Sonda siły bezpośredniej do pomiaru integracji mechanicznej między jądrem a cytoszkieletem

Summary

W tym protokole opisujemy metodę mikropipet, która bezpośrednio przykłada kontrolowaną siłę do jądra w żywej komórce. Test ten pozwala na zbadanie właściwości mechanicznych jądra w żywej, przylegającej komórce.

Abstract

Właściwości mechaniczne jądra determinują jego reakcję na siły mechaniczne generowane w komórkach. Ponieważ jądro jest molekularnie ciągłe z cytoszkieletem, potrzebne są metody badania jego mechanicznego zachowania w przylegających komórkach. W tym miejscu omawiamy sondę siły bezpośredniej (DFP) jako narzędzie do przykładania siły bezpośrednio do jądra w żywej komórce przylegającej. Mocujemy wąską mikropipetę do powierzchni jądrowej za pomocą ssania. Mikropipeta jest odsuwana od jądra, co powoduje jego deformację i translację. Gdy siła przywracająca jest równa sile ssania, jądro odłącza się i elastycznie rozluźnia. Ponieważ ciśnienie ssania jest dokładnie znane, znana jest siła działająca na powierzchnię jądra. Metoda ta ujawniła, że siły w skali nano są wystarczające do deformacji i translacji jądra w przylegających komórkach, a także zidentyfikowała elementy cytoszkieletu, które umożliwiają jądru oparcie się siłom. DFP może być używany do analizy udziału składników komórkowych i jądrowych w jądrowych właściwościach mechanicznych w żywych komórkach.

Introduction

Patologie, takie jak rak, obejmują zmiany w kształcie i strukturze jądra^1,2, którym zazwyczaj towarzyszy 'zmiękczenie' jądra^3,4. Odporność jądra na odkształcenia mechaniczne jest ogólnie charakteryzowana przez przyłożenie siły do izolowanych jąder⁵.

Jądro w komórkach jest molekularnie połączone z cytoszkieletem przez łącznik kompleksu nukleoszkieletu i cytoszkieletu (LINC)^6,7,8,9. W rezultacie jądro jest mechanicznie zintegrowane z cytoszkieletem i, poprzez adhezje komórka-podłoże, z macierzą zewnątrzkomórkową. Mechaniczne sondowanie jądra wewnątrz przylegających komórek może dostarczyć informacji na temat tej mechanicznej integracji. Metody manipulowania jądrami w żywych komórkach obejmują aspirację mikropipet^10,11 oraz mikroskopię sił atomowych^12,13,14. Niedawno opisaliśmy sondę siły bezpośredniej (DFP), która przykłada siły mechaniczne bezpośrednio do jądra w żywej komórce przylegającej¹⁵.

Tutaj opisujemy procedurę korzystania z systemu mikroiniekcji, który jest powszechnie dostępny w obiektach mikroskopowych, do przykładania znanej, nano-skalowej siły mechanicznej bezpośrednio do jądra w przylegającej komórce. Końcówka femtotip (końcówka mikropipety o średnicy 0,5 μm) jest zamontowana i połączona z systemem mikroiniekcji za pomocą rurki. Końcówka, umieszczona pod kątem 45° w stosunku do powierzchni szalki hodowlanej, jest opuszczana do momentu przylegania do powierzchni jądrowej. Rurka jest następnie odłączana i otwierana do atmosfery, co wytwarza ujemne ciśnienie ssania na powierzchni jądrowej i uszczelnia końcówkę mikropipety względem powierzchni jądrowej. Poprzez przesunięcie końcówki mikropipety jądro jest odkształcane i ostatecznie (w zależności od wielkości przyłożonej siły) odłączane od mikropipety. To oderwanie występuje, gdy siły przywracające (stawiające opór) wywierane przez jądro i komórkę są równe sile ssania przyłożonej przez mikropipetę. Analizę można przeprowadzić, mierząc przemieszczenie jądra, długość odkształcenia (równanie 1) lub odkształcenie powierzchniowe (Rysunek 1A).

Protocol

1. Przygotowanie komórek do obrazowania

UWAGA: Sonda siły bezpośredniej (DFP) może być używana dla dowolnego typu ogniwa przylegającego. W tym przypadku mysie fibroblasty NIH 3T3 są używane jako modelowa linia komórkowa dla tego protokołu.

1. Hodowla komórek fibroblastów NIH 3T3 w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) uzupełniona 10% surowicą bydlęcą dawcy i 1% penicyliną-streptomycyną na 35-milimetrowym szklanym dnie, aż do pożądanego zbiegu. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   1. Pamiętaj, aby pokryć wszystkie naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm w ilości 5 μg/ml fibronektyny (lub podobnego białka ECM) przed wysiewem komórek NIH 3T3 do obrazowania.
      UWAGA: Na potrzeby eksperymentu komórki muszą być w pełni rozłożone i przylegać do naczynia. Nie ma żadnych ograniczeń pod względem zbiegalności, aby metoda DFP działała.
2. Bezpośrednio przed eksperymentem przemyć komórki dwukrotnie PBS, a następnie jednorazowo przepłukać kompletną pożywką wzrostową.
3. Dodaj 3 ml kompletnej pożywki wzrostowej do naczynia ze szklanym dnem.

