Badanie inkorporacji rybonukleotydów: wykrywanie rybonukleotydów specyficznych dla nici w genomie drożdży i pomiar mutagenezy indukowanej rybonukleotydami

Podsumowanie

Rybonukleotydy są jednymi z najliczniejszych niekanonicznych nukleotydów włączonych do genomu podczas replikacji eukariotycznego jądrowego DNA. Jeśli rybonukleotydy nie zostaną prawidłowo usunięte, mogą powodować uszkodzenie DNA i mutagenezę. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia eksperymentalne, które są stosowane do oceny obfitości inkorporacji rybonukleotydów w DNA i ich skutków mutagennych.

Streszczenie

Wykazano, że obecność rybonukleotydów w jądrowym DNA jest źródłem niestabilności genomu. Stopień włączenia rybonukleotydów można ocenić za pomocą hydrolizy alkalicznej i elektroforezy żelowej, ponieważ RNA jest bardzo podatne na hydrolizę w warunkach zasadowych. To, w połączeniu z analizą Southern blot, może być wykorzystane do określenia lokalizacji i nici, do której zostały włączone rybonukleotydy. Jednak ta procedura jest tylko częściowo ilościowa i może nie być wystarczająco czuła, aby wykryć niewielkie zmiany w zawartości rybonukleotydów, chociaż sondowanie Southern blot specyficzne dla nici poprawia czułość. Jako miara jednej z najbardziej uderzających konsekwencji biologicznych rybonukleotydów w DNA, mutageneza spontaniczna może być analizowana za pomocą testu mutacji do przodu. Za pomocą odpowiednich genów reporterowych można wybrać rzadkie mutacje, które powodują utratę funkcji, a ogólne i specyficzne wskaźniki mutacji można zmierzyć, łącząc dane z eksperymentów fluktuacyjnych z sekwencjonowaniem DNA genu reporterowego. Test fluktuacji ma zastosowanie do badania szerokiej gamy procesów mutagennych w określonym tle genetycznym lub warunkach wzrostu.

Wprowadzenie

Podczas replikacji eukariotycznego jądrowego DNA, rybonukleotydy są włączane do genomu przez wszystkie trzy główne repliki DNA, polimerazy DNA (Pols) α, ε, oraz δ^1,2. Naprawa przez wycięcie rybonukleotydu zależna od RNazy H2 (RER³) usuwa większość tych osadzonych rybonukleotydów.

Rybonukleotyd w DNA jest podatny na hydrolizę, ponieważ grupa hydroksylowa 2' ugrupowania cukrowego może atakować sąsiednie wiązanie fosfodiestrowe, uwalniając jeden koniec z cyklicznym fosforanem 2'-3', a drugi z 5'-OH⁴. Warunki alkaliczne mogą znacznie przyspieszyć tę reakcję. Tak więc hydroliza rybonukleotydów osadzonych podczas inkubacji w roztworze zasadowym powoduje fragmentację genomowego DNA, którą można uwidocznić za pomocą elektroforezy alkaliczno-agarozowej⁵. To DNA można przenieść do błony i sondować za pomocą analizy Southern blot przy użyciu sond specyficznych dla nici, które umożliwiają identyfikację miejsc wrażliwych na alkalia spowodowanych przez rybonukleotydy włączone odpowiednio do powstającego DNA o nici wiodącej lub opóźnionej.

W komórkach drożdży pozbawionych aktywności RNazy H2 usuwanie rybonukleotydów może być zainicjowane, gdy topoizomeraza I (Top1) nacina DNA w osadzonym rybonukleotydzie^6,7. Jednakże, gdy Top1 rozszczepia się po stronie 3' rybonukleotydu, generuje to 5'-OH i 2'-3' cykliczne końce fosforanowego DNA, które są oporne na religację. Brak naprawy lub nieprawidłowe przetwarzanie tych "brudnych końców" może prowadzić do niestabilności genomu. Ponadto, jeśli nacięcie nastąpi w obrębie powtarzającej się sekwencji DNA, proces naprawy może prowadzić do mutacji delecyjnych. Jest to szczególnie problematyczne w przypadku powtórzeń tandemowych, w których często obserwuje się krótkie delecje (od dwóch do pięciu par zasad) w komórkach z niedoborem RNazy H2. Szkodliwe efekty zależne od Top1 przy braku aktywności drożdżowej RNazy H2 nasilają się w zmutowanej polimerazie DNA ε (pol2-M644G) skłonnej do włączania rybonukleotydów podczas powstającej syntezy nici wiodącej.

