W tym protokole opisujemy metodę mikropipet, która bezpośrednio przykłada kontrolowaną siłę do jądra w żywej komórce. Test ten pozwala na zbadanie właściwości mechanicznych jądra w żywej, przylegającej komórce.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Sonda siły bezpośredniej do pomiaru integracji mechanicznej między jądrem a cytoszkieletem
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Właściwości mechaniczne jądra determinują jego reakcję na siły mechaniczne generowane w komórkach. Ponieważ jądro jest molekularnie ciągłe z cytoszkieletem, potrzebne są metody badania jego mechanicznego zachowania w przylegających komórkach. W tym miejscu omawiamy sondę siły bezpośredniej (DFP) jako narzędzie do przykładania siły bezpośrednio do jądra w żywej komórce przylegającej. Mocujemy wąską mikropipetę do powierzchni jądrowej za pomocą ssania. Mikropipeta jest odsuwana od jądra, co powoduje jego deformację i translację. Gdy siła przywracająca jest równa sile ssania, jądro odłącza się i elastycznie rozluźnia. Ponieważ ciśnienie ssania jest dokładnie znane, znana jest siła działająca na powierzchnię jądra. Metoda ta ujawniła, że siły w skali nano są wystarczające do deformacji i translacji jądra w przylegających komórkach, a także zidentyfikowała elementy cytoszkieletu, które umożliwiają jądru oparcie się siłom. DFP może być używany do analizy udziału składników komórkowych i jądrowych w jądrowych właściwościach mechanicznych w żywych komórkach.
Wprowadzenie
Patologie, takie jak rak, obejmują zmiany w kształcie i strukturze jądra1,2, którym zazwyczaj towarzyszy 'zmiękczenie' jądra3,4. Odporność jądra na odkształcenia mechaniczne jest ogólnie charakteryzowana przez przyłożenie siły do izolowanych jąder5.
Jądro w komórkach jest molekularnie połączone z cytoszkieletem przez łącznik kompleksu nukleoszkieletu i cytoszkieletu (LINC)6,7,8,9. W rezultacie jądro jest mechanicznie zintegrowane z cytoszkieletem i, poprzez adhezje komórka-podłoże, z macierzą zewnątrzkomórkową. Mechaniczne sondowanie jądra wewnątrz przylegających komórek może dostarczyć informacji na temat tej mechanicznej integracji. Metody manipulowania jądrami w żywych komórkach obejmują aspirację mikropipet10,11 oraz mikroskopię sił atomowych12,13,14. Niedawno opisaliśmy sondę siły bezpośredniej (DFP), która przykłada siły mechaniczne bezpośrednio do jądra w żywej komórce przylegającej15.
Tutaj opisujemy procedurę korzystania z systemu mikroiniekcji, który jest powszechnie dostępny w obiektach mikroskopowych, do przykładania znanej, nano-skalowej siły mechanicznej bezpośrednio do jądra w przylegającej komórce. Końcówka femtotip (końcówka mikropipety o średnicy 0,5 μm) jest zamontowana i połączona z systemem mikroiniekcji za pomocą rurki. Końcówka, umieszczona pod kątem 45° w stosunku do powierzchni szalki hodowlanej, jest opuszczana do momentu przylegania do powierzchni jądrowej. Rurka jest następnie odłączana i otwierana do atmosfery, co wytwarza ujemne ciśnienie ssania na powierzchni jądrowej i uszczelnia końcówkę mikropipety względem powierzchni jądrowej. Poprzez przesunięcie końcówki mikropipety jądro jest odkształcane i ostatecznie (w zależności od wielkości przyłożonej siły) odłączane od mikropipety. To oderwanie występuje, gdy siły przywracające (stawiające opór) wywierane przez jądro i komórkę są równe sile ssania przyłożonej przez mikropipetę. Analizę można przeprowadzić, mierząc przemieszczenie jądra, długość odkształcenia (równanie 1) lub odkształcenie powierzchniowe (Rysunek 1A).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie komórek do obrazowania
UWAGA: sonda bezpośredniej siły (DFP) może być stosowana do każdego typu komórek adherentnych. W niniejszym protokole jako modelowa linia komórkowa wykorzystane zostały fibroblasty mysie NIH 3T3.
- Hodować komórki fibroblastów NIH 3T3 w pożywce DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) uzupełnionej o 10% płatkowego surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny-streptomycyny w naczyniach szklanych o dnie 35 mm aż do osiągnięcia pożądanej konfluencji. Utrzymywać komórki w temperaturze 37 °C i w atmosferze 5% CO2.
- Przed wysiewem komórek NIH 3T3 do obrazowania należy upewnić się, że wszystkie naczynia szklane o dnie 35 mm zostały pokryte fibronektyną (lub podobnym białkiem ECM) w stężeniu 5 µg/mL.
