Artykuł metodologiczny

Utrzymywanie kultur biologicznych i pomiar ekspresji genów u Aphis nerii: niemodelowy system interakcji między roślinami a owadami

6.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58044

⸱

31 sierpnia 2018

 ,  , 
1Biological Sciences Department, Vanderbilt University

W tym artykule

Podsumowanie

Mszyca Aphis nerii kolonizuje dobrze chronione rośliny z rodziny psowatych (Apocyanaceae) i dostarcza licznych możliwości badania interakcji między roślinami a owadami. W tym miejscu przedstawiamy szereg protokołów dotyczących utrzymania kultur roślin i mszyc oraz generowania i analizy danych molekularnych i -omicznych dla A. nerii.

Streszczenie

Mszyce są doskonałymi modelami eksperymentalnymi dla różnych zagadnień biologicznych, począwszy od ewolucji symbioz i rozwoju polifenizmów, a skończywszy na pytaniach dotyczących interakcji owadów z ich roślinami żywicielskimi. Zasoby genomiczne są dostępne dla kilku gatunków mszyc, a dzięki postępom w sekwencjonowaniu nowej generacji badania transkryptomiczne są rozszerzane na organizmy niemodelowe, które nie mają genomów. Co więcej, kultury mszyc mogą być zbierane z pola i hodowane w laboratorium w celu wykorzystania w eksperymentach organizmowych i molekularnych, aby wypełnić lukę między badaniami ekologicznymi i genetycznymi. Wreszcie, wiele mszyc może być hodowanych w laboratorium na preferowanych roślinach żywicielskich w nieustannych, partenogennych cyklach życiowych, co pozwala na porównania genotypów rozmnażających się bezpłciowo. Aphis nerii, mszyca mleczno-oleandrowa, stanowi jeden z takich modeli do badania interakcji owadów z toksycznymi roślinami przy użyciu eksperymentów zarówno organizmowych, jak i molekularnych. Przedstawiono i omówiono tutaj metody wytwarzania i utrzymywania kultur roślin i mszyc w szklarni i laboratorium, ekstrakcje DNA i RNA, analizę mikrosatelitarną, składanie i adnotację transkryptomu de novo, analizę różnicową ekspresji transkryptomu oraz weryfikację qPCR genów o zróżnicowanej ekspresji.

Wprowadzenie

Mszyce to małe, półmetaboliczne owady, które kolonizują różne rodziny roślin na całym świecie. Wyróżniają się kilkoma cechami, w szczególności złożonymi cyklami życiowymi obejmującymi cykliczną partenogenezę i dyskretne polifenizmy oraz obowiązkowymi symbiozami żywieniowymi z endosymbiontami bakteryjnymi lub drożdżowymi, które dostarczają składników odżywczych, których brakuje w ich diecie soków roślinnych1. Podczas gdy większość mszyc jest specjalistami od roślin żywicielskich, niektóre gatunki ogólne są ważnymi szkodnikami upraw, powodując znaczne szkody ekonomiczne dla upraw, bezpośrednio lub za pośrednictwem patogenów i wirusów, które wektorują2. Publikacja pierwszego genomu mszyc w 2010 r., mszycy grochowej Acyrthosiphon pisum3, stanowiła ważny kamień milowy w badaniach nad biologią mszyc, ponieważ dostarczyła zasobów genomicznych do odpowiedzi na pytania dotyczące adaptacji owadów do roślinożernego stylu życia, w tym tych, które mogą prowadzić do lepszych strategii zwalczania4. Od tego czasu zgromadzono dodatkowe zasoby genomiczne wraz z publikacją opisanego genomu mszycy sojowej Aphis glycines5 oraz publicznie dostępnych zasobów całego genomu dla innego gatunku mszyc trójdzielnych (Myzus cerasi (mszyca czeremchowa), Myzus persicae (mszyca brzoskwiniowo-ziemniaczana), Rhopalosiphum padi (mszyca czeremchowo-owsiana)6. Cenne zasoby transkryptomiczne de novo są również dostępne dla wielu innych gatunków mszyc (np. Aphis gossypii (mszyca bawełniana)7, Sitobion avenae (mszyca zbożowa)8, Cinara pinitabulaeformis (mszyca sosnowa)9, Aphis nerii (mszyca mleczna)10).

