Ten protokół opisuje paradygmat warunkowania mrugania oczami odpowiedni dla eksperymentów z rocznymi niemowlętami. Do dostarczania bodźców można użyć komercyjnego lub wykonanego na zamówienie sprzętu, a gromadzenie i analiza danych powinny być przeprowadzane na nagraniach wideo.
Artykuł metodologiczny
Klasyczna kondycjonowanie mrugania z krótkim opóźnieniem u dzieci rocznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Klasyczne warunkowanie mrugnięcia okiem (EBC) odnosi się do wyuczonego związku między bodźcem warunkowym (tonem słuchowym) a bodźcem bezwarunkowym (podmuch powietrza do rogówki). Kondycjonowanie mrugania oczami jest często stosowane eksperymentalnie do wykrywania nieprawidłowości w uczeniu się i pamięci zależnej od móżdżku, które leżą u podstaw tego typu uczenia się asocjacyjnego. Podczas gdy eksperymenty na dorosłych i starszych dzieciach są stosunkowo proste do przeprowadzenia przy użyciu sprzętu komercyjnego, kondycjonowanie mrugania oczami u niemowląt jest trudniejsze ze względu na ich słabe posłuszeństwo, co utrudnia prawidłowe ustawienie sprzętu. Aby osiągnąć kondycję u rocznych niemowląt, można zastosować specjalnie wykonany lub dostosowany system komercyjny do dostarczania podmuchu powietrza do rogówki niemowlęcia. Głównym wyzwaniem jest skuteczne wykrycie i sklasyfikowanie reakcji behawioralnych. Donosimy, że metody automatycznego wykrywania mrugnięć są zawodne w tej populacji i że eksperymenty z warunkowaniem powinny być analizowane przy użyciu analizy klatka po klatce dodatkowych nagrań z kamer wideo. Metoda ta może być zastosowana do badania zmian rozwojowych w warunkowaniu mrugania oczami i do zbadania, czy ten paradygmat może wykryć dzieci z zaburzeniami neurologicznymi.
Wprowadzenie
EBC to forma klasycznego warunkowania, która jest powszechnie używana do oceny uczenia się i pamięci u ludzi i innych zwierząt. Konwencjonalny paradygmat EBC odnosi się do wyuczonego związku między nieszkodliwym "uwarunkowanym" bodźcem (tonem słuchowym) a bodźcem "bezwarunkowym" (zaciągnięcie się powietrzem w rogówce, które wywołuje odruchowe mrugnięcie oczami, reakcję bezwarunkową). Uczenie się asocjacyjne ocenia się poprzez przedstawienie bodźca warunkowego i sklasyfikowanie mrugnięć oczami jako reakcji warunkowych i bezwarunkowych - wzrost liczby reakcji warunkowych w czasie lub w więcej niż jednej sesji może wskazywać na uczenie się asocjacyjne.
Paradygmat warunkowania mrugania oczami może być używany do identyfikacji osób z zaburzeniami uczenia się asocjacyjnego. Warunkowanie opóźniające - gdzie bodziec warunkowy (CS) zaczyna się wcześniej, ale nakłada się na bodziec bezwarunkowy (US) - jest kontrolowane przez obwody móżdżku1,2, i jest zakłócone u dorosłych i dzieci z zaburzeniami neurologicznymi, w tym schizofrenią3, autism4,5 oraz spektrum płodowych zaburzeń alkoholowych6,7. Z klinicznego punktu widzenia, badanie kondycji mrugania oczami u niemowląt może pomóc we wcześniejszym wykrywaniu i leczeniu tych zaburzeń neurologicznych. Jednakże, podczas gdy starsze dzieci mogą tolerować zaciągnięcie się powietrzem w rogówce6,7,8 i mogą utrzymać stabilną pozycję głowy/oczu przez cały czas trwania eksperymentu, niemowlęta są mniej posłuszne, a konwencjonalny sprzęt i oprogramowanie do wykrywania mrugania oczami nie jest wystarczające.
Tutaj opisujemy prosty protokół do badania warunkowania krótkiego opóźnienia mrugania oczami u rocznych dzieci, który został zaadaptowany z protokołów wcześniej opisanych gdzie indziej9,10,11. Protokół ten może być podawany przy użyciu dowolnego komercyjnego lub niestandardowego systemu, który jest w stanie dostarczyć kontrolowane zaciągnięcie powietrzem do rogówki. Jednak zamiast komercyjnego oprogramowania do wykrywania mrugnięć (np. EyeBlink Detection System firmy San Diego Instrument, który przetwarza sygnały z kamery na podczerwień), my i inni9,10,11, zalecamy stosowanie analizy klatka po klatce nagrań z kamer wideo w celu wykrycia i sklasyfikowania reakcji na mruganie oczami u rocznych niemowląt.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez The Northern B Health and Disability Ethics Committee, numer referencyjny: 13/NTB/181.
1. Wymagania techniczne
- Użyj jednostki zaciągania się powietrzem, która może podawać podmuch powietrza bezpośrednio do rogówki. Można to osiągnąć za pomocą elastycznej rurki przymocowanej do zbiornika powietrza za pomocą sprężarki powietrza. Aby zapewnić bezpieczeństwo niemowlęcia, wyposaż go w regulowany regulator ciśnienia, który ogranicza ciśnienie powietrza i skraca czas zaciągania się powietrzem.
UWAGA: Dostępne na rynku systemy zawierają sprężarkę w systemie i nie wymagają zbiornika powietrza. - Użyj regulowanej opaski na głowę lub czapki, która może być noszona przez niemowlę i umożliwia odpowiednie ułożenie rurki wdmuchiwania powietrza obok oka.
- Skonfiguruj dwa przenośne głośniki audio z regulowanymi ustawieniami głośności.
