Sonda siły bezpośredniej do pomiaru integracji mechanicznej między jądrem a cytoszkieletem

Summary

W tym protokole opisujemy metodę mikropipet, która bezpośrednio przykłada kontrolowaną siłę do jądra w żywej komórce. Test ten pozwala na zbadanie właściwości mechanicznych jądra w żywej, przylegającej komórce.

Abstract

Właściwości mechaniczne jądra determinują jego reakcję na siły mechaniczne generowane w komórkach. Ponieważ jądro jest molekularnie ciągłe z cytoszkieletem, potrzebne są metody badania jego mechanicznego zachowania w przylegających komórkach. W tym miejscu omawiamy sondę siły bezpośredniej (DFP) jako narzędzie do przykładania siły bezpośrednio do jądra w żywej komórce przylegającej. Mocujemy wąską mikropipetę do powierzchni jądrowej za pomocą ssania. Mikropipeta jest odsuwana od jądra, co powoduje jego deformację i translację. Gdy siła przywracająca jest równa sile ssania, jądro odłącza się i elastycznie rozluźnia. Ponieważ ciśnienie ssania jest dokładnie znane, znana jest siła działająca na powierzchnię jądra. Metoda ta ujawniła, że siły w skali nano są wystarczające do deformacji i translacji jądra w przylegających komórkach, a także zidentyfikowała elementy cytoszkieletu, które umożliwiają jądru oparcie się siłom. DFP może być używany do analizy udziału składników komórkowych i jądrowych w jądrowych właściwościach mechanicznych w żywych komórkach.

Introduction

Patologie, takie jak rak, obejmują zmiany w kształcie i strukturze jądra^1,2, którym zazwyczaj towarzyszy 'zmiękczenie' jądra^3,4. Odporność jądra na odkształcenia mechaniczne jest ogólnie charakteryzowana przez przyłożenie siły do izolowanych jąder⁵.

Jądro w komórkach jest molekularnie połączone z cytoszkieletem przez łącznik kompleksu nukleoszkieletu i cytoszkieletu (LINC)^6,7,8,9<....

Protocol

1. Przygotowanie komórek do obrazowania

UWAGA: Sonda siły bezpośredniej (DFP) może być używana dla dowolnego typu ogniwa przylegającego. W tym przypadku mysie fibroblasty NIH 3T3 są używane jako modelowa linia komórkowa dla tego protokołu.

1. Hodowla komórek fibroblastów NIH 3T3 w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) uzupełniona 10% surowicą bydlęcą dawcy i 1% penicyliną-streptomycyną na 35-milimetrowym szklanym dnie, aż do pożądanego zbiegu. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   1. Pamiętaj, aby pokryć wszystkie naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm w ilości 5 μg/ml fibronektyny....

Results

Rysunek 2A pokazuje wymuszanie jądra mysiego fibroblastu NIH 3T3. Gdy końcówka mikropipety jest przesuwana w prawo, jądro odkształca się i ostatecznie odłącza się od końcówki mikropipety. Obserwuje się, że odkształcenie długości jądra zwiększa się wraz ze wzrostem siły ssania (Rysunek 2B). Przednia krawędź jądra (krawędź ciągnąca mikropipetę) tworzy występ jądrowy, a krawędź spływu jest przemieszczona z pierwotnego położenia. Długość wysta.......

Discussion

Pomiar mechanicznej integracji jądra z cytoszkieletem jest wyzwaniem dla większości obecnych metod, takich jak aspiracja mikropipet16, ponieważ wymagają one albo izolowanych jąder (gdzie jądro jest oddzielone od cytoszkieletu), albo jąder w zawieszonych komórkach (gdzie nie występują siły zewnątrzkomórkowe, takie jak siły trakcyjne). Do jądra przyłożono siłę poprzez przyłożenie dwuosiowego odkształcenia do komórek przylegających do błony^17,18

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
FluoroDish	WPI	FD35
SYTO 59	ThermoFisher Scientific	S11341
Femtotips	Eppendorf	930000043
InjectMan NI2	Eppendorf	NA	wycofany z produkcji, obecny odpowiednik modelu: InjectMan 4
FemtoJet	Eppendorf	NA	Obecny model FemtoJet 4i
Plan Fluor olejek immersyjny 40x	Nikon	NA
Apo TIRF olejek zanurzeniowy 60x	Nikon	NA
Dawca Serum bydlęce (DBS)	ThermoFisher Naukowe	16030074	Serum NIH 3T3
Modyfikacja Eagle's (DMEM)	Mediatech cellgro	MT10013CVRF	NIH 3T3 podłoże
Penicylina-Streptomycyna	Mediatech	MT30004CIRF	NIH 3T3 średni suplement
Olejek immersyjny typu LDF Niefluorescencyjny	Nikon	77007	Olejek immersyjny do soczewek obiektywowych