Charakterystyka dynamiki mikrobiomu – przepływy pracy oparte na cytometrii przepływowej od czystych kultur do naturalnych społeczności

Summary

Analiza cytometryczna przepływu okazała się przydatna do badania czystych kultur i monitorowania dynamiki społeczności mikroorganizmów. Przedstawiamy trzy kompleksowe przepływy pracy, od próbkowania po analizę danych, dla czystych kultur i złożonych społeczności, odpowiednio w przezroczystym podłożu, jak i w trudnych matrycach.

Abstract

Badanie czystych kultur i monitorowanie dynamiki społeczności mikroorganizmów jest niezbędne do zrozumienia i kontrolowania naturalnych ekosystemów oraz technicznych zastosowań napędzanych przez mikroorganizmy. Metody sekwencjonowania nowej generacji są szeroko stosowane do rozwiązywania mikrobiomów, ale na ogół wymagają dużych zasobów i czasu oraz dostarczają głównie informacji jakościowych. Analiza mikrobiomu metodą cytometrii przepływowej nie ma tych wad i może zapewnić względną liczebność podspołeczności i bezwzględną liczbę komórek na linii. Chociaż nie dostarcza bezpośrednich informacji filogenetycznych, może zwiększyć głębię analizy i rozdzielczość podejść do sekwencjonowania. W przeciwieństwie do zastosowań medycznych, zarówno w badaniach, jak i rutynowych warunkach, cytometria przepływowa nadal nie jest powszechnie stosowana do analizy mikrobiomu. Brakujące informacje na temat przygotowania próbek i procesów analizy danych mogą stanowić barierę wejścia dla naukowców stojących przed wyzwaniami związanymi z analizą mikrobiomu, które często byłyby podręcznikowymi zastosowaniami cytometrii przepływowej. W tym miejscu przedstawiamy trzy kompleksowe przepływy pracy odpowiednio dla czystych kultur, złożonych społeczności w przejrzystym medium i złożonych społeczności w trudnych matrycach. Opisujemy indywidualne procedury pobierania próbek i utrwalania oraz zoptymalizowane protokoły barwienia dla odpowiednich zestawów próbek. Opracowujemy analizę cytometryczną za pomocą złożonego urządzenia laboratoryjnego skoncentrowanego na badaniach i skoncentrowanego na aplikacjach, opisujemy procedurę sortowania komórek i sugerujemy pakiety analizy danych. Ponadto proponujemy ważne kontrole eksperymentalne i stosujemy przedstawione przepływy pracy do odpowiednich zestawów próbek.

Introduction

Mikroorganizmy odgrywają istotną rolę w wielu aspektach ludzkiego życia. Są one głównymi biotycznymi czynnikami napędzającymi cykle węgla, azotu, fosforu i siarki na planetach¹ i działają jako degradujące^2,3, a także syntetyzujące⁴ biokatalizatory w różnych gałęziach przemysłu, takich jak oczyszczanie ścieków⁵ lub biotechnology⁶. Tworzą nawet ludzki mikrobiom, który bezpośrednio wpływa na ludzkie zdrowie i metabolizm^7,8. Dlatego informacje o strukturze, funkcji i dynamicznym zachowaniu mikroorganizmów, w odpowiedzi na ich bezpośrednie otoczenie, są niezbędne, jeśli chcemy w pełni zrozumieć i manipulować tymi systemami. Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to uznana technologia określania struktury i funkcji mikrobiomu⁹. Analiza i ocena danych NGS nie może jednak dostarczyć informacji ilościowych i nadal jest kosztowna, czasochłonna i w żadnym wypadku nie pozwala na dostarczenie wyników na miejscu w ramach korytarzy wydajności. Niektóre bakterie wykazują czas generacji krótszy niż 1 godzina i powodują ciągłe zmiany w strukturze społeczności w określonych środowiskach¹⁰. Podążając za taką dynamiką, stosowanie podejść sekwencjonowania przekroczyłoby możliwości finansowe i kadrowe większości laboratoriów naukowych.

Natomiast cytometria przepływowa może dostarczyć odcisków palców społeczności podobnych do danych NGS, zachowując przy tym wyższą efektywność czasową, pracochłonną i kosztową. W tym miejscu przedstawiamy techniki cytometrii przepływowej, które są w stanie śledzić dynamikę społeczności drobnoustrojów na linii produkcyjnej na poziomie pojedynczej komórki. W przeciwieństwie do NGS, cytometria przepływowa nie dostarcza przynależności filogenetycznej ani informacji o funkcjonalnych genach, ale dostarcza ilościowej liczby komórek. Korzystając z cytometrii przepływowej, społeczności drobnoustrojów można podzielić na podspołeczności o wyraźnych właściwościach rozpraszania światła i fluorescencji (rozpraszanie do przodu (FSC) i rozpraszanie boczne (SSC) wskazują odpowiednio wielkość i ziarnistość komórek). Przedstawione podejście wykorzystuje głównie informacje związane z wielkością komórki i ilością DNA, które są związane z określonymi typami komórek i stanami fizjologicznymi (wzrostu). Zawartość DNA jest oznaczana ilościowo za pomocą pobudliwego dla promieniowania UV barwnika 4',6-diamidino-2'-fenyloindolowego (DAPI), który wiąże się z regionami DNA bogatymi w A-T i może nawet rozwiązać różne poziomy chromosomów. Łącząc fluorescencję DAPI i FSC, można wyróżnić i monitorować ponad 50 podspołeczności pod kątem zmieniającej się liczebności w czasie¹¹. Różnice w liczebności podspołeczności mogą być skorelowane ze zmianami w otoczeniu mikrośrodowiskowym, takimi jak pH i miano produktu¹², z parametrami globalnymi, takimi jak weather^13,14, lub w przypadku mikrobiomów jelitowych lub ślinowych z niektórymi zabiegami medycznymi¹⁵. Korelacje te ujawniają kluczowe podspołeczności odpowiedzialne za poszczególne funkcje w sieci metabolicznej całej społeczności. Kluczowe podspołeczności mogą być następnie specjalnie promowane lub tłumione poprzez zmianę otaczających mikrośrodowisk lub sortowane w celu późniejszego sekwencjonowania¹⁵ lub proteomic investigation¹⁶.

Jednakże, cytometria przepływowa społeczności mikrobiologicznej nie jest jeszcze powszechnie rozpowszechniona ze względu na dość małą liczbę urządzeń cytometrycznych zdolnych do prawidłowego rozpoznawania populacji lub społeczności mikroorganizmów. Co więcej, brak doświadczenia, analiz społecznościowych i skutecznej oceny danych może stanowić barierę wejścia dla badaczy stojących przed wyzwaniami związanymi z analizą mikrobiomu. Ustanowiliśmy kompleksowe przepływy pracy, aby rozwiązać te problemy. Aby zilustrować ich ogólne zastosowanie, przedstawimy je na trzech przykładowych zestawach próbek (Plik uzupełniający 1-S1), a mianowicie i) czystej kulturze (PC) do zastosowań biotechnologicznych hodowanej na zdefiniowanym klarownym podłożu (Pseudomonas putida KT 2440 na glukozie), ii) złożonej społeczności laboratoryjnej w klarownym podłożu (osad czynny (ASC) w ściekach syntetycznych) oraz iii) złożonej społeczności ze środowiska naturalnego w gęstej matrycy (zbiorowisko biogazu (BC) w kiszonce z kukurydzy).

Kilka czynników wpływa na wybór protokołu dla każdego z tych zestawów próbek. Głębokie mrożenie rezygnuje z użycia toksycznych chemikaliów, ale jest głównie ograniczone do środowisk laboratoryjnych ze względu na użycie ciekłego azotu do szokowego oszronienia. Stabilizacja formaldehydu, a następnie utrwalanie etanolu umożliwia pobieranie próbek masowych bez konieczności przygotowania podwielokrotności i okazało się, że jest stabilny przez długi czas. Jednak próbki bogate w białko, takie jak ludzka ślina¹⁵ mogą być problematyczne, ponieważ kłaczki białkowe, denataryzowane przez formaldehyd, mogą powodować niekorzystne proporcje sygnału do szumu. Suszenie próbki zajmie najwięcej czasu (łącznie około 1 godziny) spośród procedur w tym porównaniu, ale można je przeprowadzić na miejscu bez użycia toksycznych chemikaliów. Daje stabilne granulki w tubach, które można łatwo wysłać bez chłodzenia lub dodatkowych środków ostrożności. Dodatkowo zaproponowano wiele alternatywnych metod utrwalania¹¹. Zdecydowanie zalecamy przetestowanie rozdzielczości i stabilności fiksacji różnych protokołów podczas wprowadzania nowego zestawu próbek.

