Method Article

Wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4C-seq)

DOI:

10.3791/58030

⸱

October 5th, 2018

 ,  , 
1Division of Dermatology, Center for Pharmacogenomics, Center for the Study of Itch, Department of Medicine, Washington University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja fizycznych interakcji między genami a elementami regulatorowymi jest trudna, ale została ułatwiona dzięki metodom wychwytywania konformacji chromosomów. Ta modyfikacja protokołu 4C-seq łagodzi stronniczość PCR, minimalizując nadmierną amplifikację matryc PCR i maksymalizując mapowalność odczytów poprzez włączenie etapu trawienia enzymu ograniczającego dodawanie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja elementów regulatorowych dla danego genu docelowego stanowi poważne wyzwanie techniczne ze względu na zmienność w umiejscowieniu i rozmiarach efektów elementów regulatorowych dla genu docelowego. Poczyniono pewne postępy w bioinformatycznym przewidywaniu istnienia i funkcji proksymalnych modyfikacji epigenetycznych związanych z aktywowaną ekspresją genów przy użyciu konserwatywnych miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego. Badania nad wychwytywaniem konformacji chromatyny zrewolucjonizowały naszą zdolność do odkrywania fizycznych kontaktów chromatyny między sekwencjami, a nawet w obrębie całego genomu. Wychwytywanie konformacji chromatyny kołowej w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji (sekwencjonowanie 4C) ma na celu odkrycie wszystkich możliwych interakcji fizycznych chromatyny dla danej sekwencji (punktu widzenia), takiej jak gen docelowy lub wzmacniacz regulatorowy. Obecne strategie sekwencyjne 4C sekwencjonują bezpośrednio z punktu widzenia, ale wymagają jednoczesnego sekwencjonowania wielu i różnorodnych punktów widzenia, aby uniknąć wyzwań technicznych związanych z jednolitym wywoływaniem bazy (obrazowaniem) za pomocą platform sekwencjonowania nowej generacji. Taka ilość eksperymentów może nie być praktyczna dla wielu laboratoriów. W tym miejscu przedstawiamy zmodyfikowane podejście do protokołu 4C-seq, które obejmuje zarówno dodatkowe trawienie enzymu restrykcyjnego, jak i etapy amplifikacji oparte na qPCR, które mają na celu ułatwienie lepszego przechwytywania różnych odczytów sekwencji i złagodzenie potencjalnego błędu PCR. Nasza zmodyfikowana metoda 4C jest zgodna ze standardowym laboratorium biologii molekularnej do oceny architektury chromatyny.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identyfikacja elementów regulatorowych dla ekspresji genów została ułatwiona dzięki projektowi Encyklopedia Elementów DNA (ENCODE), który kompleksowo opisywał aktywność funkcjonalną dla 80% ludzkiego genomu1,2. Identyfikacja miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych in vivo, nadwrażliwości na DNazę I oraz epigenetycznych modyfikacji histonów i metylacji DNA w poszczególnych typach komórek utorowała drogę do analiz funkcjonalnych potencjalnych elementów regulatorowych do ekspresji genów docelowych. Uzbrojeni w te odkrycia, stoimy przed wyzwaniem określenia funkcjonalnych wzajemnych powiązań między elementami regulatorowymi a genami. W szczególności, jaki jest związek między danym genem docelowym a jego wzmacniaczem (wzmacniaczami)? Metoda wychwytywania konformacji chromatyny (3C) bezpośrednio odpowiada na to pytanie, identyfikując fizyczne i prawdopodobnie funkcjonalne interakcje między regionem zainteresowania a potencjalnymi sekwencjami oddziałującymi poprzez przechwycone zdarzenia w utrwalonej chromatynie3. Jednak wraz ze wzrostem naszej wiedzy na temat interakcji chromatyny jasne jest, że badanie wstępnie wybranych loci kandydujących jest niewystarczające, aby zapewnić pełne zrozumienie interakcji gen-wzmacniacz. Na przykład w ramach projektu ENCODE wykorzystano wysokoprzepustową metodę wychwytywania konformacji chromosomowej (5C) w celu zbadania niewielkiej części ludzkiego genomu (1%, pilotażowego zestawu 44 loci) i opisano złożone wzajemne powiązania loci. Geny i wzmacniacze ze zidentyfikowanymi interakcjami miały średnio 2–4 różnych oddziałujących partnerów, z których wielu znajdowało się setki kilozasad dalej w przestrzeni liniowej4. Ponadto Li i wsp. wykorzystał analizę interakcji chromatyny za pomocą sekwencjonowania znaczników na sparowanym końcu (ChIA-PET) do analizy interakcji promotora całego genomu i stwierdził, że 65% miejsc wiązania polimerazy II RNA było zaangażowanych w interakcje chromatyny. Niektóre z tych interakcji skutkowały dużymi, wielogenowymi kompleksami obejmującymi setki kilozasad odległości genomowej i zawierającymi średnio 8-9 genów każdy5. Łącznie odkrycia te podkreślają potrzebę bezstronnych metod badania całego genomu do badania interakcji chromatyny. Niektóre z tych metod zostały omówione w Schmitt i wsp. 6.

Nowsze metody badania konformacji chromatyny w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji (Hi-C i 4C-seq) umożliwiają odkrycie nieznanych sekwencji oddziałujących z interesującym regionem6. W szczególności opracowano wychwytywanie konformacji chromosomów kołowych za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (sekwencjonowanie 4C) w celu identyfikacji loci oddziałujących z sekwencją będącą przedmiotem zainteresowania w sposób bezstronny7 poprzez sekwencjonowanie DNA z przechwyconej chromatyny proksymalnie do obszaru zainteresowania w przestrzeni 3D. Krótko mówiąc, chromatyna jest utrwalana w celu zachowania natywnych interakcji białko-DNA, rozszczepiana enzymem restrykcyjnym, a następnie ligowana w rozcieńczonych warunkach, aby uchwycić biologicznie istotne "splotu" oddziałujących loci (Figura 1). Wiązania krzyżowe są odwracane w celu usunięcia białka, pozostawiając w ten sposób DNA dostępne do dodatkowego rozszczepienia za pomocą drugiego enzymu restrykcyjnego. Końcowa ligacja generuje mniejsze kręgi oddziałujących ze sobą loci. Startery do interesującej nas sekwencji są następnie wykorzystywane do generowania amplifikowanej biblioteki nieznanych sekwencji z cyklicznych fragmentów, a następnie sekwencjonowania nowej generacji.

