Opracowaliśmy prosty i elastyczny przepływ pracy do ekstrakcji danych ilościowych z badań biologicznych komórek opartych na obrazowaniu fluorescencyjnym agregacji białek i przepływu autofagicznego w ośrodkowym układzie nerwowym modeli neurodegeneracji Drosophila.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ilościowa biologia komórki neurodegeneracji u Drosophila poprzez bezstronną analizę białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą ImageJ
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wraz z rosnącym rozpowszechnieniem chorób neurodegeneracyjnych, coraz ważniejsze staje się zrozumienie podstawowej patofizjologii, która prowadzi do dysfunkcji i utraty neuronów. Narzędzia i technologie obrazowania oparte na fluorescencji umożliwiają bezprecedensową analizę subkomórkowych procesów neurobiologicznych, jednak nadal istnieje zapotrzebowanie na bezstronne, powtarzalne i dostępne podejścia do ekstrakcji wymiernych danych z badań obrazowych. Opracowaliśmy prosty i elastyczny przepływ pracy w celu wyodrębnienia danych ilościowych z badań obrazowych opartych na fluorescencji przy użyciu modeli neurodegeneracji Drosophila. W szczególności opisujemy łatwe do naśladowania, półautomatyczne podejście wykorzystujące Fiji/ImageJ do analizy dwóch procesów komórkowych: po pierwsze, określamy ilościowo zawartość i profil zagregowanych białek w płacie wzrokowym Drosophila za pomocą znakowanych fluorescencyjnie zmutowanych białek huntingtyny; a po drugie, oceniamy strumień autofagii-lizosomów w układzie wzrokowym Drosophila za pomocą ratiometrycznej kwantyfikacji tandemowego fluorescencyjnego reportera autofagii. Co ważne, przedstawiony tutaj protokół obejmuje półautomatyczny etap segmentacji, aby zapewnić, że wszystkie struktury fluorescencyjne są analizowane w celu zminimalizowania błędu selekcji i zwiększenia rozdzielczości subtelnych porównań. Podejście to można rozszerzyć o analizę innych struktur biologicznych komórek i procesów związanych z neurodegeneracją, takich jak puncta białkowe (granulki stresu i kompleksy synaptyczne), a także przedziały związane z błoną (mitochondria i pęcherzyki transportujące błonę). Metoda ta zapewnia ustandaryzowany, a jednocześnie adaptowalny punkt odniesienia do analizy obrazu i kwantyfikacji, a także może ułatwić niezawodność i odtwarzalność w całej dziedzinie, a ostatecznie zwiększyć mechanistyczne zrozumienie neurodegeneracji.
Wprowadzenie
Choroby neurodegeneracyjne dotykają miliony ludzi każdego roku, a częstość ich występowania wzrasta wraz ze starzeniem się populacji1. Chociaż każda choroba neurodegeneracyjna ma unikalną etiologię, agregacja nieprawidłowo sfałdowanych białek i rozpad sieci proteostazy są powszechnymi patologicznymi cechami charakterystycznymi wielu z tych chorób. Wyjaśnienie, w jaki sposób zakłócenia tych podstawowych i wzajemnie powiązanych procesów przebiegają nieprawidłowo, przyczyniając się do dysfunkcji neuronów i śmierci komórek, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia chorób neurodegeneracyjnych, a także dla kierowania interwencjami terapeutycznymi. Obrazowanie oparte na fluorescencji pozwala na badanie tych złożonych i dynamicznych procesów zachodzących w neuronach i w znacznym stopniu przyczyniło się do naszego zrozumienia biologii komórek neuronalnych. Analiza białek znakowanych fluorescencyjnie jest wyzwaniem, szczególnie gdy eksperymenty są przeprowadzane in vivo, ze względu na bardzo zwarte tkanki, różnorodne typy komórek i niejednorodność morfologiczną. Kwantyfikacja wspomagana ręcznie jest niedroga i prosta, ale często jest czasochłonna i podatna na stronniczość człowieka. W związku z tym istnieje potrzeba bezstronnych, powtarzalnych i dostępnych podejść do ekstrakcji wymiernych danych z badań obrazowych.