Przetwarzanie rybonukleotydów w DNA prowadzi do spontanicznych mutacji, a ta mutageneza może być wykryta za pomocą odpowiednich genów reporterowych i selekcji pod kątem towarzyszącej zmiany fenotypowej. Test fluktuacji lub eksperyment Lurii i Delbrücka jest jedną z najczęściej stosowanych metod pomiaru wskaźników spontanicznych mutacji przy użyciu wybieralnych genów reporterowych^8,9. U drożdży geny URA3 i CAN1 mogą być wykorzystywane jako reportery w teście mutacji do przodu, co pozwala na wykrycie wszystkich typów mutacji, które powodują utratę funkcji genu. Częstość spontanicznych mutacji szacuje się jako medianę obserwowaną dla wielu równoległych kultur, które rozpoczęły się od pojedynczych kolonii bez mutacji w docelowym genie reporterowym. Szczep drożdży z niedoborem RNazy H2, taki jak rnh201Δ, ma umiarkowanie podwyższony ogólny wskaźnik spontanicznych mutacji, który jest w dużej mierze spowodowany zwiększoną częstością występowania delecji 2 - 5 pz w sekwencjach powtórzeń tandemowych. W związku z tym, aby w pełni scharakteryzować mutagenne działanie rybonukleotydów w genomie, należy określić konkretne tempo mutacji. W takim przypadku geny reporterowe URA3 lub CAN1 mogą być amplifikowane i sekwencjonowane w celu określenia typów i lokalizacji mutacji, a także można obliczyć określone wskaźniki mutacji. Kompilacja mutacji zidentyfikowanych w wielu niezależnych mutantach URA3 lub CAN1 może być następnie wykorzystana do wygenerowania spektrum mutacji.