Mszyce również wniosły trwały wkład w nasze zrozumienie interakcji między roślinami a owadami oraz ekologii życia na roślinach11. Jednym z obszarów, w którym mszyce wniosły szczególnie ważny wkład, jest nasze zrozumienie ekologii chemicznej interakcji między roślinami żywicielskimi. Owady roślinożerne wykazują różnorodne adaptacje do pokonywania mechanizmów obronnych roślin, a niektóre nawet dokooptowują obronę roślin dla własnej korzyści12,13,14. Na przykład mszyca mleczno-oleandrowa, Aphis nerii, jest jasnożółtą, inwazyjną mszycą występującą w regionach umiarkowanych i tropikalnych na całym świecie, która kolonizuje rośliny z rodziny trojeściowatych (Apocynaceae). Rośliny z rodziny Apocynaceae wyewoluowały różne chemiczne mechanizmy obronne, w tym mleczny lateks i glikozydy nasercowe znane jako kardenolidy, które wiążą nośnik kationów Na,K-ATPazę i są skutecznymi środkami odstraszającymi roślinożerców15,16. Specjaliści od trojeści wyrażają różne sposoby odporności na kardenolidy, a niektórzy selektywnie lub biernie gromadzą lub modyfikują kardenolidy w swoich tkankach jako środek odstraszający drapieżniki lub dla innych korzyści17. Uważa się, że A. nerii sekwestruje kardenolidy w ten sposób, chociaż mechanizmy i korzyści funkcjonalne pozostają niejasne10,18.

Biorąc pod uwagę dostępne zasoby genomiczne, A. nerii dostarcza doskonałego modelu eksperymentalnego do badania molekularnych i genetycznych mechanizmów związanych z interakcjami chemo-ekologicznymi między toksycznymi roślinami żywicielskimi a ich wyspecjalizowanymi roślinożercami. Warto zauważyć, że podczas gdy niektóre z najwcześniejszych badań nad A. nerii koncentrowały się na sekwestracji kardenolidów19, od tego czasu badania A. nerii dostarczyły wglądu w szeroki zestaw pytań ewolucyjnych i ekologicznych, w tym strukturę genetyczną owadów inwazyjnych20 oraz wzajemne oddziaływanie między oddolną i odgórną regulacją gęstości roślinożerców21. A. nerii jest zatem dobrym kandydatem jako model eksperymentalny dla szczególnie szerokiego zestawu badań nad interakcjami między owadami a roślinami. Kluczowe znaczenie dla powodzenia każdego badania z udziałem A. nerii ma staranna hodowla populacji mszyc, która obejmuje hodowlę roślin, od których zależą mszyce, a także wydajne generowanie wysokiej jakości danych -omicznych. Naszym celem jest przeprowadzenie czytelnika przez jedno i drugie. Poniżej przedstawiono metody wytwarzania i utrzymywania kultur roślin i mszyc w szklarni i laboratorium, ekstrakcji DNA i RNA, analizy mikrosatelitarnej, składania i adnotacji transkryptomu de novo, analizy różnicowej ekspresji transkryptomu oraz weryfikacji qPCR genów o zróżnicowanej ekspresji. Chociaż metody te są napisane dla A. nerii, ogólne metody hodowli, ekstrakcji i analizy mogą obejmować różne gatunki mszyc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Kultury roślinne

  1. Kupuj nasiona od dowolnego komercyjnego sprzedawcy lub zbieraj z dojrzałych roślin na polu.
    UWAGA: Protokół ten jest odpowiedni dla większości dostępnych na rynku gatunków trojeści mlecznej (np. Asclepias incarnata, A. syriaca, A. curassavica, Gomphocarpus physocarpus). Niektóre nasiona mogą wymagać stratyfikacji na zimno i należy sprawdzić instrukcje dostawcy nasion.
  2. Posadź nasiona w drobno kiełkującej glebie (60–70% drobnego mchu torfowego, perlitu, wermikulitu, wapień).
    1. Napełnij standardową tacę na sadzonki mieszanką do kiełkowania, upewniając się, że gleba sięga do górnej części studzienek. W każdej studzience wykonaj wgłębienie, aby utworzyć otwór w glebie o głębokości około 3 cm.
    2. Umieść jedno ziarno w każdym dołku i bardzo dobrze podlej konewką, tak aby gleba przykryła nasiona i była nasycona.
    3. Uprawiaj nasiona w szklarni (patrz warunki poniżej, 1.5). Podlewaj regularnie, codziennie lub co drugi dzień; wystarczająco, aby utrzymać wilgotność gleby na umiarkowanym poziomie.
  3. Kiedy sadzonki wyrosną z pierwszego zestawu pełnych liści, przesadź sadzonki do ogólnej mieszanki doniczkowej (50–60% mchu torfowego, kory i wapienia) (Rysunek 1A).
    1. Używaj 4-calowych okrągłych doniczek, które pasują szczelnie do klatek na kubki. Wypełnij ogólną ziemią doniczkową do około 5 cm poniżej krawędzi.
    2. Zrób dziurę w ziemi wystarczająco głęboką, aby dotrzeć do dna doniczki.
    3. Ręką delikatnie zgarnij dojrzałą sadzonkę ze studni i umieść ją głęboko w otworze w 4-calowej doniczce. Przykryj sadzonkę ziemią. Podlewaj bardzo dobrze.
    4. Uprawiaj rośliny w szklarni i podlewaj regularnie, codziennie lub co drugi dzień; wystarczająco, aby utrzymać umiarkowaną wilgotność gleby.
  4. Warunki szklarniowe.
    1. Ustaw termostaty szklarniowe tak, aby utrzymywały temperaturę w ciągu dnia w zakresie 18–28 °C i temperaturę w nocy w zakresie 16–22 °C, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. W miesiącach zimowych, kiedy dni są krótsze, uzupełnij światło dzienne wysokoprężnymi żarówkami sodowymi o mocy 600 W (12 godzin, 8 – 20
      3. ).
  5. Kontroluj niechciane szkodniki (np. wciornastki, mszyce) za pomocą dolistnego roztworu mydła organicznego, jednak używaj tych produktów ostrożnie.
    1. Przygotuj roztwór mydła zgodnie z zaleceniami producenta i nałóż za pomocą butelki z rozpylaczem.
    2. Pozostaw mydło na roślinach na 4–24 godziny. Delikatnie spłucz rośliny wodą, aby usunąć mydło 4–24 godziny po aplikacji i spłucz je wodą po raz drugi przed użyciem w laboratoryjnych kulturach mszyc.
  6. Hodowla przeciętnej populacji mszyc na roślinach, które wyrosły z co najmniej 3-4 zestawów pełnych liści i mają co najmniej 10 cm wysokości (Rysunek 1B).