- Zaprojektuj i skonfiguruj sterowanie obliczeniowe sprzętu tak, aby ton i zaciąg powietrza mogły być podawane automatycznie z precyzyjnym czasem i w różnych odstępach czasu.
- Skonfiguruj przenośną kamerę wideo z częstotliwością odświeżania co najmniej 60 Hz, aby ręcznie nagrywać reakcje mrugania oczami. Aby zmierzyć czas reakcji, należy użyć kamery wideo, która może uchwycić początek próby, rejestrując sygnał dźwiękowy lub filmując wskaźnik początku próby zaprogramowany w pakiecie oprogramowania.
- Zainstaluj i uruchom dowolne oprogramowanie do edycji wideo, które umożliwia stopniowanie klatka po klatce komponentów audio i wideo (np. Adobe Premiere Pro), aby umożliwić badaczowi zmierzenie odstępu czasu między bodźcem a reakcją mrugnięcia.
2. Paradygmat eksperymentalny
- Przeprowadzaj badania w blokach po 10 sztuk. Każdy blok powinien zawierać następujące typy prób.
- Uwzględnij osiem sparowanych prób, z których każda składa się z tonu o długości 750 ms (80 dB, 1 kHz), który nakłada się na siebie i kończy 100-milisekundowym zaciągnięciem powietrza (~1/20 psi)9,10,11.
- Uwzględnij niesparowaną próbę, która składa się z pojedynczego tonu o długości 750 ms prezentowanego samodzielnie przy braku zaciągnięcia powietrzem, aby przetestować uwarunkowaną reakcję mrugnięcia oczami wskazującą na uczenie się asocjacyjne.
- Uwzględnij badanie somatosensoryczne składające się z pojedynczego 100-milimetrowego badania zaciągania się powietrzem przedstawionego samodzielnie przy braku tonu, aby przetestować wrażliwość rogówki na zaciągnięcie powietrzem i prawidłowe ułożenie opaski.
- Losowo określ odstęp czasu między kolejnymi próbami (np. 8 - 16 s, ze średnim odstępem czasu próby wynoszącym około 12 sekund)9,10,11.
- Zmierz pięć kolejnych bloków (tj. w sumie 50 prób) podczas jednej sesji, co daje łączny czas sesji około 12 minut.
- Aby sprawdzić, czy kondycjonowanie utrzymuje się, należy przeprowadzić dwie sesje EBC po 50 badań w odstępie co najmniej 1 godziny.
3. Procedura testowania
- Wykonaj EBC w umiarkowanie oświetlonym pomieszczeniu (~300 luksów) ze stałym poziomem oświetlenia między eksperymentami.
- Umieść dwa przenośne głośniki po obu stronach niemowlęcia, około 40 cm z każdej strony głowy.
- Umieść specjalnie wykonany pałąk na głowie niemowlęcia i dostosuj go do rozmiaru głowy.
- Ustaw elastyczną rurkę przytrzymującą dyszę zaciągającą się powietrzem i sąsiedni czujnik podczerwieni tak, aby znajdowały się one w odległości około 1 - 3 cm od prawego oka dziecka pod kątem ~45° od płaszczyzny osiowej głowy (Rysunek 1).
- Przed rozpoczęciem eksperymentu sprawdź, czy konfiguracja eksperymentalna jest zoptymalizowana pod kątem dostarczania zaciągnięcia się powietrza przez rogówkę. Dostarcz pojedynczy testowy wciąg powietrza do oka niemowlęcia i obserwuj, czy pojawia się mrugnięcie oczami i czy jest ono widoczne na kamerze wideo. Jeśli nie zauważysz mrugnięcia, wyreguluj położenie pałąka tak, aby wciągnik powietrza znajdował się bliżej oka.
- Rejestruj reakcje niemowlęcia na mruganie oczami przez cały czas trwania eksperymentu. Ustaw kamerę wideo tak, aby pole widzenia było skierowane w stronę oczu niemowlęcia. Kamera powinna znajdować się na tyle blisko, aby dostrzec niewielkie ruchy gałek ocznych, ale nie na tyle blisko, aby niemowlę mogło wyjść poza kadr, jeśli stanie się wybredne.
- Upewnij się, że eksperymentatorzy są zamaskowani na czas bodźca. Jeśli interfejs użytkownika EBC wskazuje, kiedy odbędzie się następna próba, poproś badacza, aby odsunął się od interfejsu komputera, tak aby nie był świadomy, kiedy zostanie dostarczony następny bodziec. Zapobiegnie to samodzielnej reakcji badacza na bodziec i potencjalnemu przyczynieniu się do wyuczonych reakcji niemowlęcia.
4. Optymalizacja zestawu eksperymentalnego dla jednorocznych niemowląt
- Upewnij się, że dwóch badaczy jest dostępnych do przeprowadzenia eksperymentu.
- Zakładając opaskę na niemowlę, poproś opiekuna, aby ułożył niemowlę na kolanach przodem do boku. Dzięki temu badacz może podejść z boku i za głową niemowlęcia, podczas gdy drugi badacz angażuje niemowlę.
- Zakładanie pałąka i ustawianie ssawki powinno odbywać się tak szybko i spokojnie, jak to możliwe, aby zapewnić posłuszeństwo niemowlęcia. Umieszczenie dłoni na końcówce nasadki zapobiega obracaniu główki niemowlęcia w nasadce podczas ustawiania.
- Trzymaj niemowlę na kolanach opiekuna przez cały czas trwania eksperymentu.
UWAGA: Chociaż krzesełko do karmienia może zapewnić bardziej spójne środowisko między eksperymentami, może to zwiększyć niepokój i zmniejszyć przestrzeganie zaleceń u wielu niemowląt. - W przypadku niemowląt skłonnych do ingerowania w pałąk podczas eksperymentu należy delikatnie odwrócić uwagę.