Protokół

1. Hydroliza alkaliczna i Southern Blot specyficzna dla nici (Rysunek 1)

1. Wzrost komórek i izolacja genomowego DNA
   1. Wyizoluj genomowe DNA drożdży za pomocą zestawu do oczyszczania DNA drożdży zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj kultur, które znajdują się w wykładniczej fazie wzrostu (od gęstości optycznej od 0,5 do 1). Zawiesić końcowe osady DNA w 35 ml 1x buforu TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)).
   2. Dodać 1 ml 5 mg/ml RNazy A do DNA i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
   3. Wytrącić DNA za pomocą 0,1 objętości 3 M octanu sodu (pH 5,2) i 2,5 objętości 100% etanolu przez 20 minut na lodzie.
   4. Wirować przy 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant za pomocą pipety.
   5. Umyj granulat dwukrotnie 500 ml 70% etanolu. Usunąć supernatant za pomocą pipety.
   6. Wysuszyć osad na ławce i ponownie zawiesić w 35 ml 1x bufor TE.
   7. Określ ilościowo DNA za pomocą fluorymetru (tabela materiałów) z zestawem do oznaczania dsDNA BR
   .
   8. Wytrącić 5 mg DNA z każdej próbki, używając 0,1 objętości 3 M octanu sodu o pH 5,2 i 2,5 objętości 100% EtOH dla całkowitej objętości 200 ml (dodać_H2O, jeśli to konieczne, dodatkowe 5 mg DNA jest potrzebne, jeśli konieczna jest kontrola neutralnego żelu). Inkubować na lodzie przez 20 minut.
   9. Wirować przy 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant za pomocą pipety.
   10. Wysuszyć pellet na ławce. Zawiesić DNA w 14 ml_H2O.
2. Hydroliza alkaliczna i elektroforeza żelowa
   1. Dodać 6 ml 1 M KOH i inkubować w temperaturze 55 °C przez 2 godziny.
   2. Próbki należy inkubować na lodzie przez 5 minut.
   3. Dodaj 4 ml 6x alkalicznego buforu ładującego DNA: 300 mM KOH, 6 mM EDTA, pH 8,0, 18% polisacharozy (tabela materiałów), 0,15% zieleni bromokrezolowej i 0,25% cyjanolu ksylenu FF.
   4. Odlej żel alkaliczny, który składa się z 1% agarozy, 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8,0. Użyj grzebienia, który pozwala na załadowanie 24 ml próbki DNA na pas
   .
   5. Uruchom żel w temperaturze pokojowej w 1x alkaliczny bufor do elektroforezy: 50 mM NaOH, 1 mM EDTA, pH 8,0. Dołącz odpowiedni marker wielkości DNA.
   6. Krótko odkręć probówki i załaduj całą próbkę o objętości 24 ml do alkalicznego żelu agarozowego. Elektroforeza przez 30 minut przy 30 V, a następnie 18 - 20 h przy 10 V.
   7. Neutralizować żel przez 2 inkubacje po 45 minut każda w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem w buforze neutralizacyjnym I: 1 M Tris-HCl, 1,5 M NaCl.
   8. Wybarwić DNA, mocząc zobojętniony żel w 200 ml wody zawierającej rozcieńczenie 1/10 000 barwnika SYBR Gold przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z delikatnym wstrząsaniem.
   9. Wizualizacja DNA za pomocą transiluminatora UV. Zwiększona wrażliwość na alkalia powoduje pojawienie się mniejszych fragmentów DNA, co wskazuje na większą gęstość nienaprawionych rybonukleotydów w DNA⁵.
3. Przelew południowy
   1. Przenieś DNA z żelu alkalicznego do dodatnio naładowanej membrany nylonowej za pomocą działania kapilarnego¹⁰. Przykład tego, jak można skonfigurować ten transfer, znajduje się w podręczniku Sambrooka i Russella class¹⁰.
   2. Moczyć żel alkaliczny przez 15 minut w temperaturze pokojowej w alkalicznym buforze transferowym: 0,4 M NaOH, 1 M NaCl.