Użyliśmy dwóch różnych cytometrów przepływowych do analizy zestawów: i) wysoce wyrafinowanego i drogiego, skoncentrowanego na badaniach sortera komórek oraz ii) skoncentrowanego na aplikacjach analizatora stacjonarnego, który wydaje się bardziej odpowiedni do zastosowań na miejscu⁵. BC mierzono za pomocą analizatora laboratoryjnego, podczas gdy PC i ASC mierzono za pomocą sortera komórek. Analiza trzech przykładowych zestawów próbek wymagała różnych procedur w celu zoptymalizowania odtwarzalności, stabilności próbki i wygody przepływu pracy. Poniższy protokół określi sekcje dla trzech różnych systemów.

Protocol

1. Pobieranie próbek i utrwalanie

1. Czysta kultura: głębokie mrożenie^15,17
   1. Pobrać 2 ml zawiesiny komórkowej, odwirować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) i 5 000 x g i wyrzucić supernatant.
      UWAGA: Zawiesina komórek, z której pobierana jest próbka, jest opisana w pliku uzupełniającym 1-S1.
   2. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 6 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM NaH₂PO₄, 145 mM NaCl z bidestylowanym_H2O, pH 7,2) zawierającym dodatkowo 15% (v/v) glicerolu jako środek krioprotekcyjny.
   3. Inkubować przez 10 minut na lodzie i zamrażać szokowo w ciekłym azocie w celu późniejszego przechowywania w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Próbki są stabilne przez co najmniej jeden miesiąc.
2. Osad czynny zbiorowisko: stabilizacja formaldehydu + wiązanie etanolu^5,10,18
   1. Pobrać 4 ml zawiesiny komórek, odwirować przez 20 minut w temperaturze 15 °C i 3 200 x g i odrzucić supernatant.
      UWAGA: Zawiesina komórek, z której pobierana jest próbka, jest opisana w pliku uzupełniającym 1-S1.
   2. Dodać 4 ml 2% formaldehydu do PBS i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      1. Przygotuj 8% roztwór podstawowy formaldehydu z paraformaldehydu, aby uniknąć konserwującego dodatku metanolu dodawanego do formaldehydu dostarczanego w postaci płynnej. Dodać 4 g paraformaldehydu do 50 ml PBS w temperaturze 70 °C. Dodać około 125 μl 10 M roztworu NaOH. Mieszaj, aż paraformaldehyd całkowicie się rozpuszczy i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Dostosuj wartość pH do 7,0 za pomocą około 100 μl 37% HCl. Zamroź roztwór formaldehydu w 15 ml porcji do przechowywania. Nie stosować rozmrożonych porcji dłużej niż 10 dni.
         UWAGA: Z formaldehydem należy obchodzić się i utylizować ostrożnie ze względu na jego właściwości toksyczne i mutagenne. Zawsze noś rękawiczki podczas obchodzenia się z nim. Podczas rozpuszczania paraformaldehydu należy używać okapu wyciągowego, aby zapobiec narażeniu na toksyczne opary.
   3. Odwirować próbkę przez 10 minut w temperaturze 15 °C i 3,200 x g i odrzucić supernatant.
   4. Zawiesić próbkę w 4 ml 70% etanolu i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Próbki są stabilne przez co najmniej 2 miesiące. W zależności od właściwości próbki, etap wirowania opisany w ppkt 1.2.1 może być również przeprowadzany przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu zaoszczędzenia czasu.
3. Społeczność biogazowa: suszenie
   1. Za pomocą zaciśniętej końcówki pipety o pojemności 1 000 μl pobrać próbkę 200 μl lepkiego produktu pofermentacyjnego do probówki o pojemności 2 ml.
   2. Dodać 1 700 μl buforu PBS i dokładnie wymieszać.
   3. Umieść probówki w łaźni ultradźwiękowej o częstotliwości 35 kHz i efektywnej mocy wyjściowej 80 W przez 1 minutę, aby rozdzielić duże agregaty komórek i odłączyć komórki przyklejające się do resztek komórek roślinnych.
   4. Dokładnie wymieszać próbkę, przefiltrować próbkę przez filtr siatkowy o pojemności 50 μl i podzielić filtrat na cztery porcje o objętości około 400 μl.
      UWAGA: Przygotowanie podwielokrotności w tym momencie ma dwie zasadnicze zalety. Po pierwsze, mniejsze objętości są łatwiejsze i szybsze do odwodnienia mechanicznego (wirówka) i termicznego (suszenie), ale pobieranie próbek małych objętości z zwykle gęstego osadu biogazowego może być bardzo trudne. Po drugie, dodatkowe próbki mogą być wykorzystane do późniejszego sortowania komórek, pomiarów zapasowych lub kontroli.
   5. Odwirować podwielokrotności dwukrotnie przez 10 minut w temperaturze 10 °C i 4 000 x g i za każdym razem całkowicie odrzucić supernatant w celu mechanicznego odwodnienia próbki tak dokładnie, jak to możliwe.
   6. Suszyć próbki w podgrzewanej wirówce próżniowej przez 40 minut w temperaturze 35 °C, około -97 kPa i 2 500 x g, aby uzyskać stabilne granulki. Przechowywać granulki w temperaturze 4 °C w ciemności.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Granulki są stabilne przez co najmniej 6 miesięcy.

2. Barwienie

UWAGA: Udowodniono, że barwienie DAPI dostarcza wykresy punktowe o wysokiej rozdzielczości i dlatego jest szczególnie korzystne podczas analizy społeczności. Stężenie DAPI w roztworze barwiącym musi być zoptymalizowane, aby zagwarantować intensywność fluorescencji bramki komórkowej znacznie powyżej poziomu hałasu, ale poniżej kulek. Optymalna wartość zależy od czułości przyrządu i wyboru kulek, może się różnić w zależności od zestawu próbek ze względu na zawartość G/C w zawartych mikroorganizmach i generalnie powinna być testowana dla nowo wprowadzonych zestawów próbek. Dla prezentowanej konfiguracji zalecane jest testowanie stężeń w zakresie od 0,24 μM DAPI do 1 μM DAPI. Inne barwniki mogą być używane do określonych zastosowań. Stosowanie protokołu barwienia SYBR Green I jest zalecane, gdy bezwzględna dokładność zliczania komórek ma pierwszeństwo przed analizą odcisków palców (plik uzupełniający 1-S1)^6,15. Obejmuje mniej etapów obsługi próbek i wirowania i ma zastosowanie zarówno do komórek stałych, jak i życiowych. Użycie ważnych komórek dodatkowo skraca etapy obsługi próbki poprzez pominięcie utrwalania, a zatem wymaga tylko jednego wirowania do pobrania komórek. Minimalizuje to potencjalną utratę komórek, a co za tym idzie systematyczny błąd pomiaru. PBS, bufor permeabilizacyjny i roztwór barwiący stosowane podczas wszystkich kolejnych etapów powinny być filtrowane przez filtry strzykawkowe 0,2 μm w celu zmniejszenia dodatkowego obciążenia cząstkami w próbce. Zaleca się barwienie jednej próbki zawierającej Escherichia coli BL21 (DE3) jako wzorzec biologiczny w każdej puli próbek.

