Artykuł metodologiczny

Zapalenie jelita grubego (Caenorhabditis) Sito: niezaawansowany technologicznie instrument i metodologia sortowania małych organizmów wielokomórkowych

DOI:

10.3791/58014

⸱

4 lipca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Wildlife, University of Alaska Fairbanks, 2Institute of Arctic Biology, University of Alaska Fairbanks, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of Alaska Fairbanks, 4Departments of Biology and Chemistry, Earlham College, 5Department of Biological Sciences, College of Natural Science and Mathematics, California State University Long Beach

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół zawiera metodologię sortowania i czyszczenia populacji Caenorhabditis elegans w zależności od wieku.Wykorzystuje proste, niedrogie i wydajne narzędzie wykonane na zamówienie w celu uzyskania dużej eksperymentalnej populacji nicieni do badań.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans (C. elegans) to dobrze znany organizm modelowy wykorzystywany w wielu badaniach podstawowych i biomedycznych. W społeczności badawczej zajmującej się nicieniami istnieje zapotrzebowanie na niedrogi i skuteczny sposób na utrzymanie dużych, dopasowanych wiekowo populacji C. elegans. W tym miejscu przedstawiamy metodykę mechanicznego sortowania i czyszczenia C. elegans. Naszym celem jest zapewnienie opłacalnego, wydajnego, szybkiego i prostego procesu pozyskiwania zwierząt o jednakowych rozmiarach i etapach życia do wykorzystania w eksperymentach. To narzędzie, sito Caenorhabditis Sieve, wykorzystuje niestandardowy system pokryw, który nawkręca się na zwykłe stożkowe probówki laboratoryjne i sortuje C. elegans na podstawie wielkości ciała. Wykazaliśmy również, że sito Caenorhabditis skutecznie przenosi zwierzęta z jednej płytki hodowlanej na drugą, umożliwiając szybkie sortowanie, synchronizację i czyszczenie bez wpływu na markery zdrowia, w tym ruchliwość i reportery genów indukowane stresem. To dostępne i innowacyjne narzędzie jest szybką, wydajną i bezstresową opcją utrzymania populacji C. elegans.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nicienie, Caenorhabditis elegans, jest głównym organizmem modelowym. Oprócz prostego i kontrolowanego charakteru ich hodowli w laboratorium, cały ich genom jest sekwencjonowany1 i znany jest los rozwojowy każdej komórki2. Ze względu na te cechy C. elegans jest szeroko stosowanym organizmem modelowym do badań genetycznych. Jednak wraz z tymi korzystnymi cechami pojawiają się pewne wyzwania dla badaczy. Ze względu na szybki czas pokoleniowania, populacjom C. elegans może szybko zabraknąć pożywienia i/lub stać się populacjami mieszanymi z wieloma pokoleniami i etapami rozwojowymi obecnymi jednocześnie. W związku z tym eksperymenty przeprowadzane na stałych pożywkach wzrostowych nicieni (NGM) wymagają od naukowców fizycznego przeniesienia zwierząt na świeże talerze, zanim źródło pożywienia bakterii wyczerpie się i rozwiną się nowe larwy. Może to być uciążliwe, ponieważ wymagane jest częste przenoszenie zwierząt, aby zapobiec mieszaniu się populacji doświadczalnych z pokoleniami potomstwa. Mimo to niektóre eksperymenty wymagają zarówno dużej liczby zwierząt, jak i wydłużonych punktów czasowych (np. ekstrakcja DNA lub RNA w wieku dorosłym). Potęguje to wyzwania związane z dokładnym utrzymaniem zsynchronizowanej populacji i przenoszeniem dużej liczby zwierząt.

