Wykorzystanie mysich splenocytów do oceny wpływu wzorca molekularnego związanego z patogenem na ekspresję genów zegarowych

Podsumowanie

Ten protokół opisuje technikę wykorzystującą mysie splenocyty do odkrywania wzorców molekularnych związanych z patogenami, które zmieniają ekspresję genów zegara molekularnego.

Streszczenie

Od zachowania po ekspresję genów, rytmy okołodobowe regulują prawie wszystkie aspekty fizjologii. W tym miejscu przedstawiamy metodologię badania mysich splenocytów za pomocą wzorców molekularnych związanych z patogenami (PAMP), lipopolisacharydów (LPS), ODN1826 i zabitych termicznie Listeria monocytogenes oraz badamy ich wpływ na molekularny zegar okołodobowy. Wcześniej badania koncentrowały się na badaniu wpływu LPS na zegar molekularny przy użyciu różnych podejść in vivo i ex vivo z różnych modeli (np. myszy, szczura i człowieka). Protokół ten opisuje izolację i prowokację splenocytów, a także metodologię oceny ekspresji genów zegarowych po prowokacji za pomocą ilościowego PCR. Podejście to można wykorzystać do oceny nie tylko wpływu składników mikrobiologicznych na zegar molekularny, ale także innych cząsteczek, które mogą zmieniać ekspresję zegara. Podejście to może być wykorzystane do zbadania molekularnego mechanizmu interakcji receptora podobnego do PAMP-Toll wpływa na ekspresję zegara.

Wprowadzenie

Główny zegar u ssaków, który zarządza 24-godzinnymi oscylacjami dla prawie wszystkich aspektów fizjologii i zachowania, znajduje się w jądrze nadskrzyżowaniowym (SCN) podwzgórza1^,2. Oprócz regulowania procesów biologicznych na poziomie organizmu, zegar główny synchronizuje również obwodowe zegary komórkowe w całym ciele^3,4,5. Podczas gdy maszyneria zegara molekularnego składa się z co najmniej trzech zazębiających się pętli transkrypcyjno-translacyjnych sprzężenia zwrotnego, rdzeń składa się z genów okresu (Per1-3), kryptochromu (Cry1-2), Bmal1 i zegara^6,7. Oprócz utrzymania dokładnego taktowania rdzeniowego zegara molekularnego, niektóre pomocnicze produkty genów zegara (np. Rev-erbα i Dbp) regulują również ekspresję genów niezegarowych, tj. genów kontrolowanych zegarem (CCG)^6,7.

Funkcjonalne zegary molekularne zostały opisane w różnych tkankach immunologicznych (np. śledzionie i węzłach chłonnych)⁸ i komórkach (np. limfocytach B, komórkach dendrytycznych, makrofagach)^8,9. Komórki te wykrywają i reagują na wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP), konserwatywne składniki mikrobiologiczne, za pośrednictwem wrodzonych receptorów rozpoznawania immunologicznego, takich jak receptory Toll-podobne (TLR)¹⁰. Do tej pory opisano 13 funkcjonalnych TLR, które rozpoznają składniki mikrobiologiczne, takie jak składniki ściany komórkowej bakterii, białko wiciowe i mikrobiologiczne kwasy nukleinowe¹⁰. Wykazano, że PAMP, lipopolisacharyd (LPS), składnik ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych rozpoznawany przez TLR4, zmienia rytmy okołodobowe zarówno na poziomie organizmu, jak i molekularnym. Na przykład, prowokacja in vivo LPS indukowała opóźnienia fazowe podobne do fototycznych, mierzone aktywnością u myszy¹¹ i doprowadziły do zmniejszonej ekspresji genu zegara w SCN i wątrobie, jak określono odpowiednio przez hybrydyzację in situ i ilościowy PCR u szczurów¹². Po prowokacji in vivo z LPS, analiza ludzkich leukocytów krwi obwodowej¹³ i podskórnej tkanki tłuszczowej¹⁴ ujawniła zmienioną ekspresję kilku genów zegarowych, mierzoną za pomocą qPCR. Wreszcie, wyzwania ex vivo LPS dotyczące ludzkich makrofagów i mysich makrofagów otrzewnowych również doprowadziły do zmienionej ekspresji zegara, mierzonej za pomocą qPCR¹⁴.