1. Czysta kultura
   1. Rozmrozić próbki, odwirować przez 5 minut w temperaturze pokojowej i 5 000 x g, a następnie odrzucić supernatant.
   2. Ponownie zawiesić osad komórek w lodowatym PBS przez wielokrotne pipetowanie i dostosować OD_{700 nm} do 0,035 (długość ścieżki_kuwety = 0,5 cm).
   3. Przygotuj komórki do barwienia.
      1. Odwirować 1 ml dostosowanej zawiesiny komórek przez 5 minut w temperaturze pokojowej i 5 000 x g i odrzucić supernatant.
      2. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu permeabilizacyjnego zawierającego 0,3 M kwasu cytrynowego i 4,1 mM Tween20 i dokładnie wymieszać.
      3. Inkubować próbkę przez 10 minut na lodzie, aby stworzyć przepuszczalne błony komórkowe do późniejszego barwienia.
      4. Odwirować próbkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej i 5 000 x g i odrzucić supernatant.
   4. Dodać 1 ml roztworu barwiącego zawierającego 0,68 μM DAPI w 417 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ buforze (289 mM Na₂HPO₄, 128 mM NaH₂PO₄ z bidestylowanym_H2O, pH 7), wymieszać i inkubować przez co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
      UWAGA: Precyzyjna regulacja OD ma kluczowe znaczenie dla zagwarantowania porównywalnych pomiarów, ponieważ fluorescencja DAPI będzie się zmieniać wraz z gęstością komórki, jeśli stężenie DAPI będzie utrzymywane na stałym poziomie. Supernatant należy usunąć ostrożnie ze względu na ogólnie delikatną osadkę, aby zapobiec utracie komórek.
      UWAGA: Z DAPI należy obchodzić się i utylizować ostrożnie ze względu na jego właściwości mutagenne.
2. Zbiorowisko osadu czynnego
   1. Dokładnie wymieszać utrwaloną próbkę i przenieść 0,6 ml do szklanej probówki. Dodać 1,4 ml PBS i sonikować przez 10 minut w RT, jak opisano w kroku 1.3.3. Odwirować próbkę przez 10 minut w temperaturze 4 °C i 3 200 x g i usunąć supernatant. Dodaj 2 ml PBS i dokładnie wymieszaj. Sonikacja przez 5 minut.
   2. Dostosuj OD_700nm do 0.035 (_{długość ścieżki kuwety} = 0.5 cm) za pomocą PBS.
   3. Przygotuj komórki do barwienia.
      1. Odwirować próbkę przez 10 minut w temperaturze 4 °C i 3 200 x g i usunąć supernatant.
      2. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu permeabilizacyjnego zawierającego 0,11 M kwasu cytrynowego i 4,1 mM Tween20 i dokładnie wymieszać.
      3. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej, aby utworzyć przepuszczalne błony komórkowe do późniejszego barwienia.
      4. Ponownie odwirować próbkę przez 10 minut w temperaturze 4 °C i 3 200 x g i usunąć sklarowany nad osadem.
   4. Dodać 2 ml roztworu barwiącego zawierającego 0,68 μM DAPI i 417 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ buforu, dokładnie wymieszać i inkubować co najmniej 60 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie szklanych rurek, ponieważ niektóre mikroorganizmy mają tendencję do przylegania do ścianek plastikowej rurki i mogą zostać utracone podczas procesu. Możliwa jest również inkubacja przez noc, która zwykle upraszcza procedury laboratoryjne.
      UWAGA: Z DAPI należy obchodzić się i utylizować ostrożnie ze względu na jego właściwości mutagenne.
3. Społeczność biogazowa
   1. Zawiesić osad z wysuszonymi komórkami w PBS.
      1. Dodaj 800 μl PBS, dokładnie wymieszaj i pozwól granulce moczyć się przez 15 minut.
      2. Odessać fazę ciekłą za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i przenieść namoczony granulat do cylindrycznej części ścianki rurki za pomocą końcówki pipety. Powinien tam przylgnąć.
      3. Przesuwaj końcówkę pipety okrężnymi ruchami, aby zgnieść granulkę wzdłuż ścianek rurki.
      4. Zmyj powstałą zawiesinę ze ścianek probówki, dozując fazę ciekłą z końcówki pipety wzdłuż ścianki probówki.
      5. Wymieszać zawiesinę, trzykrotnie zasysając ją i zawieszając w pipecie.
   2. Przemyć próbkę dwukrotnie PBS.
      1. Wirować przez 5 minut w temperaturze 10 °C i 4 000 x g i odrzucić supernatant.
      2. Dodać 1 500 μl PBS i dokładnie wymieszać.
      3. Powtórz dwa powyższe kroki raz.
   3. Umieścić probówki w łaźni ultradźwiękowej na 1 minutę, jak opisano w kroku 1.3.3, a następnie przefiltrować każdą próbkę przez filtr siatkowy o pojemności 50 μl do pojedynczej szklanej probówki.
   4. Rozcieńczyć 2 ml próbki do OD_700nm 0,035 (długość drogi_kuwety = 0,5 cm) za pomocą PBS.
   5. Przygotuj komórki do barwienia, jak wyjaśniono w kroku 2.2.3 powyżej.
   6. Dodać 2 ml roztworu barwiącego zawierającego 0,24 μM DAPI i 417 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ buforu, dokładnie wymieszać i inkubować przez noc w temperaturze RT w ciemności.
      UWAGA: Z DAPI należy obchodzić się i utylizować ostrożnie ze względu na jego właściwości mutagenne.

3. Pomiar

UWAGA: Przykładowe zestawy próbek były analizowane za pomocą dwóch różnych cytometrów przepływowych. Komputer i ASC zostały przeanalizowane za pomocą bardziej złożonego, wysoce regulowanego i łatwo konfigurowalnego, skoncentrowanego na badaniach sortera komórek. Na potrzeby analizy komputera PC urządzenie to zostało wyposażone w laser ustawiony zgodnie z opisem w poprzedniej publikacji¹⁶, w skrócie niebieski (488 nm, 400 mW) i ultrafioletowy (334–364 nm, 100 mW) laser argonowo-jonowy. Do analizy ASC zainstalowano nowsze lasery półprzewodnikowe niebieskie (488 nm, 400 mW) i ultrafioletowe (355 nm, 150 mW). W obu przypadkach niebieski laser indukował FSC (filtr pasmowoprzepustowy 488 nm ± 5 nm, filtr o neutralnej gęstości 1,9) i SSC (filtr pasmowoprzepustowy 488 nm ± 5 nm, filtr o neutralnej gęstości 1,9, wyzwalacz). Te cechy optyczne są związane odpowiednio z wielkością i gęstością komórek. Lasery UV wzbudziły fluorescencję DAPI (filtr pasmowoprzepustowy 450 nm ± 32,5 nm) w celu ilościowego określenia zawartości DNA w komórkach. Układ fluidyczny działał pod ciśnieniem 56 psi (3,86 bara) przy nadciśnieniu próbki wynoszącym maksymalnie 0,3 psi i dyszy 70 μm. Wszystkie parametry zostały zarejestrowane jako wysokości pików, a nie obszary pików, aby poprawić rozdzielczość pomiaru. Długoterminowy monitoring społeczności biogazowej przeprowadzono za pomocą mniej złożonego analizatora laboratoryjnego opartego na kuwecie przepływowej. Ultrafioletowy laser półprzewodnikowy (355 nm, 50 mW) został wykorzystany do indukcji sygnałów FSC (filtr pasmowoprzepustowy 355 nm ± 5 nm) i SSC (filtr pasmowoprzepustowy 355 nm ± 5 nm, wyzwalanie) oraz wzbudzenia fluorescencji DAPI (filtr pasmowoprzepustowy 455 nm C). Woda używana do buforowania osłony obu urządzeń była dwudestylowana i filtrowana w 0,1 μm. PBS używany do rozcieńczania próbki powinien być filtrowany przez filtry strzykawkowe 0,2 μm, aby w jak największym stopniu zredukować szum cząstek w pomiarach.

