Artykuł metodologiczny

Pomiar rozłogów i kłączy traw darniowych za pomocą cyfrowego systemu analizy obrazu

DOI:

10.3791/58042

⸱

19 lutego 2019

 ,  , 
1Department of Agronomy, Food, Natural Resources, Animals, and Environment, University of Padova, 2Department of Horticulture, University of Arkansas

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oparty na oprogramowaniu system analizy obrazów stanowi alternatywną metodę badania morfologii gatunków rozłogowych i kłączowych. Protokół ten umożliwia pomiar długości i średnicy rozłogów i kłączy i może być stosowany do próbek z dużą ilością biomasy i do wielu różnych gatunków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Długość i średnica rozłogów lub kłączy są zazwyczaj mierzone za pomocą prostych linijek i suwmiarki. Ta procedura jest powolna i pracochłonna, dlatego często stosuje się ją na ograniczonej liczbie rozłogów lub kłączy. Z tego powodu cechy te są ograniczone w ich wykorzystaniu do charakterystyki morfologicznej roślin. Zastosowanie technologii oprogramowania do cyfrowej analizy obrazu może przezwyciężyć błędy pomiarowe wynikające z błędów ludzkich, które zwykle zwiększają się wraz ze wzrostem liczby i wielkości próbek. Protokół może być stosowany do każdego rodzaju upraw, ale szczególnie nadaje się do roślin pastewnych lub traw, gdzie rośliny są małe i liczne. Próbki darni składają się z biomasy nadziemnej i górnej warstwy gleby do głębokości maksymalnego rozwoju kłącza, w zależności od gatunku będącego przedmiotem zainteresowania. W badaniach próbki są myte z gleby, a rozłogi/kłącza są czyszczone ręcznie przed analizą za pomocą oprogramowania do cyfrowej analizy obrazu. Próbki są następnie suszone w laboratoryjnym piecu grzewczym w celu zmierzenia suchej masy; W związku z tym dla każdej próbki danymi wynikowymi są całkowita długość, całkowita sucha masa i średnia średnica. Zeskanowane obrazy można skorygować przed analizą, wykluczając widoczne części zewnętrzne, takie jak pozostałe korzenie lub liście, które nie zostały usunięte w procesie czyszczenia. Rzeczywiście, fragmenty te mają zwykle znacznie mniejsze średnice niż rozłogi lub kłącza, więc można je łatwo wykluczyć z analizy, ustalając minimalną średnicę, poniżej której obiekty nie są brane pod uwagę. Gęstość rozłogów lub kłączy na jednostkę powierzchni można następnie obliczyć na podstawie wielkości próbki. Zaletą tej metody jest szybki i sprawny pomiar długości i średniej średnicy dużej liczby próbek rozłogów lub kłączy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie morfologii roślin jest szeroko omawiane we wszystkich dyscyplinach nauki o roślinach, w tym w ekologii, agronomii, biologii i fizjologii. System korzeniowy roślin jest szeroko badany pod kątem jego wpływu na tolerancję na stres, stabilność gleby, wzrost roślin i produktywność. Rozłogi i kłącza są również szeroko badane pod kątem ich roli w strategiach rozmnażania roślin, zdolności rekonwalescencji i magazynowaniu węglowodanów. Rozłogi i kłącza to zmodyfikowane łodygi, które rosną poziomo, nad ziemią (rozłogi) lub pod ziemią (kłącza). Rozłogi i kłącza zawierają również regularnie rozmieszczone węzły i międzywęźla, a także węzły merystematyczne, które są w stanie dać początek nowym korzeniom i pędom1. Przeprowadzono wiele badań na różne tematy, badając korzenie, rozłogi i kłącza różnych roślin2,3,4,5,6,7,8. Systemy korzeniowe, rozłogi i kłącza traw darniowych są badane ze względu na ich znaczenie dla jakości murawy9, wiosenne zazielenienie po spoczynku zimowym10, oraz tolerancja zużycia i zdolność rekonwalescencji11. Co więcej, organy te są również badane w innych uprawach, trawach darniowych, takich jak ryż12, soybean4 i kukurydza13, oraz pastwiska, na których boczne łodygi odgrywają kluczową rolę w kontroli erozji gleby5.

Gęstość długości korzenia (długość korzenia na objętość gleby) i średnia średnica są zwykle mierzone za pomocą oprogramowania do skanowania3,4,5,9,14,15,16,17,18. I odwrotnie, długość i średnicę rozłogów lub kłączy są zwykle mierzone za pomocą linijki i suwmiarki3,19,20 i wymagają znacznego czasu i pracy21,22,23,24. W związku z tym są one często mierzone w ograniczonej liczbie rozłogów lub kłączy11,20,25 i często ograniczają się tylko do charakterystyki morfologicznej roślin rozstawionych w odstępach. Badanie cech rozłogów i kłączy w dojrzałym baldachimie polega na pobraniu dużej ilości biomasy, tak że zwykle określa się tylko gęstość suchej masy rozłogów i kłączy (sucha masa na jednostkę powierzchni)7,11,26,27. W rzeczywistości suchą masę rozłogową można łatwiej zmierzyć niż długość i średnicę rozłogów, susząc próbki w piecu. Jednak długość rozłogów jest ważnym gatunkiem i cechą odmianową, która nie jest dobrze związana z suchą masą. Niedawne badania na płożącej życicy trwałej (Lolium perenne) wykazały, że próbki o dużej gęstości rozłogów niekoniecznie miały wysoką gęstość masy rozłogów6.