- Pałąk często porusza się podczas eksperymentu. Jeśli niemowlę nie reaguje już na podmuch powietrza lub pałąk znacznie odsunął się od oka, przerwij eksperyment i dostosuj pozycję pałąka przed kontynuacją.
- Zachęcaj dziecko do patrzenia w górę podczas eksperymentu, aby zwiększyć intensywność ruchów mrugania oczami; w ten sposób można poprawić wykrywanie mrugnięć.
UWAGA: Można to osiągnąć, umieszczając niemowlę przed monitorem odtwarzającym film przyjazny dla niemowląt (np. kreskówkę odpowiednią do wieku z wyłączonym dźwiękiem) nieco powyżej jego linii wzroku.
5. Wykrywanie mrugnięć oczami za pomocą nagrań z kamer wideo
- Pozwól dwóm badaczom niezależnie zdefiniować reakcje mrugania oczami dla każdego eksperymentu.
- Użyj oprogramowania do edycji wideo, aby przeanalizować każdą próbę pod kątem opóźnienia 2,000 ms po rozpoczęciu próby.
- Użyj kształtu fali dźwiękowej, aby wykryć pierwszą klatkę początku próby.
- W przypadku prób sparowanych (CS + US) i niesparowanych (tylko CS) należy zdefiniować początek próby od początku sygnału dźwiękowego.
- W przypadku prób somatosensorycznych, w których prezentowane jest tylko US (zaciągnięcie powietrzem), należy przeprowadzić testy wstępne, aby upewnić się, że mikrofon kamery może wykryć subtelny 100-milimetrowy szum wytwarzany przez zaciągnięcie powietrzem. W przeciwnym razie nagranie wideo wskaźnika początku próby zaprogramowanego w pakiecie oprogramowania pomoże w wykryciu początku zaciągania się powietrza.
- Użyj ścieżki wideo, aby wykryć reakcję na mrugnięcie. Rejestruj opóźnienie mrugania w następujący sposób: Początek mrugania - pierwsza klatka, w której powieki zaczynają się zamykać; Blink peak - pierwsza ramka, w której powieki są maksymalnie zamknięte.
- W razie potrzeby opracuj strategie radzenia sobie z niejednoznacznymi reakcjami. Zobacz poniższe przykłady.
- Rozsądnie wyklucz częściowe mrugnięcia, które mogą wystąpić, gdy powieki nie zamykają się całkowicie o więcej niż ~50%.
- Z dalszych analiz należy wykluczyć próby, w których początek tonu/zaciągnięcia powietrza jest ukryty przez obcy hałas lub w których reakcja na mruganie jest zasłonięta.
- W badaniach, w których obserwuje się wielokrotne mrugnięcia, należy przeanalizować pierwszą reakcję mrugnięcia po rozpoczęciu badania.
- Zapisz liczbę klatek wideo między początkiem bodźca a szczytem mrugania. Przelicz opóźnienie na czas rzeczywisty na podstawie częstotliwości próbkowania kamery wideo.
6. Klasyfikacja odpowiedzi EBC
- Po wykryciu tych prób, w których wystąpiła reakcja mrugnięcia, zdefiniuj typ mrugnięcia, na podstawie jego opóźnienia w stosunku do początku bodźca (Rysunek 2).
- Zdefiniuj mrugnięcie jako reakcję zaskoczenia, jeśli występuje w ciągu pierwszych 200 ms po sygnale; reprezentują one odruchową reakcję na sygnał słuchowy lub mrugnięcia, które zbiegają się w czasie z początkiem tonu, który nastąpiłby niezależnie od zaciągnięcia się powietrza.
UWAGA: Reakcje zaskoczenia można zaobserwować w sparowanych (CS + US) lub niesparowanych (tylko CS) próbach, w których dostarczany jest ton słuchowy. - Zdefiniuj mrugnięcie jako reakcję somatosensoryczną, jeśli występuje w odpowiedzi na zaciągnięcie się powietrzem; wskazuje, czy rogówka jest wrażliwa na zaciągnięcie powietrzem przy obecnej konfiguracji głowicy. Jest to rodzaj reakcji bezwarunkowej (patrz poniżej).
- Zdefiniuj reakcje bezwarunkowe jako reakcje somatosensoryczne na zaciągnięcie się powietrzem podczas sparowanych prób (CS + US), które występują po upływie ponad 650 ms od początku dźwięku.
- Zdefiniuj uwarunkowane reakcje jako mrugnięcia, które są optymalnie zsynchronizowane w czasie, aby zbiegły się z zaciągnięciem powietrza. Są one inicjowane między 350 a 650 ms po rozpoczęciu tonu dla sparowanych lub niesparowanych prób i wskazują, że mogło dojść do asocjacyjnego uczenia się między CS a US.
- Zdefiniuj próbę jako nieudane odpowiedzi, jeśli nie wykryto mrugnięcia w odpowiedzi na zaciągnięcie się powietrzem; można to zaobserwować w przypadku sparowanych prób (CS + US) lub prób somatosensorycznych. Odpowiedzi te wskazują, że podmuch powietrza nie dociera do oka.
- Zdefiniuj mrugnięcie jako reakcję zaskoczenia, jeśli występuje w ciągu pierwszych 200 ms po sygnale; reprezentują one odruchową reakcję na sygnał słuchowy lub mrugnięcia, które zbiegają się w czasie z początkiem tonu, który nastąpiłby niezależnie od zaciągnięcia się powietrza.