Przedstawiony tutaj protokół, który skupia się na przygotowaniu próbki, wprowadza dwie główne zmiany do istniejących metod sekwencyjnych 4C8,9,10,11,12. Po pierwsze, wykorzystuje metodę opartą na qPCR do empirycznego określenia optymalnej liczby cykli amplifikacji dla etapów przygotowania biblioteki sekwencyjnej 4C, a tym samym łagodzi potencjalne odchylenie PCR wynikające z nadmiernej amplifikacji bibliotek. Po drugie, wykorzystuje dodatkowy etap skrótu ograniczeń w celu zmniejszenia jednorodności znanych sekwencji "przynęty", co utrudnia dokładne wywołanie bazy przez instrument sekwencjonujący, a tym samym maksymalizuje unikalną, informacyjną sekwencję w każdym odczycie. Inne protokoły omijają ten problem, łącząc wiele (12-15)8 bibliotek 4C-seq z różnymi sekwencjami przynęty i/lub miejscami ograniczeń, co jest liczbą eksperymentów, które mogą być nieosiągalne dla innych laboratoriów. Przedstawione tutaj modyfikacje pozwalają na indeksację i zebranie niewielkiej liczby eksperymentów, próbek i/lub powtórzeń w jednym tonie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Selekcja enzymów restrykcyjnych

  1. Zidentyfikuj obszar zainteresowania (np. promotor genu, polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP), wzmacniacz) i uzyskaj sekwencję DNA z repozytoriów, takich jak National Center for Biotechnology Information (NCBI).
  2. Zidentyfikuj potencjalne enzymy restrykcyjne (RE) do pierwszego trawienia enzymem restrykcyjnym (RE1), które nie przecinają się w sekwencji będącej przedmiotem zainteresowania, które wytwarzają lepkie końce (końce DNA z nawisami) po trawieniu RE i których aktywność nie jest hamowana przez metylację CpG.
    Uwaga: Rozdzielczość danych jest określana przez RE1. Enzym z sekwencją rozpoznającą 6 par zasad (bp) wytwarza średnio fragmenty o długości około 4 kilozasad (kb), podczas gdy enzym z sekwencją rozpoznawania 4 pz wytwarza fragmenty o długości około 250 pz, co pozwala na bardziej precyzyjną identyfikację oddziałujących sekwencji.
  3. Wybierz RE1 z enzymów kandydujących zidentyfikowanych w kroku 1.2, który wytwarza fragment restrykcyjny "punktu widzenia" o długości co najmniej 500 pz, który obejmuje obszar zainteresowania lub, alternatywnie, sąsiedni region.
    UWAGA: Wybrany enzym musi być podatny na projektowanie starterów (patrz Krok 2).
  4. W przypadku drugiego trawienia zidentyfikuj enzym restrykcyjny (RE2) z sekwencją rozpoznającą 4 pz, który wytwarza lepkie końce (końce DNA z nawisami) po trawieniu RE, którego aktywność nie jest hamowana przez metylację CpG, i który przecina fragment restrykcyjny generowany przez RE1, tworząc fragment przynęty o długości 250–500 pz (Rysunek 1).
    UWAGA: Wybrany enzym musi być podatny na projektowanie starterów (patrz Krok 2).

2. Projektowanie i testowanie starterów dla odwróconego PCR i wydajności trawienia qPCR

  1. Użyj narzędzia do projektowania podkładu, takiego jak Primer3 (http://primer3.ut.ee), aby zaprojektować odwrócone startery, które są skierowane na zewnątrz w kierunku końców fragmentu przynęty (tj. starter 5' jest "odwróconym" starterem, uzupełniającym pasmo dodatnie, podczas gdy starter 3' jest starterem "do przodu", uzupełniającym nić ujemną) i jak najbliżej miejsc ograniczenia, aby zminimalizować wzmocnienie nieinformacyjnej sekwencji przynęty i zmaksymalizować Skuteczność PCR (Rysunek 2A).
    UWAGA: Należy przewidzieć, że startery będą miały minimalną niespecyficzną amplifikację z genomowego DNA za pomocą przewidywań in silico PCR i nie powinny być wyrównane w innym miejscu genomu, z wyjątkiem ich zamierzonego celu o tożsamości większej niż 16/189. Ponieważ adaptery sekwencjonowania nie są wbudowane w startery odwróconego PCR, miejsce wiązania startera jest bardziej elastyczne niż w innych metodach przygotowania 4C; Podkłady powinny optymalnie wyżarzać się w odległości 50 pz od końca odpowiedniego miejsca ograniczenia.
    1. Potwierdź specyficzność starterów odwróconego PCR przez amplifikację przy użyciu oczyszczonego genomowego DNA (gDNA) jako matrycy.
    2. Optymalne startery powinny dawać niewiele produktów przy użyciu gDNA jako matrycy (patrz Krok 11.2 w celu zapoznania się z opisem oczekiwanych produktów 4C). Jeśli dojdzie do znacznej amplifikacji z gDNA, zaprojektuj nowe startery. Jeśli nie zostaną zidentyfikowane żadne akceptowalne zestawy starterów, wróć do kroku 1 i wybierz nową przynętę, wybierając nowe enzymy restrykcyjne.
  2. Zaprojektuj startery qPCR do amplifikacji fragmentów o długości 70–200 nukleotydów (nt) w celu monitorowania wydajności trawienia restrykcyjnego (Rysunek 2B).
    1. Zaprojektuj jedną parę starterów do amplifikacji w każdym miejscu ograniczenia (wybranym w kroku 1), które definiują sekwencję przynęty. Zaprojektuj podkłady zarówno dla miejsc RE1 (patrz Krok 6.5.6), jak i RE2 (patrz Krok 9.2).
    2. Zaprojektuj zestaw starterów, który amplifikuje region niezawierający miejsc dla żadnego z enzymów restrykcyjnych jako kontrolę normalizacji (nieprzecięte DNA) dla RE1 i RE2 (patrz również Krok 6.5.6).