Obecne metody przenoszenia C. elegans hodowanych na NGM to zbieranie lub mycie zwierząt z talerza na talerz; chemiczne traktowanie zwierząt (np. za pomocą inhibitora replikacji DNA fluorodeoksyurydyny lub FUDR); lub używanie cytometrii przepływowej do sortowania zwierząt na płytkach wielodołkowych. Zbieranie polega na użyciu narzędzia ręcznego, wykonanego z cienkiego drutu platynowego lub rzęsy, do ręcznego przenoszenia pojedynczych lub wielu zwierząt3,4. Ta metoda jest dokładna, ale wymaga zarówno umiejętności, jak i czasu i stanowi ograniczenie w przypadku badań z udziałem dużej liczby zwierząt. Zbieranie może być również fizycznie szkodliwe i stresujące dla zwierząt, potencjalnie narażając osobniki na nienaturalne i niespójne ilości zakłóceń i siły. Mycie polega na przepłukaniu naczynia hodowlanego roztworem buforowym i przeniesieniu roztworu ze zwierzętami za pomocą szklanej pipety Pasteura na nową płytkę hodowlaną. Ta metoda jest szybka i skuteczna, ale nie jest dokładna, ponieważ wiele pokoleń i etapów rozwoju zwierząt jest przenoszonych masowo. Zabiegi chemiczne, takie jak FUDR, mogą być rozpuszczone w pożywce hodowlanej, aby zapobiec produkcji potomstwa poprzez blokowanie replikacji DNA, a tym samym produkcji gamet i rozwoju jaj. Chociaż metoda ta jest skuteczna, musi być stosowana po osiągnięciu dojrzałości rozwojowej, aby nie zakłócać normalnych procesów rozwojowych, a to oznacza, że nadal istnieje wymóg przeniesienia zwierząt przed jej podaniem3. Metoda ta wpływa również na wiele komórkowych szlaków sygnałowych, powodując zauważalne efekty dla zwierząt w miarę starzenia się (np. wydłużenie życia lub zmienioną proteostazę) w zależności od użytego szczepu C. elegans5,6,7,8,9,10. Metody cytometrii przepływowej automatycznie sortują i przenoszą poszczególne C. elegans z jednej płytki wielodołkowej na inną11. Chociaż metoda ta jest bardzo skuteczna i wydajna, sprzęt do cytometrii przepływowej jest zbyt drogi i niedostępny dla wielu badaczy. Alternatywą dla przenoszenia zwierząt jest użycie zmutowanych modeli, które są wrażliwe na temperaturę, takich jak fer-15 i fem-1, które stają się sterylne po dostosowaniu temperatury12. Chociaż używanie zmutowanych zwierząt jest przydatne w niektórych sytuacjach, te specyficzne szczepy rosną wolniej niż zwierzęta typu dzikiego i opierają się na zmienionym genomie, służąc jako słabi przedstawiciele starzejących się lub zdrowych robaków. Ponadto, poleganie na zmianie temperatury w celu wywołania sterylności skutkuje również brakiem statycznego środowiska, a zmiany temperatury łatwo wykazano, że wpływają na ekspresję genów13,14,15. Grupy badawcze wcześniej opublikowały techniki opisujące użycie siatki do filtrowania C. elegans według rozmiaru16. Nie udało nam się jednak znaleźć wcześniejszych testów roboczych pod kątem jakichkolwiek zmian w ogólnych wynikach zdrowotnych, które mogą być związane ze stosowaniem takich filtrów.

W związku z tym społeczność badawcza C. elegans potrzebuje niedrogiej, wydajnej, szybkiej i dokładnej metody przenoszenia dużej liczby zwierząt między płytkami hodowlanymi. Opracowaliśmy ulepszony, łatwo dostępny sprzęt (nazwany sito Caenorhabditis) oraz powiązany protokół jego produkcji i działania, który spełnia potrzeby społeczności badawczej C. elegans. W niniejszym artykule przedstawiamy projekt sita Caenorhabditis i metody jego stosowania oraz wykazujemy, że jego stosowanie nie wpływa na powszechne wskaźniki zdrowia ani na żadne markery stresu w porównaniu ze standardowym ręcznym zbieraniem i leczeniem powszechnie stosowaną, ograniczającą płodność substancją chemiczną FUDR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Budowa i zastosowanie sita Caenorhabditis