Systemy analizy obrazu przyspieszają analizę pierwiastków28,29, dokładniejszy i mniej podatny na błędy ludzkie30,21 niż tradycyjne, ręczne metody31,32,33. Co więcej, systemy te zapewniają wysoką elastyczność i łatwe w użyciu narzędzia, w tym światło, konfigurację optyczną i rozdzielczość, które są często kalibrowane dla każdego zeskanowanego obrazu34. Pornaro i wsp.24 wykazał, że system WinRHIZO, system analizy obrazu specjalnie zaprojektowany do pomiaru umytych korzeni, może stanowić alternatywną metodę do dokładniejszej analizy cech rozłogów i kłączy niż obecne metody, pokonując błędy pomiarowe spowodowane błędami ludzkimi. W celu uzyskania opisu morfologicznego i informacji ilościowych na temat wzrostu rozłogów i kłączy, systemy analizy obrazowej mogą być wykorzystywane do szybkiej analizy dużej liczby próbek, nawet przy dużej ilości biomasy, co pozwala na zwiększenie precyzji statystycznej. Dlatego pakiety oprogramowania do analizy korzeni zapewniają alternatywną, niezawodną i szybką metodę badania wzrostu i morfologii rozłogów i kłączy różnych gatunków roślin24.

Prezentujemy eksperyment przeprowadzony w północno-wschodnich Włoszech w celu zbadania rozwoju rozłogów i kłączy czterech odmian trawy bermudzkiej (Cynodon spp.). Badania miały na celu poszerzenie wiedzy na temat rozwoju rozłogów i kłączy w siewnych ("LaPaloma" i "Yukon") i wegetatywnych ("Patriot" i "Tifway") odmianach trawy bermudzkiej. Eksperyment rozpoczęto w maju 2013 r., a próbki darni pobierano w trzech terminach w roku, od jesieni 2013 r. do lata 2015 r. [marzec (przed zazielenieniem), lipiec (pełny sezon wegetacyjny) i październik (przed spoczynkiem zimowym)]. Do opisu i wyjaśnienia tej metody wykorzystano próbki pobrane latem drugiego sezonu wegetacyjnego (lipiec 2014 r.), ponieważ duża biomasa próbek w tym czasie uzasadniała potrzebę szybkiej analizy. WinRHIZO, cyfrowe narzędzie do analizy obrazu zaprojektowane specjalnie do pomiarów płukanych korzeni, zostało wykorzystane do określenia gęstości długości rozłogów i średniej średnicy.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pobieranie próbek biomasy

  1. Pobrać próbki, w tym biomasę nadziemną i warstwę gleby o odpowiedniej głębokości w zależności od gatunku (w przypadku gatunków darniowych głębokość 15 cm jest zazwyczaj wystarczająca), aby zapewnić zbieranie zarówno rozłogów, jak i kłączy.
    Uwaga: Przed rozpoczęciem badania należy wziąć pod uwagę całkowitą wielkość powierzchni, ponieważ zostaną pobrane próbki niszczące. Ogólnie rzecz biorąc, im dłużej przeprowadzany jest eksperyment, tym większa wymagana jest wielkość działki.
  2. Przed pobraniem próbki należy sprawdzić warunki glebowe: jeśli gleba jest zbyt sucha, zwłaszcza na glebach ciężkich, pobranie próbek może być trudne. W takim przypadku należy nawodnić poletka przed pobraniem, aby zmiękczyć warstwy próbki.
  3. Próbki należy pobrać za pomocą próbnika rdzeniowego gleby (≥ średnicy 8 cm) lub określić powierzchnię do pobrania za pomocą ramy (≥ 10 x 10 cm) i pobrać próbki łopatą. Oznacz każdą próbkę taśmą laboratoryjną.
  4. Zbierz kilka losowych próbek na poletko, aby były reprezentatywne dla populacji roślin.
  5. Użyj tego samego próbnika do całego eksperymentu i zapisz obszar, który reprezentuje każda próbka, aby obliczyć gęstość rozłogów i kłączy.
    Uwaga: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbki można przechowywać w plastikowych torebkach i konserwować w temperaturze poniżej -18 °C.

2. Czyszczenie próbek biomasy

  1. Umieść próbkę na dużym sicie z otworami 0,5-1,5 mm w zależności od wielkości rozłogów lub kłączy. Otwory powinny być wystarczająco małe, aby zatrzymać wszystkie rozłogi i kłącza, ale wystarczająco duże, aby umożliwić usunięcie cząstek gleby. W przypadku gleb piaszczystych dwa sita z różnymi otworami, umieszczone jedno na drugim, mogą pozwolić na lepszą precyzję i wydajność.
  2. Oczyść próbki strumieniem wody o mocy wystarczającej do usunięcia cząstek gleby bez uszkadzania roślin.
  3. Pobrać oczyszczone próbki i umieścić je na tacy z ręcznikami papierowymi, zwracając uwagę na odpowiednie oznakowanie tac.
    Uwaga: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbki można przechowywać w plastikowych torebkach i konserwować w temperaturze poniżej -18 °C.
  4. Następnie oczyść próbki, usuwając korzenie i liście nożyczkami. Podczas tego procesu w razie potrzeby oddziel rozłogi i kłącza oraz zapisz dodatkowe informacje, takie jak liczba roślin, krzewów i rozłogów na roślinę.
    Uwaga: Usunięcie całej tkanki korzeni i liści z rozłogów i kłączy poprawi precyzję. Drobne korzenie są trudne do usunięcia; Jednak dzięki cyfrowej analizie obrazu możliwe jest pominięcie ich w analizie za pomocą aplikacji, która wyklucza narządy o średnicy mniejszej niż wybrana wartość (patrz krok 5.1), która jest dość dokładnie definiowana na podstawie obserwacji obrazów odtwarzanych na ekranie.
  5. Umieść rozłogi i kłącza w papierowych torebkach z etykietami.
    Uwaga: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbki można przechowywać w plastikowych torebkach i konserwować w temperaturze poniżej -18 °C.