3. Zbiór komórek

  1. Stosując metodę odpowiednią dla hodowli tkankowej lub komórkowej, uzyskać zawiesinę jednokomórkową. Osadzać komórki przez 5 minut przy 200 x g, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 500 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na 10-7 komórek.

4. Sieciowanie komórek formaldehydem w celu zachowania interakcji chromatyny

  1. Na 107 komórek dodać 9,5 ml formaldehydu klasy 1% do mikroskopii elektronowej (EM) (bez metanolu) w PBS i inkubować, bębnując na kołysce (lub podobnej), przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT, 18–22 °C).
    UWAGA: Może być konieczne zoptymalizowanie warunków fiksacji dla każdego typu ogniwa. Wcześniejsze opublikowane prace na komórkach myszy wykazały, że optymalna fiksacja powoduje, że co najmniej 40% zmapowanych odczytów jest wyrównanych z chromosomem zawierającym viewpoint9, zakładając region nietelomerowy dla chromosomu średniej wielkości.
  2. Przenieść probówki reakcyjne do lodu i dodać lodowato zimną 1 M glicyny do końcowego stężenia 0,125 M (1,425 ml) w celu wygaszenia reakcji sieciowania. Wymieszaj przez delikatne odwrócenie.
  3. Wirować przez 5 minut w temperaturze 200 x g, 4 °C i ostrożnie usunąć cały sklarowany sklarowany stan. Przechowywać osad komórkowy w temperaturze -80 °C lub natychmiast przystąpić do lizy komórek.

5. Liza komórek

  1. Zawiesić osad komórkowy z kroku 4.3 w 500 μl 5 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do przemycia. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.
  2. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 125 μl 5 mM EDTA z 0,5% dodecylosiarczanem sodu (SDS) i 1x inhibitorami proteazy, takimi jak 100x koktajl zawierający 5 mg / ml leku przeciwbólowego, 10 mg / ml chymosatyny, 10 mg / ml leupeptyny i 10 mg / ml pepstatyny A.
    UWAGA: Może być konieczne zoptymalizowanie stężenia detergentu dla każdego typu ogniwa. Niewystarczające stężenie detergentu spowoduje niepełną lizę komórek, pozostawiając chromatynę niedostępną dla enzymów restrykcyjnych. Jeśli trawienie restrykcyjne jest stale niskie w kroku 6.5.6, a aktywność enzymu została potwierdzona, może być wymagany dodatkowy detergent. Zwiększ stężenie SDS w krokach co 0,1%.
  3. Inkubować zawiesinę komórkową na lodzie przez 10 min.
    UWAGA: W przypadku pierwotnych ludzkich keratynocytów optymalną lizę osiągnięto przy użyciu 10-minutowej inkubacji w temperaturze 65 °C, a następnie inkubacji w temperaturze 37 °C przez noc w wytrząsającym bloku grzewczym z mieszaniem (900 obr./min).
  4. Upewnij się, że liza komórek została zakończona.
    1. Wymieszać 6 μl komórek z 6 μl błękitu trypanowego na szkiełku podstawowym i przykryć szkiełkiem nakrywkowym. Widok pod mikroskopem.
      Uwaga: Po udanej lizie wnętrze komórek powinno być niebieskie, a niezlizowane komórki będą białe.
    2. Jeśli liza komórek okaże się niewystarczająca, należy otoczkować komórki w ilości 200 x g przez 5 minut i zachować supernatant. Zawiesić osad i powtórzyć kroki 5.2–5.4 i/lub alternatywnie z różnymi temperaturami inkubacji (patrz uwaga w kroku 5.3).
    3. Połączyć ponownie zlizowany osad z zapisanym supernatantem i kontynuować.
      Uwaga: Oględziny nie gwarantują wystarczającej lizy. Wydajność trawienia należy obiektywnie określić jak w kroku 6.5.6.

6. Trawienie pierwszego ograniczenia

  1. Dodać 30 μl 10-krotnego buforu enzymu restrykcyjnego (określonego przez producenta) i 27 μl 20% Triton X-100 (ostatnie 1,8%) do zawiesiny z kroku 5.4. Doprowadzić całkowitą objętość do 300 μl za pomocą H2O.
    UWAGA: Skład buforu enzymu restrykcyjnego będzie zależał od RE wybranego w kroku 1.
  2. Usunąć 15 μl porcji jako "niestrawioną kontrolę" i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Dodać 200 U RE1 do pozostałej mieszaniny reakcyjnej i inkubować przez noc w temperaturze odpowiedniej dla enzymu w wytrząsanym bloku grzewczym z mieszaniem (900 obr./min). Następnego dnia dodać dodatkowe 200 U RE1 i kontynuować inkubację przez noc.
  4. Usunąć 15 μl podwielokrotności jako "strawioną kontrolę" i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  5. Określ wydajność trawienia:
    1. Dodać 82,5 μl 10 mM Tris-HCl pH 7,5 do 15 μl próbek z kroków 6.2 i 6.4. Dodać 2,5 μl proteinazy K (20 mg/ml) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 65 °C.
    2. Dodać 100 μl chloroformu fenolowego i energicznie wymieszać przez odwrócenie, aby usunąć resztki zanieczyszczenia białkowego. Wirować przez 5 minut, 16 100 x g w temperaturze pokojowej.
    3. Przenieś fazę wodną do nowej probówki. Dodać 6,66 μl 3 M octanu sodu o pH 5,2, 1 μl glikogenu 20 mg/ml i 300 μl 100% etanolu (EtOH). Delikatnie wymieszać przez odwrócenie i umieścić w temperaturze -80 °C na 1 godzinę.
    4. Wirować przez 20 minut przy 16 100 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant, dodać 500 μl 70% EtOH i wirować przez 5 minut przy 16 100 x g w temperaturze pokojowej.
    5. Usunąć supernatant i suszyć osad w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Zawiesić osad w 50 μl H2O wolnym od nukleaz.
    6. Określ wydajność trawienia za pomocą qPCR13,14 przy użyciu metody ∆∆Ct. Użyj zestawu podkładów, który nie otacza miejsca ograniczenia (patrz krok 2.2.2) jako kontrolki normalizacji. Kontynuuj, jeśli wydajność trawienia wynosi >85%. W przeciwnym razie osadzać komórki i powtarzać kroki 5.2–6.5, pomijając inkubację w temperaturze 65 °C w kroku 5.3.