  1. Protokół budowy
    1. Zdobądź 2 pokrywki ze stożkowych probówek o pojemności 50 ml (Rysunek 1A).
    2. Usuń środkowy obszar wewnątrz wewnętrznej krawędzi pokryw (patrząc od dołu, Rysunek 1B) za pomocą palnika Bunsena i gorącej metalowej sondy lub lutownicy lub wiertła stopniowego.
      UWAGA: Używanie ciepła do cięcia plastikowej pokrywy jest lepsze niż ostrze, ponieważ istnieje mniejsze ryzyko obrażeń.
    3. Oczyść i przeszlifuj przycięte krawędzie i przykryj powierzchnię zakrzywionym pilnikiem lub obrotowym narzędziem szlifierskim (np. Dremel). Zobacz Rysunek 1C.
    4. Przytnij okrąg siatki monofilamentowej do odpowiedniej średnicy (Rysunek 1D). W tym celu narysuj pokrywkę na arkuszu nylonowej siatki z monofilamentu i przetnij tuż wewnątrz narysowanej linii.
    5. Wytnij rowki/nacięcia na górnej powierzchni pokrywek, aby zwiększyć przyczepność dwóch pokrywek, gdy klej jest nakładany na plastik (Rysunek 1E).
    6. Wyczyść pokrywki etanolem i pozostaw do wyschnięcia.
    7. Nałóż klej cyjanoakrylowy na górną powierzchnię obu pokryw, trzymając się zewnętrznej krawędzi.
      UWAGA: Odrobina kleju to długa droga.
    8. Ułóż siatkę monofilamentową, zgodnie z tabelą 1, na jednej klejonej pokrywie (Rysunek 1F). Umieść drugą pokrywkę odwróconą na wierzchu siatki; Obie pokrywki muszą mieć wierzchołki razem. Dociśnij mocno do siebie (Rysunek 1G). Upewnij się, że siatka jest napięta.
      UWAGA: Ze względów bezpieczeństwa użyj pęsety, aby umieścić siatkę na pokrywkach.
    9. Po wyschnięciu początkowej warstwy kleju nałóż pierścień kleju cyjanoakrylowego wokół zewnętrznej szczeliny między pokrywkami. Bądź hojny, ponieważ zwiększa to integralność i zapobiega łuszczeniu się lub wyciekom.
    10. Oznacz filtr rozmiarem oczek siatki monofilamentowej.
      UWAGA: Tutaj używamy dwóch rozmiarów porów siatki - 20 μm i 50 μm.
  2. Użyj protokołu
    1. Wstępnie zwilż sito.
      1. Odpipetować roztwór soli fizjologicznej, taki jak M9 [5 g NaCl, 6 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 1 l ultraczystegoH2Oi 1 mlMgSO4 (1 M)]17, przez środek sita, aż utworzy się kropla, skondensuje się i kapie ze środka dna filtra (Rysunek 2A). Opcjonalnie nałóż niestrzępiącą się chusteczkę (np. Kimwipe) na spód, aby ukształtować lub rozprowadzić kroplę wilgoci na siatce.
      2. Umieść sito na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Oznacz rurkę jako "Rura odpływowa" (Rysunek 2B).
    2. Zmyj populację C. elegans z płytki agarowej.
      1. Umyj płytkę buforem M9 i umieść pożywkę zawierającą robaki na górnej stronie siatki monofilamentowej po 1 ml na raz (Rysunek 2C). Upewnij się, że działasz na środku siatki. Umyj wszystkie robaki z talerza.
        UWAGA: Zazwyczaj wystarczają 3 ml M9 na płytkę 60 mm.
      2. Aby zminimalizować liczbę robaków traconych podczas pipetowania, użyj szklanej pipety Pasteura, aby przesunąć robaki z płytki na środek siatki (powtórz w razie potrzeby).
      3. Przepłucz filtr buforem M9 od góry. Ponownie upewnij się, że działasz na środku siatki i spłucz wszystkie robaki w tym obszarze. Umyj tyle razy, ile to konieczne, aby upewnić się, że wszystkie bakterie i mniejsze robaki przeszły przez siatkę.
    3. Zbierz z sita zwierzęta o dopasowanej wielkości.
      1. Przymocuj nową stożkową probówkę o pojemności 50 ml do górnej części sita, tak aby dorosłe robaki z kroku 1.2.2.3 były skierowane do wnętrza nowej probówki zbiorczej (Rysunek 2D).
      2. Wyjmij pierwszą rurkę (rurkę odpływową) i szybko przewróć sito i nową rurkę, aby zapobiec migracji kropli (Rysunek 2E).
        UWAGA: Jeśli sterylność nie jest wymagana, użyj niestrzępiącej się chusteczki (np. Kimwipe), aby usunąć płyn z dolnej części siatki przed odwróceniem.
      3. Opłucz siatkę za pomocą M9 do nowej probówki o pojemności 50 ml z nowej górnej strony (Rysunek 2F). Ponownie działaj w środku siatki i utrzymuj kroplę na spodniej stronie siatki.
      4. Pozwól robakom się uspokoić lub delikatnie je zawiruj (np. <16 x g) przez około 1 minutę (Rysunek 2G).
      5. Odessać roztwór buforowy z osadu robaków, najlepiej do >0,5 ml, lub usunąć jak najwięcej płynu, nie naruszając osadu.
      6. Odpipetować robaki szklaną pipetą Pasteura na płytkę NGM i pozostawić do wyschnięcia. Rozmieść wiele kropel na nowej płytce, aby szybciej wyschły (Rysunek 2H).
    4. Wyczyść sito.
      1. Delikatnie i dokładnie wypłucz sito etanolem i wodą z odwróconej osmozy. Pozostaw do wyschnięcia.
      2. Przechowuj go w czystym pojemniku do użytku na czas nieokreślony w przyszłości.
      3. Wyrzuć go, gdy siatka zacznie wyglądać jak "zwisa".

