Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolowanie i włączanie anten zbierających światło z okrzemki Cyclotella Meneghiniana w liposomach z lipidami tylakoidowymi

7.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58017

⸱

28 sierpnia 2018

 ,  , 
1Institute for Molecular Biosciences, Goethe University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół izolacji białek wiążących chlorofil a/c (FCP) z okrzemek i włączenia ich do liposomów o naturalnym składzie lipidowym w celu zbadania transferu energii wzbudzenia po zmianie składu jonów.

Streszczenie

Wydajność fotosyntezy roślin, glonów i okrzemek zależy od szybkiej i efektywnej regulacji procesów zbierania światła i transferu energii w błonie tylakoidowej chloroplastów. Antena zbierająca światło okrzemek, tzw. białka wiążące chlorofil a/c (FCP) fukoksantyny, są niezbędne do absorpcji światła i efektywnego przekazywania go do centrów reakcji fotosyntezy, a także do fotoochrony przed nadmiernym światłem. Przełączanie między tymi dwiema funkcjami jest od dawna przedmiotem badań. Wiele z tych badań przeprowadzono z użyciem FCP w micelach detergentowych. Do badań interakcji detergenty zostały usunięte, co doprowadziło do niespecyficznej agregacji kompleksów FCP. W tym podejściu trudno jest odróżnić artefakty od danych fizjologicznie istotnych. W związku z tym bardziej wartościowe informacje na temat FCP i innych błonowych kompleksów zbierania światła można uzyskać, badając interakcje białko-białko, transfer energii i inne cechy spektroskopowe, jeśli są one osadzone w ich natywnym środowisku lipidowym. Główną zaletą jest to, że liposomy mają określoną wielkość i określony stosunek lipidów do białek, dzięki czemu kontrolowany jest zakres grupowania FCP. Co więcej, zmiany w pH i składzie jonów, które regulują zbieranie światła in vivo, mogą być łatwo symulowane. W porównaniu z błoną tylakoidów liposomy są bardziej jednorodne i mniej złożone, co ułatwia uzyskanie i zrozumienie danych spektroskopowych. Protokół opisuje procedurę izolacji i oczyszczania FCP, przygotowania liposomów oraz włączenia FCP do liposomów o naturalnym składzie lipidowym. Wyniki z typowej aplikacji są podane i omówione.

Wprowadzenie

Organizmy fotosyntetyzujące, takie jak okrzemki, muszą radzić sobie z nieustannie zmieniającymi się warunkami oświetlenia i reagować za pomocą złożonych mechanizmów aklimacyjnych, które podtrzymują wysoką wydajność fotosyntetyczną i chronią przed uszkodzeniami fotooksydacyjnymi wywołanymi nadmiernym światłem. Głównym procesem ochronnym przed światłem u eukariotów fotosyntetyzujących jest wysokenergetyczne gaszenie (qE) pochłoniętego światła, które stanowi główny wkład w niefotochemiczne gaszenie (NPQ) w warunkach stresu świetlnego1,2,3. Kompleksy antenowe zbierające światło (LHC) biorą udział w regulacji dróg transferu energii wzbudzenia. W odpowiedzi na niskie pH w lumenie chloroplastu indukowane przez silne światło, system antenowy przełącza się ze stanu zbierania światła w stan gaszenia. Ten energetycznie rozpraszający stan chroni fotosystemy (PS) i inne kompleksy w błonie tylakoidów przed fotooksydacją. U eukariotów fotosyntetyzujących qE jest zazwyczaj indukowane przez dwa czynniki1,2,3. Jednym z nich jest specjalistyczne białko zbierające światło, które reaguje na niskie pH. Białko PsbS indukuje qE u roślin wyższych4. LhcSRs5, modulowane przez aktywność PsbS, indukują qE u zielonych glonów6. Okrzemki posiadają białka typu Lhcx, które są strukturalnie spokrewnione z LhcSRs7,8,9,10.

Drugim czynnikiem qE jest cykl ksantofili, w którym karotenoidy anteny są przekształcane w formę fotoprotekcyjną poprzez deepoksydację i przywracane przez epoksydację. U roślin i zielonych glonów violaksantyna jest przekształcana w zeaksantynę. W okrzemkach diadinoksantyna jest przekształcana w diatoksantynę, co następnie koreluje z zakresem NPQ11. Antena zbierająca światło okrzemków posiada pewne specyficzne cechy, mimo że jest ewolucyjnie powiązana z LHC roślin i glonów. Przełączenie z pochłaniania światła na fotoprotekcję jest niezwykle szybkie, a pojemność NPQ jest wyższa w porównaniu do roślin12. Może to być jednym z powodów, dla których okrzemki odnoszą tak duże sukcesy w różnych niszach ekologicznych, odpowiadając za maksymalnie 45% oceanicznej netto pierwotnej produkcji13. W związku z tym systemy zbierania światła okrzemków stanowią interesujący obiekt badań nad fotosyntezą.

Okrzemki, takie jak centriczny gatunek Cyclotella meneghiniana, posiadają wewnątrzthylakoidowe układy zbierania światła nazwane od wiązanych przez nie pigmentów – fukoksantyny oraz chlorofilu (chl) a i c, stąd nazwa FCP. Białka zbierające światło, takie jak FCP, są osadzone w systemie błon thylakoidów składającym się z kilku warstw błonowych. Okrzemki tworzą pasma trzech thylakoidów. Ta złożona sytuacja utrudnia ich badanie na poziomie molekularnym w błonie thylakoidu. Ponadto w regulację zbierania światła zaangażowanych jest wiele komponentów (patrz wyżej). Dlatego w wielu podejściach kompleksy te izolowano z błony przy użyciu łagodnych detergentów, takich jak n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside (β-DDM), które solubilizują błonę, ale pozostawiają kompleksy FCP w nienaruszonym stanie. Wiele badań spektroskopowych przeprowadzono z wykorzystaniem solubilizowanych FCP w celu zbadania wewnątrzmolekularnego transferu energii14,15,16,17. Jednak to wcześniejsze podejście było ograniczone, ponieważ regulacja transferu energii wymaga oddziaływań ekscytonowych z innymi kompleksami antenowymi lub fotosystemami. W związku z tym tego rodzaju badania nie mogą być prowadzone na solubilizowanych kompleksach, ponieważ oddziaływania między kompleksami zostają utracone.