Opisaliśmy prosty i elastyczny przepływ pracy przy użyciu Fiji/ImageJ, potężnego i swobodnie dostępnego oprogramowania do przetwarzania obrazów2,3, aby wyodrębnić dane ilościowe z badań obrazowania fluorescencyjnego w eksperymentalnych modelach neurodegeneracji z użyciem Drosophila. Postępując zgodnie z tym protokołem w celu ilościowego określenia agregacji białek i strumienia autofagicznego – dwóch cech biologicznych komórek, które są bardzo istotne dla patologii chorób neurodegeneracyjnych – wykazaliśmy czułość i powtarzalność tego podejścia. Analiza znakowanych fluorescencyjnie zmutowanych białek huntingtyny (Htt) w płacie wzrokowym Drosophila ujawniła liczbę, rozmiar i intensywność agregatów białkowych. Zobrazowaliśmy tandemowy fluorescencyjny reporter strumienia autofagicznego w układzie wzrokowym Drosophila, który wyświetla różne sygnały emisyjne w zależności od środowiska kompartmentowego4. Analiza ratiometryczna reportera tandemowego pozwoliła na ilościowe i kompleksowe spojrzenie na przepływ autofagii i lizosomów od powstawania, dojrzewania i transportu autofagosomu do degradacji w lizosomie, a dodatkowo uwypukliła wrażliwe przedziały zakłócone w stanach neurodegeneracyjnych. Co ważne, w obu analizach wdrożyliśmy w naszym protokole półautomatyczne progowanie i segmentację, aby zminimalizować nieświadome uprzedzenia, zwiększyć moc próbkowania i zapewnić standard ułatwiający porównania między podobnymi badaniami. Prosty przepływ pracy ma na celu uczynienie potężnych wtyczek Fiji/ImageJ (opracowanych przez informatyków w oparciu o algorytmy matematyczne) bardziej dostępnymi dla neurobiologów i całej społeczności nauk przyrodniczych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Rozważania i przygotowania do projektowania eksperymentu z analizą obrazu
- Z góry określ odpowiednie markery anatomiczne, komórkowe lub subkomórkowe, które posłużą jako punkty orientacyjne do standaryzacji obszaru zainteresowania (ROI) w różnych próbkach, na przykład 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI), markery błonowe, zlokalizowane białko fluorescencyjne itp.
- Wybierz znacznik fluorescencyjny, który może wyznaczyć dyskretne punkty punktowe poza poziomami tła dla interesującej Cię struktury.
UWAGA: Ten protokół jest zoptymalizowany pod kątem struktur białkowych (np. nieprawidłowo sfałdowanych agregatów białkowych) i organelli związanych z błoną (np. reporter autofagii). Do wizualizacji agregacji białek wykorzystano N-końcowy fragment ludzkiego białka Htt oznaczony znakiem RFP z patogennym odcinkiem polyQ składającym się ze 138 powtórzeń (RFP-hHttQ138)5. Zmutowane białko Htt tworzy agregaty cytoplazmatyczne, gdy ulega ekspresji pod wpływem specyficznych dla neuronów czynników, takich jak elav-GAL45,6. Aby uwidocznić strumień lizosomów autofagosomów, aktyna-GAL4 została użyta do wszechobecnego sterowania ekspresją tandemowego reportera mCherry-GFP-Atg8a. mCherry- i GFP-dodatnie punkcta wskazują na autofagosomy, a strumień jest monitorowany, gdy fluorescencja GFP jest wygaszana w kwaśnym środowisku lizosomu, gdzie niewrażliwy na kwas mCherry pozostaje do momentu degradacji białka7. Do analizy ratiometrycznej pojedynczy kanał, który jest spójnym markerem struktury, może być użyty do segmentacji lub, w stosownych przypadkach, projekcji dwóch lub więcej kanałów może być użyty do wyznaczenia struktur, chociaż nie jest to wyraźnie opisane w tym protokole. W tym przykładzie mCherry jest używany do segmentacji cząstek dodatnich Atg8, ponieważ jest niewrażliwy na kwasy i pozostanie w przedziale przez cały przepływ przez szlak. - Pobierz i zainstaluj platformę do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym ImageJ lub Fiji — preferowana dystrybucja ImageJ z dołączonymi wtyczkami2,3.