7. Analiza uczenia się asocjacyjnego
Uwaga: Wcześniej opisano wiele metod oceny uczenia się asocjacyjnego9,10,11 (opisane krótko tutaj). Badacze powinni zmodyfikować te metody lub opracować własne, aby określić, czy nastąpiło uczenie się asocjacyjne, w zależności od ich eksperymentalnego projektu.
- Po pierwsze, należy wykluczyć badania, w których nie zebrano żadnych użytecznych danych, takich jak te, w których wystąpiły błędy techniczne.
- Oblicz wrażliwość na zaciągnięcie się powietrzem, obliczając procent reakcji mrugania oczami ze wszystkich możliwych prób somatosensorycznych.
- Oceń, czy podczas eksperymentu wystąpiło uczenie asocjacyjne, porównując odsetek odpowiedzi warunkowych w sekwencyjnych blokach 10 prób. Wzrost odsetka odpowiedzi warunkowanych w trakcie eksperymentu może wskazywać na wystąpienie warunkowania.
UWAGA: Alternatywnie, modelowanie zmian w opóźnieniach mrugania oczami w czasie może być wykorzystane do oceny, czy niemowlę dostosowało swoje czasy reakcji w trakcie eksperymentu. - Oceń, czy uczenie się asocjacyjne odbywa się w sesjach eksperymentalnych, czy między dwiema grupami eksperymentalnymi. Użyj dowolnego kryterium, aby określić, czy nastąpiło warunkowanie (np. > 40% warunkowych odpowiedzi w sesji eksperymentalnej)6,9.
Wyniki
Możliwość testowania warunkowania mrugania oka u rocznych niemowląt:
Układ eksperymentalny niezbędny do badania warunkowania mrugania oka jest trudny do zastosowania u rocznych niemowląt. W przeprowadzonych przez nas eksperymentach 35% (11 niemowląt) nie wzięło udziału w badaniu z powodu braku tolerancji na noszenie opaski na głowę lub podawanie podmuchu powietrza na rogówkę (n = 31 niemowląt podjęło próbę). Około połowa (52%, n = 16 niemowląt) ukończyła lub częściowo ukończyła pierwszą serię 50 prób (mediana [IQR] = 22,5 [0 - 50] ukończonych prób). Pozostali uczestniczyli w dwóch sesjach eksperymentalnych.
Uzyskanie wiarygodnych wyników doświadczalnych wymaga prawidłowego ustawienia opaski na głowę oraz modułu podawania podmuchów powietrza przez cały czas trwania eksperymentu. W przypadku niemowląt biorących udział w badaniu, podawanie podmuchu powietrza na rogówkę było możliwe w większości prób (77 ± 6% podmuchów powietrza wywołało odruch mrugnięcia; n = 13 niemowląt/557 podjętych prób podania podmuchu). Pozostałe próby stanowią „próby nieudane”, w których niemowlę nie wykazało wrażliwości na podmuch powietrza.
Rysunek 3 przedstawia skuteczność podawania podmuchów powietrza podczas dwóch eksperymentów warunkowania obejmujących 50 prób. Liczbę zaobserwowanych mrugnięć opisano jako procent prób z podmuchem powietrza (t.j. prób somatosensorycznych lub sparowanych). Reakcje mrugania u pierwszego niemowlęcia zmniejszają się w każdym kolejnym bloku 10 prób, co wskazuje, że opaska na głowę mogła być rozmieszczona nieoptymalnie pod koniec eksperymentu. W przeciwieństwie do tego, drugie niemowlę wykazuje stosunkowo dobrą wrażliwość na podmuch powietrza, przy czym co najmniej 90% prób z podmuchem powietrza skutecznie wywołało reakcję mrugania w każdym kolejnym bloku 10 prób.
Wskaźniki sukcesu detekcji mrugnięcia oka przy użyciu analizy z kamery wideo:
Ręczna kamera wideo zapewnia niezawodną metodę rejestracji odpowiedzi w postaci mrugnięć, umożliwiając badaczowi ręczne śledzenie oczu niemowlęcia. Do identyfikacji odpowiedzi z 90 ± 3% prób (n = 13 niemowląt/608 prób) wykorzystano ręczną analizę klatka po klatce. Pozostałe próby obejmują te, w których oczy niemowlęcia były zasłonięte podczas filmowania.
Chociaż analiza wideo wymaga subiektywnej interpretacji, metoda ta może być wykorzystana do wiarygodnego pomiaru latencji mrugnięcia okiem od momentu wystąpienia bodźca. Nasza analiza czasów odpowiedzi mrugnięciowej, zmierzonych przez dwóch niezależnych obserwatorów, wykazuje dobrą zgodność między sędziami, gdzie średnia różnica między pomiarami wyniosła 28,4 ms, a 95% granice zgodności wynosiły ± 263,9 ms (Rycina 4: n = 4 eksperymenty analizowane przez dwóch obserwatorów/94 reakcje mrugnięcia). Biorąc pod uwagę, że warunkowe mrugnięcia okiem definiuje się jako te, które mieszczą się w oknie 300 ms, pozwala to na uzyskanie wystarczającej precyzji, aby odróżnić odpowiedzi warunkowe od bezwarunkowych. Należy zauważyć, że próby z istotnymi rozbieżnościami mogą zostać łatwo ponownie ocenione po konsultacji między obserwatorami.