1. Czysta kultura i zbiorowisko osadu czynnego
   1. Uruchom urządzenie, laser, komputer i oprogramowanie i przygotuj się do analizy próbki.
      1. Włącz lasery i pracuj przez 15 minut, aby osiągnąć temperaturę roboczą i zapewnić stabilność wiązki.
      2. Napełnij zbiornik osłonowy 10x buforem osłonowym (19 mM KH₂PO₄, 38 mM KCl, 166 mM Na₂HPO₄, 1,39 M NaCl z bi-destylowanym_H2O) rozcieńczonym bi-destylowanym_H2Odo 0,2x roztworu roboczego (do sortowania komórek: 0,5x roztwór roboczy).
      3. Zalać układ hydrauliczny nadciśnieniem 56 psi, a zbiornik nieczystości podciśnieniem około 6 psi.
      4. Uruchom urządzenie na co najmniej 15 minut w trybie płukania wstecznego, aby przepłukać port próbki, rurkę i dyszę.
   2. Kalibruj za pomocą standardowych koralików.
      1. Przygotuj mieszanki kulkowe do kalibracji w zakresie liniowym (1 μm niebieski + 2 μm żółto-zielony fluorescencyjny) i logarytmicznym (0,5 μm i 1 μm niebieski fluorescencyjny). Rozcieńczyć zawiesinę kulek od oryginalnych zawiesin wyjściowych, aby uzyskać równe stężenia.
      2. Stale mierz liniową mieszankę kulek i dopasuj szczyty ściegu do wstępnie ustawionego szablonu kalibracyjnego, manipulując pozycjami dyszy i optyki laserowej, aby wstępnie skalibrować przyrząd w zakresie liniowym.
      3. Przełącz się na zakres logarytmiczny i stale mierz logarytmiczną mieszankę ściegów. Dopasuj szczyty koralików do ich wstępnie ustawionego szablonu kalibracji, aby precyzyjnie dostroić sprzęt instrumentu. Dokonaj ostatecznych korekt pozycji koralika, korzystając z ustawienia wzmocnienia lamp fotopowielacza (PMT).
      4. Sprawdź położenie dźwięku instrumentu i ewentualnie dostosuj go tak, aby pasował do szablonu kalibracyjnego.
         UWAGA: Stały szablon kalibracyjny dla pozycji ściegów musi być przygotowany przed projektem pomiarowym i nie można go zmienić (patrz plik uzupełniający 1-S4)! Hałas instrumentalny może być indukowany przez cząstki w próbce lub szum elektroniczny PMT i zawsze będzie rejestrowany do pewnego stopnia. Nie zaleca się całkowitego ukrywania szumu poprzez regulację wzmocnienia lub przesunięcie wykresu. Obfitość i umiejscowienie zdarzeń związanych z hałasem mogą być cennym źródłem informacji i dlatego powinny być zawarte w surowych danych. Próbki o bardzo dużej zawartości cząstek mogą wymagać późniejszego usunięcia szumu ze względów związanych z tworzeniem wykresów i analizą danych. Kontroluj kalibrację w regularnych odstępach czasu w ciągu dnia pomiarowego, aby zagwarantować stabilność urządzenia, a tym samym porównywalność próbki.
   3. Zmierzyć próbkę zawierającą wzorzec biologiczny opisany w ppkt 2.1.4 (Escherichia coli BL21 (DE3) barwiony DAPI, z którego pobrano próbki i utrwalił je podczas fazy stacjonarnej (16 godzin) zgodnie z protokołem ASC opisanym w ppkt 1.2). Sprawdź pozycję piku w stosunku do wstępnie ustawionego szablonu kalibracji (patrz Plik uzupełniający 1-S5).
      UWAGA: Rutynowe barwienie i pomiar wzorca biologicznego dla każdej puli próbek będzie również służył jako wewnętrzna kontrola procedury barwienia. Jeśli urządzenie jest kalibrowane za pomocą kulek, a wzorzec biologiczny nie pasuje do wstępnie ustawionego szablonu kalibracji, prawdopodobnie trzeba powtórzyć procedurę barwienia.
   4. Pobieranie próbek.
      1. Uruchom roztwór barwiący na 10 minut, aby przepłukać port próbki i probówkę oraz zapewnić stabilność fluorescencji DAPI w kolejnych próbkach.
      2. Przed pomiarem przefiltrować zabarwioną próbkę za pomocą filtra siatkowego o wielkości 50 μm, aby zapobiec zatkaniu dyszy cytometru lub kapilary przepływowej.
      3. Dodać logarytmiczną mieszaninę kulek do próbki, aby monitorować stabilność przyrządu i zapewnić możliwość retrospektywnej kontroli kalibracji. Próbki powinny zawierać od 1 000 do 2 500 zdarzeń w każdej z dwóch bramek koralików.
      4. Utwórz bramkę komórkową w oprogramowaniu przyrządu podczas pierwszych pomiarów próbnych nowego zestawu próbek. Ta bramka powinna zawierać poplamione komórki i wykluczać szum i koraliki.
      5. Wymieszaj próbki i mierz z maksymalną prędkością 3 000 zdarzeń ^s-1, aż do wykrycia 250 000 komórek (społeczności) lub 50 000 komórek (czystych kultur) w bramce komórkowej.
         UWAGA: Te liczby komórek są wybierane na podstawie doświadczeń z zestawami próbek. Różne liczby mogą być wykorzystane do przesunięcia kompromisu między wydajnością pomiaru a wykrywaniem podspołeczności o niskiej liczebności w dowolnym kierunku.
         Rozwiązywanie problemów: Nagłe przesunięcia położenia ściegu i komórki w trakcie pomiaru mogą być spowodowane przez pęcherzyki powietrza uwięzione w dyszy. Wymaga to wyjęcia i oczyszczenia dyszy oraz przepłukania układu fluidycznego za pomocą bufora osłonowego. Przyrząd należy ponownie wyregulować po ponownym zamontowaniu dyszy (zacznij od kroku 3.1.2).
      6. Dokładnie przepłukać przyrząd buforem osłonowym przed wyłączeniem i przełączeniem próbek.
2. Społeczność biogazowa
   1. Uruchom urządzenie, laser, komputer i oprogramowanie, aby przygotować się do analizy próbki.
      1. Przepłukać wstecznie co najmniej 6 ml buforu osłonowego (dwudestylowanego_H2O) przez rurkę i port próbki do luźno przymocowanej probówki, korzystając z funkcji "zalewania płynu osłonowego" w oprogramowaniu przyrządu.
      2. Zmierzyć dwudestylowany_H2Oprzy 5 μl ^s-1, aby przepłukać układ fluidyczny, aż zostanie wykrytych mniej niż 200 zdarzeń ^s-1 przy regularnym natężeniu przepływu 0,5 μl ^s-1.
   2. Skalibruj system.
      1. Przygotuj mieszankę kulek (0,5 μm i 1 μm niebieska fluorescencyjna). Rozcieńczyć zawiesinę kulek od oryginalnych roztworów podstawowych, aby uzyskać równe stężenia.
      2. Stale mierz mieszankę kulek w zakresie log₄ i dopasuj szczyty kulek do ich wstępnie ustawionego szablonu kalibracyjnego, manipulując kuwetą przepływową i pozycjami optyki laserowej. Dokonaj ostatecznych regulacji pozycji ściegu za pomocą ustawienia wzmocnienia PMT.
   3. Przeprowadzić kalibrację za pomocą wzorca biologicznego, jak opisano w kroku 3.1.3.
   4. Pobieranie próbek.
      1. Rozcieńczyć 400 μl barwionej próbki w 1 600 μl PBS, zmierzyć ją i monitorować liczbę zdarzeń w celu przeprowadzenia testu stężenia.
         UWAGA: W przypadku innych źródeł próbek może być konieczne dostosowanie współczynników rozcieńczenia. Liczba zdarzeń nie powinna przekraczać 1 200 zdarzeń ^s-1 w próbkach bogatych w cząstki, aby zapobiec utracie rozdzielczości w rozproszeniu do przodu (ujemny przykład w pliku uzupełniającym 1-S2). Czyste kultury mogą być mierzone za pomocą do 2,000 zdarzeń ^s-1.
      2. Utwórz bramkę komórkową w oprogramowaniu urządzenia podczas tych pierwszych pomiarów próbnych. Ta bramka powinna zawierać poplamione komórki i wykluczać szum i koraliki.
      3. Rozcieńczyć próbkę zgodnie z wynikami badania stężenia, tak aby przebiegało ono maksymalnie przy 1 200 całkowitych zdarzeniach ^s-1 i dodać mieszaninę kulek do próbki w celu monitorowania stabilności przyrządu i zapewnienia możliwości retrospektywnej kontroli kalibracji. Próbki powinny zawierać od 1 000 do 2 500 zdarzeń w każdej z dwóch bramek koralików.
      4. Wymieszaj i zmierz próbkę, aż 250 000 komórek (społeczności) lub 50 000 komórek (czystych kultur) zostanie wykrytych w bramie komórkowej.
      5. Dokładnie wypłukać przyrząd bidestylowanym_H2Oprzed wyłączeniem i wymianą próbek.

4. Sortowanie komórek

UWAGA: Procedura sortowania komórek wymaga dodatkowego ustawienia przyrządu i jest wykonywana zgodnie z opublikowanymi protokołami¹².

1. Uruchom i skalibruj przyrząd zgodnie z opisem w krokach 3.1.1-3.1.3, ale użyj 0,5-krotnego roztworu roboczego bufora osłony.
2. Ustaw częstotliwość DD i amplitudę DD, aby znaleźć oderwanie kropli.
3. Zamontuj płyty zwrotne, naładuj je i zdecyduj się na 2- lub 4-kierunkowy tryb sortowania.
4. Wykonaj wewnętrzną kalibrację opóźnienia kropli za pomocą żółto-zielonych kulek 2 μm, aby określić przedział czasu, w którym cząstka lub komórka musi przebyć od punktu przesłuchania (laser uderza w komórkę) do ostatniej kropli przyczepionej do strumienia.
5. Posortuj 6 razy 20 koralików na szklanym szkiełku i policz je pod mikroskopem, aby zweryfikować kalibrację opóźnienia kropli.
6. Przygotuj szablon bramki sortującej.
7. Użyj "trybu pojedynczego i jednospadowego: najwyższa czystość 99%" z szybkością nie wyższą niż 2,500 całkowitych zdarzeń ^s-1, aby posortować 500 000 komórek w maksymalnie 4 bramkach jednocześnie (tryb sortowania 4-kierunkowego).
8. Zebrać komórki przez odwirowanie (20 000 x g, 6 °C, 25 min) i zamrozić osad w temperaturze -20 °C w celu późniejszej izolacji i sekwencjonowania DNA.
   UWAGA: Unikaj sortowania komórek w bramkach o liczebności względnej mniejszej niż 5%, ponieważ czas sortowania jest odwrotnie proporcjonalny do obfitości względnej. Poszczególne kroki są szczegółowo opisane w instrukcji sortera komórek. Wymagane numery komórek są w dużym stopniu zależne od odpowiednich przypadków użycia i protokołów ekstrakcji. Zastosowano wiele metod: ddPCR (1 000 komórek^17,19), sekwencjonowanie amplikonów 16S rDNA lub mcrA (500 000 komórek^6,10,15) oraz proteomika (do 1,1 x 10⁷ komórek^16,17). Sortowanie komórek będzie szczególnie korzystne w połączeniu z podejściem metagenomicznym ze względu na mniejszą różnorodność w posortowanych podspołecznościach.
   Ostrzeżenie: Nie dotykaj płyt deflektora podczas procedury sortowania ze względu na wysokie napięcie.

