Barwienie błękitem toluidynowym skrawków zatopionych w żywicy w celu oceny morfologii nerwów obwodowych

Summary

Tutaj prezentujemy protokół do wizualizacji drobnych struktur nerwów obwodowych poprzez uzyskanie i barwienie odcinków 1-2 μm błękitem toluidynowym

Abstract

Nerwy obwodowe rozciągają się po całym ciele, unerwiając docelowe tkanki za pomocą aksonów motorycznych lub czuciowych. Ze względu na powszechną dystrybucję, nerwy obwodowe są często uszkodzone z powodu urazu lub choroby. Ponieważ opracowano metody i strategie oceny uszkodzenia nerwów obwodowych w modelach zwierzęcych, funkcji i regeneracji, analiza morfometrii nerwu obwodowego stała się niezbędnym pomiarem końcowego wyniku. Barwienie niebieskim toluidynowym przekrojów czynnych nerwów uzyskane z odcinków nerwów zatopionych w żywicy jest powtarzalną metodą jakościowej i ilościowej oceny nerwów obwodowych, umożliwiającą wizualizację morfologii, liczby aksonów i stopnia mielinizacji. Ta technika, podobnie jak w przypadku wielu innych metod histologicznych, może być trudna do nauczenia się i opanowania przy użyciu standardowych pisemnych protokołów. Intencją niniejszej publikacji jest zatem zaakcentowanie pisemnych protokołów barwienia nerwów obwodowych błękitem toluidynowym za pomocą wideografii metody, przy użyciu nerwów kulszowych pobranych od szczurów. W tym protokole opisujemy unieruchomienie nerwów obwodowych in vivo i pobranie tkanki oraz po utrwaleniu 2% tetratlenkiem osmu, osadzenie nerwów w żywicy epoksydowej oraz ultramikrotomowe cięcie nerwów do grubości 1-2 μm. Skrawki nerwów są następnie przenoszone na szkiełko podstawowe i barwione błękitem toluidynowym, po czym są oceniane ilościowo i jakościowo. Przedstawiono przykłady najczęstszych problemów, a także kroki mające na celu ich złagodzenie.

Introduction

Nerwy obwodowe rozciągają się po całym ciele, unerwiając docelowe tkanki za pomocą aksonów motorycznych lub czuciowych¹. Wady nerwów obwodowych spowodowane zaburzeniami medycznymi i urazami stanowią poważny problem zdrowia publicznego i mają duże skutki ekonomiczne^2,3. Pomimo postępów w ocenie wyników uszkodzeń nerwów obwodowych i zrozumieniu regeneracji nerwów, tradycyjne metody, takie jak histologia nerwów i techniki barwienia, są niezbędnymi narzędziami do jakościowej i ilościowej oceny zdrowia nerwów jako końcowego pomiaru wyniku w modelach zwierzęcych lub wyciętej tkance ludzkiej. ....

Protocol

Dorosłe szczury Sprague Dawley zostały wykorzystane w tym projekcie, a wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Wyoming.

1. Chirurgia i unieruchomienie nerwów in vivo

UWAGA: Informacje o dostawcach wszystkich materiałów i sprzętu użytego w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.

UWAGA: Utrwalanie nerwów in vivo służy do zachowania tkanki i zmniejszenia degradacji strukturalnej, która może wystąpić między śmiercią a pobraniem nerwów. Utrwalanie tkanek in vivo jest standardową ....

Results

Osadzone w żywicy odcinki nerwów obwodowych barwione błękitem toluidynowym pozwalają na dokładne określenie ilościowe danych histologicznych. Przegląd procedury jest pokazany w (Rysunek 2). Skrawki nerwów kulszowych zanurzone w podłożu żywicznym i zabarwione błękitem toluidynowym wykazywały wyraźne obrazy o optymalnej rozdzielczości (ryc. 3). Uszkodzenie nerwów może powodować wiele zmian w strukturach morfologicznych nerwów, na przykład zmian.......

Discussion

Badania struktur morfologicznych uszkodzenia i regeneracji nerwów obwodowych są częstymi przedmiotami badań¹³. W tym protokole opisujemy kroki w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów do kwantyfikacji danych histologicznych przy użyciu tkanki nerwowej rwy kulszowej szczura osadzonej w blokach żywicy i wybarwionej błękitem toluidynowym. Technika ta zapewnia obraz morfologii nerwów, w którym regenerację nerwów można określić ilościowo, mierząc liczbę aksonów, stopień mielinizacji, obecność naciekaj.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bufor fosforanowy Dulbecco sól fizjologiczna	Gibco	14200-075
Roztwór aldehydu glutarowego	Sigma-Aldrich	G6257
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148
Monohydrat fosforanu sodu jednozasadowy	Sigma-Aldrich	S9638
Błękit toluidynowy O	Sigma-Aldrich	T3260
Tetraboran sodu Decahydrate	Acros Organics	205950010
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-013-25
Zestaw do zatapiania żywicy epoksydowej	Sigma-Aldrich	45359
Roztwór wodorotlenku sodu	Sigma-Aldrich	72068	Aby dostosować utrwalacz pH Trumpa
Aceton	Fisher Chemical	170942
Roztwór tetratlenku osmu	Sigma-Aldrich	75632
Mikroprowadnice VWR, Superfrost Plus	VWR	48311-703
Szklana osłona mikroskopu	Fisher Scientific	12545102
Pelco Embedding Cast	Fisher Scientific	NC9671811
Maszyna do noży do szkła	Produkty RMC	GKM-2
	Produkty RMC	MT-XL
15 ml Probówka stożkowa	Falcon	ISO 9001
Eppendorf 1,5 ml mikrowirówki	Sigma-Aldrich	T9661
4 ml Szklana fiolka	Sigma-Aldrich	854190
VWR		55411-050	Do przycinania bloku żywicy
Doskonała pętla	Mikroskopia elektronowa Nauki	70944	Do zbierania cienkich odcinków żywicy
Paski noża Ultra Glass 6,4 mm x 25 mm x 400 mm	Mikroskopia elektronowa Nauki	71012
100 Watt Piec	Millipore
Bibuła filtracyjna Whatman	Sigma-Aldrich	WHA10010155
3 ml plastikowa pipeta	Zestaw mikrochirurgiczny Sigma-Aldrich	Z331740
	Światowe instrumenty
Mikroskop			Podwójna kolorowa i monochromatyczna kamera CCD, DP80