2. Kultury mszyc

  1. Rozpocznij laboratoryjne populacje mszyc od istniejącej laboratoryjnej populacji izoklonalnej lub zacznij od mszyc zebranych w terenie, postępując zgodnie z poniższymi wskazówkami.
    1. Rozpoczynając populację laboratoryjną z istniejącej laboratoryjnej populacji izoklonalnej, należy przenieść mszyce zgodnie z opisem w 2.3.1–2.3.3.
  2. Rozpoczynając nowe izoklonalne, zebrane w terenie populacje mszyc i umieść jedną, rozmnażającą się, dorosłą mszycę na odpowiedniej roślinie żywicielskiej, jak wspomniano w kroku 1.6.
    UWAGA: Populacje mogą być zapoczątkowane od skrzydlatych (alate) lub nieskrzydlatych (apterous) dorosłych.
    1. Ręcznie sprawdź rośliny ze szklarni pod kątem niechcianych szkodników przed użyciem z mszycami laboratoryjnymi. Zamroź wszystkie rośliny z niechcianymi mszycami. W razie potrzeby użyj termosu na etanol, aby usunąć wciornastki lub inne szkodniki.
      UWAGA: Pamiętaj, aby przed użyciem spłukać rośliny, które zostały potraktowane mydłem, zgodnie z opisem w kroku 1.5.2.
    2. Bezpiecznie przenieś pojedynczą dorosłą mszycę za pomocą pędzla lub pipety doustnej utworzonej z plastikowej rurki o średnicy wewnętrznej 3/16" ID x 1/4" OD, końcówki do pipety 1,000 μl i końcówki do pipety 2,00 μL (Rysunek 2A).
    3. Bezpiecznie przykryj rośliny z mszycami klatką na kubki utworzoną z plastikowego kubka z odciętą górą, pokrytą drobną siatką i zabezpieczoną taśmą (Rysunek 2B).
    4. Umieść rośliny zaatakowane przez mszyce na tacy i przechowuj w kontrolowanej komorze środowiskowej (16L: 8D, 22 °C, 70% wilgotności).
  3. Aby utrzymać populacje stada, mszyce należy co tydzień przenosić na świeże, nowe rośliny (2.2.1–2.2.3).
    1. Bezpiecznie przenieś 1–3 nimfy w drugim lub trzecim stadium rozwojowym i 1 mszycę w wieku dorosłym za pomocą pipety doustnej (ryc. 2A, 3).
      UWAGA: Stado najlepiej utrzymywać poprzez przenoszenie osobników nieuskrzydlonych.
    2. Rośliny zaatakowane przez mszyce należy bezpiecznie przykryć klatką na miseczki utworzoną z plastikowego kubka z odciętą górną częścią, przykrytą drobną siatką i zabezpieczoną taśmą.
    3. Umieść rośliny na tacy i trzymaj mszyce w komorze środowiskowej (16L: 8D, 22 °C, 70% wilgotności).
    4. Alternatywnie, w razie potrzeby i jeśli roślina żywicielska jest przyzwoitej jakości, należy użyć kolby próżniowej na etanol, aby zmniejszyć populacje, pozostawiając tylko jedną rozmnażającą się postać dorosłą i dwie do trzech nimf w drugim lub trzecim stadium rozwojowym.
  4. Aby stworzyć populacje w tym samym wieku do wykorzystania w eksperymentach, umieść do 5 dorosłych osobników (najlepiej nieuskrzydlonych) z populacji stada na nowej roślinie żywicielskiej.
    1. Usuń dorosłe osoby 24 godziny później.
    2. Około 5-7 dni później, gdy potomstwo F1 dojrzeje do dorosłości, umieść do 5 nieskrzydlatych dorosłych F1 na nowej roślinie żywicielskiej. Usuń dorosłe osoby 24 godziny później.
    3. Gdy populacja F2 dojrzeje do dorosłości, jest gotowa do wykorzystania w eksperymentach.
      UWAGA: Proces ten zapewnia, że populacja eksperymentalna jest mniej więcej w tym samym wieku i rodzi się z mniej więcej w tym samym wieku matki.
  5. Potwierdzić różnice genotypowe między liniami izoklonalnymi złowionymi w terenie za pomocą genotypowania mikrosatelitarnego (opisanego poniżej, sekcje 3 i 4).