2. Walidacja metody sortowania sitowego Caenorhabditis

  1. Ogólne utrzymanie
    1. Dla wszystkich eksperymentów, hodowla robaków na standardowym pożywce do wzrostu nicieni17 (1 l NGM składa się z 2,5 g peptonu, 17 g agaru, 3 g NaCl, 975 ml podwójnie destylowanej wody, 1 ml 5 mg/ml cholesterolu, 1 ml 1 M CaCl2, 1 ml 1 M MgSO4, 25 ml 1 M KHPO4 i 0,5 ml 100 mg/ml streptomycyny) w temperaturze 25 °C.
  2. Eksperymentalne podawanie leczenia
    1. Porównaj trzy grupy leczenia: pick, fluorodeoksyurydyna (FUDR) i sito Caenorhabditis.
      1. W przypadku grupy leczonej FUDR dodać 100 mg/ml FUDR do pożywki NGM do końcowego stężenia 100 μM, aby zapobiec produkcji potomstwa, i przenosić robaki co drugi dzień na świeżą płytkę NGM, aby uniknąć wyczerpania pokarmu.
      2. W przypadku grupy wyboru wybierz i przenieś robaki ręcznie za pomocą platynowej pętli.
      3. W przypadku grupy leczonej sitem Caenorhabditis należy postępować zgodnie z krokiem 1.2 i pipetować robaki na płytkę NGM.
  3. Caenorhabditis Procentowa wydajność sita
    1. Aby określić ilościowo, jak skuteczne jest sito w sortowaniu C. elegans, należy hodować zwierzęta N2 synchroniczne pod względem wieku do 1. dnia dorosłości w temperaturze 25 °C (tj. 48 godzin po złożeniu jaj), a następnie przenieść je poprzez zebranie na świeże płytki NGM (łącznie N = 50 lub N = 100 zwierząt na grupę poddawaną działaniu substancji).
    2. Po 24 godzinach od wyzdrowienia przenieść populację na nowe płytki NGM z sitem Caenorhabditis zgodnie z powyższym protokołem (patrz krok 1.2) i policzyć liczbę pomyślnie przeniesionych zwierząt.
    3. Oblicza się procentowy plon jako stosunek liczby przenoszonych zwierząt do liczby wyjściowej na początku transferu pomnożony przez 100 (%).
  4. Testy zdrowotności
    UWAGA: Oceń parametry zdrowotności klasy ruchliwości, szybkość pompy gardłowej oraz zarówno przednią, jak i tylną reakcję delikatnego dotyku w 2, 4, 6 i 8 dniu dorosłości dla zwierząt N2 zsynchronizowanych z wiekiem utrzymywanych w temperaturze 25 °C.
    1. Śledzenie ruchliwości
      1. Przypisz wyniki motoryki w oparciu o system oparty na klasach (klasy A, B i C) zgodnie z metodami Herndona i wsp.18. Porównaj efekty trzech grup eksperymentalnych, korzystając z porządkowego modelu statystyki logistycznej w oprogramowaniu do analizy statystycznej.
        UWAGA: Osoby klasy A poruszają się spontanicznie w normalnym, sinusoidalnym wzorcu. Osoby klasy B poruszają się w wyraźnie niesinusoidalnych ruchach i mogą wymagać szturchania, aby zachęcić do ruchu. Osobniki klasy C poruszają głową i/lub ogonem w odpowiedzi na szturchanie, ale nie są w stanie poruszać się po agarze.
    2. Szybkość pompy gardłowej
      1. Policz ruch młynka końcowej opuszki gardłowej zwierzęcia wizualnie pod mikroskopem stereoskopowym przy 600-krotnym powiększeniu końcowym przez 1 minutę.
      2. Przeprowadź analizę statystyczną z jednoczynnikową ANOVA z α = 0,05 i testami końcowymi Bonferroni z α = 0,05.
    3. Reakcja na dotyk
      1. Nagraj delikatną reakcję na dotyk i porównaj trzy grupy leczenia. Wykonaj testy w oparciu o metody opisane przez Calixto i wsp.19.
      2. Rejestruj reakcję na dotyk w przedniej i tylnej części ciała, delikatnie głaszcząc szpikulcem do rzęs prostopadle po ogonie lub głowie (5 razy każdy, naprzemiennie głowa i ogon) zwierząt.
      3. Oceń każdy ruch w kierunku przeciwnym do skoku jako 1 punkt w skali od 0 do 5 zarówno dla odpowiedzi przedniej, jak i tylnej.