Warunkowanie mrugania u jednorocznych niemowląt:
Dwa eksperymenty warunkowania przedstawione na Rysunku 5A i 5B ilustrują opóźnienia reakcji mrugania w trakcie eksperymentu zarówno dla prób sparowanych, jak i niesparowanych. Reakcje mrugania u pierwszego niemowlęcia podczas pierwszej sesji EBC osiągają szczyt po wystąpieniu podmuchu powietrza i poza oknem opóźnienia definiującym reakcję warunkową. Co więcej, niemowlę to nie reaguje na żadną z prób niesparowanych (sam ton). Wspólnie wskazuje to, że niemowlę to nie nauczyło się kojarzyć tonu z podmuchem powietrza podczas pierwszej ekspozycji na paradygmat EBC. W porównaniu z nim drugie niemowlę, uczestniczące w swojej drugiej sesji EBC, rutynowo mruga przed wystąpieniem podmuchu powietrza i reaguje na wszystkie próby niesparowane, co wskazuje, że niemowlę osiągnęło warunkowanie mrugania po początkowej sesji 50 prób. Rysunek 5C ilustruje typową metodę oceny uczenia się asocjacyjnego w wielu próbach i sesjach6,9,10,11. Liczba reakcji warunkowych u obu niemowląt jest opisana w kolejnych blokach po 10 prób oraz jako procent wszystkich prób sparowanych i niesparowanych w każdym bloku. W tym przypadku oba niemowlęta wykazują minimalne zmiany w uczeniu się asocjacyjnym podczas eksperymentu, co ilustruje brak warunkowania (niemowlę 1, sesja 1) lub fakt, że warunkowanie już nastąpiło (niemowlę 2, sesja 2).
Rysunek 1: Układ do warunkowania mrugnięcia powieką z udziałem rocznego niemowlęcia. Przedstawiono wykonaną na zamówienie opaskę podtrzymującą urządzenie do podawania podmuchów powietrza. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 2: Definicje bodźców i reakcji dla paradygmatu warunkowania mrugnięcia oka odpowiedniego do eksperymentów z rocznymi dziećmi. (A) Podczas prób parowanych 750-ms słyszalny sygnał dźwiękowy (bodziec warunkowany [CS]) nakłada się i kończy wraz ze 100-ms podmuchem powietrza (bodziec bezwarunkowy [US]). Reakcje mrugnięcia różnią się w zależności od ich czasu wystąpienia względem początku bodźca (reakcja przestrachu: 0 - 200 ms; reakcja warunkowana [CR]: 350 - 650 ms; reakcja bezwarunkowa [UR]: 650 - 2,000 ms). Definicje reakcji są identyczne dla prób nieparowanych (tylko CS). (B) Próby somatosensoryczne polegają na podaniu wyłącznie pojedynczego 100-ms podmuchu powietrza (US), a mrugnięcia występujące w oknie 300-ms są klasyfikowane jako reakcje somatosensoryczne (SSR). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 3: Przykład eksperymentów nad warunkowaniem mrugania u jednorocznych niemowląt, ilustrujący zmienność wrażliwości na podmuch powietrza. Wrażliwość na podmuch powietrza opisano jako liczbę zaobserwowanych reakcji na podmuch powietrza (podawany albo w próbie somatosensorycznej, albo w próbie sparowanej) jako procent wszystkich prób z podmuchem powietrza w każdym kolejnym bloku 10 prób. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 4: Wykres Blanda-Altmana ilustrujący zgodność czasów reakcji mrugania zmierzonych z nagrań z kamery wideo przez dwóch niezależnych obserwatorów. Szare linie wskazują obciążenie między pomiarami (zdefiniowane jako średnia różnica między pomiarami) oraz górną i dolną granicę zgodności (LOA, zdefiniowaną jako średnia różnica ± 1,96 odchylenia standardowego). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5: Przykład eksperymentów nad warunkowaniem mrugania u jednorocznych niemowląt, ilustrujący zmienność reakcji uwarunkowanych. Przedstawiono czasy reakcji mrugania dla prób sparowanych (CS + US) (czarne koła) oraz prób niesparowanych (tylko CS) (szare kwadraty). Szary pasek wskazuje moment podania podmuchu powietrza, a czarne linie wskazują latencję w przedziale 350 - 650 ms, służącą do zdefiniowania reakcji uwarunkowanej. Próby, które nie wywołały reakcji, są przedstawione na osi x. (A) Reakcje mrugania zazwyczaj wypadają poza oknem warunkowania, a próby niesparowane nie wywołały reakcji mrugania. (B) Reakcje są odpowiednio zsynchronizowane z wystąpieniem podmuchu powietrza, a odpowiedzi niesparowane i próby sparowane inicjują reakcję uwarunkowaną. (C) Warunkowanie w trakcie eksperymentu jest przedstawione jako liczba reakcji uwarunkowanych (opisana jako procent wszystkich prób sparowanych i niesparowanych) w każdym kolejnym bloku 10 prób. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Modyfikacje i rozwiązywanie problemów:
Komercyjne lub wykonane na zamówienie systemy warunkowania mrugania powinny prezentować bodźce badanemu w eksperymentalnie kontrolowany sposób i być w stanie wykryć reakcje behawioralne. Chociaż jest to procedura nieinwazyjna, wymagania techniczne dotyczące przeprowadzania tych eksperymentów w mniej posłusznych populacjach (np. niemowlętach) są trudne. Fizyczne przymocowanie mocowania głowy do oka jest możliwe w doświadczeniach na zwierzętach, takich jak eksperymenty kondycjonujące na owcach12,13. Starsze dzieci mogą tolerować noszenie opaski na głowę z dołączoną jednostką powietrzną 6,7,8 i mogą być zachęcane do utrzymywania stałej pozycji oczu za pomocą telewizji jako odwrócenia uwagi. Chociaż przestrzeganie zaleceń u bardzo małych niemowląt można osiągnąć poprzez kondycjonowanie podczas snu14, starsze niemowlęta zbliżające się do pierwszego roku życia na ogół łatwo się rozpraszają, co czyni je wyjątkowo wymagającą populacją. Pomimo wyzwań, eksperymenty z kondycjonowaniem mrugania oczami są możliwe dla niektórych rozbudzonych, rocznych niemowląt. Nasze wskaźniki sukcesu są podobne do tych opisanych wcześniej w literaturze (~40% - 50% zgodności)9, przy czym prawdopodobieństwo sukcesu prawdopodobnie odzwierciedla temperament niemowlęcia w dniu eksperymentu.