5. Analiza danych

UWAGA: Pomiar cytometryczny daje pliki danych .fcs o ogólnie jednolitej strukturze danych "standard cytometrii przepływowej". Jednak różni producenci cytometrów używają nieco zmodyfikowanych wersji, a starsze instrumenty mogą poprzedzać wprowadzenie w 2010 r. najnowszego standardu FCS 3.1. Może to prowadzić do problemów ze skalowaniem wykresu punktowego, które uniemożliwiają bezpośrednie porównanie wyników zebranych za pomocą różnych instrumentów. Jednak poszczególne punkty danych są zawsze przechowywane w liniach macierzy, z odpowiednimi wartościami intensywności rozproszenia i fluorescencji w różnych kolumnach. Przedstawione potoki analizy mikrobiomu wykorzystują charakterystyczną wielkość komórek i zawartość DNA do opisu podspołeczności drobnoustrojów. Parametry te są skorelowane z intensywnością kanałów fluorescencyjnych FSC i DAPI (sorter komórek: FL-4, analizator: FL-1) i skutkują powstawaniem klastrów podspołeczności, gdy są wizualizowane na dwuwymiarowych wykresach fluorescencji FSC i DAPI. Te wykresy punktowe umożliwiają interpretację i analizę danych cytometrii przepływowej i są zwykle skalowane logarytmicznie. Mogą być wyświetlane z plików .fcs przy użyciu zastrzeżonego oprogramowania cytometrycznego lub rozwiązań innych firm i stanowią podstawę do automatycznej (Cytometric Histogram Image Comparison, CHIC) i półautomatycznej (Cytometric Barcoding, CyBar) analizy społeczności.

1. Porównanie obrazów histogramu cytometrycznego
   Uwaga: Kod, szczegółowa dokumentacja i instrukcja obsługi tego pakietu są dostępne pod adresem http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html. Zostały one również opublikowane²⁰.
   1. Zainstaluj i załaduj pakiet języka R, ustaw katalog roboczy zawierający pliki .fcs i skonfiguruj listę plików, wykonując:
      > source("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCHIC")
      > biblioteka(flowCHIC)
      > # Ustaw katalog roboczy na ścieżkę, w której znajdują się pliki FCS
      > # Wpisz ścieżkę do cudzysłowu
      > setwd("")
      > # Pobierz listę nazw plików FCS znajdujących się w katalogu roboczym
      > pliki <- list.files(getwd(),full=TRUE,pattern="*.fcs")
      > # Pobiera listę nazw plików FCS zawartych w pakiecie
      > plików <- list.files(system.file("extdata",package="flowCHIC"),
      + full=TRUE,pattern="*.fcs")
      > # Przeczytaj pierwszy plik FCS jako flowFrame
      > ramka < czytana. FCS(files[1],alter.names=TRUE,transformation=FALSE)
      > # Pobierz listę nazw parametrów/kanałów
      > unname(frame@parameters@data$nazwa)
   2. Utwórz obrazy dla surowych danych cytometrycznych, wykonując funkcję pakietu "fcs_to_img":
      > # Utwórz obrazy histogramu przy użyciu domyślnych parametrów
      > fcs_to_img(pliki)
   3. Zdefiniuj podzbiory obrazów histogramu, wykonując funkcję pakietu "img_sub":
      > # Utwórz podzbiory obrazów histogramu przy użyciu domyślnych parametrów
      > img_sub(pliki,ch1="FS. Log",ch2="FL.4.Log")
   4. Oblicz wartości nakładania się i XOR, aby przeprowadzić analizę obrazu, wykonując funkcję pakietu "calculate_overlaps_xor":
      > # Zapisz nazwy wszystkich obrazów z podzbioru jako listę
      > podzbiory <- list.files(path=paste(getwd(),"chic_subset",sep="/"),full=TRUE,pattern="*.png")
      > # Oblicz nakładające się obrazy i XOR oraz zapisz wartości do dwóch nowych plików
      > wyniki<-calculate_overlaps_xor(podzbiory)
   5. Tworzenie niemetrycznych wykresów skalowania wielowymiarowego (NMDS) na potrzeby analizy podobieństwa, wykonując funkcję pakietu "plot_nmds":
      > # Pokaż wykres NMDS próbek
      > plot_nmds(wyniki$nakładanie się,wyniki$xor)
2. Cytometryczne kody kreskowe
   UWAGA: Kod, szczegółowa dokumentacja i instrukcja dla tego pakietu są dostępne pod adresem http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html. Zostały one również opublikowane^11,12.
   1. Opracuj szablon bramki głównej do użycia na wszystkich próbkach.
      1. Załaduj pliki .fcs do oprogramowania analitycznego za pomocą funkcji przeciągnij i upuść.
      2. Kliknij dwukrotnie pomiar i wybierz parametry osi x i y z odpowiednich list rozwijanych, aby otworzyć wykres fluorescencji FSC vs. DAPI.
      3. Użyj narzędzia do rysowania wielokątów, aby odtworzyć bramkę komórkową używaną wcześniej do kontrolowania liczby analizowanych komórek w krokach 3.1.4.5 i 3.2.4.4 i odpowiednio ją nazwać. Przeciągnij wpis bramki komórki na liście próbek w grupie wszystkie próbki, aby go zgrupować.
      4. Kliknij dwukrotnie bramkę komórkową i popraw przypisanie osi, aby zobrazować zdarzenia bramki komórki.
      5. Zdefiniuj podspołeczności dominujące w zestawie próbek za pomocą narzędzia bramek eliptycznych zgodnie z opublikowanymi wytycznymi¹² i użyj skanowania SSC lub innego trzeciego parametru²¹, aby zapewnić integralność szablonu bramki. Gromadzenie, kontrolowanie i dostosowywanie przydziału do podspołeczności w odniesieniu do pozostałych próbek.
   2. Wyeksportuj względne obfitości podspołeczności do pliku .txt do użycia w skrypcie języka R.
      1. Otwórz edytor tabel z zakładką edycji.
      2. Dodaj kolumny dla każdej podspołeczności, która została zdefiniowana w kroku 5.2.1.5, ustaw statystykę wyjściową na "częstotliwość rodzica" i nazwij je.
      3. Utwórz tabelę w "edytorze tabel" po wybraniu formatu zapisu i miejsca docelowego.
         UWAGA: Oprogramowanie analityczne bezpośrednio podaje względną liczebność podspołeczności. Można je również uzyskać poprzez podzielenie liczby zdarzeń w bramie indywidualnej podspołeczności przez liczbę zdarzeń w bramie komórki. Wartości muszą być zapisane w macierzy rozdzielanej tabulatorami w pliku .txt, który nie może zawierać żadnych pól n.d. i musi spełniać pewne dodatkowe wymagania, aby mogły zostać odczytane przez kod R (szczegółowe instrukcje można znaleźć w instrukcji obsługi i często zadawanych pytaniach).
   3. Zainstaluj i załaduj pakiet języka R, a następnie załaduj dane, wykonując następujące polecenia:
      > source("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCyBar")
      > # Wpisz ścieżkę do cudzysłowu
      > setwd("")
      > # Załaduj zestaw danych
      > data(Cell_number_sample)
      > # Pokaż dane
      > Cell_number_sample[,-1]
   4. Normalizuj względne obfitości, wykonując funkcję pakietu "normalizuj":
      # Normalizuj dane, wydrukuj 2 cyfry
      normalizować(Cell_number_sample[,-1],cyfry=2)
   5. Utwórz kod kreskowy znormalizowanego i wykres skrzynkowy oryginalnych obfitości względnych, wykonując funkcję pakietu "cybar_plot":
      Normalized_mean<-normalize(Cell_number_sample[,-1],cyfry=2)
      Normalized_mean<-data.frame(data.matrix(Normalized_mean))
      # Wykres z parametrami domyślnymi
      cybar_plot(Normalized_mean,Cell_number_sample[,-1])
   6. Utwórz wykres NMDS z oryginalnymi względnymi obfitościami.
      > Normalized_mean<-normalize(Cell_number_sample[,-1],cyfry=2)
      > Normalized_mean<-data.frame(data.matrix(Normalized_mean))
      > # Wykres NMDS znormalizowanych liczb komórek
      > nmds(Normalized_mean)
   7. Utwórz analizę korelacji znormalizowanych względnych obfitości i innych parametrów, wykonując funkcję pakietu "korelacja":
      > # Załaduj zestaw danych
      > data(Corr_data_sample)
      > # Pokaż wartości korelacji
      > Corr_data_sample[,-1]
      > # Uruchom analizę korelacji
      > korelacja(Corr_data_sample[,-1])
      UWAGA: CHIC i CyBar opierają się na względnej obfitości. Jednak cytometria przepływowa może również określać bezwzględną liczbę komórek, co może być bardzo interesujące dla zastosowań biotechnologicznych. Aby określić bezwzględną liczbę komórek, liczbę komórek w bramce zainteresowania dzieli się przez objętość analizowanej próbki. Objętość analizowanej próbki można oznaczyć, dodając do próbki zawiesinę kulkową o znanym stężeniu (wzór w pliku uzupełniającym 1-S7). Analizator laboratoryjny jest dodatkowo wyposażony w funkcję zliczania objętościowego, która bezpośrednio określa ilościowo objętość w probówce z próbką podczas pomiaru. Do zliczania komórek zaleca się stosowanie protokołu barwienia SYBR Green I.