3. Ekstrakcja DNA

  1. preparat
    1. Zastosować sterylne techniki do przygotowania 1 l buforu do lizy (0,1 M NaCl, 0,2 M sacharozy, 0,1 M Tris (pH 9,1), 0,05 M EDTA, 0,05% SDS).
    2. Podgrzać blok grzewczy lub łaźnię wodną do temperatury 65 °C.
  2. Homogenizacja i liza tkanek
    1. Umieść mszycę w pobliżu dna sterylnej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
    2. Umieść sterylny tłuczek w probówce z mszycą i zanurz dno probówki w ciekłym azocie.
      UWAGA: Optymalny rozpad tkanek osiąga się, gdy mszyca jest umieszczona między tłuczkiem a bokiem tuby.
    3. Zmiel mszycę tłuczkiem, aby początkowo zlizać komórki.
    4. W przypadku pojedynczej dorosłej mszycy należy użyć 200 μl (podzielonych na 2 x 100 μl porcji) buforu do lizy. Dodać pierwszą porcję, aby zmielić i ponownie zawiesić rozdrobnioną mszycę, aż próbka zostanie widocznie rozdrobniona, a następnie użyć drugiej podwielokrotności do zmycia tłuczka.
    5. Inkubować rozdrobnione mszyce w buforze do lizy w temperaturze 65 °C w łaźni wodnej lub bloku grzewczym przez 30 minut.
  3. Wytrącanie DNA
    1. Gdy probówka jest ciepła, dodaj 14 μl 8 M KOAc. Odwrócić probówkę, aby mix.Store próbkę na lodzie przez 30 min.
      Uwaga: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do 24 godzin.
    2. Wirować przy 13 000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść supernatant do nowej probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety. Uważaj, aby nie usunąć żadnych granulowanych zanieczyszczeń.
    3. Aby poprawić wizualizację osadów DNA, dodaj 2 μl glikogenu (20 μg/ml) do supernatantu. Jeśli wielkość próby jest wystarczająco duża, pomiń ten krok.
    4. Do supernatantu dodać 200 μl zimnego 100% etanolu molekularnego. Odwróć probówki do wymieszania i inkubacji w temperaturze pokojowej przez co najmniej 15 minut.
      UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do 24 godzin.
    5. Wirować przy 13 000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Usunąć etanol przez pipetowanie.
  4. Mycie i elucja DNA
    1. Dodaj 200 μl zimnego 70% etanolu molekularnego. Następnie przesuń rurkę, aby ponownie zawiesić i umyć granulkę.
    2. Wirować przy 13 000 x g przez 5 min. Wizualizując osad, ostrożnie usuń etanol za pomocą pipetowania i dodaj 200 μl zimnego 100% etanolu molekularnego.
    3. Wirować przy 13 000 x g przez 5 min. Podczas wizualizacji granulatu ostrożnie usuń etanol za pomocą pipetowania.
      UWAGA: W razie potrzeby powtórz mycie etanolem 100-70-100.
    4. Suszyć granulki na powietrzu przez 5–10 minut, a probówka leży poziomo otwarta na bibułce.
    5. Ponownie zawiesić osad DNA w 80 μl niskiego TE (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA).
    6. Określić ilościowo zawieszony DNA za pomocą spektrofotometru.
    7. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