- Zainstaluj wtyczkę dla h-maxima interactive watershed.
UWAGA: Ten protokół korzysta z Fidżi; Dla ImageJ mogą być wymagane dodatkowe wtyczki. Wtyczka opracowana przez Benoit Lombardot dla SCF-MPI-CBG jest dostępna online (https://imagej.net/Interactive_Watershed). - Przejdź do sekcji "Pomoc | Aktualizacja", wybierz "Zarządzaj witrynami aktualizacji" z "ImageJ Updater", wybierz z listy witrynę aktualizacji SCF-MPI-CBG, a następnie zamknij i uruchom ponownie Fidżi.
2. Sekcja mózgu i barwienie immunofluorescencyjne
- Wykonaj naczynia rozwarstwiające wyłożone elastomerem silikonowym.
- Wlej składniki elastomeru silikonowego do zlewki zgodnie ze wskazaniami producenta i dobrze wymieszaj, aż dokładnie się wymieszają.
- Za pomocą pipety napełnić 5 cm szalki do hodowli tkankowych od jednej trzeciej do połowy (około 10 ml mieszanki elastomerów). Pozwól, aby wszelkie bąbelki wypłynęły na powierzchnię i delikatnie usuń bibułą. Przykryj naczynia i umieść je na równej powierzchni do utwardzania przez 48–72 godziny w temperaturze pokojowej (RT).
- W razie potrzeby przeprowadź sekcję mózgu i układu wzrokowego Drosophila.
- Wykonaj sekcję mózgu Drosophila zgodnie z wcześniejszym opisem8,9. Wykonaj sekcję w naczyniach separacyjnych wyłożonych elastomerem, używając dna elastomerowego do ustabilizowania mózgu, aby uniknąć uszkodzenia tkanki lub kleszczy.
- Aby blaszka pozostała nienaruszona podczas sekcji, wsuń dwa kleszcze pod siatkówkę i delikatnie przeerwij środek oka, aby usunąć siatkówkę. Odciągnij tkankę siatkówki przyczepioną do blaszki za pomocą kleszczy trzymanych równolegle do powierzchni blaszki.
UWAGA: Resztki pigmentu zostaną zmyte w kolejnych krokach i zwykle nie zakłócają barwienia przeciwciał i obrazowania. - Rozcieńczyć 37% formaldehydu w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby uzyskać końcowe stężenie 3,7% świeżego przed użyciem w probówce mikrowirówkowej o pojemności 500 μl. Przenieść wypreparowany mózg do probówki mikrowirówkowej z roztworem utrwalającym i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem.
UWAGA: Formaldehyd ma naturalną tendencję do utleniania, wytwarzając kwas mrówkowy. Dlatego zaleca się porcjowanie 37% formaldehydu do przechowywania i rozcieńczanie do 3,7% na świeżo przed każdym użyciem. Nadmierna fiksacja lub niedostateczna fiksacja wpłynie na integralność tkanki i fluorescencję10. - Umyj 3 razy PBTx (PBS z 0,4% Triton X-100) przez 15 minut każdy.
- Wykonaj immunohistochemię i zamontuj próbki.
- Jeśli konieczne jest barwienie przeciwciałami, należy usunąć PBTx, dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w PBTx z 5% normalną surowicą kozią i inkubować na podwielokrotnym mieszalniku przez noc w temperaturze 4 °C.
- Usuń przeciwciało pierwszorzędowe i przemyj 3 razy PBTx przez 15 minut każde. Dodać przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w PBTx z 5% normalną surowicą kozią i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Przemyć 3 razy PBTx przez 15 minut każdy.
- Jeśli potrzebne jest barwienie DAPI, usuń PBTx, dodaj roztwór DAPI (roztwór podstawowy: 5 mg/ml, rozcieńczyć do stężenia roboczego 15 μg/ml w PBTx) i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć 3 razy PBTx przez 15 minut każdy.