7. Pierwsza ligacja

  1. Enzym restrykcyjny należy dezaktywować termicznie przez inkubację trwającą 20 minut w temperaturze 65 °C. Alternatywnie, jeżeli enzym nie może być inaktywowany termicznie, próbkę wytrąca się ekstrakt fenolowo-chloroformowy i etanol.
    UWAGA: Wyższe temperatury inaktywacji zalecane dla niektórych enzymów restrykcyjnych denaturują białka w chromatynie, co może negatywnie wpłynąć na jakość próbki. Ponadto ekstrakcja fenolu:chloroform nie jest idealna, ponieważ powoduje utratę próbki.
  2. Przenieś do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodaj 6 ml wolnego od nukleazH2O, 700 μl 10x buforu ligazy (660 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM chlorku magnezu (MgCl2), 10 mM ditiotreitolu (DTT), 10 mM trifosforanu adenozyny (ATP)) i 50 U T4 Ligazy DNA. Delikatnie wymieszać przez wirowanie i inkubować przez noc w temperaturze 16 °C.
  3. Pobrać 100 μl podwielokrotności próbki jako "próbę kontrolną ligacji".
  4. Określ skuteczność podwiązania:
    1. Dodać 2,5 μl proteinazy K (20 mg/ml) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 65 °C.
    2. Dodać 100 μl chloroformu fenolowego i energicznie wymieszać przez odwrócenie. Wirować przez 5 minut, 16 100 x g w temperaturze pokojowej.
    3. Przenieś fazę wodną do nowej probówki. Dodać 6,66 μl 3 M octanu sodu o pH 5,2, 1 μl glikogenu i 300 μl 100% EtOH. Delikatnie wymieszać przez odwrócenie i umieścić w temperaturze -80 °C przez około 1 godzinę.
    4. Wirować przez 20 minut przy 16 100 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant, dodać 500 μl 70% EtOH i wirować przez 5 minut przy 16 100 x g w temperaturze 4 °C.
    5. Usunąć supernatant i wysuszyć osad w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad w 20 μl wody i obciążyć 0,6% żelem agarozowym obok "kontroli trawienia" z kroku 6.5.
      UWAGA: Dobrze podwiązana próbka powinna wyglądać jak stosunkowo ciasny pasek o dużej masie cząsteczkowej (Rysunek 3).
    6. Jeśli podwiązanie jest wystarczające, przejdź do kroku 8. W przeciwnym razie dodać świeże ATP (1 mM stężenie końcowe) i nową ligazę; inkubować przez noc w temperaturze 16 °C i powtórzyć kroki 7.3–7.4.

8. Odwrotne sieciowanie i izolacja chromatyny

  1. Dodać 15 μl proteinazy K (20 mg/ml) i inkubować przez noc w temperaturze 65 °C w celu odwrócenia wiązania krzyżowego.
  2. Dodać 30 μl RNazy A (10 mg/ml) i inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Dodać 7 ml chloroformu fenolowego i energicznie wymieszać przez odwrócenie. Wirować 15 min, 3 300 x g w temperaturze pokojowej.
  4. Przenieś fazę wodną do nowej probówki o pojemności 50 ml i dodaj 7,5 ml wolnego od nukleazH2O(w celu rozcieńczenia DTT obecnego w buforze ligazy, który w przeciwnym razie wytrąca się wraz z DNA), 1 ml 3 M octanu sodu o pH 5,6, 7 μl glikogenu (20 mg / ml) i 35 ml 100% EtOH. Wymieszać i inkubować w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę.
  5. Wirować przez 20 minut, 3.900 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant (osad może być słabo widoczny), przemyć osad 10 ml lodowatego 70% EtOH i odwirować 15 min, 3.300 x g w temperaturze 4 °C.
  6. Usunąć supernatant i krótko wysuszyć osad w temperaturze pokojowej (RT). Rozpuścić osad w 150 μl 10 mM Tris-HCl pH 7,5 w temperaturze 37 °C. Przechowywać w temperaturze -20 °C lub kontynuować w kroku 9.

9. Drugie ograniczenie trawienia: przycinanie kręgów

UWAGA: Ten krok tworzy mniejsze okręgi, aby zminimalizować nadreprezentację mniejszych przechwyconych fragmentów z powodu stronniczości PCR w dalszych etapach amplifikacji.

  1. Do próbki z kroku 8.6 dodać 50 μl 10-krotnego buforu enzymu restrykcyjnego (określonego przez producenta), 300 μl wolnego od nukleazH2Oi 50 U enzymu restrykcyjnego RE2. Inkubować przez noc w temperaturze odpowiedniej dla wybranego enzymu.
  2. Usunąć 15 μl podwielokrotności próbki jako "kontrolę mineralizacji". Określ wydajność trawienia zgodnie z opisem w kroku 6.5.