UWAGA: W celu przeprowadzenia eksperymentu komórki muszą być w pełni rozprzestrzenione i przylegające do dna naczynia. Metoda DFP nie nakłada żadnych ograniczeń w zakresie konfluencji.
- Przed wysiewem komórek NIH 3T3 do obrazowania należy upewnić się, że wszystkie naczynia szklane o dnie 35 mm zostały pokryte fibronektyną (lub podobnym białkiem ECM) w stężeniu 5 µg/mL.
- Bezpośrednio przed eksperymentem przemyć komórki dwukrotnie za pomocą PBS, a następnie jednokrotnie za pomocą pełnej pożywki wzrostowej.
- Dodać 3 mL pełnej pożywki wzrostowej do naczynia o szklanym dnie.
2. Mikroskopia i akwizycja obrazu
Uwaga: Odwrócony mikroskop fluorescencyjny (lub odpowiednik) z mikromanipulatorem zamontowanym do ramienia bocznego, zgodnie z zaleceniami producenta. Mikroskop powinien być również wyposażony w komorę środowiskową w celu utrzymania temperatury 37 °C oraz poziomu CO2 na poziomie 5%. Wymagany jest również mikromanipulator i mikroinżektor przymocowane do mikroskopu. Do eksperymentów zaleca się stosowanie obiektywów imersyjnych olejowych 40x/1.3 NA lub 60x/1.49 NA (lub odpowiednich zamienników). Mikroskop powinien być ustawiony na stole wibroizolacyjnym.
Rycina 1. Deformacja jądra i ustawianie ostrości mikroskopu
A. Maksymalna deformacja jądra i relaksacja deformacji jądra. Przed obliczeniem maksymalnej deformacji jądra, w celu skorygowania translacji zdeformowanego jądra, najpierw dopasowano tylne krawędzie kształtów jądra. Kształt jądra w momencie odczepienia końcówki mikropipety nałożono na początkowy kształt jądra przed rozciąganiem. Różnicę pól powierzchni między tymi dwoma kształtami zmierzono jako ΔA1. Maksymalną deformację jądra zdefiniowano jako ΔA1 podzielone przez pierwotną powierzchnię jądra. Analogicznie, drugi parametr, ΔA2, można zdefiniować poprzez nałożenie końcowego, ustalonego kształtu jądra po odczepieniu mikropipety na pierwotny kształt jądra. B. Ustawienie ostrości komórki w płaszczyźnie A, a następnie przesunięcie płaszczyzny ogniskowania w górę do płaszczyzny B w celu zlokalizowania końcówki mikropipety. Podczas obrazowania mikropipeta była przesuwana w prawo (kierunek pomarańczowej strzałki). Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Neelam et al.15. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Włącz mikroinżektor zgodnie z protokołem producenta.
- Za pomocą zakraplacza do oleju imersyjnego nanieś jedną kroplę oleju imersyjnego na górną powierzchnię obiektywu.
- Mocno przymocuj szalkę w uchwycie i umieść uchwyt na stoliku.
UWAGA: Przez cały czas trwania eksperymentu komórki muszą być utrzymywane w temperaturze 37 °C i przy stężeniu 5% CO2. - Wyreguluj wysokość obiektywu, aby ustawić ostrość na komórkach (Płaszczyzna A, Rycina 1B).
- Przesuwaj stolik mikroskopu, aby znaleźć interesującą komórkę.
- Obróć joystick mikromanipulatora, aby przesunąć uchwyt pipety do pozycji górnej. Umieść mikropipetę o średnicy końcówki 0,5 µm w uchwycie.
- Aby zapobiec adhezji komórek do mikropipety, poddaj końcówkę mikropipety działaniu roztworu PLL-g-PEG o stężeniu 0,3 mg/mL przez 1 h w temperaturze pokojowej. Przetestuj adhezję, dotykając końcówką mikropipety jądra komórkowego bez stosowania podciśnienia, a następnie odsuwając mikropipetę od jądra. Brak adhezji objawia się całkowitym brakiem deformacji i przemieszczenia jądra.
UWAGA: Prosimy postępować zgodnie z zaleceniami producenta podczas otwierania opakowania.
- Aby zapobiec adhezji komórek do mikropipety, poddaj końcówkę mikropipety działaniu roztworu PLL-g-PEG o stężeniu 0,3 mg/mL przez 1 h w temperaturze pokojowej. Przetestuj adhezję, dotykając końcówką mikropipety jądra komórkowego bez stosowania podciśnienia, a następnie odsuwając mikropipetę od jądra. Brak adhezji objawia się całkowitym brakiem deformacji i przemieszczenia jądra.