Ważną cechą w regulacji anten jest „zatłoczenie molekularne” (molecular crowding) anten i fotosystemów w błonie tylakoidu18. Wcześniej stosowano proste podejście w celu symulacji tego efektu in vitro. Usuwano detergent, co prowadziło do przypadkowej agregacji kompleksów antenowych. Chociaż dzięki tej metodzie uzyskano pewne wiarygodne dane17,19, usuwanie detergentu nie odzwierciedla sytuacji in vivo i posiada pewne ograniczenia, ponieważ kompleksy nie oddziałują ze sobą w ramach swojej regularnej struktury trzeciorzędowej.

Zastosowanie liposomów pozwala pokonać wiele z wcześniejszych ograniczeń. Struktura trzeciorzędowa pozostaje w pełni nienaruszona. Błona liposomu zapewnia środowisko quasi-natywne dla kompleksów antenowych. Błona oddziela wnętrze liposomu od środowiska zewnętrznego. W ten sposób liposomy zapewniają dwa przedziały reakcyjne do badań gradientów jonowych i pH, a także procesów transportu. Ponadto parametry układu eksperymentalnego mogą być łatwiej kontrolowane w badaniach nad błoną tylakoidów. Wykazano już, że liposomy są doskonałym narzędziem do badania kompleksów fotosyntetycznych. W przeszłości główny nacisk kładziono na roślinne LHC, gdzie badano wpływ zmienionego składu lipidowego na LHC II20. W innych podejściach badano oddziaływania białko-białko pomiędzy różnymi LHC II21. Przeprowadzono również niektóre badania na zielonych algach, które opisują spontaniczne klastrowanie LHC22. Biorąc pod uwagę znaczenie okrzemków dla ekosystemów wodnych, wykonano stosunkowo niewiele badań nad kompleksami antenowymi okrzemków. Dwie prace badały kompleksy antenowe okrzemka centrującego Cyclotella meneghiniana, wykazując klastrowanie anten FCP23 oraz reaktywność FCP na gradienty elektrochemiczne24. Zatem liposomy są doskonałym narzędziem do badania anten okrzemków oraz ich oddziaływań i regulacji w warunkach niemal natywnych. Liposomy są wszechstronne, ponieważ można kontrolować wiele parametrów, takich jak skład lipidowy, wielkość liposomów, gęstość białek oraz otaczająca faza wodna. Ponadto metoda ta wymaga niewielkich ilości próbek. Układ eksperymentalny jest stabilny i wysoce powtarzalny. Przedziałowość liposomów umożliwia badanie gradientów pH i jonów, które są istotnymi czynnikami w regulacji kompleksów antenowych.

W niniejszej pracy opisujemy izolację kompleksów antenowych FCP z C. meneghiniana oraz ich wbudowywanie w liposomy o naturalnym składzie lipidowym tylakoidów. Dostarczamy również przykładowych danych dla charakterystyki spektroskopowej solubilizowanego FCP i porównujemy je z FCP w liposomach. Metoda ta podsumowuje wiedzę i zestandaryzowane protokoły uzyskane dzięki ulepszeniom wprowadzonym przez Gundermann i Büchel w 2012 roku.23, Natali i wsp. 201622, oraz Ahmad i Dietzel 201724.

Izolacja tylakoidów i wbudowanie FCP w syntezie proteoliposomów; schemat etapów metody.
Rycina 1: Schematyczny przebieg procesu. (1) Odnosi się do akapitu 1, który opisuje wzrost komórek, ich rozbicie oraz izolację tylakoidów z następującym rozdzieleniem FCP na gradientach gęstości sacharozy; komórki C. m.-Cyclotella meneghiniana. (2) Przygotowanie naturalnej mieszaniny lipidów tylakoidalnych (MGDG, DGDG i SQDG) opisane w akapicie 2 oraz tworzenie miceli lipidowo-detergentowych z użyciem oktyloglikozydu (OG). Określoną wielkość miceli lipidowych uzyskuje się poprzez ekstruzję przez membrany o zdefiniowanej średnicy porów. FCP i micele lipidowe są łączone w określonym stosunku lipid:białko, a detergenty OG i β-DDM są usuwane poprzez kontrolowaną dializę, co prowadzi do powstania proteoliposomów FCP. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Kompleksy fotosyntetyczne, takie jak FCP, są bardzo wrażliwe na światło i ciepło. Należy zawsze pracować w warunkach ochłodzenia (na lodzie) i przy bardzo słabym oświetleniu.