10. Druga ligacja i oczyszczanie DNA

  1. Dezaktywuj enzym restrykcyjny zgodnie z zaleceniami producenta. Jeśli enzym nie może być inaktywowany termicznie, usuń enzym za pomocą zestawu do oczyszczania opartego na kolumnie.
    UWAGA: Ponieważ powoduje to utratę próbki, oczyszczanie kolumny nie jest idealne.
  2. Przenieść próbkę do probówki o pojemności 50 ml i dodać 12,1 ml wolnego od nukleazH2O, 1,4 ml 10-krotnego buforu ligacyjnego (660 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2; 10 mM DTT; 10 mM ATP) i ligazę DNA 100 U T4. Inkubować przez noc w temperaturze 16 °C.
  3. Dodać 467 μl 3 M octanu sodu o pH 5,6, 233 μl H2O bez nukleaz, 7 μl glikogenu (20 mg/ml) i 35 ml 100% EtOH. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze -80 °C przez 1 godzinę.
  4. Wirować przez 45 minut, 3 900 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant, dodać 10 ml zimnego 70% EtOH i odwirować 15 minut, 3 300 x g w temperaturze 4 °C.
  5. Usunąć supernatant i krótko wysuszyć osad w temperaturze pokojowej. Dodać 150 μl 10 mM Tris-HCl pH 7,5 i inkubować w temperaturze 37 °C w celu rozpuszczenia osadu.
  6. Oczyść próbki za pomocą zestawu do oczyszczania PCR opartego na kolumnie krzemionkowej, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Użyj 1 kolumny na 3 x 106 komórek, w oparciu o początkową liczbę komórek. Eluować kolumny za pomocą 50 μl 10 mM Tris-HCl o pH 7,5 i połączyć próbki.
  7. Zmierzyć stężenie za pomocą fluorymetrii lub spektrofotometrii, stosując absorbancję przy długości fali 260 nm. Matryca 4C jest teraz gotowa do odwróconego PCR. Przechowywać w temperaturze -20 °C lub przejść bezpośrednio do kroku 11.

11. PCR Wzmacnianie nieznanych sekwencji oddziałujących metodą odwrotnego PCR

  1. Określ liniowy zakres amplifikacji, wykonując PCR przy użyciu rozcieńczeń matrycy 12,5, 25, 50 i 100 ng 4C. W razie potrzeby amplifikuj z gDNA równolegle, aby bezpośrednio porównać produkty w celu zidentyfikowania amplifikacji niespecyficznej. Przeprowadzić reakcje PCR z zastosowaniem początkowej denaturacji w temperaturze 94 °C przez 2 minuty; 30 cykli składających się z etapu denaturacji w temperaturze 94 °C przez 10 s, etapu wyżarzania w temperaturze 55 °C przez 1 minutę i etapu przedłużania w temperaturze 68 °C przez 3 minuty; i końcowe przedłużenie w temperaturze 68 °C przez 5 min.
  2. Oddziel 15 μl każdego produktu PCR od 1,5% żelu agarozowego, aby potwierdzić amplifikację liniową i ocenić jakość matrycy (Ryc. 4). Amplifikacja z matrycy 4C powinna dać dyskretne prążkowanie przy niskich stężeniach DNA i rozmaz przy wyższych stężeniach. Obecność rozmazu wskazuje na zwiększoną złożoność amplifikowanych ligacji 4C.
  3. Jeśli jesteś zadowolony z jakości i ilości wygenerowanego produktu odwróconego PCR, ustaw qPCR, aby określić optymalną liczbę cykli do użycia do amplifikacji:
    1. Ustawić reakcje zawierające barwniki SYBR i ROX, używając mieszaniny reakcyjnej w tabeli 2. O ile amplifikacja nie jest liniowa przy wysokich stężeniach w kroku 11.2, należy użyć 100 ng matrycy na reakcję.
      UWAGA: Dodanie ROX ułatwia normalizację sygnału fluorescencyjnego od studni do studni i z cyklu na cykl.
    2. Reakcje PCR należy przeprowadzić, stosując początkową denaturację w temperaturze 94 °C przez 2 minuty; 40 cykli składających się z etapu denaturacji w temperaturze 94 °C przez 10 s, etapu wyżarzania w temperaturze 55 °C przez 1 minutę i etapu przedłużania w temperaturze 68 °C przez 3 minuty; i końcowego przedłużenia w temperaturze 68 °C przez 5 minut.
    3. Określić pik (punkt końcowy) fluorescencji reakcji za pomocą wykresu amplifikacji. Określ cykl, w którym reakcje osiągają 25% szczytowej fluorescencji (Rysunek 5).
      UWAGA: Jest to liczba cykli, które zostaną użyte do wzmocnienia bibliotek 4C (patrz krok 11.4).
  4. Ustaw odwrotny PCR, jak w Tabeli 3, aby amplifikować nieznane sekwencje podwiązane do przynęty z matrycy 4C. Przed uruchomieniem podzielić na 16 reakcji po 50 μl. Przeprowadzić reakcje PCR, stosując początkową denaturację w temperaturze 94 °C przez 2 minuty i cykle składające się z etapu denaturacji w temperaturze 94 °C przez 10 s, etapu wyżarzania w temperaturze 55 °C przez 1 minutę i etapu wydłużania w temperaturze 68 °C przez 3 minuty. Użyj liczby cykli określonej w kroku 11.3.3.
  5. Zbierz i zbierz reakcje. Oczyść za pomocą zestawu do oczyszczania PCR opartego na kolumnie krzemionkowej. Użyj co najmniej 2 kolumn na 16 reakcji. Połącz oczyszczone produkty PCR.
  6. Oznaczyć ilość i czystość próbki za pomocą spektrofotometrii. Typowe plony wynoszą od 10 do 20 μg dla A260/A280 ~1,85. Jeśli współczynniki wchłaniania nie są optymalne, należy je ponownie oczyścić, aby zapobiec problemom podczas sekwencjonowania.
  7. Oceń złożoność biblioteki, oddzielając 300 ng oczyszczonego produktu PCR od 1,5% żelu agarozowego.
    UWAGA: Amplifikowany produkt powinien przypominać ten z kroku 11.2.