3. Skanowanie i analiza obrazu próbek

  1. Umieść próbkę na przezroczystej plastikowej tacy standardowego sprzętu skanującego WinRHIZO. Ręcznie umieść rozłogi i kłącza za pomocą kleszczy laboratoryjnych, aby zminimalizować nakładanie się. Duże próbki mogą wymagać podzielenia na podpróbki.
  2. Nie dolewaj wody do tacki (zgodnie z zaleceniami dla korzeni), ponieważ rozłogi i kłącza mają wystarczającą sztywność, aby uniknąć nadmiernej bliskości narządów, co może powodować błędy odczytu, co zwykle zdarza się w przypadku drobnych korzeni.
  3. Umieść tacę na powierzchni skanera.
  4. Włącz skaner i rozpocznij uruchamianie programu.
  5. Sprawdź rozdzielczość obrazu w menu Obraz, polecenie Parametr akwizycji obrazu, aby uzyskać możliwą dalszą kontrolę nad zapisanym obrazem.
  6. Sprawdź próg w Analizie, poleceniu Root & Background Distinction, aby uzyskać dobrą klasyfikację pikseli należących do skanowanych narządów.
  7. Sprawdź, czy cała powierzchnia zasobnika zostanie zeskanowana w menu Obraz, poleceniu Parametr pozyskiwania obrazu.
  8. Sprawdź klasę średnicy wyświetlaną dla rozkładu narządów według średnicy, w obszarze graficznym nad zeskanowanym obrazem. Wybierz 20 klas o równej szerokości z odstępami 0,1 mm, klikając na oś poziomą wykresu. Funkcja ta pozwala na wykluczenie danych należących do korzeni lub małych narządów, gdy rozłogi lub kłącza nie zostały idealnie oczyszczone. W literaturze podaje, że większość korzeni gatunków darni ma średnicę mniejszą niż 0,2 mm.
    Uwaga: Szerokość i liczbę klas można modyfikować z uwzględnieniem średniej średnicy rozłogów i kłączy dla analizowanych próbek oraz zmienności wokół tej średniej. W przypadku niektórych próbek należy przeprowadzić kontrolę w celu określenia minimalnej średnicy, która ma zostać wyłączona.
  9. Uruchom pierwsze skanowanie próbki i sprawdź, czy edycja pozwala na dobrą analizę.
  10. Postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania, aby zapisać obraz i przetworzoną analizę. Oznacz obraz i analizę etykietą próbki.
  11. Kontynuuj skanowanie wszystkich próbek.
    Uwaga: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbki można przechowywać w plastikowych torebkach i konserwować w temperaturze poniżej -18 °C.

4. Pomiar suchej masy

  1. Za pomocą precyzyjnej wagi elektronicznej umieść zeskanowane próbki w tarowanej aluminiowej tacy.
  2. Powtórz krok 4.1 dla wszystkich zeskanowanych próbek.
  3. Włóż wszystkie próbki do piekarnika ustawionego na 105 °C i susz je przez 24 godziny.
  4. Usuń próbki i poczekaj, aż masa tkanki się ustabilizuje.
  5. Zważyć wszystkie próbki wraz z ich tarą.
  6. Odjąć tarę od zarejestrowanej masy, aby uzyskać masę netto każdej próbki.

5. Korekta danych i obliczanie gęstości długości i masy

  1. Korekta długości i uśrednionej średnicy
    1. Przekonwertuj plik .txt wynikający z analizy za pomocą WinRHIZO na plik .csv.
    2. Użyj wyników pogrupowanych według klas średnic, aby wykluczyć dane dotyczące narządów mniejszych niż 0,2 mm (korzenie, część liści lub zadrapania na tacy).
    3. Dla każdego odczytu WinRHIZO (wierszy pliku .txt) zsumuj wszystkie długości zarejestrowane dla klas średnic większych niż 0,2 mm. Długość obliczona za pomocą tej poprawki jest długością efektywną, która ma być wykorzystana do dalszego przetwarzania danych.
    4. Dla każdego odczytu WinRHIZO zsumuj obszary rzutowania zarejestrowane dla klas średnic większych niż 0,2 mm. Proporcja między długością a powierzchnią projekcji daje średnią średnicę skorygowaną o wykluczenie narządów o średnicy mniejszej niż 0,2 mm.
  2. Jeżeli próbka została podzielona na podpróby, należy obliczyć końcową długość jako sumę wszystkich długości podprób i obliczyć końcową średnią średnicę jako proporcję między sumą wszystkich długości podpróbek a sumą wszystkich obszarów rzutowania podpróby.
  3. W razie potrzeby należy obliczyć długość i gęstość masy na jednostkę powierzchni na podstawie wielkości próby.
  4. Wykorzystaj uzyskane dane do analizy statystycznej.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesienią 2013 roku przeprowadzono eksperyment polowy w celu porównania rozwoju rozłogów i kłączy czterech odmian trawy bermudzkiej, w tym dwóch typów z nasionami ("LaPaloma" i "Yukon") oraz dwóch sterylnych hybryd wegetatywnych ("Patriot" i "Tifway"). Projekt eksperymentalny polegał na randomizowanym, kompletnym bloku z trzema powtórzeniami, co daje łącznie 12 wykresów (2 x 2 m).