      4. Przeprowadź analizę statystyczną za pomocą jednoczynnikowej ANOVA z α = 0,05 i testów końcowych Bonferroni z α = 0,05.
  5. Test płodności
    1. Aby określić wpływ sita Caenorhabditis na rozrodczość, należy hodować zwierzęta N2 synchroniczne z wiekiem do 2 dnia dorosłości w temperaturze 25 °C.
    2. Po 60 godzinach od złożenia jaj przenieś zwierzęta na nowe płytki NGM za pomocą platynowego kilofa lub sita Caenorhabditis i daj im 4 godziny na dojście do siebie (suszyć przesiane płytki przez 20–30 minut).
    3. Po wyzdrowieniu należy pojedynczo przyłożyć zwierzęta za pomocą szpikulca do rzęs do płytek NGM, dać im 24 godziny na złożenie jaj i usunąć zwierzęta. Pozwolić potomstwu na każdej szalce rozwinąć się w normalnych warunkach w temperaturze 25 °C przez kolejne 24 godziny
      UWAGA: Szpikulec do rzęs to ludzka rzęsa przymocowana do końca pipety Pasteura lakierem do paznokci i wysterylizowana etanolem.
    4. Policz liczbę zdolnych do życia osobników z pokolenia F1. Wykonaj analizę statystyczną przy użyciu testu T, w którym α = 0,05,
      Uwaga: Za żywotne potomstwo uważa się jaja, które pomyślnie się wykluwają i rozpoczynają swój rozwój w regularnych cyklach larwalnych.
  6. Fluorescencyjne testy reporterowej odpowiedzi na stres
    1. Wykonaj trzy powszechnie stosowane fluorescencyjne testy reporterowe w celu wykrycia potencjalnych markerów stresu: translokacji DAF-16::GFP do jąder komórek w szczepie [TJ356- zIs356 (pDAF-16::D AF-16-GFP; rol-6)]20; wyrażenie hsp-16.2 [TJ375- gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]21; oraz wyrażenie sod-3 [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]22.
    2. Dla każdego testu należy wyhodować zwierzęta synchroniczne pod względem wieku z trzech grup poddanych działaniu substancji w temperaturze 20 °C i zbadać je w 3. dniu dorosłości: stosować kontrolę ujemną (codziennie ręcznie przenieść grupę zwierząt za pomocą platynowego kilofa), kontrolę pozytywną (codziennie należy ręcznie przenieść grupę zwierząt za pomocą platynowego kilofa plus ustalonego czynnika stresogennego), oraz sito Caenorhabditis (przepuść zwierzęta przez sito i pozwól im dojść do siebie przez 30 minut na NGM tuż przed obrazowaniem).
    3. W teście DAF-16::GFP należy przeprowadzić szok cieplny u zwierząt kontrolnych w temperaturze 37 °C przez 30 minut przed obrazowaniem20. W przypadku testu hsp-16.2 należy przeprowadzić szok termiczny u zwierząt z kontrolą pozytywną przez 90 minut, 20 godzin przed obrazowaniem21. W przypadku testu sod-3 należy traktować zwierzęta kontrolne dodatnie parakwatem 100 mM przez 4 godziny przed obrazowaniem22.
    4. Robaki należy natychmiast zebrać za pomocą szpikulca do rzęs i przymocować je do szkiełka nakrywkowego z 1 μl 36% roztworu środka powierzchniowo czynnego poloxamer 407 w celu unieruchomienia robaków.
    5. Umieść zamontowane robaki na kanapie z kolejnym szkiełkiem nakrywkowym. Zamontuj dwa szkiełka nakrywkowe na standardowym szkiełku mikroskopowym i zobrazuj robaki przy użyciu 8-krotnego powiększenia na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym (dla całkowitego powiększenia 80x) i stałej ekspozycji z filtrem FITC.
    6. Aby wykryć jakiekolwiek różnice między trzema grupami w teście DAF-16::GFP, skategoryzuj zwierzęta na podstawie lokalizacji reportera DAF-16::GFP (jądrowy, jeśli reporter translokował się do jąder, cytozolowy, jeśli reporter znajdował się w cytozolu, i pośredni, jeśli reporter znajdował się zarówno w jądrze, jak i cytozolu).