12. Trzecie ograniczenie trawienia: Odetnij sekwencje przynęty

UWAGA: Ten krok usuwa nieinformacyjne sekwencje przynęt z produktów odwróconego PCR, aby zmaksymalizować informacyjne sekwencje przechwytywane w dalszych etapach sekwencjonowania. Aby monitorować wydajność trawienia, "monitor trawienia"15 jest trawiony równolegle przy użyciu równoważnego stężenia DNA i enzymu. Jeśli RE1 i RE2 są niekompatybilne do jednoczesnego trawienia, na przykład z powodu różnych optymalnych temperatur inkubacji lub reakcyjnych, należy to przeprowadzić jako trawienie sekwencyjne (nie jest to idealne).

  1. Zaopatrzyć się w monitor trawienia RE i przetestować wytrawianie w reakcji 50 μl.
    UWAGA: Jest to cząsteczka dsDNA (na przykład plazmid, amplikon PCR lub syntetyczne DNA), która zawiera miejsce (miejsca) RE. Jedynym wymogiem jest to, aby na żelu agarozowym było łatwo odróżnić monitor cięty od nieoszlifowanego. W razie potrzeby zoptymalizuj RE, monitoruj masę i stężenie enzymów.
  2. Trawić 1 μg oczyszczonego produktu odwróconego PCR z kroku 11.6 i równolegle monitor RE z kroku 12.1.
    UWAGA: Stężenie DNA i enzymu, a także czas inkubacji, powinny być takie same, jak w przypadku trawienia testowego w kroku 12.1 zarówno dla produktu odwrotnego PCR, jak i trawienia monitorowego. W razie potrzeby dostosuj objętość reakcji.
  3. Uruchomić monitor trawionego RE na żelu agarozowym o stężeniu odpowiednim dla oczekiwanych fragmentów. Trawienie uważa się za wystarczające, gdy <10% DNA pozostaje nieoszlifowane (Ryc. 6).
  4. Oczyść strawiony produkt odwróconego PCR na zestawie do oczyszczania DNA opartym na kolumnie krzemionkowej. Jeśli wymagane jest sekwencyjne trawienie, powtórz kroki 12.1–12.4 z drugim enzymem.

13. Przygotowanie biblioteki sekwencjonowania

  1. Ligate adaptery kompatybilne z odpowiednią platformą sekwencjonowania nowej generacji.
    1. Zaprojektuj adaptery dla każdego RE1 i RE2 tak, aby po wyżarzaniu oligonukleotydów każdy adapter RE miał odpowiedni 1-stronny zwis.
      UWAGA: Na przykład, jeśli używany jest HindIII, wyżarzony adapter powinien zawierać 5' fosforylowany zwis "AGCT". Alternatywnie, jeśli używane są standardowe adaptery z wysięgiem T, należy naprawić koniec i ogon biblioteki przed podwiązaniem adaptera.
    2. Wyżarzać odpowiedni adapter RE oligos. Zawiesić oligonukleotydy w buforze do wyżarzania (10 mM Tris, pH 7,5, 50 mM chlorku sodu (NaCl), 1 mM EDTA), wymieszać w ilościach równomolowych do 50 μM, podgrzać do 95 °C i pozostawić do powolnego ostygnięcia do 25 °C.
    3. Przeprowadź reakcję podwiązania. Wymieszaj ponownie strawioną bibliotekę 4C z całkowitym 5- do 10-krotnym nadmiarem molowym wyżarzonych adapterów (krok 13.1.2; stosunek 50:50 dla każdego użytego adaptera RE) w 1x buforze ligazy i dodaj ligazę DNA 6U. Inkubować zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Usuń nadmiar adapterów, oczyszczając je za pomocą zestawu kolumn na bazie krzemionki o niskiej objętości elucji.
  2. Wybór rozmiaru.
    UWAGA: Wybór rozmiaru można również przeprowadzić za pomocą zestawu do czyszczenia na bazie ściegów i jest zalecany nawet po oczyszczeniu kolumny.
    1. Odlej 2% żel agarozowy za pomocą agarozy o wysokiej rozdzielczości, dodając plamę bez promieniowania UV przed wylaniem. Upewnij się, że woda utracona w wyniku parowania podczas ogrzewania została zastąpiona przez zważenie butelki lub kolby przed i po podgrzaniu i dodanie wody w celu odzyskania utraconej masy.
    2. Uruchom biblioteki ligowane adapterem na żelu, pozostawiając puste pasy między próbkami.
    3. Plastry żelu należy wyciąć w zakresie wielkości od 150 pz do 1 kb za pomocą czystego skalpela lub żyletki.
    4. Oczyść biblioteki z żelu za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu. Aby zminimalizować odchylenie GC w odzyskiwaniu DNA, rozpuść plastry żelu w temperaturze pokojowej z rotacją.
  3. Określić liczbę cykli amplifikacji PCR metodą qPCR, stosując mieszaninę reakcyjną z tabeli 4. Przeprowadzić reakcje PCR, stosując początkową denaturację w temperaturze 98 °C przez 2 minuty i 40 cykli składających się z etapu denaturacji w temperaturze 98 °C przez 10 s, etapu wyżarzania w temperaturze 60 °C przez 1 minutę i etapu przedłużania w temperaturze 72 °C przez 3 minuty.
    UWAGA: Cykl, w którym fluorescencja osiąga 25% maksimum, to liczba cykli, które zostaną użyte do wzmocnienia biblioteki, jak w kroku 11.3.
  4. Amplifikować biblioteki, stosując mieszaninę reakcyjną z tabeli 5. Przeprowadzić reakcje PCR, stosując początkową denaturację w temperaturze 98 °C przez 2 minuty i cykle składające się z etapu denaturacji w temperaturze 98 °C przez 10 s, etapu wyżarzania w temperaturze 60 °C przez 1 minutę i etapu wydłużania w temperaturze 72 °C przez 3 minuty. Liczba cykli amplifikacji, które mają być używane dla każdej biblioteki, została określona w kroku 13.3.
  5. Oczyść wzmocnione biblioteki za pomocą zestawu kolumn na bazie krzemionki o niskiej objętości elucji.