Kluczowe kroki w ramach protokołu:
Zalecamy dostosowanie dostępnej na rynku konfiguracji EBC lub użycie niestandardowego generatora ciśnienia powietrza, jak opisano wcześniej, dla młodszych niemowląt 9,10,11. Początkowym wyzwaniem jest utrzymanie jednostki doprowadzającej powietrze we właściwej pozycji przez cały czas trwania eksperymentu, co wymaga mniejszego, zmodyfikowanego nakrycia głowy. Bezpieczeństwo oczu jest szczególnym problemem dla niemowląt, które nie przestrzegają przepisów, a które próbują samodzielnie zdjąć nakrycie głowy. Dlatego niemowlęta muszą być przez cały czas ściśle monitorowane. Część dzieci nie będzie tolerować noszenia opaski na głowę lub przyjmowania podmuchu powietrza do oka (tutaj ~35%), chociaż można to poprawić, delikatnie odwracając uwagę niemowlęcia, jeśli protokół eksperymentalny na to pozwala i jeśli nie ingeruje to jawnie w zachowanie niemowlęcia. Dla dzieci, które ukończą eksperyment, próby tylko z zaciągnięciem się powietrzem są niezbędne, aby potwierdzić, że nakrycie głowy zostało prawidłowo ustawione, ponieważ brak lub odwrócenie reakcji warunkowania może być spowodowane słabym dostarczaniem zaciągnięcia powietrzem przez cały eksperyment.
Podczas gdy ręczna analiza wideo jest czasochłonna, zautomatyzowane pomiary reakcji niemowląt na mruganie są obecnie trudne do osiągnięcia. Czujniki podczerwieni dostarczane z komercyjnymi konfiguracjami EBC (umieszczonymi na pałąku przylegającym do jednostki zaciągania powietrza) rejestrują odbicie od rogówki z chwili na chwilę z częstotliwością próbkowania 1 kHz, a mrugnięcia można wykryć, mierząc zmianę odbicia po nadejściu bodźca. Znaczące zmiany w stosunku do wyjściowego współczynnika odbicia wskazują, że wystąpiło mrugnięcie, a automatyczna analiza może być wykorzystana do wykrywania i klasyfikowania reakcji na mruganie. Jednak my i inni 9,10,11 sugerujemy, że naukowcy nie powinni polegać na pomiarach odbicia rogówki w podczerwieni dostarczanych z komercyjnymi zestawami EBC do wykrywania mrugnięć u rocznych dzieci. Chociaż ta metoda może być odpowiednia dla dorosłych uczestników lub starszych dzieci 6,7, nie byliśmy w stanie wiarygodnie wykryć mrugnięć u jednorocznych dzieci za pomocą tej metody. W tym przypadku obserwuje się znikomą zmianę wyjściowego współczynnika odbicia na przestrzeni całej epoki próby, co wskazuje, że mrugnięcie nie jest wykrywane przez czujnik podczerwieni. Ponadto często obserwuje się fałszywie dodatnie szczyty, które są spowodowane ruchami głowy niemowlęcia, które zmieniają położenie czujnika. Testy pilotażowe przeprowadzone na osobach dorosłych sugerują, że uczestnik musi skupić się na poziomej linii wzroku lub nieco powyżej niej, z jednostką zaciągania się powietrzem umieszczoną w odległości 1-2 cm od rogówki, aby skutecznie wykryć mruganie oczami - stany, których nie można utrzymać w sposób spójny u niemowlęcia. Ponadto mały rozmiar szczeliny międzypowiekowej u niemowląt może zmniejszać współczynnik odbicia rogówki, co utrudnia wykrywanie mrugania niż u dorosłych lub starszych dzieci.
Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod:
Pomimo konieczności ręcznej analizy z kamery wideo i niższej rozdzielczości czasowej wideo 60 Hz w porównaniu z pomiarami odbicia 1 kHz, lepsze wskaźniki sukcesu nagrań wideo sprawiają, że jest to lepsza metoda niż czujnik podczerwieni. Chociaż zaciągnięcie powietrzem przez rogówkę jest również dostarczane przez tę samą nasadkę głowicy, co komercyjny czujnik podczerwieni, dostarczanie bodźca wydaje się być bardziej odporne na pozycjonowanie niż czujnik podczerwieni, ponieważ siłę zaciągania się powietrzem można regulować zgodnie z wymaganiami. Pozwala to uniknąć nadmiernej regulacji pałąka, która ma tendencję do zmniejszania podatności niemowląt. Naukowcy, którzy mogą osiągnąć wyższe wskaźniki sukcesu przy użyciu czujnika podczerwieni, mogą nadal wymagać wsparcia w analizie z kamery wideo. W przypadku prób, w których czujnik podczerwieni nie zarejestrował wykrywalnej reakcji na mrugnięcie okiem, nagrania wideo mogą odróżnić prawdziwe odpowiedzi od nieprawidłowych prób (tj. czy dziecko nosiło urządzenie do zaciągania się powietrzem we właściwej pozycji, czy nie mrugało lub czy czujnik podczerwieni nie wykrył mrugnięcia). Podobnie, nagrania wideo są niezbędne do potwierdzenia wyników fałszywie dodatnich, ponieważ ruchy podczas badania mogą również powodować powstawanie artefaktów udających mrugnięcia. Aparat do śledzenia ruchu gałek ocznych15,16 i elektromiografia 9,10,14 mięśnia okrężnego oka to inne zautomatyzowane metody wykrywania mrugania, które wykraczają poza zakres tego artykułu, chociaż bez wizualnego potwierdzenia umiejscowienia jednostki zaciągnięcia się powietrzem dla każdej próby, metody te mogą mieć te same wady, co opisane tutaj oprogramowanie do wykrywania mrugania w podczerwieni.