Tutaj opisujemy protokół do oceny wpływu PAMPs LPS, ODN1826 (syntetycznych oligonukleotydów zawierających niemetylowane motywy CpG) i zabijanych termicznie Listeria monocytogenes (HKLM), rozpoznawanych odpowiednio przez TLR4, TLR9 i TLR2, na ekspresję genu zegara molekularnego w mysich splenocytach. Protokół obejmuje splenektomię myszy, izolację i prowokację splenocytów, ekstrakcję RNA, syntezę cDNA i qPCR w celu oceny ekspresji kilku genów zegarowych. Protokół ten pozwala na szybkie pozyskanie dużej liczby komórek odpornościowych przy bardzo niewielkiej manipulacji zwierzęcej lub komórkowej, które następnie można poddać próbie ex vivo za pomocą różnych PAMP. Wykazano, że zegar molekularny moduluje różne aspekty odpowiedzi immunologicznej^8,15,16, dlatego zakłócenie zegara molekularnego najprawdopodobniej zakłóciłoby prawidłową zależną od czasu zmienność odpowiedzi immunologicznej. Ponadto, ponieważ zakłócenia rytmu okołodobowego mogą prowadzić do poważnych patologii^17,18,19,20, może być interesujące dla badaczy, aby rzucić wyzwanie splenocytom za pomocą szerokiej gamy cząsteczek i ocenić ich wpływ na zegar.

Protokół

Podczas badania, opieka nad zwierzętami i leczenie były zgodne z polityką National Institutes of Health, były zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi i zostały zatwierdzone przez University of Hartford Animal Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Porywanie zwierząt

UWAGA: W badaniu wykorzystano dwudziestotygodniowe samce myszy B6129SF2/J.

1. Porwać myszy do 12-godzinnego cyklu światła (standardowe białe światło nad głową)/12-godzinnego cyklu ciemności przez 2 tygodnie przed eksperymentem.
   UWAGA: Tutaj czas zeitgeber (ZT) 0 odpowiada włączonym światłom, a ZT12 wyłączonym światłom, przy jednoczesnym utrzymaniu wszystkich innych czynników środowiskowych (tj. żywności, wody i temperatury pokojowej) na stałym poziomie ²¹.

2. Przygotowanie instrumentów, pożywki hodowlanej i pożywki prowokacyjnej

1. Kleszcze do autoklawu i nożyczki preparacyjne. Owiń pary matowych szkiełek mikroskopowych folią aluminiową i autoklawem.
2. Przygotować pożywkę hodowlaną, dodając płodową surowicę bydlęcą (FBS) do RPMI 1640 do końcowego stężenia 10%. Przygotować 10 ml pożywki prowokacyjnej w probówkach o pojemności 50 ml, dodając następujące PAMP do pożywki hodowlanej (RPMI z 10% FBS); LPS (5 μg/ml), ODN1826 (5 μg/ml), Listeria monocytogenes (10,⁸ HKLM/ml) lub inny PAMP w sugerowanym stężeniu.
3. Ogrzać pożywkę hodowlaną i pożywkę prowokacyjną do temperatury 37 °C w łaźni wodnej i przechowywać około 70 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,2) w temperaturze pokojowej.
4. Dodać 10 ml pożywki hodowlanej za pomocą pipety 10 ml i przystawki do pipetowania do probówki o pojemności 50 ml i umieścić na lodzie.
5. Dodaj około 30 ml 70% etanolu do zlewki o pojemności 100 ml i umieść w niej końce nożyczek preparacyjnych i kleszczyków, aby zapobiec skażeniu mikrobiologicznemu.
6. Przygotować bufor do lizy do izolacji RNA, dodając 10 μl β-merkaptoetanolu (pod wyciągiem) do każdego 1 ml buforu RLT w probówce o pojemności 50 ml. Przygotuj tylko taką ilość, jaka będzie potrzebna (600 μl na próbkę, która składa się z około 1 x 10⁶ komórek).
   UWAGA: Buffer RLT jest składnikiem zestawu do ekstrakcji RNA, który wspomaga wiązanie RNA z membraną krzemionkową.