14. Sekwencjonowanie i analiza danych sekwencjonowania

  1. Określ stężenia amplifikowanych bibliotek za pomocą testu fluorymetrycznego. Rozcieńczyć biblioteki do stężenia odpowiedniego do sekwencjonowania (skontaktuj się z usługą sekwencjonowania lub rdzeniem, aby uzyskać ich zalecenia).
  2. Określ jakość bibliotek za pomocą platformy do analizy mikroprzepływowych kwasów nukleinowych.
    UWAGA: Profil rozmiaru biblioteki powinien odzwierciedlać profil widoczny na żelu do wyboru rozmiaru w kroku 13.2, a stężenie próbki określone w tym kroku ma być użyte do sekwencjonowania.
  3. Pula bibliotek indeksowanych w celu uzyskania co najmniej 3 milionów odczytów (co najmniej 50 odczytów bp; pojedynczy [1X50] lub sparowany koniec [2X50]) na próbkę. Biblioteka wysokiej jakości wymaga co najmniej 1 miliona zmapowanych odczytów9, ale podczas mapowania wystąpi pewne wyczerpanie. Na przykład platforma sekwencjonowania, która zapewnia około 150 milionów odczytów na linię, może pomieścić do 50 próbek na jednym torze.

15. Analiza danych sekwencyjnych

  1. Demultipleksuj dane przy użyciu sekwencji indeksów, aby przypisać odczyty do odpowiednich próbek.
    UWAGA: W zależności od znajomości, użytkownicy mogą wykonywać dalsze analizy obliczeniowe surowych plików sekwencji FASTA/FASTQ za pomocą podstawowego interfejsu wiersza poleceń lub, alternatywnie, przyjaznego dla użytkownika, opartego na przeglądarce graficznego interfejsu użytkownika Galaxy (GUI)16.
  2. Przycinaj sekwencje adapterów i wszelkie sekwencje przynęty wynikające z niepełnego trawienia RE w kroku 12, na przykład za pomocą zestawu narzędzi FAST-X Toolkit (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/).
  3. Mapowanie odczytów demultipleksowanych do odpowiedniego genomu będącego przedmiotem zainteresowania (np. UCSC mm10, hg19) przy użyciu Burrows-Wheeler Aligner (BWA)17 lub innego oprogramowania do wyrównywania, co skutkuje plikami wyjściowymi SAM. W razie potrzeby przekonwertuj pliki SAM na BAM za pomocą samtools18 (zobacz Krok 15.4).
  4. Użyj potoku analizy 4C-seq, takiego jak Basic4Cseq19, 4C-ker20, FourCSeq21 lub fourSig22, aby przeanalizować dane i zidentyfikować interakcje.
    UWAGA: Analizę danych i ocenę ich jakości należy przeprowadzać zgodnie z instrukcją referencyjną wybranego pakietu oprogramowania. Pakiety generują pliki wyjściowe BED, chyba że zaznaczono inaczej. Krótko mówiąc, Basic4CSeq19 używa wejściowego pliku SAM (Krok 15.3) do wizualizacji interakcji (txt, tiff, BED i pliki wyjściowe peruki) i ocenia jakość danych na podstawie kryteriów określonych w van de Werken i in. 9 4C-ker20 (wejście przycięte FASTQ, krok 15.2) i FourCSeq21 (wejście BAM, Krok 15.3) identyfikują zróżnicowane interakcje między warunkami. fourSig22 (dane wejściowe SAM) również identyfikuje istotne interakcje i nadaje priorytet tym, które mogą być powtarzalne. Narzędzia takie jak Genomic Regulatory Enrichment of Annotations Tool (GREAT)23 lub integracja z zestawami danych ENCODE mogą być również wykorzystywane do przewidywania funkcji biologicznej interakcji odkrytych przez 4C-seq.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotne ludzkie keratynocyty wyizolowano z 2-3 odrzuconych napletków noworodków, zebrano je i wyhodowano w KSFM uzupełnionym 30 μg/ml ekstraktem z przysadki bydlęcej, 0,26 ng/ml rekombinowanego ludzkiego czynnika wzrostu naskórka i 0,09 mM chlorku wapnia (CaCl2) w temperaturze 37 °C, 5% dwutlenku węgla. Komórki podzielono na dwie kolby, a jedną kolbę różnicowano przez dodanie CaCl2 do końcowego stężenia 1,2 mM przez 72 godziny. 107 komórek każda z prolif...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki 4C mogą potencjalnie ujawnić interakcje chromatyny, które mogą zidentyfikować nieznane wcześniej elementy regulatorowe i/lub geny docelowe, które są ważne w określonym kontekście biologicznym 24,25,26. Jednak przeszkody techniczne mogą ograniczać dane uzyskane z tych eksperymentów. Prawdopodobny jest błąd PCR wynikający z nadmiernej amplifikacji matrycy w protokołach 4C. Protokół ten rozwiązuje ten problem, wykorzystując ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez NIAMS (R01AR065523).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HindIIINEBR0104S
CviQINEBR0639S
DNAIDTDo zaprojektowania przez czytelnika
50 ml stożkowe probówki wirówkoweFisher Scientific06-443-19
Probówki do mikrowirówek 1,7 mlMidSciAVSS1700
Sól fizjologicznabuforowana fosforanemThermo Fisher14190-136
Formaldehyd, bez metanoluMikroskopia elektronowa Sciences15710
NutatorVWR15172-203
GlicynaJT Baker4059-00
Wirówka
Mikrowirówka
Etylenodiaminotetraoctowy kwas (EDTA)Sigma-AldrichED2SS
20% roztwór SDSSigma-Aldrich05030
Trypan BlueThermo Fisher15250061
Szkiełka szklaneFisher Scientific12-550-143
Szkiełka nakrywkoweVWR16004-094
Mikroskop
Triton X-100Alfa AesarA16046
Wytrząsający blok
2 M Tris-HClJakość Biologiczna351-048-101
Proteinaza KNEBP8107S
(25:24:1)Sigma-AldrichP2069
Octan soduSigma-AldrichM5661
20 mg/ ml glikogenuThermo FisherR0561
EtanolFisher Scientific04-355-223
Woda wolna od nukleazFisher ScientificMT-46-000-CM
cykler qPCRThermo Fisher4453536
płytki qPCRThermo Fisher4309849
TermocyklerThermo Fisher4375786
Probówki paskowe do PCRMidSciAVSST-FL
1 M Chlorek magnezuJakość Biologiczna351-033-721
DitiotreotolSigma-Aldrich43815
Trifosforan adenozynySigma-AldrichA2383
Ligaza DNA T4NEBM0202S
AgarozaSigma-AldrichA6013
RNase AThermo FisherEN0531
Zestaw do oczyszczania Qiaquick PCRQiagen28104
MinElute Zestaw do oczyszczania PCR
Rozwiń system PCR z długim szablonemSigma-Aldrich11681834001
FisherR0191
SYBR Green ISigma-AldrichS9430
ROXBioRad172-5858
Chlorek soduSigma-AldrichS5886
End-It DNA End-It End-Repair KitLucigenER0720
LigaFast Rapid System ligacji DNAPromegaM8221
SYBR SafeThermo FisherS33102
Taq PolimerazaNEBM0267S
UltraSieve AgarozaIBI ScientificIB70054
Zestaw do ekstrakcji żelu QiaquickQiagen28704
Startery oligonukleotydowe stołowaz chłodzeniemświetlnygrzewczy Fenol:chloroform:alkohol izoamylowy Spektrofotometr Qiagen 28004 dNTP mix Thermo