- Aby usunąć tkankę, umieść kroplę podłoża montażowego na środku szkiełka mikroskopowego z przekładką z jednej warstwy przezroczystej taśmy po obu stronach. Przenieś mózg na kroplę pożywki montażowej i odczekaj 1-2 minuty, aż mózg stanie się przezroczysty. Ostrożnie usuń podłoże mocujące za pomocą pipety.
- Aby zamontować, nałóż kroplę świeżego podłoża mocującego na mózgi na szkiełku. Ostrożnie nałóż na szkło nakrywkowe, unikając pęcherzyków powietrza. Uszczelnij krawędzie cementem gumowym i susz na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Przejdź do akwizycji obrazu, aby uzyskać najlepsze wyniki.
3. Akwizycja obrazu
- Zoptymalizuj parametry akwizycji mikroskopu, w tym rozdzielczość przestrzenną, obiektyw, powiększenie, szybkość skanowania i rozmiar kroku, aby zmaksymalizować rozdzielczość interesujących struktur i ułatwić półautomatyczną segmentację podczas analizy obrazu.
UWAGA: Przydatne może być przechwycenie obrazu próbki i przetestowanie półautomatycznej segmentacji (w kroku 5 niniejszego protokołu) przed obrazowaniem wszystkich próbek eksperymentalnych. W ten sposób użytkownik może dostosować ustawienia obrazowania tak, aby narzędzia analityczne mogły łatwo dostrzec interesującą go strukturę biologiczną. - Dostosuj elementy sterujące detektora obrazu, aby uchwycić najwyższy stosunek sygnału do szumu i najwyższy zakres dynamiki próbki.
- Użyj tabeli LUT (tabela przeglądowa), która wskazuje nasycenie pikseli (zbyt wysoka ekspozycja) lub niedożywienie (zbyt niskie przesunięcie) podczas dostosowywania ustawień (Rysunek 3B, czerwony oznacza nasycenie pikseli przez Hi/Low LUT).
- Sprawdź, czy ustawienia wzmocnienia i przesunięcia są odpowiednie dla wszystkich grup eksperymentalnych, ponieważ manipulacje eksperymentalne prawdopodobnie zmieniają strukturę zainteresowania.
UWAGA: Konieczne jest, aby te same ustawienia były używane dla wszystkich grup w celu dokonywania porównań ilościowych.
- Obraz przez tkankę, aby przechwycić wszystkie dane.
UWAGA: Zaleca się przechwycenie wszystkich dostępnych danych podczas jednej sesji obrazowania i zdefiniowanie bardziej precyzyjnego obszaru podczas wyboru ROI w kroku 4, jeśli to konieczne. - Zapisz obraz jako typ pliku obsługiwany przez oprogramowanie do obrazowania, aby zachować metadane, takie jak parametry akwizycji i kalibracja przestrzenna. Zapisz obraz z nazwą pliku zawierającą datę eksperymentu, tło genetyczne i reportery fluorescencyjne, przeciwciała lub barwniki odpowiadające skanowanym kanałom, takie jak [Nazwa grupy eksperymentalnej]_[Nazwa próbki]_[Data eksperymentu]_Ch1.[Cel fluoroforowy/Barwnik]_Ch2.[Cel fluoroforowy/Barwnik] itp.
4. Import obrazów Fidżi/ImageJ i wybór ROI
- Otwórz obraz w mieście Fidżi. Użyj okna dialogowego "Opcje importu formatów biologicznych", wybierz "Wyświetl stos z: Hyperstack" i ustaw "Tryb kolorów: Skala szarości".
UWAGA: Zaleca się otwarcie mikroskopu file typu, ponieważ metadane, takie jak kalibracja przestrzenna, mogą być odczytane przez Fidżi. - Zidentyfikuj obszar na podstawie pojedynczej płaszczyzny Z lub rzutu na podstawie kanałów znaczników, które można wykorzystać jako ustandaryzowany zwrot z inwestycji w próbkach (Rysunek 1, wybór ROI).
- Użyj paska przewijania "C", aby wyświetlić kanał(y) używany do przechwytywania znacznika (znaczników) wskazanego w kroku 1.1.
- Użyj paska przewijania "Z", aby poruszać się po płaszczyznach ogniskowych. Wybierz pojedynczy plasterek lub utwórz projekcję wielu plasterków, klikając "Obraz | Stosy | Projekt Z" i ustaw "Rozpocznij plasterek" i "Zatrzymaj plasterek", aby objąć ROI.