4. Mikrosatelitarny PCR i sekwencjonowanie genotypowania mszyc

  1. Zamów odpowiednie startery F i R do sekwencjonowania mikrosatelitarnego (Tabela 120).
    UWAGA: Odwrotne sekwencje starterów powinny być modyfikowane za pomocą etykiet fluorescencyjnych 5'-6-FAM lub 5'-5-HEX, aby umożliwić multipleksowanie próbek do sekwencjonowania mikrosatelitarnego.
  2. Przeprowadzić PCR z pojedynczymi próbkami DNA mszyc (opisanymi w sekcji 3) i znakowanymi fluorescencyjnie starterami mikrosatelitarnymi.
    1. Mieszać reakcje PCR zgodnie z protokołem producenta (0,2 μM każdy starter F/R, 2,5 mM MgCl2, 50–200 ng matrycy DNA).
    2. Użyj następujących ustawień termocyklera: początkowa denaturacja w temperaturze 94 °C przez 4 minuty, 35 cykli w temperaturze 94 °C przez 30 s, 58 °C przez 35 s, 72 °C przez 45 s i końcowy etap wydłużania w temperaturze 72 °C przez 10 minut.
  3. Połącz próbki PCR z różnymi znacznikami fluorescencyjnymi, aby zmniejszyć liczbę sekwencjonowanych próbek i sekwencjonować próbki mikrosatelitarne w zakładzie genotypowania.
  4. Przeanalizuj surowe pliki próbek .fsa za pomocą oprogramowania do analizy mikrosatelitarnej.

5. Ekstrakcja RNA

  1. Próbki mszyc należy pobrać do ekstrakcji RNA w probówkach wolnych od RNaz / DNaz o pojemności 1,5 ml i natychmiast zamrozić w ciekłym azocie.
    UWAGA: Jeśli poniższe kroki nie zostaną wykonane natychmiast, próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Homogenizacja tkanek
    1. Z sterylnym tłuczkiem w probówce z mszycą zamrażać w ciekłym azocie przez 10–15 sekund, aż próbka przestanie skwierczeć. Dobrze zmiażdż mszycę tłuczkiem, jak opisano w kroku 3.2.
      UWAGA: Optymalny rozpad tkanek osiąga się, gdy mszyca jest umieszczona między tłuczkiem a bokiem tuby.
    2. Do dygestorium dodać 800 μl odczynnika do ekstrakcji tiocyjanianianu i chloroformu guanidyny do próbki (1–5 dorosłych mszyc). Homogenizować próbki za pomocą tłuczka i wyrzucać tłuczek.
  3. Separacja faz
    UWAGA: Wszystkie czynności należy wykonywać w dygestorium.
    1. Inkubować homogenizowane próbki przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 160 μl chloroformu do próbki. Wstrząsaj energicznie ręką przez 15 s.
    2. Inkubować przez 2-3 minuty w temperaturze pokojowej. Wirować przez 15 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Po odwirowaniu mieszanina rozdziela się na 3 warstwy: dolną, czerwoną fazę fenolowo-chloroformową, interfazę i bezbarwną górną fazę wodną. RNA pozostaje wyłącznie w fazie wodnej. Objętość roztworu wodnego wyniesie ~480 μL.
  4. Wytrącanie RNA
    1. W dygestorium przenieś fazę wodną do świeżej, wolnej od RNaz probówki. Nie zakłócaj fazy pośredniej.
    2. Wytrącić RNA przez dodanie 400 μl izopropanolu i inkubować próbkę w temperaturze -20 °C przez 10 min.
      UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C do 24 godzin.
    3. Odwirować próbkę przez 10 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C.
  5. Mycie i elucja RNA
    1. Usunąć supernatant i uważać na osad RNA.
    2. Przemyj osad RNA 1 ml 75% etanolu w wodzie uzdatnionej przez DEPC. Mieszaj przez powolne wirowanie. Wirować przez 5 minut w temperaturze 7 500 x g w temperaturze 4 °C.
    3. Powtórz kroki 5.5.1–5.5.2, aby usunąć zanieczyszczenia fenolowe.
    4. Usunąć supernatant i suszyć osad na powietrzu przez 5-10 minut z probówką leżącą poziomo otwartą na sterylnej ławce. Nie pozwól, aby osad RNA całkowicie wyschł.
    5. Rozpuść osad RNA w 30 μl wody wolnej od RNaz lub uzdatnionej DEPC. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby wymieszać. Inkubować w temperaturze 55–60 °C przez 10–15 minut.

