Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nieniszczące monitorowanie rozwoju naczyń krwionośnych opartych na degradowalnych rusztowaniach za pomocą optycznej koherentnej tomografii

5.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58040

⸱

3 października 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangdong General Hospital, 2Medical Research Center, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangdong General Hospital, 3Institute of Geriatric medicine, Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangdong General Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano tutaj krok po kroku protokół do nieniszczącego i długoterminowego monitorowania procesu przebudowy naczyń krwionośnych i degradacji rusztowań w czasie rzeczywistym biodegradowalnych naczyń krwionośnych opartych na polimerowych rusztowaniach z pulsacyjną stymulacją za pomocą optycznej koherentnej tomografii

.

Streszczenie

Zmodyfikowane przeszczepy naczyniowe o właściwościach strukturalnych i mechanicznych zbliżonych do naturalnych naczyń krwionośnych mają sprostać rosnącemu zapotrzebowaniu na bypassy tętnicze. Charakterystyka dynamiki wzrostu i procesu przebudowy degradowalnych naczyń krwionośnych opartych na rusztowaniach polimerowych (TEBV) ze stymulacją pulsacyjną ma kluczowe znaczenie dla inżynierii tkanki naczyniowej. Techniki obrazowania optycznego wyróżniają się jako potężne narzędzia do monitorowania unaczynienia tkanek inżynieryjnych, umożliwiające obrazowanie w wysokiej rozdzielczości w hodowli w czasie rzeczywistym. W artykule przedstawiono nieniszczącą i szybką strategię obrazowania w czasie rzeczywistym w celu monitorowania wzrostu i przebudowy TEBV w hodowli długoterminowej za pomocą optycznej tomografii koherentnej (OCT). Oceniana jest morfologia geometryczna, w tym proces przebudowy naczyń krwionośnych, grubość ścianek oraz porównanie grubości TEBV w różnych punktach czasowych hodowli i obecność stymulacji pulsacyjnej. Wreszcie, OCT zapewnia praktyczne możliwości obserwacji degradacji polimeru w czasie rzeczywistym w rekonstruowanych tkankach pod wpływem stymulacji pulsacyjnej lub bez niej oraz w każdym segmencie naczynia, w porównaniu z oceną degradacji polimeru przy użyciu skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) i mikroskopu spolaryzowanego.

Wprowadzenie

Naczynia krwionośne inżynierii tkankowej (TEBV) są najbardziej obiecującym materiałem jako idealny przeszczep naczyniowy1. W celu opracowania przeszczepów, które będą klinicznie użyteczne o podobnych właściwościach strukturalnych i funkcjonalnych jak naczynia natywne, zaprojektowano wiele technik utrzymania funkcji naczyń krwionośnych2,3. Chociaż podczas implantacji i badania klinicznego fazy III wynaleziono naczynia o akceptowalnych wskaźnikach drożności< klasie sup = 'xref'>4, jednak długotrwała hodowla i wysokie koszty również wskazują na konieczność monitorowania rozwoju TEBV. Zrozumienie procesów wzrostu, przebudowy i adaptacji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w TEBV w biomimetycznym środowisku chemo-mechanicznym może dostarczyć kluczowych informacji dla rozwoju inżynierii tkanek naczyniowych.

Idealna strategia do śledzenia rozwoju statków inżynieryjnych o małej średnicy5 powinna być nieniszcząca, sterylna, podłużna, trójwymiarowa i ilościowa. TEBV w różnych warunkach hodowli można ocenić za pomocą tej metody obrazowania, nawet z uwzględnieniem zmian przed i po przeszczepie naczyń. Potrzebne są strategie opisujące cechy żywych statków inżynieryjnych. Techniki obrazowania optycznego umożliwiają wizualizację i kwantyfikację osadzania tkanek i biomateriałów. Inne zalety to możliwość umożliwienia obrazowania głębokich tkanek i bez znaczników z wysoką rozdzielczością6,7. Jednak cząsteczki specyficzne dla obrazu i trudniej dostępny sprzęt optyczny do monitorowania w czasie rzeczywistym stanowią istotną przeszkodę praktyczną, która ograniczyła szerokie zastosowanie nieliniowej mikroskopii optycznej. Optyczna koherentna tomografia (OCT) to podejście optyczne z modalnością obrazowania wewnątrznaczyniowego jako szeroko stosowanym narzędziem klinicznym do kierowania terapią interwencyjną serca8. W literaturze metoda OCT została opisana jako sposób oceny grubości ścianek TEBVs9,10, w połączeniu z afirmatywnymi metodami obrazowania do badań nad inżynierią tkanki naczyniowej. Natomiast nie zaobserwowano dynamiki inżynieryjnego wzrostu i przebudowy naczyń krwionośnych.