Czternaście rozłogów i czternaście kłączy z każdej odmiany darniowej i dzikiej trawy bermudzkiej zebrano losowo na poletkach, jak również z dzikich roślin trawy bermudzkiej rosnących w pobliżu działek, w sumie 70 rozłogów i 70 kłączy. Wszystkie rozłogi i kłącza zostały oczyszczone zgodnie z opisem w protokole (krok 2) przed dalszym pomiarem. Średnicę i długość międzywęźla mierzono odpowiednio suwmiarką i linijką, a liczbę węzłów policzono dla każdego rozłogów lub kłącza. Rejestrowano również czasy niezbędne do oczyszczenia i zmierzenia próbek rozłogów i kłączy za pomocą linijki i suwmiarki. Średnice rozłogów i kłączy obliczono jako średnie wszystkich zmierzonych średnic międzywęźli. Całkowita długość rozłogów i kłączy została obliczona jako suma wszystkich długości międzywęźli. Ponadto zmierzono całkowite zeskanowane długości i średnice zeskanowanych rozłogów i kłącza za pomocą cyfrowego systemu analizy obrazu, jak opisano w krokach 3 i 5. Zarejestrowano czas niezbędny do zmierzenia cech rozłogów i kłączy za pomocą systemu analizy cyfrowej. Każdy rozłog i kłącze zostały następnie przecięte nożyczkami w celu oddzielenia międzywęźli od węzłów, a międzywęźla wykorzystano do oszacowania zeskanowanej średnicy międzywęźla, jak opisano w krokach 3 i 5. Współczynniki korelacji Pearsona obliczono dla rozłogów i kłączy (n = 70 rozłogów, n = 70 kłączy) między długościami zmierzonymi i zeskanowanymi, średnicami zmierzonymi i zeskanowanymi, liczbą węzłów oraz wartością bezwzględną różnicy między średnicami zmierzonymi i zeskanowanymi oraz średnicami zmierzonymi i zeskanowanymi średnicami międzywęźlowymi. Długości zmierzone linijką posłużyły do kalibracji długości oszacowanych za pomocą systemu cyfrowej analizy obrazu.

Analiza regresji wykazała wysoką korelację między długością skanowanych rozłogów a długością zmierzoną (Rysunek 1a), o nachyleniu 1,03 i przecięciu -4,22, a także między długością skanowanego kłącza a długością zmierzoną (Rysunek 1b), o nachyleniu 1,03 i przecięciu 4,22. Ręczne czyszczenie 14 rozłogów i 14 kłączy trwało średnio odpowiednio 21 minut i 24 s oraz 11 min i 12 s. Średni czas pomiaru długości i średnicy za pomocą linijki i suwmiarki wynosił 14 minut i 6 s dla rozłogów oraz 13 minut i 35 s dla kłączy. Skanowanie i analiza programowa próbek za pomocą WinRHIZO trwała średnio 11 minut w przypadku rozłogów oraz 12 minut i 4 s w przypadku kłączy.

Zmierzone i zeskanowane średnice były również istotnie skorelowane zarówno w rozłogach, jak i kłączach. Zależności między zmierzoną a zeskanowaną średnicą były bliskie 1:1, co wskazuje na dobre dopasowanie danych (Rysunek 2a i 2b). Przechwycenie wykazało jednak, że system cyfrowej analizy obrazu przeszacował zmierzoną średnicę, zwłaszcza dla niższych wartości, a wyższe wartości średnicy kłącza były niedoszacowane. To przeszacowanie może być spowodowane węzłami rozłogowymi, które są skanowane przez oprogramowanie, wpływając na całkowitą powierzchnię rzutu, która jest używana do obliczania średnicy (stosunek całkowitej powierzchni rzutu do całkowitej długości), a zamiast tego są wykluczane podczas pomiarów za pomocą suwmiarki. Korelacja między liczbą węzłów a różnicą między wartościami średnic uzyskanymi obiema metodami (zmierzoną i zeskanowaną) była istotna tylko w przypadku rozłogów (Rysunek 3a); również różnice w liczbie węzłów wyjaśniały tylko niewielką część zmienności tej różnicy (R2 = 14%). Istotna korelacja stwierdzona między zeskanowaną średnicą międzywęźla a zmierzoną średnicą (nachylenia 1,01 i 0,98 odpowiednio dla rozłogów i kłączy; przecięcia bliskie zeru) (ryc. 4a i 4b) pokazuje, że średnicę międzywęźla można dokładnie oszacować za pomocą cyfrowego systemu analizy obrazu, o ile węzły są usuwane. W związku z tym całkowita długość rozłogów i średnia średnica próbek składających się z licznych rozłogów lub kłączy można łatwo i dokładnie określić ilościowo za pomocą cyfrowego systemu analizy obrazu.