1. Izolacja FCP z komórek

  1. Izolacja tylakoidów z C. meneghiniana komórki
    1. Hodowla C. meneghiniana w pięciu kolbach o pojemności 500 mL, z których każda została wypełniona 300 mL pożywki ASP23,25 oraz 50 milionów komórek. Kolby należy zatkać watowanym korkiem i pozwolić komórkom rosnąć do fazy wzrostu wykładniczego przez około tydzień w inkubatorze wytrząsowym przy 120 obr./min, z 16-godzinnym cyklem światła i 8-godzinnym cyklem ciemności w temperaturze 40 µmol fotonów/(m²s) światła białego i temperatura między 15-18 °CZa pomocą komory licznikowej należy sprawdzić, czy liczba komórek mieści się w przedziale 1,5–2 mln komórek/ml.
    2. Wirować komórki przy 4 000 x g w schłodzonym wcześniej rotorze z probówkami do wirowania o pojemności 500 ml (4 °C) przez 15 min w wirówce wysok prędkości. Ponownie zawiesić osady komórkowe w 12 ml buforu homogenizującego (HB, Tabela 1) za pomocą pipety.
      1. Przenieść zawiesinę do jednej plastikowej probówki o pojemności 50 ml. Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C lub przejść do kroku 1.1.3.
    3. Wstępnie schłodzić młyn kulkowy oraz sprzęt. Napełnić zlewka o pojemności 50 ml w młynku kulkowym w 75% mieszaniną kulek szklanych i dodać zawiesinę komórkową. W celu rozbicia komórek zastosować 7 impulsów po 45 s przy pełnej prędkości, z 30-sekundową przerwą na chłodzenie między każdym impulsem. Pobrać 20 µL rozbitych komórek do kontroli jakości w kroku 1.1.6.
    4. Przefiltruj zdezintegrowane komórki przez szklany lejek filtrujący i przemyj, wlewając bufor HB na szklane kuleczki, aż będą one wyglądać na czyste. Połącz frakcję płukania z filtratem. Utrzymaj objętość końcową poniżej 150 mL.
    5. Wirować próbkę przez 15 min przy 140 x g g należy użyć trzech plastikowych probówek o pojemności 50 mL w celu odwirowania osadu z fragmentów komórek. Następnie należy ostrożnie przenieść nadsącz do poliwęglanowych probówek do ultrawirowania o pojemności 20 mL, a osad usunąć.
      1. Napełnić probówki buforem HB, wyrównać masę i wirować w odpowiednim rotorze przez 1 h przy 300 000 x g. g i 4 °C w celu oc settlingu błon tylakoidów.
    6. Wykorzystaj czas wirowania do sprawdzenia pod mikroskopem przy powiększeniu 400X proporcji rozbitych komórek za pomocą 20 µL próbka pobrana w punkcie 1.1.3. Obliczyć stosunek okrywek (szkieletów krzemionkowych) wolnych od chloroplastów do okrywek zawierających chloroplasty.
      Uwaga: Ściany komórkowe okrzemków składają się z krzemionki, która w mikroskopie jest widoczna jako substancja silnie dyfrakcyjna. Chloroplasty występujące w postaci zielonych kropek powinny zostać uwolnione z komórek, jeżeli proces rozrywania komórek przebiegł pomyślnie.
    7. Resuspend osad z membrany w jak najmniejszej ilości buforu piorącego (0,5–1 ml), używając małego pędzla malarskiego. Napełnij poliwęglanowe probówki do ultrawirówki buforem piorącym (Tabela 1), wyrównać ich masę i wirować przez 20 min przy 200 000 x g i 4 °C.
      1. Ponownie zawiesić wypłukane membrany za pomocą pędzla malarskiego. Dodać bufor piorący tylko w razie potrzeby, aby utrzymać możliwie najwyższe stężenie tylakoidów. Przenieść wszystkie tylakoidy do jednej probówki (15 ml).
    8. Przediluj próbki, używając 10 µL próbki z 90 µL ze 100% acetonu. Wirować przy 12 000 x g przez 5 min w celu zgranulowania wytrąconego białka. Pobierz 10 µL z roztworu wstępnego i wymieszać go z 990 µL z 90% acetonu.
      1. Zmierzyć absorbancję (ABS) chlorofilu a i c przy 664 nm i 630 nm w 90% acetonie. Odjąć ABS750 nm z obu wartości. Całkowitą zawartość chlorofilu należy wyznaczyć za pomocą następującego wzoru:24
        1)       Wzór na stężenie chlorofilu a, mg/ml, z wykorzystaniem absorbancji przy 664 nm i 630 nm.
        2)       Wzór na stężenie chlorofilu c, równanie: chl c [mg/mL] = 24,34*ABS630nm - 3,73*ABS664nm.
    9. Rozdziel tylakoidy w porcjach zawierających 0,5 mg całkowitej chlorofilu do probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 ml, zamroź je w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
  2. Separacja i zagęszczanie kompleksów FCP
    1. Przygotować roztwór gradientu sacharozy i napełnić probówki do ultrawirówki do poziomu górnej krawędzi pomniejszonej o objętość próbki (300 – 500 µL). Zamrozić probówki w temperaturze -20 °C aż do całkowitego zamrożenia. Pozostawić probówki do rozmrożenia w temperaturze +4 °Cco w przypadku probówki o pojemności 17 ml trwa od 3 do 4 h.
      1. Powtórz cykl zamrażania i rozmrażania dwukrotnie, aby dopracować gradient w celu uzyskania lepszej rozdzielczości.
    2. Należy wykorzystać próbki otrzymane w punkcie 1.1.9, odpowiadające 0,5 mg chlorofilu, i dostosować ich objętość za pomocą buforu B1 (Tabela 1) do końcowej objętości 2 ml. W celu solubilizacji należy dodać n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (b-DDM) do końcowego stężenia 20 mM.
      1. Odwróć probówkę 3 razy i pozostaw na lodzie przez 20 min, delikatnie wstrząsając, aby uniknąć powstania piany. Wirować przez 5 min przy 12 000 x g w schłodzonej wcześniej wirówce nakładkowej przy temp. +4 °C.
    3. Naniesć nadpływ na gradient. Nie nanosić więcej niż 125 µg całkowitej zawartości chlorofilu na gradient w przypadku użycia probówek o pojemności 17 ml. Wirować przez 22 h przy 100 000 x g i +4 °C.
      1. Odzyskać pożądane brązowe frakcje FCP z gradientu za pomocą strzykawki (Rycina 2A). Pobrać 5 µL pobrać odpowiednią ilość i rozcieńczyć ją za pomocą 995 µL B1a.
    4. Zmierz widmo absorbancji (ABS) w zakresie 370–750 nm za pomocą spektrofotometru UV-VIS. Użyj półmikrokuwet z ryglowanego szkła optycznego.
      1. Otwórz oprogramowanie spectra manager, przejdź do trybu widma (spectrum mode) i zarejestruj linię bazową w zakresie od 370 do 750 nm, a następnie wykonaj pomiary próbek. Zastosuj następujące ustawienia: prędkość skanowania 200 nm/min, krok danych 0,5 nm, odpowiedź: średnia (medium).
    5. Zmierz objętość odzyskaną próbkę za pomocą mikropipety. Przemyj kompleksy FCP, dodając dwukrotność odzyskanej objętości buforu B1 (Tabela 1). Skoncentrować w koncentratorze membranowym z progiem odcięcia 30 kDa przy 1 000 x g. g i +4 °C do ABS672 nm co najmniej 20.
      Uwaga: Stężenie b-DDM może wzrosnąć na skutek wzbogacenia miceli w komorze z próbką. Może to prowadzić do dalszej solubilizacji kompleksów FCP! Aby uniknąć nadmiernej solubilizacji, w przypadku konieczności przeprowadzenia dodatkowych etapów płukania w celu usunięcia resztkowej sacharozy, należy dodać wolny od detergentu bufor B1.
    6. Pobrać 20 µL odpowiednią porcję do kontroli. Próbki zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