W tym manuskrypcie szczegółowo opisujemy przygotowanie biodegradowalnych polimerowych rusztowań TEBV do czterotygodniowej hodowli. Ludzkie tętnice pępowinowe, komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych (HUASMC) są ekspandowane i wysiewane w porowatych, degradowalnych rusztowaniach kwasu poliglikolowego (PGA) w bioreaktorze. Polimery biodegradowalne odgrywają rolę tymczasowego podłoża dla inżynierii tkankowej i mają określony współczynnik degradacji11. Aby zapewnić odpowiednie dopasowanie między degradacją rusztowania a powstawaniem tkanek nowotworowych, rusztowania ECM i PGA są kluczowymi czynnikami skutecznej przebudowy naczyń krwionośnych. System perfuzyjny symuluje biomechaniczne mikrośrodowisko natywnych naczyń i utrzymuje stałe odkształcenie pod wpływem stymulacji ciśnieniowej.

Celem prezentowanego protokołu jest opisanie stosunkowo prostej i nieniszczącej strategii obrazowania TEBV i długoterminowego monitorowania hodowli. Protokół ten może być wykorzystany do wizualizacji zmian morfologicznych i pomiarów grubości naczyń inżynieryjnych w różnych warunkach hodowli. Dodatkowo w celu identyfikacji można przeprowadzić analizy degradacji materiałów na bazie polimerów w rusztowaniach inżynierii tkankowej. Łącząc metody skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM) i mikroskopu spolaryzowanego stosowane w tym protokole, można uzyskać korelację i kwantyfikację rozkładu macierzy zewnątrzkomórkowej i degradacji PGA, co może ułatwić ocenę degradacji rusztowania w połączeniu z obrazowaniem OCT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Degradowalna hodowla naczyń krwionośnych na bazie rusztowań PGA