Results

Poniższe reprezentatywne wyniki podkreślają konieczność powtórzeń i ilustrują różne techniki wizualizacji i analizy danych w każdym z trzech zestawów próbek. Pokazują one wyniki możliwych potoków oceny danych odpowiednich do udzielenia odpowiedzi na standardowe pytania badawcze dotyczące danego zbioru. Przedstawione techniki nie ograniczają się jednak wyłącznie do zestawu próbek, z którym są prezentowane. Surowe dane cytometrii przepływowej zostały udostępnione publicznie za pomocą identyfikatora FlowRepository FR-FCM-ZY46. Wcześniej przesłane dane ASC są dostępne pod identyfikatorem FR-FCM-ZYD7.

Biologiczne i techniczne repliki zostały pobrane, przygotowane i przeanalizowane zgodnie z opublikowanymi protokołami¹¹. Powtórzone próbki biologiczne z PC i ASC pobrano z trzech równoległych kolb. Powtórzone próbki biologiczne BC pobrano w trzech kolejnych próbkach w jednym miejscu w zakładzie na skalę pilotażową. Trzy podwielokrotności jednej próbki utrwalono, wybarwiono i przeanalizowano, aby zapewnić techniczną odtwarzalność. Odtwarzalność metod została oceniona zgodnie z wcześniej opublikowanymi procedurami¹¹. Do obliczenia odchylenia standardowego (%) na bramkę użyto szablonu bramki dla wszystkich próbek z jednego zestawu próbek (plik uzupełniający 1-S6).

Dla komputera maksymalne odchylenie standardowe względnej obfitości wynosiło 3,44%, podczas gdy średnie odchylenie standardowe wynosiło 2,13% (Rysunek 1). Dla ASC i BC maksymalne odchylenia standardowe względnej liczebności wynosiły 1,27% i 0,88%, podczas gdy średnie odchylenia standardowe wynosiły 2,13% i 0,21% (plik uzupełniający 1-S8).

Standardową procedurą, podczas badania czystej hodowli szczepu, jest przygotowanie krzywej wzrostu do analizy fazy opóźnienia, czasu generacji i gęstości komórek w określonych warunkach. Połączyliśmy tę procedurę z przepływem pracy analizy cytometrii przepływowej, aby uzyskać głębsze zrozumienie systemu (Rysunek 2). Wykresy fluorescencji FSC i DAPI ujawniają stany cyklu komórkowego hodowli w różnych punktach hodowli okresowej. Szablon bramki głównej (plik uzupełniający 1-S6) został ustanowiony w celu ilościowego określenia proporcji komórek z jednym (c1n), dwoma (c2n) i wieloma chromosomami (cXn, Rysunek 2B). Przeważający odsetek inokulowanych komórek miał tylko jeden chromosom (93,7% po 0 godzinach). Zmieniło się to drastycznie podczas wzrostu wykładniczego, gdzie prawie wszystkie komórki zawierały więcej niż jeden (99,6%, 4 h), a ponad połowa populacji (53,1%) zawierała nawet więcej niż dwa chromosomy. Ilustruje to zdolność P. putidado replikacji chromosomów szybciej niż w czasie generacji.

Analiza cytometryczna przepływu okazała się bardzo przydatna do monitorowania ewolucji społeczności mikroorganizmów. Może podążać za dynamiką społeczności znacznie bliżej niż bardziej zasobożerne metody molekularne^5,10. Podkreśliliśmy tę dynamikę w filmie i uzyskaliśmy przegląd zmian zachodzących w społeczności osadu czynnego w czasie. Każda jednosekundowa klatka pokazuje wykres fluorescencji FSC i DAPI punktu próbkowania (plik uzupełniający 2). Bardzo wyraźna zmiana między dniem 0 a dniem 4 nastąpiła po ustanowieniu podstawowej społeczności po dniu 7. Dodatkowe podspołeczności pojawiły się w 21 dniu. Ustaliliśmy główny szablon bramki (plik uzupełniający 1-S6), który umożliwił ocenę dynamiki drobnoustrojów na poziomie podspołeczności. Dominujące podspołeczności na różnych etapach eksperymentu zostały wyraźnie zidentyfikowane za pomocą narzędzia CyBar (Rysunek 3). Połączenie tego z rozkładem częstości względnej liczebności podspołeczności pomogło wybrać bramki, które są interesujące (znacząca zmiana liczebności wywołana w kluczowym punkcie czasowym) i opłacalne (ponad 5% względnej liczebności) do sortowania i dalszej analizy²².

Zastosowania bioreaktorów na skalę przemysłową mogą napotkać potencjalne niejednorodności przestrzenne ze względu na ograniczenia w mieszaniu. Są one również często narażone na zmieniające się parametry eksploatacyjne, takie jak zmiany jakości podłoży niesyntetycznych. Taki system reprezentuje BC, z którego pobrano próbki z różnych miejsc w dynamicznie napędzanym reaktorze z przepływem tłokowym. Wykresy fluorescencji FSC i DAPI (Rysunek 4) przykładowych punktów próbkowania wykazują tylko niewielką przestrzenność, ale wyraźną niejednorodność czasową. BC był dalej badany przy użyciu zarówno szybko zautomatyzowanego CHIC, jak i bardziej dogłębnego podejścia CyBar opartego na szablonie bramki głównej.

Jego zautomatyzowany, szybki i bezstronny charakter sprawia, że CHIC jest szczególnie interesujący do kontroli bioprocesów na miejscu w środowisku przemysłowym. Porównuje surowe dane .fcs wszystkich dostępnych próbek. Dwa z tych porównań są wyświetlane w Rysunek 5. Uzyskane wartości odmienności potwierdzają wcześniejsze obserwacje dotyczące niejednorodności przestrzennej i czasowej. Wykresy NMDS wygenerowane z macierzy odmienności narzędzi CHIC (Rysunek 6) dodatkowo uzasadniają ten wynik i odpowiednio go wizualizują.

Ponadto, obliczyliśmy względną liczebność 23 podspołeczności BC za pomocą szablonu bramki głównej (Plik uzupełniający 1-S6). Przeprowadzono analizę korelacji 48 próbek z okresu jednego roku, aby zrozumieć relacje funkcjonalne w społeczności drobnoustrojów. Może to pomóc w zidentyfikowaniu bramek zainteresowania do dalszych badań (sortowanie 4 komórek). Silne dodatnie lub ujemne korelacje z parametrami abiotycznymi, takimi jak miano produktu, mogą pomóc w zrozumieniu i optymalizacji ekosystemów i procesów biotechnologicznych. Współczynnik obciążenia organicznego zawarty w tej korelacji (Rysunek 7) ilustruje taki parametr abiotyczny. G5, G4 i G10 wykazują silne dodatnie korelacje i mogą zawierać gatunki fermentacyjne, podczas gdy ujemna korelacja w G8 może wskazywać na archeony metanogenne.