    7. Porównaj wyniki przy użyciu porządkowego modelu statystycznego logistyki w oprogramowaniu do analizy statystycznej. W przypadku testów ekspresji hsp-16.2 i sod-3 należy użyć jednoczynnikowej ANOVA z α = 0,05 i testów post hoc Tukeya z α = 0,05, aby porównać całkowitą fluorescencję obszaru głowy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sito Caenorhabditis składa się z 2 zakrętek, zabezpieczających obszar tkanej nylonowej siatki monofilamentowej mniejszej niż średnica ciała w pożądanym wieku rozwojowym, używany do ekstrakcji żywych populacji organizmów za pomocą prostej techniki mycia. Mocuje się go do standardowych stożkowych rurek i wykorzystuje siatkę do mechanicznego sortowania zwierząt według średnicy ciała, pozostawiając pożądane zwierzęta w tubie gotowe do dalszej konserwacji i eksperymentów (np....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiliśmy projekt i zastosowanie dostępnego, skutecznego sita Caenorhabditis jako narzędzia do sortowania i konserwacji C. elegans. To narzędzie ma kilka zalet w porównaniu z ręcznym wybieraniem pojedynczych zwierząt, myciem populacji, zabiegami chemicznymi (np. FUDR) i droższymi metodami segregacji zwierząt. Po pierwsze, sito Caenorhabditis skutecznie i szybko (mniej niż 20 minut) sortuje potomstwo z dużych mieszanych populacji zwierząt (tabela 2)...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Heather Currey za jej początkowy wkład w projekt badania, oraz dr Swarupowi Mitrze za krytyczną recenzję manuskryptu. Chcielibyśmy również podziękować dr Michaelowi B. Harrisowi za komentarze, udoskonalenia i pomoc w przygotowaniu demonstracji tej metodologii. Szczepy zostały dostarczone przez Caenorhabditis Genetics Center, które jest finansowane przez Biuro Programów Infrastruktury Badawczej NIH (P40 OD010440). Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez Narodowy Instytut Ogólnych Nauk Medycznych Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach numerów nagród UL1GM118991, TL4GM118992 lub RL5GM118990 oraz przez Nagrodę Rozwoju Instytucjonalnego (IDeA) przyznaną przez Narodowy Instytut Ogólnych Nauk Medycznych Narodowych Instytutów Zdrowia w ramach grantu o numerze 5P20GM103395-15. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health. UA jest pracodawcą i instytucją edukacyjną AA/EO i zakazuje nielegalnej dyskryminacji jakiejkolwiek osoby: www.alaska.edu/titleIXcompliance/nondiscrimination.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Okulary ochronneUlineS-21076
Rękawica ochronna żaroodpornaGraingerPozycja # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Strona katalogu # 1703
Rurka stożkowa 50 mlFalcon14-432-22
Siatka z nylonu syntetycznegoDynamic
Aqua-Supply Ltd		NTX20 i NTX50
Klej cyjanoakrylowyScotch Super Glue LiquidSAD114
SzczypceVampliersVMPVT-001-8
Narzędzie Dremmel z okrągłym pilnikiemLowe'sItem # 525945 Model # 100-LG
FUDRSigmaF0503
M9 chemikalia (NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4) Sigma S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506 Chemikalia płytkowe M7506
NGM (baktopepton, agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2, cholesterol, streptomycyna)BD Biosciences (baktopepton), Lab express (agar), Sigma (reszta)BD bioscience 211677, Lab Express 1001,  Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501
Pluronic F-127SigmaP2443
Hydrat dichlorku parakwatuSigma36541
Mikroskop fluorescencyjny odwróconyOlympusFSX100