   3. Membranę nylonową (przyciętą do rozmiaru żelu) zwilżyć krótko wodą, a następnie moczyć przez 5 minut w alkalicznym buforze transferowym.
   4. Ustaw platformę transferową, odwracając 3 szklane zlewki (100 ml) w szklanym naczyniu do pieczenia. To danie powinno być nieco większe niż rozmiar żelu agarozowego. Postaw na nich szklany talerz.
   5. Na szklanej płytce ułożyć 2 duże kawałki bibuły chromatograficznej CHR o grubości 3 mm (przycięte do rozmiaru szerokości żelu plus dłuższe boki, które mogą zwisać po krawędziach do zbiornika buforowego).
   6. Wlej alkaliczny bufor transferowy na bibułę chromatograficzną i napełnij szklane naczynie do połowy. Wygładź bąbelki za pomocą szklanej pipety o pojemności 5 ml.
   7. Na wierzch nałóż żel agarozowy, ponownie wygładzając bąbelki. Otocz wszystkie krawędzie żelu parafilmem. Wlej niewielką ilość Alkaline Transfer Buffer na żel.
   8. Umieść wstępnie nasączoną nylonową membranę na wierzchu żelu. Wygładź bąbelki.
   9. Zwilż 2 kawałki papieru pocięte na rozmiar żelu agarozowego. Umieść je na membranie i wygładź wszelkie pęcherzyki.
   10. Ułóż duży stos ręczników papierowych (przyciętych do rozmiaru nieco większego niż żel agarozowy) na wierzchu kanapki z transferem. Ostrożnie umieść szklany talerz na ręcznikach papierowych. Na wierzch dodaj obciążony przedmiot (dobrze sprawdza się książka o masie 400 g).
   11. Pozostaw transfer na noc w temperaturze pokojowej.
   12. Ostrożnie rozebrać stos transferowy i moczyć membranę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w buforze neutralizacyjnym II: 0,5 M Tris-HCl, pH 7,2, 1 M NaCl.
   13. Sieciuj DNA z naładowaną membraną nylonową za pomocą środka sieciującego UV. Umieść membranę w urządzeniu sieciującym i użyj ustawienia automatycznego sieciowania.
4. Przygotowanie sondy południowej
   Uwaga: Opisane tutaj podejście do wykrywania miejsc wrażliwych na alkalia w powstającej nici wiodącej i opóźnionej nici DNA opiera się na protokole opublikowanym wcześniej¹¹. W naszym eksperymencie sondowanie przeprowadza się na genie reporterowym URA3, który został wstawiony w jednej z dwóch orientacji (OR1 lub OR2) sąsiadujących z początkiem replikacji ARS306 na chromosomie III (Figura 3A). Obecność miejsc wrażliwych na zasady w genomowym DNA drożdży jest wskaźnikiem inkorporacji rybonukleotydów, co pozwala na wykorzystanie rybonukleotydów jako biomarkerów aktywności polimerazy DNA^12,13,14. To podejście, wykorzystujące docelową sekwencję DNA sąsiadującą z wydajnym początkiem replikacji ARS306, powinno być również podatne na inne lokalizacje genomowe i geny docelowe.
   1. Amplifikacja PCR 520-parowego segmentu genu reporterowego URA3 przy użyciu następującej pary starterów: URA3-F1 (5'-GCTACATATAAGGAACGTGCTGC) i URA3-R1 (5'-CTTTGTCGCTCTTCGCAATGTC).
   2. Przeprowadzić reakcję PCR używając 10 - 20 ng genomowego DNA drożdży jako matrycy, 4 μL każdego startera (10 μM zapasu), 10 μL 10x buforu Ex Taq (Mg²⁺ plus), 8 μL mieszaniny dNTP (2,5 mM każdy), 0,5 μL polimerazy DNA Ex Taq (5 U/μL), i dostosować końcową objętość do 100 μl za pomocą_H2O.
   3. Uruchom następujący program PCR: 95 °C przez 5 min; 30 cykli po 95 °C przez 1 min, 55 °C przez 1 min, 72 °C przez 2 min; 72 °C przez 10 min i utrzymuj w temperaturze 4 °C.
   4. Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR i eluuj DNA za pomocą 50 ml_H2O. Można go teraz wykorzystać jako matrycę w reakcji znakowania radioaktywnego.