Rysunek 1: Odtwarzalność analizy cytometrycznej czystej kultury. Wykresy fluorescencji FSC vs. DAPI z kulkami kontrolnymi (A, B) i wykresami słupkowymi 3 liczebności podspołeczności [%] ze słupkami błędów reprezentującymi ± jedno odchylenie standardowe (C, D). Względne liczebności zostały określone za pomocą szablonu bramki pokazanego w pliku uzupełniającym 1-S6. Trzy kontrpróby biologiczne A, B i C pobrano z krzywej wzrostu po 4 godzinach, a trzy kontrpróby techniczne P1, P2, P3 przygotowano z próbki A i zmierzono trzykrotnie, odpowiednio: M1, M2, M3 i podano im odpowiednie odchylenia standardowe. W bramie celi zarejestrowano 50 000 zdarzeń. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Analiza cyklu komórkowego czystej kultury pobranej podczas eksperymentu z krzywą wzrostu przez 12 godzin. (A). Wykresy fluorescencji FSC i DAPI z dwugodzinnych próbek, które wykazują zmianę zawartości DNA podczas fazy wzrostu wykładniczego. Ta seria pomiarowa nie obejmuje koralików (patrz plik uzupełniający 1-S3). (B). Krzywa wzrostu oparta na gęstości optycznej ze słupkami błędów reprezentującymi ± jedno odchylenie standardowe i względną liczebność w podspołecznościach w czasie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Ewolucja struktury zbiorowiska osadu czynnego w ciągu 24 dni. (A) flowCyBar z nakładającymi się rozkładami częstotliwości wizualizowanymi na wykresach skrzynkowych dla poszczególnych bramek, które są ułożone według podobieństwa trendów, odpowiedniego klucza koloru (B) i analizy podobieństwa na wykresie NMDS z R <0,001 (C). Podstawowe wątki są pokazane w sekwencji filmowej w pliku uzupełniającym 2. Liczebność względną określono za pomocą szablonu bramki w pliku uzupełniającym 1-S6. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Przestrzenna i czasowa niejednorodność struktury zbiorowisk mikroorganizmów w reaktorze biogazowym na skalę przemysłową. (A) Porównanie struktury zbiorowisk mikrobiologicznych w czterech portach pobierania próbek I-IV w dniu 223. (B) Porównanie struktury społeczności zależnej od czasu zmienia się od dnia 0 do dnia 384 w porcie II. Szum został odcięty z opóźnieniem, aby poprawić wizualizację. Zmierzono 250 000 zdarzeń w bramie komórki (plik uzupełniający 1-S6). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Porównanie obrazu histogramu cytometrycznego — CHIC. Zasada działania algorytmu CHIC jest zilustrowana przez porównanie dwóch próbek reprezentujących odpowiednio niejednorodność przestrzenną i czasową. (i) Obrazy CHIC są tworzone z plików .fcs po wybraniu dwóch parametrów do wyświetlenia (fluorescencja FSC vs. DAPI). Skala szarości (0–255) koduje liczbę zdarzeń w pikselu. (ii) Podzbiory CHIC generowane są po określeniu obszaru zawierającego komórki (tutaj: 200 < x < 4000, 200 < y < 2200). (iii) Obraz kombinacji XOR jest tworzony przez porównanie pikseli między podzbiorami. Żadna różnica nie jest równa 0 i jest wyświetlana jako. Maksymalna różnica wynosi 200 i jest wyświetlana na biało. Odpowiednia wartość XOR jest obliczana przez dodanie wartości skali szarości wszystkich pikseli na obrazie XOR. (iv) Obraz kombinacji nakładek jest tworzony przez dodanie wartości skali szarości pikseli podzbiorów. Odpowiednia wartość nakładki jest obliczana przez zliczenie pikseli obrazu nakładki, które nie są równe zeru i dlatego zawierają informacje. (v) Wartości odmienności są obliczane przez podzielenie wartości XOR i nakładki. Są one podstawą wykresu NMDS w Rysunek 6. Zarówno wartości odmienności, jak i wykres NMDS wskazują na znikomą niejednorodność przestrzenną i wyraźną czasową społeczność. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Analiza podobieństwa próbek społeczności biogazowej w oparciu o CHIC. Próbka 0-day została wykluczona z tego wykresu ze względu na jej skrajnie odmienną strukturę zbiorowiska, która zniekształciła analizę (plik uzupełniający 1-S11). Wykres NMDS potwierdza założenie o niskiej niejednorodności przestrzennej i wyższej czasowej przyjęte za pomocą narzędzia CHIC i wyjaśnione w Rysunek 5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Analiza korelacji w społeczności biogazowej. Macierz została obliczona przy użyciu współczynnika kolejności rang Spearmana i opiera się na względnej liczebności 23 podspołeczności, które zostały określone za pomocą szablonu bramki głównej w pliku uzupełniającym 1-S6. Skorelowano je ze współczynnikiem obciążenia organicznego (OLR) dla 48 próbek z okresu jednego roku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Analiza podobieństwa zbiorowisk na bazie planktonu (P) i osadów ściekowych (S) w ściekach. Próbki pobrano z osadnika wstępnego (PCL), zbiornika osadu czynnego (AS) i zbiornika fermentacyjnego (DT) pełnowymiarowej oczyszczalni ścieków (wykresy kropkowe w pliku uzupełniającym 1-S10). Liczebność względną określono przy użyciu szablonu bramki pokazanego w pliku uzupełniającym 1-S6. Liczebność tych podspołeczności została również przeanalizowana za pomocą narzędzia flowCyBar w celu stworzenia wykresu CyBar (plik uzupełniający 1-S10) i NMDS (R <0,01). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Stabilność fiksacji czystej kultury. Próbki z doświadczenia z krzywą wzrostu pobrane w ciągu 0 godzin przechowywano przez 28 dni w temperaturze -80 °C po utrwaleniu w 15% glicerolu. Pokazano wykresy fluorescencji FSC i DAPI z koralikami kontrolnymi. Seria pomiarowa nie obejmuje ściegów (plik uzupełniający 1-S3). W bramie komórki zarejestrowano 50 000 zdarzeń (plik uzupełniający 1-S6). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Skuteczna analiza populacji i społeczności drobnoustrojów wymaga dobrze dostrojonych cytometrów, odpowiedniego doboru parametrów komórek i niezawodnego przepływu pracy, od pobierania próbek i fiksacji po pomiar i ocenę danych. Wybrane parametry komórki muszą być zgodne z dostępnymi długościami fal wzbudzenia. Używamy i polecamy DAPI, który jest bardzo czuły na niskie stężenia; ale musi być wzbudzony przez laser UV, który zwykle nie jest zawarty w standardowych zestawach cytometru. Inne barwniki, takie jak SYBR Green I, również barwią całe populacje lub społeczności, ale na ogół zapewniają gorsze rozdzielczości. Nie zalecamy stosowania procedur FISH ani testów żywotności w zbiorowiskach drobnoustrojów. Podejścia te są niemożliwe do ilościowego określenia, zweryfikowania i kontrolowania, ponieważ ich wpływ na poszczególne gatunki w zbiorowisku jest niepewny. Nie można ich wiarygodnie przetestować, dopóki znaczna część typowych społeczności nie jest nadal dostępna jako czysta kultura.

Krytyczne etapy protokołu obejmują procedury pobierania próbek i utrwalania, a także sortowanie komórek. Pobieranie próbek może być skomplikowane ze względu na tendencję niektórych czystych kultur i społeczności drobnoustrojów do agregacji w kłaczki lub przylegania do cząstek matrycy próbki. Konieczne jest rozproszenie tych agregatów i oddzielenie komórek w próbce przed wprowadzeniem ich do analizy cytometrii przepływowej, aby zagwarantować wiarygodne wyniki. Przedstawione protokoły preparacji zostały zoptymalizowane tak, aby umożliwić analizę pojedynczych komórek. Przed pomiarem przeprowadzana jest końcowa filtracja o grubości 50 μm w celu usunięcia wszelkich pozostałości kruszywa i zapobieżenia zatkaniu dyszy 70 μm sortownika komórek i kuwety przepływowej analizatora. Kłaczki komórkowe z oczyszczalni ścieków są szczególnie obfite, wytrzymałe i niezbędne do funkcjonowania systemu. Zbadaliśmy zbiorowiska mikrobiologiczne na bazie planktonu i osadów w różnych zbiornikach pełnowymiarowej oczyszczalni ścieków, aby przetestować ustalony protokół. Osad tworzący agregaty komórkowe uległ wyraźnemu rozproszeniu, a skład zbiorowiska pozostał stabilny. Co więcej, zbiorowiska oparte na planktonie i szlamie wykazywały niezwykłe podobieństwo między nimi we wszystkich trzech zbiornikach, z których pobrano próbki (Rysunek 8, Plik Uzupełniający 1-S10). Wyniki te zweryfikowano przez porównawcze sekwencjonowanie amplikonu 16S rDNA świeżej, poddanej działaniu formaldehydu, utrwalonej formaldehydem i etanolem próbki oraz posortowanej próbki¹⁰. Niemniej jednak niezwykle trudne próbki środowiskowe, takie jak silne biofilmy lub bakterie rosnące w ściśle powiązanych łańcuchach, mogą być niemożliwe do rozproszenia. Próbki gleby mogą być szczególnie problematyczne, ponieważ wszechobecne cząsteczki pojawiają się na histogramie i mogą zasłaniać komórki samą obfitością. W takich przypadkach należy zastosować tradycyjne metody sekwencjonowania.

