (2004).
  37. Viggiani, A., Siani, L., Notomista, E., Birolo, L., Pucci, P., Di Donato, A. The Role of the Conserved Residues His-246, His-199, and Tyr-255 in the Catalysis of Catechol 2,3-Dioxygenase from Pseudomonas stutzeri OX1. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48630-48639 (2004).
  38. Uragami, Y., et al. Crystal structures of substrate free and complex forms of reactivated BphC, an extradiol type ring-cleavage dioxygenase. Journal of Inorganic Biochemistry. 83 (4), 269-279 (2001).
  39. Veldhuizen, E. J. A., et al. Steady-state kinetics and inhibition of anaerobically purified human homogentisate 1,2-dioxygenase. Biochemical Journal. 386 (Pt 2), 305-314 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

bia ko z tagiem polihistydynowymrekonstytucja jonami metaliwi zanie elaza niehemowegopomiar aktywno ci enzymatycznejchromatografia filtracyjna w eluanaliza SDS PAGEoczyszczanie bia ek w warunkach laboratoryjnychmetody laboratoryjne dla student wenzym aktywny redoksowo

Powiązane artykuły