   5. Użyj następujących starterów do znakowania radioaktywnego specyficznego dla nici: Użyj URA3-A (5'-CTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCC) do wizualizacji DNA, które wyżarza się w celu sondowania A. Odpowiada to powstającej wiodącej nici DNA, gdy URA3 znajduje się w OR2 i powstającemu opóźnionemu DNA nici, gdy URA3 jest w OR1. Użyj URA3-B (5'-CAGTACCCTTAGTATATTCTCCAG) do wizualizacji powstającego DNA, które wyżarza się do sondy B. Odpowiada to powstającej wiodącej nici DNA, gdy URA3 znajduje się w OR1 i powstającemu opóźnionemu DNA nici, gdy URA3 jest w OR2 (Rysunek 3).
      1. Przeprowadzić reakcję znakowania radioaktywnego przy użyciu 10 - 20 ng amplifikowanego fragmentu URA3 jako matrycy DNA, 2 μL startera (10 μM zapasu), 5 μL 10x buforu Ex Taq (Mg²⁺ plus), 4 μL 2,5 mM dNTP (minus dCTP), 5 μL (50 μCi) a-32 P-dCTP, 0,5 μL polimerazy DNA ExTaq (5 U/μL) i dostosować końcową objętość do 50 μL za pomocą H₂O. Uruchomić następujący program do znakowania radioizotopowego: 94 °C przez 5 min; 25 cykli w temperaturze 94 °C przez 1 min, 55 °C przez 30 s, 72 °C przez 1 min; 72 °C przez 5 minut i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
   6. Użyj kolumny wirującej G-25, aby usunąć niewbudowaną radioaktywną etykietę. Przed dodaniem próbki znakowanej izotopem promieniotwórczym należy odwirować kolumnę przez 1 minutę przy 720 x g i usunąć bufor przez pipetowanie. Załadować znakowany radioaktywnie produkt reakcji i odwirować przez 2 minuty przy 720 x g, aby wymyć znakowaną sondę.
   7. Inkubować w temperaturze 95 °C przez 5 minut w celu denaturacji sondy bezpośrednio przed hybrydyzacją. Ostudzić krótko na lodzie.
5. Hybrydyzacja południowa
   1. Zwiń zwilżoną membranę do probówki hybrydyzacyjnej i dodaj 25 ml świeżo przygotowanego buforu hybrydyzacyjnego: 0,5 M buforu fosforanu sodu, pH 7,2, 7% dodecylosiarczanu sodu (SDS), 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Inkubować w temperaturze 65 °C przez 1-2 godziny z rotacją w piecu do hybrydyzacji.
   2. Ostrożnie wylać roztwór i dodać 25 ml buforu hybrydyzacyjnego oraz sondę znakowaną radioizotopem. Inkubować w temperaturze 65 °C przez 16 - 18 godzin na zmianach.
   3. Roztwór przelać do pojemnika na odpady radioaktywne. Wykonaj 5 płukań po 5 minut każde w temperaturze pokojowej roztworem myjącym Phosphate-SDS I: 40 mM bufor fosforanowo-sodowy, pH 7,2, 5% SDS, 0,5% BSA, 1 mM EDTA, pH 8,0.
   4. Wykonać 2 płukania po 15 minut każde w temperaturze 65 °C roztworem myjącym Phosphate-SDS II: 40 mM bufor fosforanowo-sodowy, pH 7,2, 1% SDS, 1 mM EDTA, pH 8,0.
   5. Usuń membranę z probówki hybrydyzacyjnej za pomocą pęsety i umieść w otwartej plastikowej osłonie rękawa. Przykryj i wystaw na płytce obrazowej. Wypróbuj kilka różnych czasów naświetlania, od 4 godzin do 4 dni.
   6. W razie potrzeby usuń i ponownie wysonduj blot za pomocą innej sondy około 3 - 4 razy. Aby usunąć izolację, inkubować błonę przez 2 godziny w temperaturze 65 °C w 25 ml 50% formamidu, 2x roztwór SSPE.
      Uwaga: 20x roztwór podstawowy SSPE: 3 M NaCl, 0,2 M NaH₂PO₄, 0,02 M EDTA, pH 7,4.
   7. Roztwór przelać do pojemnika na odpady radioaktywne. Wykonać 2 płukania po 15 minut każde w temperaturze 65 °C w roztworze myjącym Phosphate-SDS II.
   8. Sprawdź membranę za pomocą licznika Geigera i powtórz protokół usuwania, jeśli sygnał pozostał.
   9. Przeprowadź wstępną hybrydyzację i hybrydyzację zgodnie z powyższym opisem.