Analiza chromatograficzna i spektroskopowa; wykresy absorpcji, fluorescencji, oczyszczanie białek.
Rysunek 2: Oczyszczanie FCP, kontrole spektroskopowe i kontrola czystości. (A) Typowy wygląd gradientu gęstości sacharozy po nocnym wirowaniu. Wszystkie brązowe prążki zawierają pulę FCP składającą się z FCPa i FCPb. pigm. – wolne pigmenty, PS – fotosystemy (B) Widma absorbancji FCP przed (linia niebieska) i po (linia pomarańczowa przerywana) zagęszczeniu przy użyciu filtrów wirówkowych z odcięciem 30 kDa. W szczególności karotenoidy są podatne na utratę z FCP, co skutkowałoby niższą absorbancją w regionie między 500-550 nm. Wykresy są znormalizowane do maksimum Qy chlorofilu przy ~670 nm. (C) Widma emisji chlorofilu a przy wzbudzeniu chl c (465 nm) w celu przetestowania funkcjonalnego transferu energii wzbudzenia. Jeśli transfer energii z chl c do chl a jest utrudniony, pojawiłby się dodatkowy prążek fluorescencji przy ~640 nm (chl c). Wykresy są znormalizowane do maksimum emisji. (D) Widma wzbudzenia zarejestrowane przy 675 nm (maksimum fluorescencji chl a) w celu przetestowania transferu energii do chl a ze wszystkich pigmentów absorbujących w zakresie od 370 nm do 600 nm. Jeśli transfer energii do chl a jest mniej wydajny, wydajność fluorescencji spadłaby zwłaszcza między 465 a 550 nm. Wykresy są znormalizowane do maksimum w okolicach 440 nm. Widma w (B), (C) i (D) są prawie identyczne, jeśli zagęszczanie przebiegło pomyślnie. (E) Kontrola czystości wyizolowanego FCP przy użyciu żelu Tris-tricine28. FCPa i FCPb posiadają podjednostki o masie między 18-19 kDa. Wszystkie widoczne białka barwione srebrem o masie większej niż 20 kDa są zanieczyszczeniami. Thyl. – tylakoidy Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

  1. Kontrole spektroskopowe i żelowe
    1. Po kroku 1.2.5 zmierz absorbancję w zakresie 370-750 nm dla 5 µL FCP w 995 µL B1a. Porównaj wynik ze widmem uzyskanym w kroku 1.2.4. Użyj tej samej aparatury i ustawień, które opisano w kroku 1.2.4.
      1. Wyeksportuj dane do pliku *.csv i zaimportuj je do arkusza kalkulacyjnego. Znormalizuj oba widma do maksimum chl a w pasmie Qy około 672 nm, jak przedstawiono na Rysunku 2B.
    2. Oblicz czynnik rozcieńczenia próbek z kroku 1.2.4 i 1.3.1, dzieląc zmierzoną wartość ABS672nm przez pożądaną wartość ABS672nm wynoszącą 0,03. Odpowiednio rozcieńcz próbki buforem B1a i przenieś je do specjalnych szklanych kuwet fluorescencyjnych.
    3. Zmierz widmo emisji fluorescencji chl a za pomocą spektrofluorometru, aby wykazać nienaruszony transfer energii świetlnej z chl c do chl a (Rysunek 2C).
      1. W oprogramowaniu spektrometru przejdź do trybu pomiaru widma z następującymi ustawieniami: tryb (mode), emisja (emission); szerokość szczeliny wzbudzenia i emisji (slit width excitation and emission), 3 nm; czułość (sensitivity), średnia (medium); prędkość skanowania (scan speed), 100 nm/min; krok danych (data pitch), 0,5 nm; długość fali wzbudzenia (excitation wavelength), 465 nm; emisja (emission), 600-800 nm. Wykonaj autozero i dokonaj pomiaru.
    4. Zmierz widma wzbudzenia przy użyciu tej samej próbki i aparatury, aby wykazać nienaruszony transfer energii ze wszystkich pigmentów do chl a (Rysunek 2D). Zmień ustawienia na: tryb (mode), wzbudzenie (excitation); długość fali emisji (emission wavelength), 675 nm; wzbudzenie (excitation), 370-600 nm. Zarejestruj widma.
      1. Koryguj wyniki za pomocą widma rodaminy w tym samym zakresie w celu uwzględnienia właściwości spektralnych lampy – por. instrukcje w instrukcji obsługi.
    5. Wymieszaj próbki FCP odpowiadające 1 µg chl a z 10 µL buforu do nakładania SDS. Inkubuj przez 10 min w 25 °C. Wiruj przez 5 min przy 12000 x g w wirówce stołowej.
      1. Naniesienie supernatantu na żel Tris-tricine28. Rozdziel białka przez 2 h przy 150 V, a po rozdzieleniu przeprowadź barwienie srebrem40.
        Uwaga: Podjednostki FCP rozdzielają się na dwa wyraźne prążki białkowe między 18-19 kDa, które są składnikami FCPa i FCPb29 (Rysunek 2E).