W ramach trwającego eksperymentu, jedna próbka murawy (głębokość 20 x 20 x 15 cm) została pobrana na każdej działce sezonowo od jesieni 2013 do lata 2015 roku i została potraktowana zgodnie z opisem w protokole. Długość rozłogów i kłączy na jednostkę powierzchni (długość, gęstość) oraz waga na jednostkę powierzchni (gęstość wagowa) próbek pobranych w lipcu 2014 r. przedstawiono na rysunku Rysunek 5. Zaobserwowano różnice w gęstości długości rozłogów między odmianami rozmnażanymi wegetatywnie ("Patriot" i "Tifway") a wysiewanymi ("La Paloma" i "Yukon"). Największą gęstość długości kłączy wykazała się odmiana "Patriot", następnie "Tifway" i odmiany z wysiewem. Gęstość masy rozłogów była różna dla wszystkich odmian, przy czym najwyższą wartość wykazała odmiana "Patriot", a następnie "Tifway", "La Paloma" i "Yukon". Odmiany rozmnażane wegetatywnie wykazywały również większą gęstość masy kłącza niż odmiany wysiewane. Rozwój długości rozłogów i kłączy na jednostkę powierzchni (gęstość długości) oraz masy na jednostkę powierzchni (gęstość masy) odmiany Patriot w okresie badania przedstawiono w Rysunek 6. Zagęszczenie rozłogów wzrosło od marca 2014 r. do lipca 2014 r. i nie zmieniło się od lipca 2014 r. do lipca 2015 r. W próbkach pobranych w październiku 2013 r. i marcu 2014 r. znaleziono tylko kilka kłączy. Gęstość długości kłącza wzrosła w lipcu 2104 r., osiągając najwyższe wartości, ale ponownie spadła w październiku 2014 r. Gęstość masy rozłogów nieznacznie wzrosła od marca do lipca 2014 r.; Szybszy wzrost zaobserwowano jednak od lipca do października 2014 r., a następnie spadek w marcu 2015 r. Gęstość masy kłącza wykazywała podobny trend do gęstości długości kłącza, osiągając najwyższą wartość w lipcu 2014 r.

Oprogramowanie uwzględnia w analizie wszystkie obiekty na zeskanowanym obrazie. Przedstawiono przykład układu cyfrowej analizy obrazu z oprogramowania WinRHIZO (Rysunek 7), gdzie linie o różnych kolorach nakładają się na obiekty (rozłogi) o różnej średnicy w celu obliczenia całkowitej długości dla każdej klasy średnicy. Możemy zaobserwować, że w analizie brane są pod uwagę fragmenty korzeni czy liści. Jak opisano w kroku 3.9, możliwe jest ograniczenie szerokości i liczby analizowanych klas średnicy. Histogram przedstawia rozkład długości na wybrane klasy średnic (Rysunek 7). Histogram ten można wykorzystać do oceny minimalnych klas średnicy, które mają zostać wyłączone. Wizualna obserwacja tego wykresu w górnej części obrazu ekranu podkreśla, że długość ma rozkład normalny wokół średniej klasy średnicy, z wyjątkiem dwóch pierwszych klas, które wykazują wyższe wartości niż te, które pasują do rozkładu normalnego. Nawet jeśli próbki zostały starannie oczyszczone, w tym te mniejsze klasy, analiza danych może mieć wpływ na wyniki, przeszacowując gęstość długości i niedoszacowanie średniej średnicy. Z naszych wyników wynika, że długość mniejszych klas (średnica < 0,2 mm) stanowiła 13-32% całkowitych wartości długości kłączy wynikających z analizy oprogramowania (tab. 1). Ponadto średnia średnica była niedoszacowana w zakresie 2-17% (tab. 1).

figure-results-1
Rysunek 1: Analiza regresji wartości długości mierzonych linijką w stosunku do wartości oszacowanych za pomocą systemu cyfrowej analizy obrazu rozłogów trawy bermudzkiej24 (a) i) kłączy (b). Linia przerywana reprezentuje stosunek 1:1. Panel A został zmodyfikowany w stosunku do Pornaro et al.24. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Analiza regresji wartości średnicy mierzonych suwmiarką w stosunku do wartości oszacowanych za pomocą systemu cyfrowej analizy obrazu rozłogów trawy bermudzkiej24 (a) i kłączy (b). Linia przerywana reprezentuje stosunek 1:1. Panel A został zmodyfikowany w stosunku do Pornaro et al.24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58042/58042fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Analiza regresji liczby węzłów rozłogów trawy bermudzkiej24 (a) i kłączy (b) w stosunku do bezwzględnych wartości różnicy między średnicą oszacowaną za pomocą cyfrowego systemu analizy obrazu a zmierzoną suwmiarką. Linia przerywana reprezentuje stosunek 1:1. Panel A został zmodyfikowany w stosunku do Pornaro et al.24. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Analiza regresji wartości średnicy mierzonych suwmiarką w stosunku do wartości oszacowanych za pomocą systemu cyfrowej analizy obrazu rozłogów trawy bermudzkiej24 (a) i kłączy (b) tylko dla międzywęźli. Linia przerywana reprezentuje stosunek 1:1. Panel A został zmodyfikowany w stosunku do Pornaro et al.24. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Przykładowe wyniki długości i gęstości masy rozłogów i kłączy z doświadczenia terenowego porównującego cztery odmiany trawy bermudzkiej (Patriot, Tifway, La Paloma, Yukon). Gęstość długości rozłogów (a), gęstość długości kłącza (b), gęstość masy rozłogów (c) i gęstość masy kłącza (d). Słupki pionowe reprezentują błędy standardowe wynoszące sześć powtórzeń. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Przykładowe wyniki długości i gęstości masy rozłogów i kłączy z doświadczenia terenowego pokazującego rozwój rozłogów i kłączy odmiany trawy bermudzkiej Patriot. Gęstość długości rozłogów (a), gęstość długości kłącza (b), gęstość masy rozłogów (c) i gęstość masy kłącza (d). Słupki pionowe reprezentują błędy standardowe wynoszące sześć powtórzeń. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Przykładowy układ cyfrowej analizy obrazu z oprogramowania WinRHIZO. Zeskanowany obraz na pierwszym planie oraz wykresy słupkowe w górnej części obrazu ekranu pokazują rozkład długości w wybranych klasach średnic. Kolorowe linie wskazują analizę obrazu, a każdy kolor odpowiada kolorom klas średnic zgłoszonych na wykresach słupkowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. TGL pkt. TGL pkt. TGL pkt. szt. pkt. TGE pkt. SZT. pkt. szt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. TGL pkt. pkt. pkt. pkt. TGL pkt. Rozdział TGL pkt.
OdmianaBlokDługość kłącza (cm/dm2)Średnia średnica (mm)
< 0,2 mmłącznyWspółczynnikA< 0,2 mmłącznyWspółczynnikB
patriota1231Rozdział 278Rozdział 16,91.6378461,5994Nr 97,7
patriotacyfra arabskaRozdział 304Okręg wyborczy 349Rozdział 12,81.620667Numer katalogowy: 1.58837198,0
patriota3Rozdział 304Rozdział 366Rozdział 16,8Numer katalogowy: 1.6499181.62136798,3
Tifway (Kręty)1184 Rozdział 18423120,62.1497451,995192,8
Tifway (Kręty)cyfra arabskaRozdział 155193Pytanie 19,9Numer katalogowy: 1.866253Numer katalogowy: 1.7660594,6
Tifway (Kręty)3Rozdział 11915020,91.877386Numer katalogowy: 1,7586593,7
La Paloma11723Norma 24,4Nr kat. 2.139019Numer katalogowy: 1,890488,4
La Palomacyfra arabska2638 Rozdział 3831,6Numer katalogowy: 2.101385Numer katalogowy: 1,745583,1
La Paloma3Rozdział 34Rozdział 4727,5Numer katalogowy: 2.0337291,735485,3
Yukon1Rozdział 32Rozdział 4428,0Numer katalogowy: 1.700155Numer katalogowy: 1,494587,9
Yukoncyfra arabska172533,2Numer katalogowy: 1.683391,428484,9
Yukon367Rozdział 87Norma 23,6Numer katalogowy: 1.8447211,677490,9
a Długość klas ≤0,2 mm/długość całkowita
b Całkowita średnica/średnica klas ≤0,2 mm