6. RNAseq de novo Zestaw transkryptomu, adnotacja i analiza wyrażeń różnicowych

  1. Analizuj stężenie i jakość próbki RNA za pomocą kapilarnego systemu elektroforetycznego opartego na chipie.
    UWAGA: System elektroforezy kapilarnej oparty na chipie jest preferowaną metodą z wyboru niż analiza za pomocą spektrofotometru, ponieważ zapewnia dokładniejszy i bardziej czuły pomiar stężenia i jakości RNA.
    1. Jeśli próbki są odpowiedniej jakości (≥ 250 ng ogółem, RIN (RNA Integrity Number) ≥ 5), należy przeprowadzić sekwencjonowanie RNA.
      UWAGA: Co ważne, ponieważ te dane sekwencjonowania będą wykorzystywane zarówno do profilowania ekspresji, jak i składania transkryptomu de novo, większa głębokość odczytu spowoduje wyższą jakość transkryptomu. W przypadku dość kompleksowego montażu przy użyciu technologii sekwencjonowania Illumina, zalecanym punktem wyjścia byłoby 100–200 milionów 100 pz, sparowane odczyty końcowe. Całkowite przygotowanie biblioteki mRNA i sekwencjonowanie RNA przeprowadzono za pomocą urządzenia do sekwencjonowania.
  2. Sprawdź jakość odczytów za pomocą Fast QC22.
  3. Połącz wszystkie odczyty próbek i złóż transkryptom de novo za pomocą Trinity23,24 (włączone filtrowanie jakości trymmatycznej).
  4. Udoskonalanie zespołu
    1. Użyj Transdecoder25, aby zidentyfikować otwarte ramki odczytu (ORF), które mają długość co najmniej 100 aminokwasów.
    2. Przeprowadź wyszukiwanie homologii dla przetłumaczonych ORF-ów w bazach danych Pfam26 i UniProt27 za pomocą odpowiednio BLASTP28 i HMMER29.
    3. Usuń transkrypty bakteryjne (dowolną translację sekwencji, której najlepsze trafienie BLAST dotyczyło genu bakteryjnego z wynikiem bitowym powyżej 300 i minimalną identycznością sekwencji aminokwasów wynoszącą 50%).
    4. Zwiń wszystkie kompletne, przetłumaczone ORF-y, które są co najmniej w 99% identyczne na poziomie aminokwasów, używając CD-HIT30.
    5. Zwiń pozostałe, niekompletne ORF, które są co najmniej w 95% identyczne na poziomie nukleotydów, używając CD-HIT30.
    6. Pozostałym sekwencjom nukleotydowym przypisz unikalne, specyficzne dla gatunku identyfikatory (np. APHNE 0001).
  5. Oceń kompletność udoskonalonego złożenia, korzystając z BUSCO (http://busco.ezlab.org/) i zestawu danych genów Arthropoda31.
  6. Adnotacja transkryptomu
    1. Najpierw dodaj adnotacje do udoskonalonego transkryptomu za pomocą HMMER w bazie danych PfaM26,29.
    2. Po drugie, dodaj adnotacje do transkryptomu za pomocą BLASTP w bazie danych UniProt 27,28.
    3. Po trzecie, należy dokonać adnotacji transkryptomu za pomocą BLASTP w stosunku do sekwencji kodujących wybranych owadów z opublikowanymi, opisanymi genomami.
    4. Na koniec opisz transkryptom za pomocą BLASTP tylko w bazie danych białka mszycy grochowej.
    5. Użyj Trinotate, aby wygenerować adnotacje GO z akcesji UniProt .
    6. Użyj funkcji Trinotate, aby uporządkować wszystkie wyniki adnotacji w bazie danych SQLite i wygenerować raport adnotacji.
  7. Analiza różnicowa wyrażeń
    UWAGA: Korzystając z udoskonalonego transkryptomu jako odniesienia, wyrównaj i określ ilościowo każdą bibliotekę osobno.
    1. Użyj Trimmomatic, aby filtrować jakość i przycinać oryginalne odczytane pliki32.
      Uwaga: Jeśli wykonujesz ten krok po montażu Trinity, możesz zamiast tego użyć wyjścia Trimmomatic z tego kroku.
    2. Wykonaj lokalne wyrównania dla każdej próbki za pomocą Bowtie233.
    3. Wyodrębnij liczbę odczytów z każdej próbki indywidualnie za pomocą SAMtools34.
    4. Oblicz wyrażenie różnicowe między próbkami będącymi przedmiotem zainteresowania za pomocą DESeq2 z parametrami domyślnymi i parametrycznym dopasowaniem35.

7. qPCR Weryfikacja genów o zróżnicowanej ekspresji

UWAGA: Jeśli użytkownicy są zainteresowani genami o zróżnicowanej ekspresji z ich eksperymentów RNAseq, można użyć następującego protokołu do weryfikacji wzorców ekspresji różnicowej.