2. Przygotowanie liposomów i inkorporacja FCP

  1. Przygotowanie mieszaniny lipidowej i miceli lipidowo-detergentowych
    Uwaga:     Lipidy są wrażliwe na wysokie temperatury w połączeniu z warunkami utleniającymi. Należy starać się przechowywać lipidy w warunkach schłodzenia i w atmosferze N2.
    1. Obliczyć pożądane stosunki lipidów tylakoidowych dla C. meneghiniana zgodnie z Vieler et al. 200730. Należy odnieść się do przykładu podanego w Tabeli uzupełniającej 1. Przygotować roztwory stokowe lipidów zalecane przez producenta w naczyniu odpornym na rozpuszczalniki.
    2. Odmierzyć pipetą pożądaną ilość lipidów do probówki reakcyjnej o pojemności 2 mL i odparować chloroform za pomocą delikatnego strumienia azotu, starając się rozprowadzić lipidy na całej powierzchni dna probówki. Kontynuować przepływ N2 aż do całkowitego odparowania rozpuszczalnika.
    3. Rozpuścić mieszaninę lipidową w 29 µL roztworu n-oktyloglikozydy β-D (OG) w temperaturze 4 °C przez 4 h. Inkubować mieszaninę lipidową przez 10 min w 30 °C. Inkubować lipidy w kąpieli sonikacyjnej 3 x 3 min w 25 °C z przerwami 30 s na lodzie.
      1. Dodać 221 µL buforu tricina i 250 µL 4x buforu do dializy.
    4. Użyć ekstrudera z membranami poliwęglanowymi 0,1 µm w celu uzyskania zdefiniowanej średnicy liposomów od 50-70 nm. Złożyć ekstruder z membraną i podkładką filtrującą. Unikać pęcherzyków powietrza i dokładnie dokręcić zestaw.
    5. Napełnić jedną strzykawkę 4x buforem do dializy i zwilżyć ekstruder, aż w drugiej strzykawce nie będzie widocznych pęcherzyków powietrza.
    6. Przenieść micele lipidowo-detergentowe do ekstrudera i przeciskać roztwór z jednej strzykawki do drugiej w przód i w tył. Powtórzyć ten krok 5 razy, aż roztwór stanie się jednorodny.
      Uwaga: Roztwór ten można przechowywać w 4 °C przez kilka dni. Nie zamrażać!
  2. Inkorporacja kompleksów FCP oraz usuwanie detergentów i agregatów
    Uwaga: W tym przykładzie stosujemy stosunek lipid/chl a wynoszący 12:1, co odpowiada stosunkowi lipid/białko około 100:1.
    1. Dodać FCP w ilości odpowiadającej 20 µg chl a w całkowitej objętości 500 µL buforu B1a do 250 μL ekstrudowanych miceli lipidowych i 250 µL 4x buforu do dializy. Inkubować próbki 3 x 3 min w 25 °C w termomikserze przy 1 500 – 3 000 obr./min z przerwami 30 s na lodzie.
    2. Odciąć wieczko czterech probówek reakcyjnych o pojemności 1,5 mL tuż pod górną krawędzią, pozostawiając pierścień, który wciąż pasuje do wieczka. Przygotować kawałki membrany dializacyjnej o wymiarach 1,5 cm x 1,5 cm i przemyć je w 20 mL 1x buforu do dializy.
    3. Wlać 250 µL próbki do każdego wieczka. Ostrożnie położyć membranę na wieczku tak, aby komora była całkowicie wypełniona próbką i nie pojawiły się pęcherzyki powietrza. Dokręcić pierścień probówki reakcyjnej na zestawie, aby uzyskać zamkniętą komorę.
    4. Dializować próbki w 50 mL 1x buforu do dializy przez noc (12-16 h) na lodzie na wytrząsarku obrotowej. Wymienić zużyty bufor do dializy na świeży i dodać 7 mg kulek adsorbentów, aby usunąć pozostałe detergenty przez co najmniej 6 h.
    5. Ponownie wymienić bufor do dializy i dializować przez kolejne 12 h. Odzyskać liposomy, przebijając membranę dializacyjną końcówką mikropipety 200 µL i aspirując wszystkie liposomy z wieczka probówki reakcyjnej.
    6. Krok opcjonalny: Jeśli wymagana jest wysoka czystość (>95%). Przygotować nieciągły gradient gęstości w probówkach do ultrawirówek o pojemności 17 mL z etapami zawierającymi 6%, 10%, 15% i 20% kopolimeru sacharozy i epichlorohydryny w buforze do dializy. Nałożyć liposomy na górze i ultrawirować przy 100 000 x g przez 4 h w rotorze z koszykami wahadłowymi.
      1. Odzyskać górny brązowy prążek za pomocą strzykawki, rozcieńczyć próbkę 1:5 za pomocą DP i przejść do następnego kroku.
    7. Wirować liposomy FCP w co najmniej 2 mL 1x buforu do dializy przez 1,5 h przy 100 000 x g i 4 °C. Odzyskać liposomy, przechylając probówkę wirówki pod kątem 45°. Pozostawić liposomy, aby opadły w dół przez 1 min (Rysunek 3A).
    8. Odzyskać liposomy FCP w końcowej objętości 25-50 µL. Unikać zburzenia osadu.
  3. Kontrole 1: absorbancja, spektroskopia fluorescencyjna
    1. Dodać aalikwot 3 µL liposomów FCP do końcowej objętości 1 mL 1x buforu do dializy i wirować przez 5 min przy 12 000 x g.
      1. Zarejestrować absorbancję liposomów FCP w zakresie od 370 do 750 nm przy użyciu tej samej aparatury, która została opisana w punkcie 1.2.4. Znormalizować widmo do maksimum w obszarze Qy chl a (670-680 nm) i porównać je z znormalizowanym widmem solubilizowanego FCP (Rysunek 3C).
    2. Przygotować liposomy FCP w 1 mL DP z absorbancją (ABS) = 0,03 w odniesieniu do maksimum między 670-680 nm. Dostosować solubilizowane FCP w detergencie z kroku 1.2.6 do tej samej wartości ABS, rozcieńczając buforem B1a.
    3. Zarejestrować widma absorbancji obu próbek zgodnie z opisem w punkcie 1.2.4. Zarejestrować widmo emisji fluorescencji chl a obu próbek zgodnie z opisem w punkcie 1.3.3.
      Uwaga: Wydajność fluorescencji jest zmniejszona w próbce liposomów FCP (Rysunek 3D oraz por. dyskusja).