  1. Produkcja rusztowań PGA
    1. Zszyj siatkę PGA (o średnicy 19 mm i grubości 1 mm) wokół rurki silikonowej sterylizowanej tlenkiem etylenu (długość 17 cm, średnica 5,0 mm i grubość 0,3 mm) za pomocą szwu 5-0.
    2. Zszyć politetrafluoroetylen (ePTFE, długość 1 cm) szwem 4-0 na każdym końcu siatki PGA i zachodzić na 2 mm.
    3. Zanurz rusztowania PGA ręką w 1 mol/l NaOH na 1 minutę, aby dostosować strukturę przestrzenną siatki i zanurz je w wodzie klasy kulturowej tkankowej trzy razy przez 2 minuty każde. Za każdym razem delikatnie osuszaj rusztowanie bibułą. Następnie wysuszyć rusztowania w kapturze z dmuchawą przez 1 godzinę.
  2. Montaż bioreaktora i złącza Y do obrazowania OCT
    1. Namocz samodzielnie opracowany szklany cylindryczny bioreaktor (10 cm średnicy i 11,7 cm wysokości z czterema wargami wewnątrz i czterema bocznymi ramionami na zewnątrz reaktora, jak pokazano na Rysunek 1), rusztowania PGA, rurkę silikonową (średnica zewnętrzna 5 mm, grubość 0,3 mm), biokompatybilne rurki, łączniki, mieszadło i sprzęt do montażu w zbiorniku na 95% etanolu przez 2 godziny.
    2. Przeciągnij rusztowanie PGA przez boczne ramiona bioreaktora połączone z jednej strony za pomocą złącza, a z drugiej strony za pomocą złącza Y służącego do doprowadzenia przewodu prowadzącego OCT. W ten sam sposób zamontuj kolejne rusztowanie PGA w bioreaktorze. Proszę zapoznać się z Rysunek 1.
    3. Dopasuj ePTFE do warg bioreaktora, zaciskając szwy 4-0.
    4. Ponownie umieść bioreaktor w zbiorniku etanolu na 1 godzinę i wysusz przez noc w okapie z włączoną dmuchawą.
  3. Wysiew HUASMC i kondycjonowanie statyczne w bioreaktorze
    1. Wyizolować HUASMC z ludzkich tętnic pępowinowych za pomocą standardowych technik eksplantacji.
    2. Rozwijaj i utrzymuj komórki w pożywce do wzrostu komórek mięśni gładkich składającej się z pożywki DMEM, 20% płodowej surowicy bydlęcej, 2,36 mg / ml HEPES, 100 U / ml penicyliny G, 50 μg / ml proliny, 20 μg / ml alaniny, 50 μg / ml glicyny, 1,5 μg / ml CuSO4, 50 μg / ml kwasu askorbinowego, 10 ng / ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów i 10 ng / ml płytkowego czynnika wzrostu.
    3. Wysiewać HUASMC w stężeniu 5×106 komórek/ml w powyższej pożywce hodowlanej na rusztowania PGA.
    4. Umieść mieszadło (o długości 1,5 cm) w bioreaktorze. Włóż jedną rurkę zasilającą (średnica 5 mm, długość 15 cm) i trzy krótkie segmenty rurki (średnica 5 mm, długość 7 cm) w celu wymiany gazu przez silikonową pokrywę korka.
    5. Podłącz filtry PTFE 0,22 μm do każdej rurki wymiany powietrza i jedną nasadkę heparyny do rurki zasilającej. Wyreguluj mieszadło z prędkością mieszania 13 rund na minutę. Zamontuj szklany bioreaktor, silikonową pokrywę korka i rusztowanie PGA w systemie hodowli.
    6. Pozwól HUASMC przylegać przez 45 minut, przechylając bioreaktor co 15 minut ze stojakiem, w lewo i w prawo. Porty i złącza reaktora są uszczelnione folią parafinową.
    7. Podłącz pompę Luo-Ye, worek PBS, sterownik z biokompatybilnymi rurkami jako system perfuzyjny. Otwórz napęd, aby napełnić probówki PBS.
    8. Umieścić cały bioreaktor w nawilżonym inkubatorze z 5% stężeniemCO2 w temperaturze 37 °C. Napełnić komorę hodowlaną 450 ml pożywki hodowlanej HUASMCs.
    9. Naciśnij przycisk stop i wyłącz zasilanie urządzenia napędowego. Uprawiaj rusztowania z nasionami w kulturze statycznej przez tydzień.
    10. Pożywkę należy zmieniać co 3-4 dni, zasysając połowę starej pożywki przez rurkę zasilającą i ponownie napełniając reaktor równoważną ilością świeżej pożywki hodowlanej.
  4. Przygotowanie systemu perfuzyjnego do obrazowania OCT
    1. Pompuj płyny w worku PBS, aby krążyły przez biokompatybilne rurki i wróciły do worka.
    2. Otwórz moc sterownika i reguluj ustawienie pompy z częstotliwością 60 uderzeń na minutę i wyjściowym ciśnieniem skurczowym 120 mmHg. Dostosuj parametry mechaniczne do potrzeb hodowli naczyniowej w inżynierii tkankowej.
    3. Kliknij przycisk uruchom, aby system perfuzyjny działał. Zapewnij powyższą stałą stymulację pulsacyjną naczyń przez 3 tygodnie, iteracyjnie zwiększając ciśnienie w biokompatybilnych rurkach10,12 po 1 tygodniu hodowli statycznej.