3. Izolacja i wyzwanie splenocytów

1. Poddaj myszy eutanazji w określonym czasie za pomocą narkozy, trzymając je w oryginalnej klatce i dodając CO₂ do klatki z natężeniem przepływu 3 l / min. Kontynuuj dostarczanie CO₂ przez 1 minutę po ustaniu oddychania.
2. Potwierdź zgon przez zwichnięcie szyjki macicy, umieszczając kciuk i palec wskazujący po obu stronach szyi u podstawy czaszki. Alternatywnie, naciśnij pręt u podstawy czaszki, jednocześnie szybko pociągając (drugą ręką) podstawę ogona lub kończyny tylne, aby spowodować oddzielenie kręgów szyjnych od czaszki²².
3. Spryskaj pień myszy 70% etanolem i wytrzyj ręcznikiem papierowym. Połóż mysz na plecach i lekko przechyl na prawą stronę. Odetnij futro za pomocą nożyczek preparacyjnych wzdłuż lewej strony myszy, mniej więcej w połowie odległości między przednimi i tylnymi nogami.
4. Za pomocą kleszczy chwyć otrzewną i ostrożnie wykonaj nacięcie, aby nie uszkodzić śledziony. Usuń śledzionę za pomocą kleszczy i umieść w sterylnej probówce o pojemności 50 ml zawierającej około 10 ml pożywki hodowlanej na lodzie. Powtórz dla pozostałych zwierząt.
   UWAGA: Śledziona ma kolor fasoli i jest dłuższa i bardziej płaska niż nerka.
5. Przenieść jedną śledzionę z 2 ml pożywki hodowlanej na małą sterylną szalkę Petriego.
   1. Homogenizuj śledzionę, mieląc ją między oszronioną częścią dwóch sterylnych matowych szkiełek. Jeśli to możliwe, trzymaj problem i komórki w pożywce podczas procesu homogenizacji.
   2. Po dokładnej homogenizacji odpipetować 2 ml pożywki hodowlanej zawierającej splenocyty przez sitko do komórek nylonowych o średnicy 40 μm do probówki o pojemności 50 ml.
   3. Powtórz powyższe kroki dla pozostałych śledzion, używając nowych par szkiełek matowych, probówek o pojemności 50 ml z pożywką hodowlaną i sitek komórkowych.
6. Dodać 8 ml zimnej pożywki hodowlanej do każdej z 50 ml probówek zawierających splenocyty, aby uzyskać całkowitą objętość 10 ml / probówkę. Określ liczbę komórek na mililitr za pomocą hemocytometru.
7. Dodaj około 1 x 10⁶ komórek/dołka do 6-dołkowych płytek hodowlanych. Dodaj komórki do liczby studzienek, które odpowiadają liczbie różnych PAMP używanych w eksperymencie i dołącz studzienkę kontrolną. Dodać 3 ml pożywki hodowlanej lub 3 ml pożywki prowokacyjnej do odpowiednich studzienek.
8. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez 3 godziny.
9. Zeskrob komórki z dna studzienki za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 000 μl dołączonej do mikropipety P1000. Przenieść pożywkę zawierającą komórki za pomocą tej samej końcówki pipety o pojemności 1 000 μl do probówki o pojemności 15 ml.
10. Granulować komórki przez odwirowanie w stężeniu 167 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i przemyć osad komórkowy 5 ml PBS.
11. Osadzać komórki po raz drugi w temperaturze 167 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i dodać 600 μl buforu do lizy komórek w celu lizy komórek. Następnie przejdź do izolacji RNA.

4. Izolacja RNA i synteza cDNA

1. Wyizoluj RNA ze splenocytów za pomocą zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcjami producenta i przeprowadź "opcjonalne" trawienie DNA na kolumnie.
2. Przed syntezą cDNA należy określić stężenie RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego, aby sprawdzić, czy stężenie mieści się w optymalnym zakresie RNA (do 2 μg) zestawu do syntezy cDNA.
3. Zsyntetyzuj cDNA dla każdej z próbek za pomocą zestawu do odwrotnej transkrypcji zgodnie z instrukcjami producenta. Użyć 10 μl RNA dla każdej z próbek w całkowitej objętości reakcyjnej 20 μl. Po zakończeniu odwrotnej transkrypcji (przebieg termocyklera) dodać 20 μl _H2Odo każdej reakcji.
4. Skonstruuj standardowe zakrzywienie za pomocą mikropipety P10 lub P20, aby zebrać mRNA z kilku próbek kontrolnych (np. 5 μl z 2 próbek, co daje łącznie 10 μl) w probówce o pojemności 0,5 ml w celu przygotowania cDNA.
   1. Dodać 10 μL 2x główna mieszanka odwrotnej transkryptazy.
   2. Po zakończeniu odwrotnej transkrypcji dodać 10 μl_H2Odo probówki reakcyjnej, która posłuży jako stężenie początkowe ("1") w szeregu rozcieńczeń dla krzywej wzorcowej.
   3. Wykonać 10-krotną serię rozcieńczeń (1 do ^10-4), dodając 45 μl wody za pomocą mikropipety P100 lub P200 do czterech probówek o pojemności 0,5 ml oznaczonych jako ^10-1, ^10-2, ^10-3 i ^10-4.
      1. Dodać 5 μl początkowego stężenia "1" do pierwszej probówki (^10-1) za pomocą mikropipetatora P20, wymieszać przez kilkakrotne pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenieść 5 μl z probówki ^10-1 do probówki oznaczonej jako ^10-2 i wymieszać.
      2. Przenieść 5 μl za pomocą mikropipety P20 z probówki ^10-2 do probówki oznaczonej ^10-3 i wymieszać. Przenieść 5 μl za pomocą mikropipety P20 z probówki ^10-3 do probówki oznaczonej ^10-4 i wymieszać.

5. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (qPCR)

1. Określ względną ilościowość poziomów mRNA metodą qPCR. W konfiguracji eksperymentalnej wybierz "Kwantyfikacja - Względna krzywa standardowa" i "TaqMan" chemia. Zmienić objętość reakcji na 10 μl. Wprowadzić odpowiednie informacje do układu płytki (np. gen docelowy, krzywa wzorcowa, reporter itp.).
2. Przygotować reakcję tak, aby zawierała 0,5 μl testu starter/sonda, 5 μl głównej mieszanki ekspresji genów, 2 μl_H2Oi 2,5 μl cDNA (10–100 ng).
   1. Przygotuj mieszaninę wzorcową, mnożąc każdy z poprzednich odczynników (z wyjątkiem cDNA) przez liczbę reakcji, upewniając się, że uwzględniono te z krzywej wzorcowej, kontrole ujemne, przeprowadzając każdą reakcję w dwóch egzemplarzach i 2 dodatkowe reakcje, które będą uwzględniać zmienność pipetowania.
   2. Odpipetować 7,5 μl przygotowanej mieszanki wzorcowej do wcześniej ustalonych studzienek na 96-dołkowej płytce reakcyjnej za pomocą mikropipety lub pipety wielokanałowej. Odpipetować 2,5 μl cDNA do odpowiedniej studzienki dla niewiadomych i wzorców, a 2,5 μl_H2Odo studzienek kontroli ujemnej.
   3. Uwzględnij testy starterów/sond dla różnych genów zegara molekularnego, a także uwzględnij test dla kontroli endogennej (np. β-aktyny).
3. W celu określenia względnych wartości ekspresji należy obliczyć średnią ilość względną dla każdej kontrpróby, a następnie dla każdej próbki podzielić średnią ilość względną dla genu docelowego przez średnią ilość względną dla β-aktyny.

6. Analiza statystyczna

1. Za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej wprowadź dane do programu w ramach opcji statystyki kolumnowej. Wybierz jednoczynnikową ANOVA z testem post hoc Dunnetta, aby ocenić różnice między średnimi wartościami ekspresji genów zegarowych po prowokacji PAMP w porównaniu z kontrolą.

Wyniki

Myszy zostały złożone w ofierze w ZT13, splenocyty zostały wyizolowane i poddane ex vivo próbie PAMPs LPS, ODN1826 lub HKLM. Po 3 godzinach RNA wyizolowano, a qPCR użyto do oceny względnych poziomów ekspresji genów zegara molekularnego Clock, Per2, Dbp i Rev-erbα w porównaniu z niekwestionowanymi komórkami kontrolnymi. Po prowokacji PAMP poziomy ekspresji zegara nie różniły się znacząco od ekspresji w komórkach kontrolnych (

Dyskusja

W ramach tego protokołu spektrofotometr mikroobjętościowy może być używany do ilościowego określania i oceny czystości RNA używanego do określania ekspresji genów. Kwasy nukleinowe absorbują światło UV przy 260 nm, białka zazwyczaj pochłaniają światło przy 280 nm, podczas gdy inne potencjalne zanieczyszczenia używane podczas procedury ekstrakcji RNA (np. fenol) są wykrywalne przy 230 nm. W związku z tym, oceniając stosunek absorbancji (A) przy 260/280 nm (RNA do białka) i 260/230 nm (RNA do zanieczyszczeń niebia...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełka matowe	Fisher	12-550-343
Sitka do komórek	Fisher	22363547
Lipopolisacharyd	InvivoGen	ltrl-eklps
ODN1826	InvivoGen	Tlrl-1826-1
HKLM	InvivoGen	Tlrl-hklm
RPMI 1640	Gibco	11875-093
PBS	Gibco	20012-043
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104 lub 74106
Zestaw DNaz bez RNaz	Qiagen	79254
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowej	Denville	T1006
Probówki 50 ml	Corning	352070
Probówki 15 ml	Corning	352097
Zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemności	ThermoFisher	4368814
TaqMan Testy ekspresji genów B-aktyna	ThermoFisher	Mm00607939_s1
Testy ekspresji genów TaqMan Per2	ThermoFisher	Mm00478113_m1
TaqMan Testy ekspresji genów Rev-erba	ThermoFisher	Mm00520708_m1
TaqMan Testy ekspresji genów Bmal1	ThermoFisher	Mm00500226_m1
TaqMan Testy ekspresji genów Dbp	ThermoFisher	Mm00497539_m1
qPCR Maszyna StepOnePlus	ThermoFisher
TaqMan Gene Expression Master Mix	ThermoFisher	4369016
MicroAmp Fast 96-dołkowa płytka reakcyjna (0,1 ml)	Oprogramowanie	4346907
	Prism 7.0a