Schemat agregacji liposomów oraz wykresy absorbancji i fluorescencji FCP w detergencie/liposomie.
Rycina 3: Izolacja proteoliposomów FCP, a następnie kontrole spektroskopowe i obrazowanie konfokalne. (A) Odzysk liposomów FCP po wirowaniu. Przechylenie probówki do wirowania pod kątem 45° i odczekanie około 1 min – liposomy opadną na dno, podczas gdy agregaty FCP, które nie zostały wbudowane w liposomy, pozostaną przy ściankach probówki. (B) Porównanie widm absorbancji rozpuszczonego FCP w detergencie (kolor niebieski) i FCP w liposomach (kolor pomarańczowy). (C) Te same widma co w (B), znormalizowane do maksimum chl a w obszarze czerwonym (~670 nm – szczyt Qy); rozpuszczony FCP w detergencie (kolor niebieski) i FCP w liposomach (kolor pomarańczowy). Potencjalnie może wystąpić utrata pigmentów, głównie karotenoidów, widoczna w zakresie 500-550 nm. Agregacja FCP w liposomach może prowadzić do poszerzenia piku i lekkiego przesunięcia maksimum chl a (~670 nm) w stronę czerwieni. (D) Widma emisji rozpuszczonego FCP w detergencie oraz FCP w liposomie. Agregacja FCP w liposomie nasila oddziaływania energetyczne kompleksów FCP, co obniża wydajność fluorescencji (krzywa pomarańczowa) i nieznacznie przesuwa maksima emisji w stronę czerwieni. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół opisuje izolację całkowitej frakcji FCP z Cyclotella meneghiniana oraz jej inkorporację do liposomów o natywnym składzie lipidowym. Izolacja tylakoidów jest wysoce powtarzalna, jednak wydajność uzyskiwania tylakoidów może ulec zmianie. Wynik jest akceptowalny, jeśli w kroku 1.1.4 odzyskano ponad 50% wszystkich pigmentów. Optymalny wynik to ponad 80%.

Solubilizacja tylakoidów jest krytycznym etapem. Dobrze solub...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Liposomy FCP o naturalnym składzie lipidowym stanowią poręczne, proste i powtarzalne narzędzie do badania właściwości spektroskopowych in vitro. Środowisko lipidowe w liposomach FCP przypomina sytuację w błonie tylakoidów, co prowadzi do uzyskania wyników eksperymentalnych bliższych warunkom naturalnym.