2. Mikroskopia i akwizycja obrazu

Uwaga: Mikroskop fluorescencyjny z odwróconą lampą fluorescencyjną (lub równoważny) z mikromanipulatorem zainstalowanym na bocznym ramieniu, zgodnie z zaleceniami producenta. Mikroskop powinien być również wyposażony w komorę środowiskową, aby utrzymać temperaturę na poziomie 37 °C, a poziom CO₂ na poziomie 5%. Wymagany jest również mikromanipulator i mikroiniektor dołączony do mikroskopu. Do eksperymentów zalecane jest zanurzenie w oleju 40x/1,3 NA lub 60x/1,49 NA (lub równoważne obiektywy). Mikroskop powinien być zamontowany na stole wibroizolacyjnym

.

Rysunek 1. Deformacja jądrowa i ogniskowanie pod mikroskopem
A. Maksymalne odkształcenie jądrowe i relaksacja deformacji jądrowej. Przed obliczeniem maksymalnej deformacji jądrowej najpierw zbiegły się tylne krawędzie kształtów jądrowych, aby skorygować translację zdeformowanego jądra. Kształt jądra w momencie oderwania końcówki mikropipety został nałożony na początkowy kształt jądra przed wyciągnięciem. Różnica powierzchni między tymi dwoma kształtami została zmierzona jako ΔA₁. Maksymalne odkształceniejądrowe zdefiniowano jako Δ A ₁ podzielone przez pierwotną powierzchnię jądrową. Podobnie, drugi parametr, ΔA₂, można zdefiniować poprzez nałożenie końcowego kształtu jądra w stanie ustalonym po odłączeniu mikropipety na oryginalny kształt jądra. B. Ustaw ostrość kuwety na płaszczyźnie A, a następnie przesuń płaszczyznę ogniskowej w górę do płaszczyzny B, aby znaleźć końcówkę mikropipety. Podczas obrazowania mikropipeta została przesunięta w prawo (kierunek pomarańczowej strzałki). Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie Neelam et al. ¹⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Włącz mikrowtryskiwacz zgodnie z protokołem producenta.
2. Za pomocą zakraplacza olejku immersyjnego nałóż pojedynczą kroplę olejku immersyjnego na soczewkę obiektywu.
3. Clamp naczynie mocno w uchwycie na naczynia i załaduj uchwyt na naczynia na stage.
   UWAGA: Komórki muszą być utrzymywane w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez cały czas trwania eksperymentu.
4. Dostosuj wysokość obiektywu, aby ustawić ostrość komórek (płaszczyzna A, Rysunek 1B).
5. Przesuń stolik mikroskopu, aby znaleźć interesującą Cię komórkę.
6. Obróć joystick na mikromanipulatorze, aby przesunąć uchwyt pipety do górnej pozycji. Załaduj mikropipetę z końcówką o średnicy 0,5 μm do uchwytu pipety.
   1. Aby uniknąć przywierania komórek do mikropipety, należy ją wstępnie potraktować roztworem PLL-g-PEG o stężeniu 0,3 mg/ml przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Sprawdzić przyczepność, dotykając mikropipety do jądra bez żadnego ciśnienia ssania, a następnie przesuwając mikropipetę z dala od jądra. Brak adhezji można odróżnić od całkowitego braku deformacji jądrowej i translacji.
      UWAGA: Postępuj zgodnie z sugestiami producenta, aby otworzyć opakowanie.
7. Podnieś płaszczyznę ogniskowej obiektywu powyżej płaszczyzny A i górną część komórki do płaszczyzny B, regulując precyzyjną kontrolę (Rysunek 1B, patrz krok 2.4).
8. Ustaw mikromanipulator na kontrolę zgrubną. Powoli zejdź mikropipetę do płaszczyzny B, obserwując sylwetkę mikropipety, aż mikropipeta znajdzie się w pełnej ostrości.
9. Gdy końcówka mikropipety znajdzie się w ustawieniu ostrości, ustaw mikromanipulator w pozycji Dokładna kontrola.
10. Obniż obiektyw do płaszczyzny równikowej celi (płaszczyzna A, Rysunek 1B) i opuść mikropipetę do około 15 μm powyżej płaszczyzny A (Rysunek 1B, mikropipeta przerywana).
11. Ustaw ciśnienie kompensacji (Pc₎ na mikrowtryskiwaczu na żądane ciśnienie; poczekaj kilka sekund, aż ciśnienie się ustabilizuje.
    UWAGA: Optymalna nastawa ciśnienia zależy zarówno od typu ogniwa, jak i konkretnych celów eksperymentu. W większości przypadków 300 hPa byłoby dobrym punktem wyjścia.
12. Upewnij się, że mikropipeta nie jest zatkana, korzystając z ustawienia Clean (Czyszczenie) na panelu mikromanipulatora i sprawdzając, czy z końcówki mikropipety wydostają się pęcherzyki powietrza.
13. Włóż końcówkę do kuwety, stopniowo opuszczając mikropipetę, aż końcówka lekko dotknie powierzchni jądra.
    UWAGA: Po opuszczeniu mikropipety sylwetka końcówki mikropipety stanie się wyraźna, gdy znajdzie się w ostrości. Zanim mikropipeta dotknie jądra, należy podnieść ognisko obiektywu i wyrównać końcówkę mikropipety z jądrem (ta sama współrzędna x-y, wyższa płaszczyzna z). Przywróć ostrość z powrotem na płaszczyznę równikową jądra (płaszczyzna A, Rysunek 1B) i stopniowo opuszczaj końcówkę mikropipety.
14. Uszczelnienie należy utworzyć między końcówką mikropipety a membraną jądrową, odłączając rurkę doprowadzającą ciśnienie od systemu mikroiniekcji, otwierając w ten sposób koniec rurki mikropipety do atmosfery. Ten krok wytwarza podciśnienie równe P_c na powierzchni jądrowej.
15. Uzyskuj obrazy za pomocą oprogramowania do zbierania obrazów mikroskopów. Skonfiguruj akwizycję avi (wideo) lub akwizycję nd-age (obrazy) w oprogramowaniu do zbierania obrazów.
    UWAGA: W przypadku dowolnego oprogramowania do pozyskiwania obrazów skonfiguruj obrazowanie wideo w czasie rzeczywistym lub akwizycję obrazów poklatkowych z krótkim odstępem czasu.
16. Przełącz się na odpowiedni kanał obrazowania fluorescencyjnego (tj. GFP, RFP itp.) i rozpocznij obrazowanie.
17. Odsuń końcówkę mikropipety od korpusu komórki (w prawo, Rysunek 1B), aż jądro odłączy się od mikropipety.
    UWAGA: Pociągnij końcówkę wzdłuż dodatniego kierunku x (w prawo w polu view). Szybkość ciągnięcia można zaprogramować i kontrolować za pomocą komputera lub joystick można przesuwać ręcznie. Nie znaleźliśmy żadnej korelacji między szybkością ciągnięcia a deformacją jądrową¹⁵, co sugeruje przede wszystkim elastyczną reakcję na siłę.