- Podnieś płaszczyznę ogniskowej obiektywu powyżej Płaszczyzny A i górnej części komórki do Płaszczyzny B, regulując pokrętło precyzyjne (Rycina 1B, patrz krok 2.4).
- Ustaw mikromanipulator w trybie regulacji Coarse (grubej). Powoli opuszczaj mikropipetę do Płaszczyzny B, obserwując jej sylwetkę, aż mikropipeta zostanie całkowicie ustawiona w ostrości.
- Gdy końcówka mikropipety znajdzie się w ostrości, przełącz mikromanipulator w tryb regulacji Fine (precyzyjnej).
- Opuść obiektyw do płaszczyzny równikowej komórki (Płaszczyzna A, Rycina 1B) i opuść mikropipetę na wysokość około 15 µm powyżej Płaszczyzny A (Rycina 1B, przerywana linia mikropipety).
- Ustaw ciśnienie kompensacyjne (Pc) w mikroinżektorze na pożądanej wartości; odczekaj kilka sekund do ustabilizowania się ciśnienia.
UWAGA: Optymalna wartość nastawy ciśnienia zależy zarówno od typu komórki, jak i od konkretnych celów eksperymentu. W większości przypadków dobrym punktem wyjścia będzie 300 hPa. - Upewnij się, że mikropipeta nie jest zapchana, używając ustawienia Clean na panelu mikromanipulatora i sprawdzając, czy z końcówki mikropipety wydobywają się pęcherzyki powietrza.
- Wprowadź końcówkę do komórki, stopniowo opuszczając mikropipetę, aż końcówka lekko dotknie powierzchni jądra.
UWAGA: Podczas opuszczania mikropipety sylwetka jej końcówki stanie się wyraźna w miarę ustawiania ostrości. Zanim mikropipeta dotknie jądra, podnieś ostrość obiektywu i wyrównaj końcówkę mikropipety z jądrem (te same współrzędne x-y, wyższa płaszczyzna z). Przywróć ostrość do płaszczyzny równikowej jądra (Płaszczyzna A, Rycina 1B) i stopniowo opuszczaj końcówkę mikropipety. - Utwórz uszczelnienie między końcówką mikropipety a błoną jądrową, odłączając rurkę doprowadzającą ciśnienie z systemu mikroiniekcji, otwierając tym samym koniec rurki mikropipety na atmosferę. Ten krok wytwarza na powierzchni jądra ciśnienie ujemne równe Pc.
- Wykonaj akwizycję obrazów za pomocą oprogramowania do zbierania obrazów z mikroskopu. Skonfiguruj akwizycję avi (wideo) lub nd (obrazy) w programie.
UWAGA: W przypadku dowolnego oprogramowania do akwizycji obrazów ustaw obrazowanie wideo w czasie rzeczywistym lub akwizycję obrazów time-lapse z krótkim interwałem czasowym. - Przełącz na odpowiedni kanał obrazowania fluorescencyjnego (np. GFP, RFP itp.) i rozpocznij obrazowanie.
- Przesuwaj końcówkę mikropipety w kierunku przeciwnym do ciała komórki (w prawo, Rycina 1B), aż jądro oddzieli się od mikropipety.
UWAGA: Odciągaj końcówkę wzdłuż dodatniej osi x (w prawo w polu widzenia). Szybkość odciągania może być programowana i kontrolowana komputerowo lub joystick może być przesuwany ręcznie. Nie stwierdzono żadnej korelacji między szybkością odciągania a deformacją jądra15, co sugeruje reakcję głównie sprężystą na przyłożoną siłę.
3. Analiza danych
- Przeprowadzić analizę obrazu przy użyciu dowolnego podstawowego oprogramowania do przetwarzania obrazów. Stopień deformacji jądra można określić za pomocą odkształcenia liniowego (Ɛ) lub odkształcenia powierzchniowego (Rycina 1A). Wartość odkształcenia liniowego należy obliczyć zgodnie z równaniem 1, gdzie L i L0 oznaczają odpowiednio długość jądra w momencie maksymalnej deformacji oraz w pozycji początkowej.