Stabilność fiksacji każdego nowego zestawu próbek powinna zostać przetestowana przed zaprojektowaniem eksperymentu, aby zagwarantować trafność wyników. Dobra stabilność utrwalania umożliwia również zbiorcze barwienie i pomiar wielu punktów czasowych próbki w ciągu jednego dnia. Ponadto umożliwia pomiary replikacyjne i retrospektywne sortowanie komórek w decydujących punktach czasowych po zakończeniu i końcowej ocenie eksperymentu. Stabilność fiksacji czystej kultury weryfikowano przez 28 dni (ryc. 9). W przypadku doświadczeń na miejscu, w tym transportu próbki, stabilność wiązania powinna być badana przez dłuższy czas (w tym przypadku 60 dni dla społeczności osadu czynnego, 195 dni dla społeczności biogazowej, plik uzupełniający 1-S9).

Barwienie zwykle nie jest problematyczne, ale musi być kontrolowane za pomocą standardu biologicznego, aby umożliwić zastosowanie narzędzi oceny bioinformatycznej. Użyliśmy próbnego szczepu E. coli BL21 (DE3), który został utrwalony zgodnie z protokołem ASC i zgromadzony do użycia w każdej partii barwienia.

Oprócz DAPI, SYBR Green I jest od kilku lat z powodzeniem stosowany do rozwiązywania problemów ze zbiorowiskami drobnoustrojów 14,23,24,25,26. SYBR Green I może rozdzielać społeczności na podzbiory o wysokiej i niskiej zawartości kwasów nukleinowych (HNA i LNA) przy użyciu żywych komórek w trybie online. DAPI jest jednak bardziej specyficzny w swoim wiązaniu z DNA i umożliwia rozróżnienie ponad 50 podspołeczności w jednym zestawie próbek, ale wymaga etapu utrwalenia przed barwieniem.

Sortowanie komórek jest wyjątkową cechą tego podejścia i może być stosowane, jeśli pewne podspołeczności są przedmiotem dalszego zainteresowania. Należy podkreślić, że ani PFA- (wykonywane tylko przez 30 min), ani obróbka etanolem czy barwienie DAPI¹⁰ nie miały negatywnego wpływu na późniejsze sekwencjonowanie amplikonów 16S. Potencjalny wpływ procedur utrwalania i barwienia na analizy metagenomu podspołeczności nadal wymaga przetestowania.

Wiele informacji na temat funkcji społeczności i dynamiki trendów można uzyskać niezależnie od podejścia sortującego w przypadku stosowania narzędzi bioinformatycznych, które rozwiązują cechy społeczności na wirtualnej komórce po komórce i łączą te cechy z parametrami abiotycznymi.

Ostatnio opracowano szereg nowych narzędzi oceny bioinformatycznej, z których wszystkie są przydatne zarówno dla podejścia SYBR Green I, jak i DAPI, w celu rozwiązania cytometrycznych wzorców społeczności. Są to FlowFP²⁷, pakiety użyte w tym badaniu (flowCHIC²⁰, flowCyBar²⁸), model dekonwolucji opracowany dla zbiorowisk słodkowodnych²⁹ i narzędzie używane do rozróżniania szczepów według ich cech fizjologicznych³⁰. Ponadto można określić różnorodność cytometryczną²⁵ , a nawet właściwości stabilności zbiorowisk drobnoustrojów można teraz śledzić za pomocą narzędzia online¹⁰.

Analizy cytometrii przepływowej mają więc ogromną przewagę, jeśli chodzi o szybką ocenę zbiorowisk drobnoustrojów i ewentualnych korelacji parametrów abiotycznych. Jednak nadal istnieją ograniczenia tej metody. Nie można go zastosować w pełni online za pomocą narzędzia flowCyBar, ze względu na doświadczoną procedurę ustawiania bramki. Co więcej, opracowanie niestandardowych, łatwych w użyciu cytometrów przepływowych znacznie przyspieszyłoby rozpowszechnienie podejścia do analizy mikrobiomu metodą cytometrii przepływowej. Podejmowane są pierwsze kroki w tym kierunku²⁸ .

Można przewidzieć przyszłe zastosowania mikrobiologicznej cytometrii przepływowej w ekologii mikrobiologicznej, ponieważ umożliwia ona monitorowanie wysokiej częstotliwości w zakresie czasów generacji bakterii i wykazano, że paradygmaty ekologiczne mają zastosowanie do danych cytometrycznych ^5,10. Metoda ta jest bardzo przydatna w rutynowych badaniach przesiewowych środowiska naturalnego, takich jak obowiązkowe kontrole wody pitnej w Szwajcarii³¹. Może być również cennym narzędziem do zastosowań medycznych, takich jak badania przesiewowe mikrobiomu u ludzi¹⁵ lub zwierząt³². Ponadto najnowsze osiągnięcia w dziedzinie bioinformatyki mogą sprawić, że mikrobiologiczna cytometria przepływowa stanie się integralnym czujnikiem w sterowaniu procesami w zarządzanych systemach mikrobiologicznych. Cytometria społeczności drobnoustrojów zapewnia również narzędzie przesiewowe do sortowania komórek, które umożliwia badania genomowe w wyższej rozdzielczości określonych podzbiorów społeczności.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
System Milli-Q Synteza A10	Merck, Darmstadt, (GER)
BioPak Wkład ultrafiltracyjny	Merck, Darmstadt, (GER)	CDUF BI0 01
Sorter komórek MoFlo Legacy	Beckman-Coulter, Brea, Kalifornia (USA)
Innova 90C	Coherent, Inc , Santa Clara (USA)		334 nm - 364 nm, 100 mW
Innova 70C	Coherent, Inc , Santa Clara (USA)		488 nm, 400 mW
Genesis MX488-500 STM OPS	Coherent, Inc , Santa Clara (USA)		488 nm, 400 mW
Xcyte CY-355-150	Lumentum, Milpitas, Kalifornia, USA		355 nm, 150 mW
Lampy fotopowielacza R928 i R3896	Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japonia)
Oprogramowanie	Summit 4.3Beckman-Coulter, Brea, Kalifornia (USA)
1 &mikro; m  Sondy	molekularne FluoSpheres, Eugene, Oregon (USA)	F8815	350/440 niebieska fluorescencyjna
2 μ m Sondy molekularne YG FluoSpheres	, Eugene, Oregon (USA)	F-8827	505/515 żółto-zielone koraliki fluorescencyjne
0,5 μ m Mikrosfery karboksylowe Fluoresbrite BB	PolyScience, Niles, Illinois (USA)	18339	360/407
1 μ m Fluoresbrite BB Mikrosfery karboksylowe	PolyScience, Niles, Illinois (USA)	17458	360/407 niebieska fluorescencyjna
1 &mikro; Sondy molekularne mYG FluoSpheres	, Eugene, Oregon (USA)	F-13081	505/515 żółto-zielone koraliki fluorescencyjne
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)	Nr CAS 7778-77-0
KCl	Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)	Nr CAS 7447-40-7
Cyflow Space	Sysmex Corporation, Kobe (Japonia)
UV Laser Genesis CX,Coherent	, Inc , Santa Clara (USA)		355 nm, 150 mW
seria H6779-32 PMTs	Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japonia)
Oprogramowanie FloMax	Sysmex Partec GmbH, Gö rlitz, (GER)
wszystkie filtry optyczne	Carl Zeiss, Jena (GER)
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)	Nr CAS 7778-77-0
KCl	Carl Roth, Karlsruhe (GER)	6781.3
FlowJo 10.0.8r1	FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA)		Numer kompilacji: 42398
R-software v.3.4.3	R Core Team
flowCHIC	http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html
flowCyBar	http://www.bioconductor.org/packages/devel/ bioc/html/flowCyBar.html