Tabela 1: Gęstość długości kłącza i średnia średnica kłącza z mniejszymi klasami średnic i bez nich. gęstość długości z klasami średnic mniejszymi niż 0,2 mm i bez nich, z uwzględnieniem klas mniejszych niż 0,2 mm i ich współczynników (długość klas ≤ 0,2 mm/długość całkowita); oraz średnica średnia, z klasami średnic mniejszymi niż 0,2 mm i bez nich, wraz z klasami mniejszymi niż 0,2 mm i ich stosunkami (średnica wraz z klasami < 0,2/średnica bez uwzględniania klas średnic < 0,2 mm).

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół został opracowany i oceniony na potrzeby badania traw darniowych. Może być jednak stosowany w odniesieniu do wielu gatunków rozłogowych lub kłączowych z niezbędnymi dostosowaniami w zależności od ich cech morfologicznych, warunków środowiskowych i precyzji czyszczenia próbek.

Średnia średnica oszacowana za pomocą tego protokołu nie może być porównywana ze średnicą międzywęźla mierzoną suwmiarką. Cyfrowa analiza obrazu uwzględnia węzły i międzywęźla w obliczeniach średniej średnicy, czyli stosunku całkowitej powierzchni rzutu do całkowitej długości. Jak omówili Pornaro i wsp.24, średnia średnica uzyskana dla rozłogów trawy bermudzkiej z systemem WinRHIZO zawyżyła średnie wartości średnicy mierzone suwmiarką na międzywęźlu. Średnica rozłogów jest zwykle używana do opisania średnicy międzywęźli rozłogowych i jest powszechnym parametrem używanym do opisu botanicznego18,25. Z tego powodu Pornaro i wsp.24 zwróciło uwagę, że średnia średnica oszacowana za pomocą systemu WinRHIZO i ręcznie zmierzona średnica międzywęźla opisują dwa różne aspekty morfologii.

Czas wymagany do wykonania tego protokołu pozostaje czynnikiem ograniczającym rutynową analizę. Najbardziej czasochłonnym etapem jest czyszczenie próbek (krok 2.4). Z naszego doświadczenia wynika, że oczyszczenie jednej próbki darni dużą ilością biomasy (tj . 20 x 20 cm) wymaga około trzech osób pracujących przez 2 do 4 godzin. Jak opisano w protokole, proces czyszczenia jest konieczny zarówno w przypadku systemu analizy cyfrowej, jak i podczas korzystania z suwmiarki i linijki. W przypadku gdy próbki składają się z ograniczonej liczby rozłogów/kłączy, czas niezbędny do zebrania danych za pomocą tych dwóch metod jest podobny. Jednak wraz ze wzrostem wielkości próby, metoda oparta na oprogramowaniu nie ma późniejszego wydłużania czasu, ponieważ jedynym czynnikiem ograniczającym jest powierzchnia skanera. Wręcz przeciwnie, czas potrzebny na zmierzenie narządów za pomocą linijki i suwmiarki zwiększa się wraz z liczbą rozłogów lub kłączy składających się na próbkę.

Badanie cech rozłogów i kłączy u dojrzałych traw darniowych zawsze opierało się na pomiarze długości i średnicy międzywęźla oraz masy suchej masy 7,11,26,27. Ze względu na długi czas potrzebny na przetworzenie próbek i spadek dokładności wraz ze wzrostem wielkości próbki, pomiary ręczne powinny być ograniczone do niewielkiej liczby rozłogów lub kłączy 11,20,25. W związku z tym mogą nadawać się tylko do eksperymentów na jednej roślinie. Przewagą systemu analizy obrazu nad tradycyjnymi metodami jest to, że może on mierzyć długość dużych próbek rozłogów lub kłączy i obliczać zarówno długość, gęstość, jak i ciężar właściwy (stosunek masy do długości).