2. Wykonywanie obrazowania optycznego za pomocą OCT

  1. Użyj źródła światła, aby zapewnić rozdzielczość osiową 10-20 μm i głębokość obrazu 1-2 mm, aby zidentyfikować strukturę TEBV na podstawie systemu obrazowania wewnątrznaczyniowego OCT w dziedzinie częstotliwości9.
  2. Włącz wyłącznik zasilania i otwórz oprogramowanie do przechwytywania obrazu.
  3. Podłącz światłowodowy cewnik do obrazowania do silnika napędowego i sterownika optycznego (DOC) z funkcją automatycznego wycofywania cewnika.
  4. Ustaw parametry szybkości akwizycji obrazu na 10 klatek na sekundę z automatyczną prędkością cofania 10 mm/s.
  5. Przymocuj cewnik do obrazowania do złącza Y za pomocą nasadki heparyny z igłą 18G.
  6. Umieść cewnik w silikonowej rurce i określ szczelność szwów siatki PGA przed załadowaniem rusztowania PGA do bioreaktora.
  7. Umieść końcówkę cewnika w obszarze zainteresowania. Dostosuj urządzenie odciągające i sprawdź jakość obrazu8.
  8. Uzyskuj obrazy po 1, 4, 7, 10, 14, 17, 21, 28 dniach hodowli dla każdego pojedynczego TEBV i zapisuj sekwencyjnie dzięki obserwacji mikrostruktury TEBV w czasie rzeczywistym, w tym morfologii powierzchni, struktury wewnętrznej i składu.
  9. Powtórz pomiar 3 razy, aby za każdym razem uzyskać wiarygodny pomiar naczyń inżynieryjnych. Uchwyć serię obrazów podczas testów za pomocą oprogramowania do przechwytywania obrazów.

3. Analiza obrazowa

  1. Użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby zmierzyć grubość ścianki TEBV. Wybierz obraz, który ma zostać przeanalizowany. Kliknij narzędzie do śledzenia, aby automatycznie zidentyfikować wewnętrzną stronę TEBV przez oprogramowanie i ręcznie naszkicować zewnętrzną stronę. Na ekranie pojawi się wykres grubości.
  2. Powtórz pomiar 5 razy, aby uzyskać wiarygodny pomiar konstrukcji. Analiza OCT została przeprowadzona przez dwóch niezależnych badaczy, którzy nie zwrócili uwagi na uzyskane informacje.

4. Zbiór TEBV i przetwarzanie tkanek

  1. Otwórz silikonową pokrywkę korka umieszczoną nad bioreaktorem po zakończeniu hodowli i wyrzuć pożywkę hodowlaną. Poluzuj ePTFE z warg bioreaktora i odetnij silikonowe rurki od zewnętrznej strony ePTFE nożyczkami. Zebrać TEBV z bioreaktora i pociąć na sekcje w celu badania za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.
  2. Wyjmij resztę TEBV i pokrój na odcinki o grubości 4 μm. Wyciągnij podtrzymującą rurkę silikonową i przymocuj sekcje 4% paraformaldehydu. Wykonaj rutynowe barwienie histologiczne trichromu Massona i czerwieni Syriusza, aby zbadać morfologię kolagenu i PGA10,13,14.
  3. Aby ocenić zawartość PGA i składnika kolagenu, obserwuj próbki histologiczne z czerwonym zabarwieniem Sirius za pomocą mikroskopu spolaryzowanego. Pozostałości PGA są wyraźnie odgraniczone przez dwójłomność, a obszar pozostałości można określić ilościowo na podstawie pola przekroju poprzecznego10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Trójwymiarowy system hodowlany składał się z komory hodowlanej w bioreaktorze oraz systemu perfuzyjnego z zamkniętym obiegiem płynu10,13 (Rysunek 1). Cewnik do obrazowania OCT wprowadzono do dystalnego końca złącza w kształcie litery Y, a następnie wycofywano wewnątrz rurki silikonowej w celu wykonania obrazowania. Obrazowanie OCT wykorzystano w pierwszej kolejności do określenia charakterystyki struk...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Generowanie zmodyfikowanych naczyń o właściwościach strukturalnych i mechanicznych podobnych do natywnych naczyń krwionośnych może prowadzić do skrócenia czasu stosowania klinicznego i jest ostatecznym celem inżynierii naczyniowej. Techniki obrazowania optycznego umożliwiają wizualizację specyficznych składników naczyniowych inżynierii tkankowej, które nie mogą monitorować poszczególnych konstruktów w trakcie hodowli i ekspozycji przeszczepów na środowisko hodowli bez uszczerbku dla sterylności7. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Projektowi Planowania Nauki i Technologii prowincji Guangdong w Chinach (2016B070701007) za wsparcie tej pracy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Siatka PGARurka silikonowa Synthecon
Cole Parmer
St. Jude Medical, IncILUMIEN™ OPTIS&handel; SYSTEM
skaningowy mikroskop elektronowyPhilipsFEI Philips XL-30
polaryzacyjnyOlympusOlympus BX51
szwyJohnson & Pompa
Guangdong Instytut Sercowo-Naczyniowy LightLab
Oprogramowanie do obrazowaniaSt. Jude Medical, Inc
Złącze Wewnątrznaczyniowy system OCT Cole Parmer mikroskop pulsacyjna Johnson