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. C elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  2. Herman, M. A. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , 1-16 (2006).
  3. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  4. Chalfie, M., Hart, A. C., Rankin, C. H., Goodman, M. B. Assaying mechanosensation. WormBook. , (2014).
  5. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. Deletion of the Mitochondrial Superoxide Dismutase sod-2 Extends Lifespan in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 5 (2), e1000361(2009).
  6. Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing Development. 132 (10), 519-521 (2011).
  7. Gandhi, S., Santelli, J., Mitchell, D. H., Stiles, J. W., Sanadi, D. R. A simple method for maintaining large, aging populations of Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 12 (2), 137-150 (1980).
  8. Aitlhadj, L., Stürzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (5), 364-365 (2010).
  9. Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mechanisms of Ageing Development. 133 (1), 46-49 (2012).
  10. Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9 (1), e85964(2014).
  11. Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Molecular Biology. 351, 275-286 (2006).
  12. Argon, Y., Ward, S. Caenorhabditis elegans fertilization-defective mutants with abnormal sperm. Genetics. 96 (2), 413-433 (1980).
  13. Lee, S. J., Kenyon, C. Regulation of the longevity response to temperature by thermosensory neurons in Caenorhabditis elegans. Current Biology. 19 (9), 715-722 (2009).
  14. Klass, M. R. Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span. Mechanisms of Ageing Development. 6 (6), 413-429 (1977).
  15. Zhang, B., et al. Environmental Temperature Differentially Modulates C. elegans Longevity through a Thermosensitive TRP Channel. Cell Reports. 11 (9), 1414-1424 (2015).
  16. Michaelson, L. C. C. elegans: A Practical Approach. Ian A. Hope (ed.). Oxford University Press, Oxford. 1999. Pp. 281. ISBN 0 19 963738 5. Heredity. 85 (1), 97-100 (2000).
  17. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  18. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419 (6909), 808-814 (2002).
  19. Calixto, A., Chelur, D., Topalidou, I., Chen, X., Chalfie, M. Enhanced neuronal RNAi in C. elegans using SID-1. Nature Methods. 7 (7), 554-559 (2010).
  20. Henderson, S. T., Johnson, T. E. daf-16 integrates developmental and environmental inputs to mediate aging in the nematode Caenorhabditis elegans. Current Biology. 11 (24), 1975-1980 (2001).
  21. Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
  22. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115 (4), 489-502 (2003).
  23. Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. 68 (3), 476-486 (2014).
  24. Scerbak, C., Vayndorf, E. M., Hernandez, A., McGill, C., Taylor, B. E. Mechanosensory neuron aging: Differential trajectories with lifespan-extending alaskan berry and fungal treatments in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Aging Neuroscience. 8, 173(2016).
  25. Vayndorf, E. M., et al. Morphological remodeling of C. elegans neurons during aging is modified by compromised protein homeostasis. npj Aging and Mechanisms of Disease. 2, 16001(2016).
  26. Murakami, S., Johnson, T. E. A genetic pathway conferring life extension and resistance to UV stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 143 (3), 1207-1218 (1996).
  27. Abbas, S., Wink, M. Green Tea Extract Induces the Resistance of Caenorhabditis elegans against Oxidative Stress. Antioxidants (Basel). 3 (1), 129-143 (2014).
  28. Yanase, S., Hartman, P. S., Ito, A., Ishii, N. Oxidative stress pretreatment increases the X-radiation resistance of the nematode Caenorhabditis elegans. Mutation Research. 426 (1), 31-39 (1999).
  29. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sortowanie nicienisynchronizacja C elegansfiltracja siatkowaselekcja wielko ci nicienimonta prob wek sto kowychprzemywanie buforem M9przenoszenie na p ytki NGMutrzymanie populacjiselekcja stadium rozwojowego

Powiązane artykuły