UWAGA: Ustawienie opcji "Typ projekcji" na "Maksymalna intensywność" w oknie dialogowym "Rzut Z" często najlepiej nadaje się do podkreślenia struktur do segmentacji w sekcji 5, chociaż może to nie być odpowiednie dla wszystkich zastosowań. Jeśli do analizy wymagany jest inny rodzaj odwzorowania, należy pamiętać o zapisaniu i udokumentowaniu tego pliku jako takiego w celu wyodrębnienia cech w sekcji 6 i/lub 7. - Wygeneruj nowy obraz zawierający kanał(y) i płaszczyznę ogniskową (płaszczyzny) ogniskowej, aby uprościć następujące kroki w protokole analizy obrazu. Wybierz "Obraz | Duplikuj", ustaw żądane "Kanały" (c) i "Plasterki" (z), a następnie zmień nazwę pliku, aby odzwierciedlić wybór (np. [Nazwa grupy eksperymentalnej]_[Nazwa próbki]_[Data eksperymentu]_[Kanał(y)]_[z-płaszczyzna(y)]).
- Użyj jednego z "narzędzi wyboru" na pasku narzędzi Fidżi, aby ręcznie wybrać ustandaryzowany zwrot z inwestycji na podstawie kryteriów wyboru określonych w kroku 4.2.
- Dodaj ROI do menedżera ROI, klikając "Analizuj | Narzędzia | ROI Manager" i kliknij "Dodaj" w menu ROI Manager. Zapisz zwrot z inwestycji w menu Menedżera zwrotu z inwestycji, klikając "Więcej | Zapisz", a następnie nazwij plik, aby odzwierciedlić zwrot z inwestycji (np. [Nazwa grupy eksperymentalnej]_[Nazwa próbki]_[Data eksperymentu]_[Kanał(y)]_[z-płaszczyzna(y)]_[Opis ROI]).
UWAGA: Można to ponownie otworzyć na Fidżi w celu późniejszych analiz lub można je zastosować do innych kanałów lub obrazów, jak w sekcji 5.3.
5. Wstępne przetwarzanie i segmentacja za pomocą h-maxima Watershedding
- Wykonaj przetwarzanie wstępne na kanale używanym do przechwytywania interesujących struktur.
- Jeśli plik obrazu składa się z wielu kanałów, oddziel kanały, klikając "Obraz | Kolor | Podziel kanały", aby wyizolować interesujący Cię kanał.
- Zastosuj filtr, taki jak filtr mediany, aby zredukować szum lub rozmycie gaussowskie w celu wygładzenia, klikając "Proces | Filtry | Typ filtra" (np. "Filtr mediany" lub "Rozmycie gaussowskie").
- Próbkuj różne filtry i parametry filtrów na obrazach z każdej grupy eksperymentalnej. Przejdź do kroku 6.2 z reprezentatywnym przykładem z każdej grupy, aby sprawdzić skuteczność segmentacji. Wybierz filtr i ustawienia, które ułatwiają segmentację interesujących Cię struktur.
- Zapisz filtr i ustawienia. Zastosuj te parametry w grupach eksperymentalnych.
- Zapisz kopię obrazu jako plik TIFF wraz z zastosowanym filtrem w celach informacyjnych. Użyj szczegółowej nazwy, takiej jak [Nazwa grupy eksperymentalnej]_[Nazwa próbki]_[Data eksperymentu]_[Kanał]_[z-plane(s)]_[Filtruj z parametrami].
- Wykonaj segmentację interesujących struktur za pomocą interaktywnego narzędzia h-maxima watershed na wstępnie przetworzonym obrazie wygenerowanym i zapisanym w kroku 5.1.
- Gdy wstępnie przetworzony obraz jest aktywny na Fidżi, uruchom interaktywne narzędzie zlewni h-maxima, klikając "SCF | Etykietowanie | Interaktywny H_Watershed".