Protokół ten pozwala na pomiar długości rozłogów i kłączy oraz obliczenie gęstości długości w próbkach o dużej biomasie (dla których masa rozłogów lub kłącza jest obecnie jedynym parametrem stosowanym do opisu morfologii). Długość rozłogów i/lub kłącza może być ważnym parametrem w wielu badaniach, którego nie można oszacować przy użyciu obecnych technik. Ostatnie badania na różnych gatunkach murawy6 wykazały, że gęstość masy i długości rozłogów nie zawsze jest ze sobą skorelowana, co wskazuje, że pożądane może być zmierzenie wielu parametrów w celu odpowiedniej oceny systemu rozłogów i kłączy. Metoda ta powinna być szczególnie przydatna do porównywania praktyk zarządzania odmianami lub kulturami.

Kilka kroków w ramach protokołu ma kluczowe znaczenie dla pomyślnego oszacowania długości i średniej średnicy rozłogów i kłączy. Ze względu na dużą zmienność morfologii roślin w różnych warunkach środowiskowych, liczba próbek (wielkość próby) i wymiary powierzchni gruntu, które powinny być próbkowane (wymiar próby) powinny być starannie ocenione i powinny być jak najbardziej reprezentatywne dla populacji w celu zmniejszenia zmienności danych. Co więcej, oczyszczenie korzeni i liści z rozłogów przed analizą jest skrupulatną pracą wymagającą szczególnej uwagi, aby uniknąć przeszacowania. Wreszcie, przed przetworzeniem obrazów, zaleca się staranne wybranie szerokości klas średnic i minimalnej średnicy za pomocą opcji oprogramowania, aby wykluczyć z analizy wszystko, co nie jest rozłogami lub kłączami. Każdy eksperyment wymaga wyboru minimalnej średnicy, ponieważ średnica zmienia się w zależności od gatunku i warunków środowiskowych, w tym praktyk kulturowych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
taśma laboratoryjnaDowolneznaczniki NAmogą być używane do oznaczania próbek
torby plastikoweDowolnaNA Każda plastikowa torba może być używana do przechowywania próbek do momentu ich sklepania
toreb papierowychDowolnaNIE NAKażda torba papierowa może być używana do przechowywania oczyszczonych próbek, aby uniknąć tworzenia się pleśni
ręczniki papieroweDowolnaNAPo umyciu próbek wodą, a przed ich oczyszczeniem nożyczkami, pomocne jest położenie ich na ręczniku papierowym, aby wchłonąć wodę
NożyczkiDowolnaBRAK DANYCHDowolne nożyczki z cienkimi końcówkami
Pudełko aluminioweDowolnabrak danychDowolne aluminiowe pudełko wystarczająco duże, aby pomieścić tacki na próbki
Dowolnabrak danychPomocne jest używanie plastikowej tacki do przechowywania próbek podczas procesu czyszczenia
sito z otworami 0,5-1,5 mmDowolnaBRAK DANYCHDowolna
próbnik rdzeniowyDowolnaBRAK DANYCHDo pobierania gleby o średnicy co najmniej 8 cm używamy próbnika rdzeniowego
Dowolnybrak danychDo pobierania dużych próbek używamy kwadratowej ramy (10 x 10 cm lub 15 x 15 cm lub 20 x 20 cm)
DowolnaBRAK Używamyłopaty do wyciągania próbek ograniczonych kwadratową ramką
precyzyjna waga elektronicznaDowolnadanychDowolna precyzyjna waga elektroniczna
piec laboratoryjnyDowolnybrak danychDowolna maszyna laboratoryjna
ZamrażarkaDowolna zamrażarka
Oprogramowanie WinRHIZORegent Instruments Inc., QuebecNAWyłączone z wersji "podstawowej"
Skaner WinRHIZORegent Instruments Inc., QuebecNASystem WinRHIZO zawiera skaner skalibrowany dla oprogramowania Akcesoria
do skanera WinRHIZORegent Instruments Inc., QuebecNASystem WinRHIZO zawiera akcesoria, takie jak plastikowa taca i pozycjoner, do użytku ze skanerem
gleby z sitem brak