(Równanie 1)
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 2A przedstawia wymuszanie deformacji jądra fibroblasta mysiego linii NIH 3T3. W miarę przesuwania końcówki mikropipety w prawo jądro ulega deformacji, a ostatecznie odrywa się od końcówki mikropipety. Widać, że odkształcenie podłużne jądra zwiększa się wraz ze wzrostem siły ssania (Rysunek 2B). Przednia krawędź jądra (krawędź przyciągana przez mikropipetę) tworzy wypukłość jądrową, natomiast krawędź tylna zostaje przesuni...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Pomiar mechanicznej integracji jądra z cytoszkieletem jest wyzwaniem dla większości obecnych metod, takich jak aspiracja mikropipet16, ponieważ wymagają one albo izolowanych jąder (gdzie jądro jest oddzielone od cytoszkieletu), albo jąder w zawieszonych komórkach (gdzie nie występują siły zewnątrzkomórkowe, takie jak siły trakcyjne). Do jądra przyłożono siłę poprzez przyłożenie dwuosiowego odkształcenia do komórek przylegających do błony17,18
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez NIH R01 EB014869.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| FluoroDish | WPI | FD35 | |
| SYTO 59 | ThermoFisher Scientific | S11341 | |
| Femtotips | Eppendorf | 930000043 | |
| InjectMan NI2 | Eppendorf | NA | wycofany z produkcji, obecny odpowiednik modelu: InjectMan 4 |
| FemtoJet | Eppendorf | NA | Obecny model FemtoJet 4i |
| Plan Fluor olejek immersyjny 40x | Nikon | NA | |
| Apo TIRF olejek zanurzeniowy 60x | Nikon | NA | |
| Dawca Serum bydlęce (DBS) | ThermoFisher Naukowe | 16030074 | Serum NIH 3T3 |
| Modyfikacja Eagle's (DMEM) | Mediatech cellgro | MT10013CVRF | NIH 3T3 podłoże |
| Penicylina-Streptomycyna | Mediatech | MT30004CIRF | NIH 3T3 średni suplement |
| Olejek immersyjny typu LDF Niefluorescencyjny | Nikon | 77007 | Olejek immersyjny do soczewek obiektywowych |
Bibliografia
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nature Reviews Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nature Reviews Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
- Bank, E. M., Gruenbaum, Y. The nuclear lamina and heterochromatin: a complex relationship. Biochemical Society Transactions. 39 (6), 1705-1709 (2011).
- Lammerding, J., et al. Lamins A and C but not lamin B1 regulate nuclear mechanics. Journal of Biological Chemistry. 281 (35), 25768-25780 (2006).
- Dahl, K. N., Engler, A. J., Pajerowski, J. D., Discher, D. E. Power-law rheology of isolated nuclei with deformation mapping of nuclear substructures. Biophysical Journal. 89 (4), 2855-2864 (2005).
- Crisp, M., et al. Coupling of the nucleus and cytoplasm: role of the LINC complex. Journal of Cell Biology. 172 (1), 41-53 (2006).
- Sosa, B. A., Rothballer, A., Kutay, U., Schwartz, T. U. LINC complexes form by binding of three KASH peptides to domain interfaces of trimeric SUN proteins. Cell. 149 (5), 1035-1047 (2012).
- Tapley, E. C., Starr, D. A. Connecting the nucleus to the cytoskeleton by SUN-KASH bridges across the nuclear envelope. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 57-62 (2013).
- Arsenovic, P. T., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophysical Journal. 110 (1), 34-43 (2016).
- Rowat, A. C., Lammerding, J., Ipsen, J. H. Mechanical properties of the cell nucleus and the effect of emerin deficiency. Biophysical Journal. 91 (12), 4649-4664 (2006).
- Rowat, A. C., Foster, L. J., Nielsen, M. M., Weiss, M., Ipsen, J. H. Characterization of the elastic properties of the nuclear envelope. Journal of the Royal Society Interface. 2 (2), 63-69 (2005).
- Pagliara, S., et al. Auxetic nuclei in embryonic stem cells exiting pluripotency. Nature Materials. 13 (6), 638-644 (2014).
- Liu, H., et al. In situ mechanical characterization of the cell nucleus by atomic force microscopy. ACS Nanotechnology. 8 (4), 3821-3828 (2014).
- Krause, M., Te Riet, J., Wolf, K. Probing the compressibility of tumor cell nuclei by combined atomic force-confocal microscopy. Physical Biology. 10 (6), 065002(2013).
- Neelam, S., et al. Direct force probe reveals the mechanics of nuclear homeostasis in the mammalian cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5720-5725 (2015).
- Pajerowski, J. D., Dahl, K. N., Zhong, F. L., Sammak, P. J., Discher, D. E. Physical plasticity of the nucleus in stem cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (40), 15619-15624 (2007).
- Lammerding, J., et al. Lamin A/C deficiency causes defective nuclear mechanics and mechanotransduction. Journal of Clinical Investigation. 113 (3), 370-378 (2004).
- Chancellor, T. J., Lee, J., Thodeti, C. K., Lele, T. Actomyosin tension exerted on the nucleus through nesprin-1 connections influences endothelial cell adhesion, migration, and cyclic strain-induced reorientation. Biophysical Journal. 99 (1), 115-123 (2010).
- Neelam, S., Dickinson, R. B., Lele, T. P. New approaches for understanding the nuclear force balance in living, adherent cells. Methods. 94, 27-32 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