UWAGA: Ta wtyczka najpierw oblicza zlewnię, a następnie pozwala użytkownikowi zbadać wpływ lokalnych maksimów i opcji progowych na segmentację za pomocą natychmiast zaktualizowanego obrazu wyjściowego. - Na panelu sterowania dostosuj dynamikę wysiewu (h), próg intensywności (T) i szczytowe zalanie (%), aby zoptymalizować segmentację.
UWAGA: Zawsze odwołuj się do surowego obrazu przed wstępnym przetwarzaniem z sekcji 4.2, aby ręcznie sprawdzić wydajność segmentacji interesujących struktur. - Gdy wyniki segmentacji są zadowalające, wybierz "Eksportuj maskę regionów" i wybierz "Eksportuj". Spowoduje to wygenerowanie binarnego obrazu wyników zlewni (Rysunek 1, Segmentacja).
- Zapisz parametry segmentacji; parametry te muszą być zastosowane we wszystkich grupach eksperymentalnych do porównań ilościowych. W razie potrzeby zapisz binarną maskę wyników w celach informacyjnych z parametrami segmentacji wyszczególnionymi w nazwie, takimi jak [Nazwa grupy eksperymentalnej]_[Nazwa próbki]_[Data eksperymentu]_[Kanały]_[płaszczyzny z]_[Filtruj z parametrami]_[H_Watershed parametry].
- Gdy wstępnie przetworzony obraz jest aktywny na Fidżi, uruchom interaktywne narzędzie zlewni h-maxima, klikając "SCF | Etykietowanie | Interaktywny H_Watershed".
- Wyodrębnij interesujące struktury z wyników zlewni.
- Otwórz zapisany zwrot z inwestycji z kroku 4.4 w menedżerze zwrotu z inwestycji. Gdy aktywna jest maska regionów binarnych z kroku 5.2.4, wybierz ROI z menedżera ROI, aby zastosować do obrazu, aby ograniczyć wyodrębnianie cech do ustandaryzowanego ROI.
- Gdy ROI jest aktywny w binarnej masce zlewni, wybierz "Analizuj | Analizuj cząstki" z zaznaczoną opcją "Dodaj do menedżera" w oknie dialogowym, aby wyodrębnić elementy.
UWAGA: Spowoduje to dodanie identyfikatora cząstek dla każdej struktury wyznaczonej podczas segmentacji do Menedżera ROI. W tym menu dostępne są opcje wykluczania obiektów na podstawie rozmiaru lub kołowości, jeśli jest to konieczne w celu udoskonalenia struktur uwzględnionych w analizie. - Zapisz cząsteczki, klikając "Więcej | Zapisz" z menu menedżera ROI. Upewnij się, że identyfikatory nie są zaznaczone, a wszystkie cząsteczki zostaną zapisane w pliku zip. Użyj szczegółowej nazwy, takiej jak [Nazwa grupy eksperymentalnej]_[Nazwa próbki]_[Data eksperymentu]_[Kanały]_[z-płaszczyzny]_[Filtruj z parametrami]_[H_Watershed parametry]_[struktury].
6. Kwantyfikacja i analiza ilościowa, obszarowa i intensywna
- Otwórz obraz RAW wygenerowany i zapisany w kroku 4.2. Przewiń do kanału używanego do przechwytywania interesujących struktur.
UWAGA: Bardzo ważne jest, aby wykonać pomiary intensywności z obrazu RAW (przed wstępnym przetwarzaniem), ponieważ zastosowanie filtrów w kroku 5.1 zmienia wartości pikseli. - Otwórz cząstki uzyskane z ekstrakcji cech w kroku 5.3 i wybierz opcję "Pokaż wszystko" w Menedżerze ROI.
UWAGA: Ta czynność nałoży na obraz kontur każdej cząstki w "Menedżerze ROI" i powinna pasować do krawędzi interesujących struktur (Rysunek 1, Wyodrębnianie cech). - Ustaw żądane pomiary, klikając "Analizuj | Ustaw wymiary".