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beard, J. B. Beard's turfgrass encyclopedia for golf courses, grounds, lawns, sports fields. , Michigan State University Press. (2004).
  2. Anderson, J. A., Taliaferro, C. M., Wu, Y. Q. Freeze tolerance of seed- and vegetatively propagated bermudagrasses compared with standard cultivars. Applied Turfgrass Science. , (2007).
  3. Gennaro, P., Piazzi, L. The indirect role of nutrients in enhancing the invasion of Caulerpa racemosa var cylindracea. Biological Invasions. 16 (8), 1709-1717 (2014).
  4. Ortiz-Ribbing, L. M., Eastburn, D. M. Evaluation of digital image acquisition methods for determining soybean root characteristics. Crop Management. , (2003).
  5. Pornaro, C., Schneider, M. K., Leinauer, B., Macolino, S. Above-and belowground patterns in a subalpine grassland-shrub mosaic. Plant Biosystems. 151 (3), 493-503 (2017).
  6. Pornaro, C., Menegon, A., Macolino, S. Stolon development in four turf-type perennial ryegrass cultivars. Agronomy Journal. , In press (2018).
  7. Rimi, F., Macolino, S., Richardson, M. D., Karcher, D. E., Leinauer, B. Influence of three nitrogen fertilization schedules on bermudagrass and seashore paspalum: II. Carbohydrates and crude protein in stolons. Crop Science. 53, 1168-1178 (2013).
  8. Schiavon, M., Macolino, S., Leinauer, B., Ziliotto, U. Seasonal changes in carbohydrate and protein content of seeded bermudagrasses and their effect on spring green-up. Journal of Agronomy and Crop Science. 202 (2), 151-160 (2016).
  9. Macolino, S., Ziliotto, U. Comparison of Turf Performance and Root Systems of Bermudagrass Cultivars and Companion Zoysiagrass. Acta Horticulturae. 938, 185-190 (2012).
  10. Giolo, M., Macolino, S., Barolo, E., Rimi, F. Stolons reserves and spring green-up of seeded bermudagrass cultivars in a transition zone environment. HortScience. 48 (6), 780-784 (2013).
  11. Lulli, F., et al. Physiological and morphological factors influencing wear resistance and recovery in C3 and C4 turfgrass species. Functional Plant Biology. 39, 214-221 (2012).
  12. Ramalingam, P., Kamoshita, A., Deshmukh, V., Yaginuma, S., Uga, Y. Association between root growth angle and root length density of a near-isogenic line of IR64 rice with DEEPER ROOTING 1 under different levels of soil compaction. Plant Production Science. 20 (2), 162-175 (2017).
  13. Qin, R., Noulas, C., Herrera, J. M. Morphology and Distribution of Wheat and Maize Roots as Affected by Tillage Systems and Soil Physical Parameters in Temperate Climates: An Overview. Archives of Agronomy and Soil Science. , 1-16 (2017).
  14. Barnes, B. D., Kopecký, D., Lukaszewski, A. J., Baird, J. H. Evaluation of turf-type interspecific hybrids of meadow fescue with perennial ryegrass for improved stress tolerance. Crop Science. 54, 355-365 (2014).
  15. Biernacki, M., Bruton, B. D. Quantitative response of Cucumis melo inoculated with root rot pathogens. Plant Disease. 85, 65-70 (2001).
  16. Bouma, T. J., Nielsen, K. L., Koutstaal, B. Sample preparation and scanning protocol for computersied analysis of root length and diameter. Plant and Soil. 218, 185-196 (2001).
  17. Kraft, J. M., Boge, W. Root characteristics of pea in relation to compaction and Fusarium root rot. Plant Disease. 85, 936-940 (2000).
  18. Rimi, F. Performance of warm season turfgrasses as affected by various management practices in a transition zone environment. , University of Padova. Italy. Doctorate thesis (2012).
  19. Burgess, P., Huang, B. Growth and physiological responses of creeping bentgrass (Agrostis stolonifera) to elevated carbon dioxide concentrations. Horticulture Research. 1, 14021(2014).
  20. Volterrani, M., et al. The Effect of Increasing Application Rates of Nine Plant Growth Regulators on the Turf and Stolon Characteristics of Pot-grown 'Patriot' Hybrid Bermudagrass. HortTechnology. 25 (3), 397-404 (2015).
  21. Böhm, W. Methods of studying root systems. Ecological studies: Analysis and synthesis. , Springer-Verlag. New York. 64-71 (1979).
  22. Box, J. E. Modern methods for root investigations. Plant Roots: The Hidden Half. , Marcel Dekker. New York. 193-237 (1996).
  23. Dowdy, R. H., Nater, E. A., Dolan, M. S. Quantification of the length and diameter of root segments with public domain software. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 26, 459-468 (1995).
  24. Pornaro, C., Macolino, S., Menegon, A., Richardson, M. WinRHIZO Technology for Measuring Morphological Traits of Bermudagrass Stolons. Agronomy Journal. 109 (6), 3007-3010 (2017).
  25. Patriot turf bermudagrass. United States Plant Patent. , US PP16,801 P2 (2006).
  26. Munshaw, G. C., Williams, D. W., Cornelius, P. L. Management strategies during the establishment year enhance production and fitness of seeded bermudagrass stolons. Crop Science. 41, 1558-1564 (2001).
  27. Rimi, F., Macolino, S., Richardson, M. D., Karcher, D. E., Leinauer, B. Influence of three nitrogen fertilization schedules on bermudagrass and seashore paspalum: I. Spring green-up and fall color retention. Crop Science. 53, 1161-1167 (2013).
  28. Murphy, S. L., Smucker, A. J. M. Evaluation of video image analysis and line-intercept methods for measuring root systems of alfalfa and ryegrass. Agronomy Journal. 87, 865-868 (1995).
  29. Wright, S. R., Jennette, M. W., Coble, H. D., Rufty, T. W. Root morphology of young Glycine max, Senna obtusifolia, and Amaranthus palmeri. Weed Science. 47, 706-711 (1999).
  30. Nilsson, H. E. Remote sensing and image analysis in plant pathology. Annual Review of Phytopathology. 15, 489-527 (1995).
  31. Ottman, M. J., Timm, H. Measurement of viable plant roots with the image analyzing computer. Agronomy Journal. 76, 1018-1020 (1984).
  32. Newman, E. I. A method of estimating the total length of roots in a sample. Journal of Applied Ecology. 3, 139-145 (1966).
  33. Tennant, D. A test of a modified line intersect method of estimating root length. Journal of Ecology. 63, 995-1001 (1975).
  34. Arsenault, J. L., Pouleur, S., Messier, C., Guay, R. WinRHIZO™, a root-measuring system with a unique overlap correction method. HortScience. 30, 906(1995).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pomiar roz og w i k czymorfologia traw dar owychpobieranie pr bekskanowanie WinRHIZOpomiar suchej masyanaliza klas rednicg sto d ugo ci roz og wg sto d ugo ci k czyoprogramowanie do przetwarzania obrazu

Powiązane artykuły