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dunham, I., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  2. Hoffman, M. M., et al. Integrative annotation of chromatin elements from ENCODE data. Nucleic Acids Research. 41 (2), 827-841 (2013).
  3. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing Chromosome Conformation. Science. 295 (5558), 1306-1311 (2002).
  4. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
  5. Li, G., et al. Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation. Cell. 148 (1-2), 84-98 (2012).
  6. Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
  7. Zhao, Z., et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nature genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).
  8. Splinter, E., de Wit, E., van de Werken, H. J. G., Klous, P., de Laat, W. Determining long-range chromatin interactions for selected genomic sites using 4C-seq technology: From fixation to computation. Methods. 58 (3), 221-230 (2012).
  9. Van De Werken, H. J. G., et al. 4C technology: Protocols and data analysis. Methods in Enzymology. 513, Elsevier Inc. (2012).
  10. Brouwer, R. W. W., van den Hout, M. C. G. N., van IJcken, W. F. J., Soler, E., Stadhouders, R. Unbiased Interrogation of 3D Genome Topology Using Chromosome Conformation Capture Coupled to High-Throughput Sequencing (4C-Seq). Eukaryotic Transcriptional and Post-Transcriptional Gene Expression Regulation. , 199-220 (2017).
  11. Matelot, M., Noordermeer, D. Determination of High-Resolution 3D Chromatin Organization Using Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq). Polycomb Group Proteins: Methods and Protocols. , 223-241 (2016).
  12. Gheldof, N., Leleu, M., Noordermeer, D., Rougemont, J., Reymond, A. Detecting Long-Range Chromatin Interactions Using the Chromosome Conformation Capture Sequencing (4C-seq) Method. Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols. , 211-225 (2012).
  13. Göndör, A., Rougier, C., Ohlsson, R. High-resolution circular chromosome conformation capture assay. Nature. 3 (2), 303-313 (2008).
  14. Hagège, H., et al. Quantitative analysis of chromosome conformation capture assays (3C-qPCR). Nature. 2 (7), 1722-1733 (2007).
  15. Anand, R. D., Sertil, O., Lowry, C. V. Restriction digestion monitors facilitate plasmid construction and PCR cloning. BioTechniques. 36 (6), 982-985 (2004).
  16. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic acids research. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  17. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  18. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. Walter, C., Schuetzmann, D., Rosenbauer, F., Dugas, M. Basic4Cseq: An R/Bioconductor package for analyzing 4C-seq data. Bioinformatics. 30 (22), 3268-3269 (2014).
  20. Raviram, R., et al. 4C-ker: A Method to Reproducibly Identify Genome-Wide Interactions Captured by 4C-Seq Experiments. PLoS Computational Biology. 12 (3), (2016).
  21. Klein, F. A., Pakozdi, T., Anders, S., Ghavi-helm, Y., Furlong, E. E. M., Huber, W. FourCSeq: analysis of 4C sequencing data. Bioinformatics. 31 (19), 3085-3091 (2015).
  22. Williams, R. L. Jr, et al. fourSig a method for determining chromosomal interactions in 4C-Seq data. Nucleic Acids Research. 42 (8), (2014).
  23. McLean, C. Y., et al. GREAT improves functional interpretation of cis-regulatory regions. Nature Biotechnology. 28 (5), 495-501 (2010).
  24. Stolzenburg, L. R., et al. Regulatory dynamics of 11p13 suggest a role for EHF in modifying CF lung disease severity. Nucleic Acids Research. 45 (15), 8773-8784 (2017).
  25. Meddens, C. A., et al. Systematic analysis of chromatin interactions at disease associated loci links novel candidate genes to inflammatory bowel disease. Genome Biology. 17 (1), 1-15 (2016).
  26. Yeung, J., et al. Transcription factor activity rhythms and tissue-specific chromatin interactions explain circadian gene expression across organs. Genome research. , 207787(2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Circular Chromosome Conformation Capture4C seq ProtocolChromatin Interaction AnalysisNext generation SequencingRestriction Enzyme DigestionInverse PCR AmplificationQPCR based AmplificationChromatin Architecture AssessmentGene Regulatory SequencesTranscriptional Regulation Field

Related Articles