UWAGA: Obszar, intensywność i gęstość cząstek można zmierzyć, wybierając "obszar" i "gęstość zintegrowaną". Po wybraniu gęstości zintegrowanej Fidżi uzyska dwie wartości: "gęstość zintegrowaną" obliczaną jako iloczyn obszaru i średniej wartości szarości oraz "Gęstość zintegrowaną surową" mierzoną jako suma wartości pikseli. Gęstość białka fluorescencyjnego w cząstkach oblicza się jako sumę wartości pikseli podzieloną przez powierzchnię. Liczba cząstek wygenerowanych w kroku 5.3 wskazuje ilość cząstek w tkance ROI zdefiniowaną w kroku 4.4. - Z menu Menedżer zwrotu z inwestycji wybierz "Pomiar". Wyniki są wyrażane w skalibrowanych jednostkach, o ile pomiary są wykonywane z plików pochodzących z Fidżi z oprogramowania do obrazowania. Skopiuj wyniki z okna wyników i wklej je do arkusza kalkulacyjnego w celu kompilacji i dalszych obliczeń.
7. Kwantyfikacja ratiometryczna i analiza danych
- Wykonaj kroki 6.1 i 6.2, aby otworzyć identyfikatory cząstek w pierwszym interesującym nas nieprzetworzonym kanale.
- Ustaw żądane pomiary, klikając "Analizuj | Ustaw wymiary".
UWAGA: Średnią intensywność na cząstkę można zmierzyć, wybierając "Średnia wartość szarości". - W Menedżerze ROI wybierz "Mierz". Skopiuj dane z okna wyników i wklej je do arkusza kalkulacyjnego.
- Przesuń pasek przewijania "C" do drugiego interesującego nas kanału surowego, GFP w tym przykładzie (Rysunek 4A) i powtórz kroki 7.2. i 7.3.
UWAGA: Cząstki zapisane w kroku 5.3 będą domyślnie przypisane do kanału i wycinka, z którego zostały wygenerowane. Zadbaj o to, aby cząsteczki zostały nałożone na właściwy kanał zainteresowania. - Oblicz stosunek intensywności z jednego kanału do intensywności drugiego dla każdej cząstki w oprogramowaniu arkusza kalkulacyjnego.
- Wykres punktowy służy do wizualizacji i ilościowego określania danych ratiometrycznych z fluoroforów, które wykazują indywidualne zmiany odzwierciedlające podstawowe procesy biologiczne.
- Wygeneruj wykres punktowy w oprogramowaniu do tworzenia wykresów.
UWAGA: Każdy punkt danych reprezentuje strukturę zainteresowania, w której intensywność pierwszego fluoroforu będącego przedmiotem zainteresowania jest "wartością x", a intensywność drugiego fluoroforu jest "wartością y" mierzoną dla każdej cząstki. - Ustaw progi bramkowania dla każdego fluoroforu, aby zdefiniować ćwiartki.
- Wygeneruj wykres punktowy w oprogramowaniu do tworzenia wykresów.
- Użyj profilu linii, aby zobrazować intensywność fluoroforu w całej strukturze będącej przedmiotem zainteresowania.
- Wybierz ROI wygenerowany w kroku 5.3 i użyj narzędzia linii prostej na pasku narzędzi, aby narysować linię prostą przechodzącą przez ROI. Dodaj wiersz ROI do Menedżera ROI.
- Dla każdego interesującego Cię kanału, z aktywną linią ROI, wybierz "Analizuj | Profil działki".