  1. Wygeneruj próbki RNA zgodnie z powyższym opisem (krok 5).
  2. Ilościowo określić ekstrakcje RNA za pomocą spektrofotometru, aby sprawdzić jakość i uzyskać stężenie.
  3. Zsyntetyzuj próbki cDNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu zgodnie z zaleceniami producenta.
  4. Określ wydajność startera dla genów będących przedmiotem zainteresowania, aby zapewnić dokładną dwukrotną amplifikację PCR.
    1. Na podstawie oryginalnych stężeń RNA wykonaj seryjne rozcieńczenia (10:1), aby uzyskać 3 stężenia cDNA.
    2. Stosując ilościową mieszaninę wzorcową PCR, wymieszaj potrójne reakcje qPCR zgodnie z protokołem producenta, stosując trzy stężenia starterów (np. 100 nM, 200 nM, 300 nM) z trzema seryjnie rozcieńczonymi stężeniami cDNA (np. 0,1 ng/μL, 10 ng/μL, 100 ng/μL).
    3. Dla każdego genu docelowego obliczyć nachylenie (m) utworzonej linii, używając średnich wartości Ct dla każdej próbki jako zmiennych zależnych i logarytmu (stężenie cDNA) jako zmiennych niezależnych (łącznie trzy punkty).
    4. Użyj poniższego równania, aby obliczyć wydajność podkładu (E), gdzie m jest nachyleniem obliczonym w 7.4.3:
      E = 10^(-1/m)
      UWAGA: Wydajność podkładu w zakresie 90-110% jest odpowiednia do analiz. Proces ten zapewnia równą amplifikację wszystkich genów uwzględnionych w obliczeniach.
  5. Użyj metody ΔΔCt z genem porządkowania, aby określić ilościowo ekspresję różnicową dla genów będących przedmiotem zainteresowania36.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Hodowle roślin: Nasiona będą potrzebować około dwóch do czterech tygodni, w zależności od pory roku, aby urosnąć na tyle dużych, by można było je przesadzić (Rysunek 1A). Przesadzone siewki będą potrzebować kolejnych dwóch do czterech tygodni, aby osiągnąć optymalny rozmiar dla hodowli mszyc (Rysunek 1B).

Hodowl...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Od dawna wiadomo, że aposematyka A. nerii może dostarczyć wglądu we wzorce i mechanizmy odporności na obronę roślin, a w szczególności sekwestrację chemiczną18,37. W ostatnim czasie pojawiło się wiele zasobów genomicznych dla A. nerii10, oferując nowe możliwości w zakresie ekologicznych i funkcjonalnych badań genomicznych, które wykorzystują A. nerii jako model. Przedstawiamy podstawowe protokoły w hodowli mszyc ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Michelle Moon (Vanderbilt University) za pomoc w fotografii. Vanderbilt University zapewnił wsparcie dla PA, a SSLB jest wspierany przez DGE-1445197.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sun Gro Fafard Mieszanka do kiełkowaniaHummert International10-0952-2
Sun Gro Fafard 3B/ Metro MixHummert International10-0951-2
2 "x 4" Okrągły standardowy garnekAnderson Pots1503
DreamTaq Polimeraza DNAThermoFisherScientific EP0701
TrizolThermoFisher Scientific
Indeks nadrzędny® III Zestaw do syntezy pierwszej niciThermoFisher Scientific 18080051
Power SYBR Green PCR Master MixThermoFisher Scientific4367659
15596026