2. Pomiar częstości mutacji i swoistości w szczepach S. cerevisiae

1. Przygotuj kulturę komórkową
   1. Zaszczepić pojedynczą kolonię (zdrowe komórki drożdży potrzebują 2 - 3 dni w temperaturze 30 °C, aby utworzyć kolonie o odpowiedniej wielkości) wyhodowaną na agarze YPD uzupełnionym 100 mg / ml adeniny do 5 ml bulionu YPDA uzupełnionego 250 mg / ml adeniny (suplementacja adeniny jest konieczna tylko wtedy, gdy użyty szczep jest auksotrofem adeniny). Hodować w inkubatorze z wytrząsarką lub na rotatorze w temperaturze 30 °C, aż kultura osiągnie nasycenie (36 - 48 godzin w przypadku odmiany bez poważnych wad wzrostu).
   2. Wiruj komórki w temperaturze ~2000 x g przez 5 minut.
   3. Odrzucić supernatant i przemyć komórki 5 ml sterylnej wody.
   4. Ponownie zawiesić komórki w 500 ml sterylnej wody.
2. Rozcieńczanie hodowli komórkowej i posiewanie
   1. W przypadku kontroli bez selekcji należy rozcieńczyć komórki na 96-dołkowej płytce przez współczynnik 1 600 000 i rozlać 100 ml każdej kultury na kompletną płytkę (COM).
   2. Aby dokonać selekcji mutantów ura3, należy umieścić 100 ml nierozcieńczonych komórek na płytce 5-FOA dla szczepu typu dzikiego (WT). Odpowiednio rozcieńczyć komórki, jeśli oczekuje się, że szybkość mutacji interesującego nas szczepu będzie wyższa niż w szczepie WT.
   3. Aby wybrać mutanty can1, rozcieńczyć komórki 5-krotnie i umieścić 100 ml na płytce zawierającej kanawaninę (CAN) dla szczepu WT. Współczynnik rozcieńczenia wynosi 0,5.
   4. Inkubować płytki w temperaturze 30 °C, aż utworzą się kolonie drożdży. W przypadku odmian bez wady wzrostu zwykle wystarczają 2-3 dni w przypadku płytek COM i CAN oraz 3-5 dni w przypadku płytek 5-FOA. Aby porównać tempo mutacji między różnymi szczepami, najlepiej wybrać ten sam dzień wzrostu, aby policzyć kolonie. Płytki gotowe do policzenia przechowywać w chłodni (~4 °C).
3. Obliczanie współczynnika spontanicznych mutacji
   1. Policz widoczne kolonie na każdej tabliczce i zanotuj numery kolonii
   2. Oblicz szybkość mutacji za pomocą wzoru Drake'a: μ = f ÷ ln (μNt). f jest częstością mutacji obliczoną na podstawie liczby mutantów podzielonej przez liczbę komórek w końcowej hodowli. Nt to liczba komórek w końcowej hodowli, a μ to szybkość mutacji. Równanie to można rozwiązać za pomocą metody iteracyjnej, takiej jak metoda Newtona-Raphsona. Istnieją inne metody estymatora, w tym test Lea i Coulsona, do obliczania współczynnika mutacji¹⁵.
   3. Obliczyć przedział ufności przy założeniu logarytmicznego rozkładu normalnego szybkości użycia poszczególnych izolatów. Najczęściej stosuje się 95% przedział ufności.
4. Analiza spektrum mutacji
   1. Wybierz pojedynczą kolonię z każdej płytki 5-FOA lub CAN i odśwież na talerzu YPDA.
   2. Przeprowadzić PCR kolonii w celu amplifikacji genu i sekwencji URA3 lub CAN1 w celu wykrycia mutacji przy użyciu następujących starterów: URA3-F (5'-CGCATATGTGTGTTGAAGAA-3') i URA3-R (5'-TGTGAGTTTAGTATACATGCA-3') zarówno do amplifikacji PCR, jak i sekwencjonowania genu URA3 o długości 800 pz; CAN1-F (5'-CTTCTACTCCGTCTGCTTTC-3') i CAN1-R (5'-CAGAGTTCTCTAGACTTC-3') do amplifikacji oraz CAN1-AR (5'- TGAAATGTGAAGGCAGCGTT-3'), CAN1-9R (5'- CCTGCAACACCAGTGATA-3'), CAN1-10R (5'- GAGGATGTAACAGGGATGAAT-3') i CAN1-BR (5'-CGGTGTATGACTTATGAGGG-3') do sekwencjonowania genu reporterowego CAN1 1800 pz.
   3. Aby przeprowadzić PCR kolonii, ponownie zawieś pojedynczą kolonię w 5 μl_H2Oi użyj 1 μl jako matrycy. Dodać 1 μl każdego ze starterów (5 μM zapasu), 2 μL 5x buforu KAPA2G (Mg²⁺ plus), 0,5 μl dNTP (2,5 mM), 0,5 μL szybkiej polimerazy DNA KAPA2G, 12 μL_H2O.
   4. W celu amplifikacji genu URA3 uruchom następujący program PCR: 95 °C przez 5 minut; 5 cykli 95 °C przez 10 s, 61 °C przez 15 s, 72 °C przez 30 s; 35 cykli 95 °C przez 10 s, 61 °C przez 15 s, 72 °C przez 30 s; 72 °C przez 2 minuty i utrzymuj w temperaturze 4 °C. W celu amplifikacji genu CAN1 uruchom następujący program PCR: 95 °C przez 5 min; 5 cykli w temperaturze 95 °C przez 10 s, 61 °C przez 15 s, 72 °C przez 45 s; 35 cykli w temperaturze 95 °C przez 10 s, 61 °C przez 15 s, 72 °C przez 45 s; 72 °C przez 2 minuty i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
   5. Dopasuj wyniki sekwencjonowania do sekwencji referencyjnej za pomocą programu, takiego jak DNASTAR, Seqman Pro lub Sequencher w celu identyfikacji mutacji.
   6. Skompiluj dane dotyczące mutacji według typu mutacji (Rysunek 4) lub lokalizacji mutacji ( Rysunek 5). Obliczyć określone wskaźniki mutacji przez częstość mutacji (liczba zaobserwowanych zdarzeń podzielona przez liczbę zsekwencjonowanych mutantów) pomnożoną przez ogólny wskaźnik mutacji.