UWAGA: Funkcja profilu wykresu wygeneruje wykres histogramu i tabelę wartości intensywności wzdłuż linii. Skopiuj wyniki zmierzone z każdego kanału i wklej je do arkusza kalkulacyjnego, aby wygenerować wykres przedstawiający oba kanały wzdłuż linii.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Kwantyfikacja liczby, powierzchni i intensywności agregatów zmutowanego białka Htt znakowanych fluorescencyjnie w płacie wzrokowym Drosophila
Aby zbadać agregację błędnie sfałdowanych białek w ośrodkowym układzie nerwowym modelu choroby Huntingtona u Drosophila, zmodyfikowane ludzkie białko Htt znakowane RFP z niepatologiczną (UAS-RFP-hHttQ15) lub patologiczną ekspansją (UAS-RFP-hHttQ138) oraz me...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół może być wykorzystany do solidnego i powtarzalnego ilościowego oznaczania procesów biologicznych komórek wizualizowanych za pomocą obrazowania opartego na fluorescencji. Kontekst biologiczny i ograniczenia techniczne muszą być starannie rozważone, aby ukierunkować projekt eksperymentalny. Markery fluorescencyjne interesujących struktur subkomórkowych, niezależnie od tego, czy są immunohistochemiczne, oparte na barwniku, czy wyrażane genetycznie, muszą być odróżnialne od tła pod względem morfo...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca jest wspierana przez Sheila and David Fuente Neuropathic Pain Research Program Graduate Fellowship (dla J.M.B.), Lois Pope LIFE Fellows Program (dla C.L., Y.Z. i J.M.B.), stypendium Predoctoral Fellowship Fundacji Snydera-Robinsona (dla C.L.), Fundację Dr. Johna T. Macdonalda (dla C.L.), kontrakty, granty z National Institutes of Health (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018 i R56NS095893 (do R.G.Z.) oraz przez Taishan Scholar Project (prowincja Shandong, Chińska Republika Ludowa) (do R.G.Z.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| SYLGARD(R) 184 Zestaw elastomerów silikonowych | Dow Corning Corporation | PF184250 | Naczynie preparacyjne |
| Falcon 35 mm Nie z powłoką TC Bakteriologiczna szalka Petriego | Corning | 351008 | Naczynie preparacyjne |
| Dumont #5 Kleszcze | Fine Science Tools | 11251-20 | Narzędzie do preparacji |
| Chlorek sodu | Roztwór | ||
| Sigma S3014 PBSFosforan sodu dwuzasadowy | Sigma | S5136 | PBS roztwór |
| Fosforan potasu Monobasic | Sigma | P5655 | PBS roztwór |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Roztwór do przemywania i inkubacytacji przeciwciał. |
| 37% formaldehydu | VWR | 10790-710 | Jednorazowe |
| probówki wirówkowe do utrwalania (0,5 ml, niebieskie) | VWR | 89000-022 | Utrwalanie, mycie i inkubacja przeciwciał. |
| Gładkie i matowe mikroszkiełka (25 razy; 75mm) | VWR | 48312-004 | Szkiełka do obrazowania konfokalnego |
| Okulary Micro Cover Glass, prostokątne (22 razy; 40mm) | VWR | 48393-172 | Szkiełka do obrazowania konfokalnego |
| Rubber Cement | Slime | 1051-A | Montaż |
| VECTASHIELD Antifade Montaż Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Taśma montażowa |
| Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm&; 25,4 m) | 3M Company | 810 | Montaż |
| normalnej surowicy koziej | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Przeciwciało inkubatonu |
| DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Barwienie kwasami nukleinowymi. Rozpuścić w wodzie dejonizowanej, aby uzyskać roztwór podstawowy o stężeniu 5 mg/ml i przechowywać w temperaturze -80°C. Rozcieńczyć do stężenia roboczego 10-20 μ g/ml w PBTx. |
| 3,5X-90X Stereo Zoom Inspekcja Mikroskop przemysłowy | AmScope | SM-1BNZ | Luneta preparacyjna. Wyposażony w 6W LED Dual Gooseneck Illuminator |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | Z SCF_MPI_CBG wtyczkami (wersja 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Mikroskop skaningowy z laserem ogniskowym | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
Bibliografia
- Erkkinen, M. G., Kim, M. -O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118(2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671(2012).
- Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. Assays to monitor autophagy in Drosophila. Methods. 68 (1), 134-139 (2014).
- Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -C. M., Littleton, J. T. Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington's disease model. Genetics. 190 (2), 581-600 (2012).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).
- DeVorkin, L., Gorski, S. M. Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).
- Fischbach, K. -F., Dittrich, A. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress. Nature Communications. 6, 10057(2015).
- Zhai, R. G., et al. NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration. Nature. 452 (7189), 887(2008).
- Li, C., et al. Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome. Nat Commun. 8 (1), 1257(2017).
- Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
- Maday, S., Holzbaur, E. L. Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway. Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy. Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).
- Vincent, L., Soille, P. Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations. IEEE Transactions on Pattern Analysis & Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).
- Najman, L., Schmitt, M. Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation. IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).
- Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast. Prion. 8 (3), 276-284 (2014).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