Istnieje kilka zalet stosowania C. meneghiniana jako systemu modelowego dla anteny FCP. Rośnie stosunkowo szybko i jest bardziej wytrzymały w porównaniu z innymi modelowymi ga...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Rana Adeel Ahmad za pomoc w oczyszczaniu FCP. Prof. Claudia Büchel jest wdzięczna za pomocne dyskusje i przeczytanie manuskryptu. Praca ta była wspierana przez Niemiecką Fundację Badawczą dla LD (DI1956-1/1) oraz Fundację Humboldta dla stypendium Feodor-Lynen dla LD.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
500 ml fiolki
wirówka szybkoobrotowaHeraeus
Bead Mill VI 2Edmund-Bü hler (edmund-buehler.de)nowsza wersja: Vibrogen-Zellmü hle Vl 6
Silibeads S 400 µ mSigmund-Lindner.com 5223-7
Kulki silikonowe S 1,-1,3 mmSigmund-Lindner.com4504
Lejek filtracyjny VitraPOR - por1ROBU GmbH21121
fiolki ultrawirówki z poliwęglanu (30 ml) do T-865Beranek Laborgerä te (Laborgeraete-beranek.de)314348
Ultrawirówka Discovery 90SESorvalln.a.rotor
T 865ThermoFisher Scientific (thermofisher.com)51411
Komora licznika komórek Neubauera (ulepszona)Carl Roth Laborbedarf (Carlroth.com)T729.1
Zeiss Mikroskop Primostar (7)Optik-Pro (optik-pro.de)51428
kuwety ze szkła optycznego (6040-OG)Hellma Analytics (hellma-analytics.com)"6040-10-10"
V-630 Spektrofotometr UV-VIS (z oprogramowaniem)Jasco (jasco.de)V-630
n-Dodecyl-β-D-MaltopyranosideANATRACE (anatrace.com)D310LA
Ultra-Clear probówki 17 ml do AH629Beranek Laborgerä te (Laborgeraete-beranek.de)344061
rotor AH629-17-mLThermoFisher Scientific (thermofisher.com)54285
Membrana concentrator_Centriprep 30 kDa odcięcieMilipore (merckmillipore.com)4307
Biometra Minigel-TwinAnalytik Jena AG (analytik-jena.de)846-010-100
Zestaw do barwienia srebraBio-Rad (bio-rad.com)
Arkusz kalkulacyjny 1610449 libre officePodstawa dokumentówhttps://de.libreoffice.org/download/libreoffice-still/
specjalne szklane kuwety do fluorescencji (101-0S)Hellma Analytics (hellma-analytics.com)101-10-20
Spektrofluorometr FP-6500 (z oprogramowaniem)Jasco (jasco.de)FP-6500
Bufor ładowania SDS Roti-LoadROTH (carlroth.com)K929.1
n-oktyl β-D-glukopiranozydANATRACE (anatrace.com)O311
Monogalaktozylodiaglicerol (MGDG)Larodan AB (larodan.com)59-1300przygotować roztwór podstawowy w chloroformie
Digalaktozylodiacyloglicerol (DGDG)Larodan AB (larodan.com)59-1310zrobić roztwór podstawowy w chloroformie
Sulphoquinovosyl Diacylglycerol (SQDG)Larodan AB (larodan.com)59-1230przygotować roztwór podstawowy w chloroformie
L-alfa-fosfatydyloglicerol (PG)Larodan AB (larodan.com)37-0150przygotować roztwór podstawowy w chloroformie
L-&alfa;-FosfatydylocholinaSigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)P3782 SIGMAprzygotować roztwór podstawowy w
kąpieli sonikatora chloroformu S-50THSonicor (getmedonline.comSONICOR-S-50TH
mini-ekstruderAvanti Polar Lipids (Avanti.com)610000
Membrana poliwęglanowa NuleoporeAvanti Polar Lipids (Avanti.com)610005
membrana dializowa Visking 14 kDa odcięcieROTH (carlroth.com)0653.1przed użyciem zagotować w wodzie destylowanej
Biobeads SM2 AdsorbentBiorad (Bio-rad.com)152-3920
kopolimer epichlorhydryny sacharozy - Ficoll 400Sigma-Aldrich (sigmaaldrich.com)F4375
Fiolki do ultrawirówek z poliwęglanu (2,7 mL) do TFT 80.4Beranek Laborgerä te (Laborgeraete-beranek.de)252150
rotor TFT 80.4Millipore (merckmillipore.com)54356
materiał wymieniony w kolejności występowania Szczegółowe instrukcje dotyczące bezpieczeństwa można znaleźć w kartach charakterystyki materiałów i instrukcjach dotyczących materiału.
Standardowe materiały laboratoryjne i substancje nie są wymienione.
wirówkowe