Bibliografia

  1. Chan-Park, M. B., et al. Biomimetic control of vascular smooth muscle cell morphology and phenotype for functional tissue-engineered small-diameter blood vessels. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 88, 1104-1121 (2009).
  2. Ballyns, J. J., Bonassar, L. J. Image-guided tissue engineering. Journal of Cellular & Molecular Medicine. 13, 1428-1436 (2009).
  3. Smith, L. E., et al. A comparison of imaging methodologies for 3D tissue engineering. Microscopy Research & Technique. 73, 1123-1133 (2010).
  4. Chang, W. G., Niklason, L. E. A short discourse on vascular tissue engineering. NPJ Regenerative Medicine. 2, (2017).
  5. Appel, A. A., Anastasio, M. A., Larson, J. C., Brey, E. M. Imaging challenges in biomaterials and tissue engineering. Biomaterials. 34, 6615-6630 (2013).
  6. Rice, W. L., et al. Non-invasive characterization of structure and morphology of silk fibroin biomaterials using non-linear microscopy. Biomaterials. 29, 2015-2024 (2008).
  7. Niklason, L. E., et al. Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 3335-3339 (2010).
  8. Zheng, K., Rupnick, M. A., Liu, B., Brezinski, M. E. Three Dimensional OCT in the Engineering of Tissue Constructs: A Potentially Powerful Tool for Assessing Optimal Scaffold Structure. Open Tissue Engineering & Regenerative Medicine Journal. 2, 8-13 (2009).
  9. Gurjarpadhye, A. A., et al. Imaging and characterization of bioengineered blood vessels within a bioreactor using free-space and catheter-based OCT. Lasers in Surgery and Medicine. 45, 391-400 (2013).
  10. Chen, W., et al. In vitro remodeling and structural characterization of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered vascular grafts using optical coherence tomography. Cell & Tissue Research. 370, 417-426 (2017).
  11. Naito, Y., et al. Characterization of the natural history of extracellular matrix production in tissue-engineered vascular grafts during neovessel formation. Cells Tissues Organs. 195, 60-72 (2012).
  12. Ye, C., et al. The design conception and realization of pulsatile ventricular assist devices-from Spiral-Vortex pump to Luo-Ye pump. Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 9, 35-40 (2002).
  13. Chen, W., et al. Application of optical coherence tomography in tissue engineered blood vessel culture based on Luo-Ye pump. Chinese Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 31, 687-690 (2015).
  14. Pickering, J. G., Boughner, D. R., et al. Quantitative assessment of the age of fibrotic lesions using polarized light microscopy and digital image analysis. American Journal of Pathology. 138, 1225-1231 (1991).
  15. Martinho, J. A., et al. Dependence of optical attenuation coefficient and mechanical tension of irradiated human cartilage measured by optical coherence tomography. Cell Tissue Bank. 16, 47-53 (2015).
  16. Poirierquinot, M., et al. High-resolution 1.5-Tesla magnetic resonance imaging for tissue-engineered constructs: a noninvasive tool to assess three-dimensional scaffold architecture and cell seeding. Tissue Engineering Part C Methods. 16, 185-200 (2010).
  17. Naito, Y., et al. Beyond burst pressure: initial evaluation of the natural history of the biaxial mechanical properties of tissue-engineered vascular grafts in the venous circulation using a murine model. Tissue Engineering Part A. 20, 346-355 (2014).
  18. Smart, N., Dube, K. N., Riley, P. R. Coronary vessel development and insight towards neovascular therapy. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 90, 262-283 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tkankowo in ynieryjne naczynia krwiono nestymulacja pulsacyjnaprzebudowa naczyniowaanaliza grubo ci cianyskaningowa mikroskopia elektronowamikroskopia polaryzacyjnarusztowanie z PGAludzkie kom rki mi ni g adkich t tnicy p powinowej
Nieniszczące monitorowanie rozwoju naczyń krwionośnych opartych na degradowalnych rusztowaniach za pomocą optycznej koherentnej tomografii
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.