Wyniki

Traktowanie genomowego DNA alkaliami, a następnie elektroforeza w żelu alkalicznym pozwala na półilościowe wykrycie fragmentacji DNA ze względu na obfitość stabilnie włączonych rybonukleotydów. Rysunek 2 przedstawia obrazy genomowego DNA drożdży w żelu poddanego działaniu KOH⁵. Wariant M644L Pol2, katalityczna podjednostka Polε, zmniejszył zdolność do włączania rybonukleotydów, podczas gdy mutant M644G zawiera więcej rybonukleotydó...

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy protokoły dla dwóch zestawów eksperymentów, które są często używane do półilościowej analizy rybonukleotydów włączonych podczas replikacji DNA oraz mutagennego działania nienaprawionych rybonukleotydów. Chociaż podejścia te obejmują modelowego eukarionta S. cerevisiae, techniki te można łatwo dostosować do innych drobnoustrojów, a nawet wyższych eukariontów.

Sondowanie w poszukiwaniu nienaprawionych rybonukleotydów w DNA za pomocą elektroforezy alkaliczno-agaro...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pożywka			20 g dekstrozy, 20 g peptonu, 10 g ekstraktu drożdżowego, w dejonizowanym H2O do 1 l, dodać 20 g agaru Bacto do pożywek stałych, autoklaw.
Płytki			1,3 g SC dropout mix, 1,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów lub (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dekstrozy, 20 g Bacto agar dejonizowany H2O do 1 L. Dostosuj pH do 5,8. Autoklaw i 30 – 35 ml na talerz.
Płytki CAN			lub (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dekstrozy, 20 g agaru Bacto, 25 mg uracylu i H2O do 1 L. Autoklaw przez 15 minut w temperaturze 121 ° C i schłodzić do 56 stopni C. Dodać 6 ml sterylizowanego przez filtr 1% roztworu siarczanu kanawaniny.
5 płytek			1,3 g proszku SC-Ura, 1,7 g drożdżowej zasady azotowej bez aminokwasów lub (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g dekstrozy, 20 g agaru Bacto, 25 mg uracylu i H2O do 800 ml. Autoklaw przez 15 minut w temperaturze 121 stopni; C i schłodzić do 60 stopni C. Dodać 200 ml wysterylizowanego przez filtr 0,5% roztworu 5-FOA.
Siarczan L-kanawaniny	US Biological	C1050
5-FOA	US Biological	F5050
20 ml szklana probówka			hodowlana Dowolna marka
Rotator kultur w 30 & stopniach; Inkubator			tego można użyć inkubatora z wytrząsarką
96 dołków			Okrągłe płytki denne Sterylne, dowolnej marki
Koraliki szklane 3 mm	Autoklaw Fisher Scientific	11-312A	przed użyciem
Pipety			Dowolna marka
Ex Taq DNA Polimeraza	TaKaRa	RR001
Epicentre MasterPure Drożdże DNA Zestaw do oczyszczania	Epicenter	MPY80200
3 M octan sodu	Sigma-Aldrich	S7899
100% etanol
Qubit 2.0 Fluorometr	Invitrogen	Q32866	Dostępny nowszy model
Zestaw do oznaczania dsDNA BR	Invitrogen	Q32850
KOH	Sigma-Aldrich	221473
EDTA	Sigma-Aldrich	E7889
Ficoll 400	Dot Scientific Inc.
Zieleń bromokrezolowa	Eastman	6356
Cyjanol ksylenu FF	International Technologies Inc.	72120
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045
1 M Tris-HCl (pH 8,0)	Teknova	T5080
SYBR Gold Żel kwasu nukleinowego Bejca	Invitrogen	S11494
Transformator
Membrana nylonowa Amersham Hybond-N+	GE Healthcare	RPN303B
3 MM CHR Bibuła chromotograficzna	Whatman	3030-392
NaCl	Caledon	7560-1
Stratalinker 1800	Stratagene
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR Kolumna wirująca	Qiagen	28106
G-25	GE Healthcare	27-5325-01
1 M Bufor fosforanowy sodu (pH 7,2)	Sigma-Aldrich	NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390)
SDS	Sigma-Aldrich	L4522
BSA	Sigma-Aldrich	A3059
Formamid	Sigma-Aldrich	47671
			Geigera