Bibliografia

  1. Eberhard, S., Finazzi, G., Wollman, F. A. The Dynamics of Photosynthesis. Annual Review of Genetics. 42, 463-515 (2008).
  2. Li, Z. R., Wakao, S., Fischer, B. B., Niyogi, K. K. Sensing and Responding to Excess Light. Annual Review of Plant Biology. 60, 239-260 (2009).
  3. Niyogi, K. K., Truong, T. B. Evolution of flexible non-photochemical quenching mechanisms that regulate light harvesting in oxygenic photosynthesis. Current Opinion in Plant Biology. 16 (3), 307-314 (2013).
  4. Li, X. -P., et al. A pigment-binding protein essential for regulation of photosynthetic light harvesting. Nature. 403 (6768), 391-395 (2000).
  5. Peers, G., et al. An ancient light-harvesting protein is critical for the regulation of algal photosynthesis. Nature. 462 (7272), 518-521 (2009).
  6. Correa-Galvis, V., et al. Photosystem II Subunit PsbS Is Involved in the Induction of LHCSR Protein-dependent Energy Dissipation in Chlamydomonas reinhardtii. The Journal of biological chemistry. 291 (33), 17478-17487 (2016).
  7. Bailleul, B., et al. An atypical member of the light-harvesting complex stress-related protein family modulates diatom responses to light. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18214-18219 (2010).
  8. Taddei, L., et al. Multisignal control of expression of the LHCX protein family in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum. Journal of experimental botany. 67 (13), 3939-3951 (2016).
  9. Lepetit, B., et al. The diatom Phaeodactylum tricornutum adjusts nonphotochemical fluorescence quenching capacity in response to dynamic light via fine-tuned Lhcx and xanthophyll cycle pigment synthesis. New Phytologist. 214 (1), 205-218 (2017).
  10. Büchel, C. Evolution and function of light harvesting proteins. Journal of Plant Physiology. 172, 62-75 (2015).
  11. Lavaud, J., Rousseau, B., van Gorkom, H. J., Etienne, A. -L. Influence of the Diadinoxanthin Pool Size on Photoprotection in the Marine Planktonic Diatom Phaeodactylum tricornutum. Plant Physiology. 129 (3), 1398-1406 (2002).
  12. Ruban, A., et al. The super-excess energy dissipation in diatom algae: comparative analysis with higher plants. Photosynthesis Research. 82 (2), 165-175 (2004).
  13. Mann, D. G. The species concept in diatoms. Phycologia. 38 (6), 437-495 (1999).
  14. Papagiannakis, E., van Stokkum, I. H. M., Fey, H., Büchel, C., van Grondelle, R. Spectroscopic Characterization of the Excitation Energy Transfer in the Fucoxanthin-Chlorophyll Protein of Diatoms. Photosynthesis Research. 86 (1-2), 241-250 (2005).
  15. Premvardhan, L., Robert, B., Beer, A., Büchel, C. Pigment organization in fucoxanthin chlorophyll a/c2 proteins (FCP) based on resonance Raman spectroscgopy and sequence analysis. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1797 (9), 1647-1656 (2010).
  16. Gildenhoff, N., Herz, J., Gundermann, K., Büchel, C., Wachtveitl, J. The excitation energy transfer in the trimeric fucoxanthin-chlorophyll protein from Cyclotella meneghiniana analyzed by polarized transient absorption spectroscopy. Chemical Physics. 373 (1), 104-109 (2010).
  17. Ramanan, C., et al. Exploring the mechanism(s) of energy dissipation in the light harvesting complex of the photosynthetic algae Cyclotella meneghiniana. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (9), 1507-1513 (2014).
  18. Haferkamp, S., Kirchhoff, H. Significance of molecular crowding in grana membranes of higher plants for light harvesting by photosystem II. Photosynthesis Research. 95 (2-3), 129-134 (2008).
  19. Wahadoszamen, M., et al. Stark fluorescence spectroscopy reveals two emitting sites in the dissipative state of FCP antennas. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (1), 193-200 (2014).
  20. Zhou, F., et al. Effect of monogalactosyldiacylglycerol on the interaction between photosystem II core complex and its antenna complexes in liposomes of thylakoid lipids. Photosynthesis Research. 99 (3), 185-193 (2009).
  21. Moya, I., Silvestri, M., Vallon, O., Cinque, G., Bassi, R. Time-resolved fluorescence analysis of the photosystem II antenna proteins in detergent micelles and liposomes. Biochemistry. 40 (42), 12552-12561 (2001).
  22. Natali, A., et al. Light-harvesting Complexes (LHCs) Cluster Spontaneously in Membrane Environment Leading to Shortening of Their Excited State Lifetimes. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16730-16739 (2016).
  23. Gundermann, K., Büchel, C. Factors determining the fluorescence yield of fucoxanthin-chlorophyll complexes (FCP) involved in non-photochemical quenching in diatoms. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1817 (7), 1044-1052 (2012).
  24. Ahmad, R. A., Dietzel, L. Relaxation of cellular K+ gradients by valinomycin induces diatoxanthin accumulation in Cyclotella meneghiniana cells and alters FCPa fluorescence yield in vitro. Physiologia Plantarum. , 171-180 (2017).
  25. Provasoli, L., McLaughlin, J. J. A., Droop, M. R. The development of artificial media for marine algae. Archiv für Mikrobiologie. 25 (4), 392-428 (1957).
  26. Jeffrey, S., Humphrey, G. New spectrophotometry equations for determining chlorophyll a, chlorophyll b, chlorophyll c-1 and chlorophyll c-2 in higher plants, algae and natural phytoplankton. Biochemie und Physiologie der Pflanzen. 167, 191-194 (1975).
  27. Beer, A., Gundermann, K., Beckmann, J., Büchel, C. Subunit Composition and Pigmentation of Fucoxanthin−Chlorophyll Proteins in Diatoms: Evidence for a Subunit Involved in Diadinoxanthin and Diatoxanthin Binding. Biochemistry. 45 (43), 13046-13053 (2006).
  28. Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Analytical Biochemistry. 166 (2), 368-379 (1987).
  29. Büchel, C. Fucoxanthin-Chlorophyll Proteins in Diatoms: 18 and 19 kDa Subunits Assemble into Different Oligomeric States. Biochemistry. 42 (44), 13027-13034 (2003).
  30. Vieler, A., Wilhelm, C., Goss, R., Süß, R., Schiller, J. The lipid composition of the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii and the diatom Cyclotella meneghiniana investigated by MALDI-TOF MS and TLC. Chemistry and Physics of Lipids. 150 (2), 143-155 (2007).
  31. Gundermann, K., Büchel, C. The fluorescence yield of the trimeric fucoxanthin-chlorophyll-protein FCPa in the diatom Cyclotella meneghiniana is dependent on the amount of bound diatoxanthin. Photosynthesis Research. 95 (2-3), 229-235 (2008).
  32. Miloslavina, Y., et al. Ultrafast fluorescence study on the location and mechanism of non-photochemical quenching in diatoms. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1787 (10), 1189-1197 (2009).
  33. Grouneva, I., Jakob, T., Wilhelm, C., Goss, R. The regulation of xanthophyll cycle activity and of non-photochemical fluorescence quenching by two alternative electron flows in the diatoms Phaeodactylum tricornutum and Cyclotella meneghiniana. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1787 (7), 929-938 (2009).
  34. Chukhutsina, V. U., Büchel, C., van Amerongen, H. Disentangling two non-photochemical quenching processes in Cyclotella meneghiniana by spectrally-resolved picosecond fluorescence at 77 K. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1837 (6), 899-907 (2014).
  35. Ghazaryan, A., Akhtar, P., Garab, G., Lambrev, P. H., Büchel, C. Involvement of the Lhcx protein Fcp6 of the diatom Cyclotella meneghiniana in the macro-organisation and structural flexibility of thylakoid membranes. Biochimica Et Biophysica Acta-Bioenergetics. 1857 (9), 1373-1379 (2016).
  36. Darley, W. M. Biochemical composition. The biology of diatoms. 13, 198-223 (1977).
  37. Milsman, M. H. W., Schwendner, R. A., Weder, H. G. Preparation of large single bilayer liposomes by a fast and controlled dialysis. Biochimica Et Biophysica Acta. 512 (1), 147-155 (1978).
  38. Zumbuehl, O., Weder, H. G. Liposomes of controllable size in the range of 40 to 180 nm by defined dialysis of lipid-detergent-mixed micelles. Biochimica Et Biophysica Acta. 640 (1), 252-262 (1981).
  39. Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps. Scientific Reports. 2 (306), (2012).
  40. Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nature Protocols. 1 (4), 1852-1858 (2006).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja FCPprzygotowanie liposom wwirowanie w gradiencie sacharozysolubilizacja dodecylomaltosydemmetoda ekstruzji lipid winkorporacja FCPgradient jon w potasu
Izolowanie i włączanie anten zbierających światło z okrzemki Cyclotella Meneghiniana w liposomach z lipidami tylakoidowymi
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.