Wcześniej opublikowane prace na temat kondycjonowania mrugania oczami koncentrowały się na młodszych niemowlętach, zwykle w wieku 4-5 miesięcy; Niniejsza praca uzupełnia tę literaturę, opisując techniki stosowania u starszych niemowląt (w wieku od 12 ± 1 miesiąca) oraz wyjątkowe wyzwania, jakie stawia przed tą grupą wiekową. Inni autorzy również wykorzystali analizę wideo (samodzielnie lub w połączeniu z elektromiografią) z niemowlętami 9,10,11,14. Przedstawione tutaj wyniki są zgodne z wcześniejszymi odkryciami, które sugerują, że analiza wideo klatka po klatce jest najlepszą metodą wykrywania mrugnięć u niemowląt, ponieważ zarówno elektromiografia, jak i monitorowanie w podczerwieni mogą być problematyczne ze względu na ruchy twarzy i głowy u bardzo małych dzieci. Praca ta potwierdza również odkrycie, że niemowlęta mogą rozwijać uwarunkowane reakcje nawet w bardzo młodym wieku, przynajmniej przez 650-milimetrowy interwał opóźnienia9.
Przyszłe aplikacje:
Ponieważ w ograniczonej liczbie badań podjęto próby eksperymentów z kondycjonowaniem mrugania oczami u niemowląt, parametry bodźca powinny być dokładnie rozważone w przyszłych eksperymentach. Kondycjonowanie obserwowano już w 10 dniu życia w wieku17 lat i co najmniej w pierwszym miesiącu życia14 lat, chociaż długie przerwy między bodźcami (np. 1500 ms) wydają się być bardziej skuteczne w tych bardzo wczesnych stadiach niemowlęctwa18. Dla porównania, dzieci zbliżające się do szóstego miesiąca życia mogą być bardziej niezawodnie kondycjonowane w krótszym odstępie10, choć mniej skutecznie niż u dorosłych19. Odstęp 650 ms między dźwiękiem a zaciągnięciem powietrza sugerowany dla rocznych dzieci w tym protokole może z powodzeniem wywołać kondycjonowanie u 4- lub 5-miesięcznych niemowląt 9,10,11, a także u starszych dzieci 6,7. Sugeruje to, że kondycjonowanie mrugania oczami jest regulowane rozwojowo, a optymalne opóźnienie między tonem a zaciągnięciem powietrza zmniejsza się wraz z niemowlęciem w wieku10 lat, chociaż wymagane są dodatkowe eksperymenty dostosowujące ten protokół w celu dalszego zbadania tych parametrów.
Ograniczenia tej techniki:
Konfiguracja EBC może być trudna i może wymagać rozwiązywania problemów w każdej indywidualnej sytuacji. Określenie, kiedy nastąpiło warunkowanie, jest trudne do zdefiniowania i najlepiej zaobserwować je podczas wielu prób lub sesji. Na przykład w innych badaniach stosowano arbitralny wskaźnik kondycjonowania wynoszący 40% w każdym bloku 10 prób w celu zdefiniowania warunkowania i porównania wszelkich zmian między kolejnymi sesjami eksperymentalnymi 6,9,10,11. Pomyślne ukończenie wymaganej liczby prób w celu zaobserwowania kondycjonowania może być zatem trudne do osiągnięcia u małych dzieci.
Jeśli chodzi o analizę danych, jednym ze szczególnych wyzwań jest oddzielenie mrugnięć wywołanych bodźcem od mrugnięć spontanicznych (endogennych)9. Częstość spontanicznych mrugnięć oczami jest różna u poszczególnych osób, ale mogą na nią wpływać czynniki środowiskowe, takie jak wilgotność w pomieszczeniu, a także stany behawioralne. Podwójne mrugnięcia występują, gdy w bardzo krótkim czasie (np. 400 ms)20 występują dwa całkowite zamknięcia powiek i możliwe jest, że odzwierciedlają one spontaniczne mrugnięcia występujące w tym samym czasie, co odruchowe (uwarunkowane lub bezwarunkowe) mrugnięcie oczami. Od czasu do czasu obserwowaliśmy podwójne mrugnięcia w naszym zestawie danych i korzystając z tego protokołu, rejestrowaliśmy opóźnienie tylko do pierwszego mrugnięcia. Jednak odrzucenie tych prób może zwiększyć pewność, że analiza obejmuje tylko mrugnięcia wywołane bodźcem.
Naukowcy będą również musieli podjąć decyzje dotyczące okna opóźnienia, w którym zdefiniować reakcję warunkową lub bezwarunkową, a także czy zdefiniować opóźnienie do początku mrugania, czy do szczytu mrugania (zamknięcie powieki). Tutaj konserwatywnie zdefiniowaliśmy reakcję warunkową jako mrugnięcie, które osiąga szczyt przed 650 ms w próbach sparowanych lub niesparowanych, aby zapewnić pewność, że mrugnięcie jest inicjowane przed nadejściem zaciągnięcia się powietrzem, a nie w odpowiedzi na zaciągnięcie się powietrzem. Jednak to okno opóźnienia można wydłużyć dla prób niesparowanych, w których nie występuje zaciągnięcie powietrzem, szczególnie w przypadku użycia szczytu mrugnięcia do zdefiniowania opóźnienia odpowiedzi. Ważną zasadą jest to, że wszystkie instancje są rozpatrywane w ten sam sposób, przez wszystkich egzaminatorów, a kryterium to jest ustalane przed rozpoczęciem jakiejkolwiek analizy danych.