Bibliografia

  1. Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum.: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. BioEssays. 28, 747-755 (2006).
  2. Dixon, A. F. G. Aphid Ecology: An Optimization Approach. , Springer. Netherlands. (1985).
  3. Consortium, T. I. A. G. Genome Sequence of the Pea Aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biology. , 1000313(2010).
  4. Srinivasan, D. G., Brisson, J. A. Aphids: A Model for Polyphenism and Epigenetics. Genetics Research International. 2012, 1-12 (2012).
  5. Wenger, J. A., et al. Whole genome sequence of the soybean aphid, Aphis glycines. Insect Biochememistry and Molecular Biology. , 1-10 (2017).
  6. Aphidbase. Genouest.org. , Available from: bipaa.genouest.org/is/aphidbase/ (2018).
  7. Li, Z. -Q., et al. Ecological adaption analysis of the cotton aphid (Aphis gossypii) in different phenotypes by transcriptome comparison. PLoS ONE. 8, 83180(2013).
  8. Wang, D., Liu, Q., Jones, H. D., Bruce, T., Xia, L. Comparative transcriptomic analyses revealed divergences of two agriculturally important aphid species. BMC Genomics. 15 (1), 1023-1024 (2014).
  9. Wu, S., et al. De novo characterization of the pine aphid Cinara pinitabulaeformis Zhang et Zhang transcriptome and analysis of genes relevant to pesticides. PLoS ONE. 12, 0178496-0178517 (2017).
  10. Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Gerardo, N. M., Abbot, P. Transcriptional profile and differential fitness in a specialist milkweed insect across host plants varying in toxicity. Molecular Ecology. , (2017).
  11. Dixon, A. F. G. Insect Herbivore-Host Dynamics. , Cambridge University Press. Cambridge. (2005).
  12. Goggin, F. L. Plant-aphid interactions: molecular and ecological perspectives. Current Opinion in Plant Biology. 10, 399-408 (2007).
  13. Will, T., Furch, A., Zimmermann, M. R. How phloem-feeding insects face the challenge of phloem-located defenses. Frontiers in Plant Science. 4, 1-12 (2013).
  14. Webster, B. The role of olfaction in aphid host location. Physiological Entomology. 37, 10-18 (2012).
  15. Agrawal, A. A., Petschenka, G., Bingham, R. A., Weber, M. G., Rasmann, S. Toxic cardenolides: chemical ecology and coevolution of specialized plant-herbivore interactions. New Phytologist. 194, 28-45 (2012).
  16. Dobler, S., Petschenka, G., Pankoke, H. Coping with toxic plant compounds- the insect's perspective on iridoid glycosides and cardenolides. Phytochemistry. 72, 1593-1604 (2011).
  17. Opitz, S. E. W., Müller, C. Plant chemistry and insect sequestration. Chemoecology. 19, 117-154 (2009).
  18. Birnbaum, S. S. L., Abbot, P. Insect adaptations toward plant toxins in milkweed-herbivores systems - a review. Entomologia Experimentalis et Applicata. 58, 579-610 (2018).
  19. Rothschild, M., von Euw, J., Reichstein, T. Cardiac glycosides in the oleander aphid, Aphis nerii. Journal of Insect Physiology. 16, 1141-1145 (1970).
  20. Harrison, J. S., Mondor, E. B. Evidence for an invasive aphid 'superclone': extremely low genetic diversity in oleander aphid (Aphis nerii) populations in the southern United States. PLoS ONE. 6, 17524(2011).
  21. Mooney, K. A., Halitschke, R., Kessler, A., Agrawal, A. A. Evolutionary trade-offs in plants mediate the strength of trophic cascades. Science. 327, 1642-1644 (2010).
  22. Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Bioinformatics. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2010).
  23. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).
  24. Haas, B. J., et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature Protocols. 8, 1494-1512 (2013).
  25. Transdecoder. , Available from: http://transdecoder.sf.net (2018).
  26. Finn, R. D., et al. The Pfam protein families database: towards a more sustainable future. Nucleic Acids Research. 44, Database Issue 279-285 (2016).
  27. The UniProt Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 45, 158-169 (2017).
  28. Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 1 (36), 5-9 (2008).
  29. Hmmer.org. , Available from: http://hmmer.org (2018).
  30. Fu, L., Niu, B., Zhu, Z., Wu, S., Li, W. CD-HIT: accelerated for clustering the next generation sequencing data. Bioinformatics. 28 (23), 3150-3152 (2012).
  31. Simão, F. A., Waterhouse, R. M., Ioannidis, P., Kriventseva, E. V., Zdobnov, E. M. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs. Bioinformatics. 31, 3210-3212 (2015).
  32. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
  33. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, 357-359 (2012).
  34. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  35. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 31(2014).
  36. Rieu, I., Powers, S. J. Real-time quantitative RT-PCR: design, calculations, and statistics. Plant Cell. 21, 1031-1033 (2009).
  37. Malcolm, S. B. Chemical defence in chewing and sucking insect herbivores: plant-derived cardenolides in the monarch butterfly and oleander aphid. Chemoecology. 1, 12-21 (1990).
  38. Agrawal, A. A., Underwood, N., Stinchcombe, J. R. Intraspecific variation in the strength of density dependence in aphid populations. Ecological Entomology. 29, 521-526 (2004).
  39. Zehnder, C. B., Hunter, M. D. A comparison of maternal effects and current environment on vital rates of Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid. Ecological Entomology. 32, 172-180 (2007).
  40. Hartbauer, M. Collective defense of Aphis nerii and Uroleucon hypochoeridis (Homoptera, Aphididae) against natural enemies. PLoS ONE. 5, 10417(2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hodowla mszycekstrakcja DNAekstrakcja RNAanaliza de novo sk adania transkryptomuanaliza r nicowej ekspresji transkryptomuweryfikacja qPCRanaliza mikrosatelitarnahodowla szklarniowakomora z kontrolowanymi warunkami rodowiskowymi

Powiązane artykuły