3. Analiza danych

1. Wykonuj analizę obrazu za pomocą dowolnego dostępnego podstawowego oprogramowania do przetwarzania obrazu. Zakres deformacji jądrowej można określić ilościowo za pomocą odkształcenia o długości (Ɛ) lub odkształcenia powierzchniowego (Rysunek 1A). Określ ilościowo długość odkształcenia za pomocą równania 1, gdzie L i L₀ reprezentują odpowiednio długości jądra przy maksymalnym odkształceniu i pozycję początkową.
   (Równanie 1)

Results

Rysunek 2A pokazuje wymuszanie jądra mysiego fibroblastu NIH 3T3. Gdy końcówka mikropipety jest przesuwana w prawo, jądro odkształca się i ostatecznie odłącza się od końcówki mikropipety. Obserwuje się, że odkształcenie długości jądra zwiększa się wraz ze wzrostem siły ssania (Rysunek 2B). Przednia krawędź jądra (krawędź ciągnąca mikropipetę) tworzy występ jądrowy, a krawędź spływu jest przemieszczona z pierwotnego położenia. Długość wysta...

Discussion

Pomiar mechanicznej integracji jądra z cytoszkieletem jest wyzwaniem dla większości obecnych metod, takich jak aspiracja mikropipet16, ponieważ wymagają one albo izolowanych jąder (gdzie jądro jest oddzielone od cytoszkieletu), albo jąder w zawieszonych komórkach (gdzie nie występują siły zewnątrzkomórkowe, takie jak siły trakcyjne). Do jądra przyłożono siłę poprzez przyłożenie dwuosiowego odkształcenia do komórek przylegających do błony^17,18

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
FluoroDish	WPI	FD35
SYTO 59	ThermoFisher Scientific	S11341
Femtotips	Eppendorf	930000043
InjectMan NI2	Eppendorf	NA	wycofany z produkcji, obecny odpowiednik modelu: InjectMan 4
FemtoJet	Eppendorf	NA	Obecny model FemtoJet 4i
Plan Fluor olejek immersyjny 40x	Nikon	NA
Apo TIRF olejek zanurzeniowy 60x	Nikon	NA
Dawca Serum bydlęce (DBS)	ThermoFisher Naukowe	16030074	Serum NIH 3T3
Modyfikacja Eagle's (DMEM)	Mediatech cellgro	MT10013CVRF	NIH 3T3 podłoże
Penicylina-Streptomycyna	Mediatech	MT30004CIRF	NIH 3T3 średni suplement
Olejek immersyjny typu LDF Niefluorescencyjny	Nikon	77007	Olejek immersyjny do soczewek obiektywowych