Podsumowując, analiza wideo klatka po klatce może zapewnić wiarygodną i powtarzalną metodę oceny klasycznych reakcji EBC u małych niemowląt. Miary te stanowią jedną miarę zachowań związanych z uczeniem się, chociaż do pełnego scharakteryzowania rozwoju neurologicznego w okresie niemowlęcym wymagana jest kompleksowa ocena rozwojowa.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez New Zealand Optometric Vision Research Foundation, Health Promotion Agency, The University of Auckland Faculty Research Development Fund, oraz The University of Auckland School of Medicine PBRF fund.
Jesteśmy wdzięczni dwóm studentom optometrii z Uniwersytetu w Auckland (Shannon Boy i Harpreet Singh), którzy przeprowadzili ręczną analizę wideo, aby sprawdzić zgodność w pomiarach reakcji na mrugnięcie.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| System kondycjonowania mrugnięcia oczami | San Diego Instruments | Model #2325-0145-W | zawiera przenośną jednostkę powietrzną i emiter/odbiornik podczerwieni zamontowany na regulowanym pałąku; oprogramowanie do wykrywania bodźców i reakcji mrugnięć; Interfejs PC |
| Kamera sportowa 4K Ultra HD | RV77 | Model SJ9000 | nagrywanie na karcie micro SD / TF 90 kl./s przy 720p |
Bibliografia
- Freeman, J. H., Steinmetz, A. B. Neural circuitry and plasticity mechanisms underlying delay eyeblink conditioning. Learning & Memory. 18 (10), 666-677 (2011).
- Mccormick, D. A., et al. The engram found? Role of the cerebellum in classical conditioning of nictitating membrane and eyelid responses. Bulletin of the Psychonomic Society. 18 (3), 103-105 (1981).
- Bolbecker, A. R., et al. Eye-blink conditioning deficits indicate temporal processing abnormalities in schizophrenia. Schizophrenia Research. 111 (1-3), 182-191 (2009).
- Sears, L. L., Finn, P. R., Steinmetz, J. E. Abnormal classical eye-blink conditioning in autism. Journal of Autism and Development Disorders. 24 (6), 737-751 (1994).
- Oristaglio, J., et al. Children with autism spectrum disorders show abnormal conditioned response timing on delay, but not trace, eyeblink conditioning. Neuroscience. 248, 708-718 (2013).
- Jacobson, S. W., et al. Impaired eyeblink conditioning in children with fetal alcohol syndrome. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 32 (2), 365-372 (2008).
- Jacobson, S. W., et al. Impaired delay and trace eyeblink conditioning in school-age children with fetal alcohol syndrome. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 35 (2), 250-264 (2011).
- Ohlrich, E. S., Ross, L. E. Acquisition and differential conditioning of the eyelid response in normal and retarded children. Journal of Experimental Child Psychology. 6 (2), 181-193 (1968).
- Ivkovich, D., Eckermann, C. O., Krasnegor, N. A., Stanton, M. E. Using eyeblink conditioning to assess neurocognitive development. Eyeblink Classical Conditioning: Volume I. Woodruff-Pak, D., Steinmetz, J. E. , Springer. Boston, MA. 119-142 (2002).
- Klaflin, D. I., Stanton, M. E., Herbert, J., Greer, J., Eckerman, C. O. Effect of delay interval on classical eyeblink conditioning in 5 month old human infants. Developmental Psychobiology. 41 (4), 329-340 (2002).
- Ivkovich, D., Collins, K. L., Eckerman, C. O., Krasnegor, N. A., Stanton, M. E. Classical Delay Eyeblink Conditioning in 4- and 5-Month-Old Human Infants. Psychological Science. 10 (1), 4-8 (1999).
- Nation, K., et al. Video-based data acquisition system for use in eye blink classical conditioning procedures in sheep. Behavior Research Methods. , 1-14 (2016).
- Johnson, T. B., Stanton, M. E., Goodlett, C. R., Cudd, T. A. Eyeblink classical conditioning in the preweanling lamb. Behavioral Neuroscience. 122 (3), 722-729 (2008).
- Reeb-Sutherland, B. C., et al. One-month-old Human Infants Learn About the Social World While They Sleep. Developmental Science. 14 (5), 1134-1141 (2011).
- Kulke, L., Atkinson, J., Braddick, O. Automatic Detection of Attention Shifts in Infancy: Eye Tracking in the Fixation Shift Paradigm. PLoS One. 10 (12), e0142505(2015).
- Meng, X., Uto, Y., Hashiya, K. Observing Third-Party Attentional Relationships Affects Infants' Gaze Following: An Eye-Tracking Study. Frontiers in Psychology. 7, 2065(2016).
- Naito, T., Lipsitt, L. P. Two attempts to condition eyelid responses in human infants. Journal of Experimental Child Psychology. 8 (2), 263-270 (1969).
- Little, A. H., Lipsitt, L. P., Rovee-Collier, C. Classical conditioning and retention of the infant's eyelid response: effects of age and interstimulus interval. Journal of Experimental Child Psychology. 37 (3), 512-524 (1984).
- Hoffman, H. S., Cohen, M. E., Devido, C. J. A comparison of classical eyelid conditioning in adults and infants. Infant Behavior and Development. 8 (3), 247-254 (1985).
- Nakanishi, M., Mitsukura, Y., Wang, Y., Wang, Y. T., Jung, T. P. Online Voluntary Eye Blink Detection using Electrooculogram. IEICE Proceeding Series. , (2012).
Przedruki i uprawnienia
