Artykuł metodologiczny

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

13.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58051

⸱

25 września 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Circulating Tumor Biomarkers Laboratory, SiRIC, Translational Research Department, Institut Curie, PSL Research University, 2CNRS UMR144, Institut Curie, PSL Research University, 3Department of Medical Oncology, Institut Curie, PSL Research University, 4University Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines, 5University Paris Descartes, 6Inserm U830, Institut Curie, PSL Research University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego ilościowego oznaczania wielu zmian genetycznych regionu docelowego w jednej reakcji za pomocą drop-off ddPCR i unikalnej pary sond hydrolizy.

Streszczenie

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej (ddPCR) to bardzo czuła metoda ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oparta na frakcjonowaniu próbki na tysiące nanowymiarowych indywidualnych reakcji typu woda w oleju. Ostatnio ddPCR stał się jednym z najdokładniejszych i najbardziej czułych narzędzi do wykrywania krążącego DNA nowotworu (ctDNA). Jednym z głównych ograniczeń standardowej techniki ddPCR jest ograniczona liczba mutacji, które można przebadać na reakcję, ponieważ wymagane są specyficzne sondy hydrolizy rozpoznające każdą możliwą wersję alleli. Alternatywna metodologia, ddPCR typu drop-off, zwiększa przepustowość, ponieważ wymaga tylko jednej pary sond do wykrycia i ilościowego określenia potencjalnie wszystkich zmian genetycznych w regionie docelowym. Drop-off ddPCR wykazuje porównywalną czułość do konwencjonalnych testów ddPCR, z tą zaletą, że wykrywa większą liczbę mutacji w jednej reakcji. Jest opłacalny, pozwala zachować cenny materiał próbki, a także może być używany jako narzędzie do odkrywania, gdy mutacje nie są znane a priori.

Wprowadzenie

Zgłoszono tysiące mutacji somatycznych związanych z rozwojem raka1. Wśród nich kilka to predykcyjne markery skuteczności terapii celowanej 2,3, a genetyczne badania przesiewowe tych mutacji są obecnie rutynową praktyką kliniczną. Technologia kropelkowego cyfrowego PCR (ddPCR) może być używana do monitorowania obecności lub braku mutacji z wysoką dokładnością wykrywania i jest wysoce kompatybilna z nieinwazyjnymi płynnymi biopsjami4,5. Jednak obecne testy ddPCR są przede wszystkim przeznaczone do wykrywania mutacji znanych a priori. To poważnie ogranicza stosowanie ddPCR jako narzędzia do odkrywania, gdy mutacja jest nieznana. Rzeczywiście, w konwencjonalnym projekcie ddPCR, sonda hydrolizy rozpoznająca allel typu dzikiego (sonda WT) konkuruje ze specyficzną sondą rozpoznającą zmutowany allel (sonda MUT) (Figura 1A). Sonda o wyższym powinowactwie hybrydyzuje z matrycą i uwalnia swój fluorofor, wskazując na charakter odpowiedniego allelu. Dane fluorescencyjne uzyskane dla każdej kropli można zwizualizować na wykresie punktowym reprezentującym fluorescencję emitowaną przez sondy WT i MUT w różnych wymiarach. Schematyczne przedstawienie typowego wyniku konwencjonalnego testu ddPCR przedstawiono w Rysunek 1A. W tym przykładzie niebieska chmura odpowiada kropelkom zawierającym allele WT zidentyfikowane przez sondę WT, podczas gdy czerwona chmura odpowiada kropelkom, w których allel MUT został amplifikowany i zidentyfikowany przez sondę MUT. W zależności od ilości DNA załadowanego w reakcji mogą pojawić się podwójnie dodatnie kropelki zawierające zarówno amplikony WT, jak i MUT (zielona chmura). Jasnoszara chmura odpowiada pustym kropelkom.

Ponieważ większość platform pozwala na wykrycie ograniczonej liczby fluoroforów (zwykle 2, ale do 5), przepustowość konwencjonalnego ddPCR jest ograniczona. W związku z tym celowanie w regiony z wieloma sąsiadującymi mutacjami wymaga zaprojektowania technicznie trudnych testów multipleksowych ddPCR lub zastosowania wielu reakcji ukierunkowanych równolegle na każdą mutację. Strategia drop-off ddPCR pokonuje to ograniczenie, ponieważ może potencjalnie wykryć wszelkie zmiany genetyczne w regionie docelowym za pomocą unikalnej pary sond hydrolizy WT. Pierwsza sonda (Sonda 1) obejmuje sekwencję niezmienną, przylegającą do obszaru docelowego, a druga sonda (Sonda 2) jest komplementarna do sekwencji WT regionu docelowego, w którym spodziewane są mutacje (Rysunek 1B). Podczas gdy pierwsza sonda określa ilościowo całkowitą ilość amplifikowalnych cząsteczek w reakcji, druga sonda rozróżnia allele WT i MUT przez nieoptymalną hybrydyzację do zmutowanych sekwencji. Sonda 2 może zidentyfikować wiele typów mutacji w regionie docelowym (substytucje pojedynczych lub wielokrotnych nukleotydów, delecja itp.)6. Podobnie jak w przypadku konwencjonalnego ddPCR, jasnoszara chmura odpowiada kropelkom niezawierającym cząsteczek DNA. Należy przypomnieć, że w tego typu testach optymalna separacja chmur WT i MUT zależy od ilości DNA załadowanego w reakcji, ponieważ kropelek zawierających zarówno allele docelowe WT, jak i MUT nie można odróżnić od kropel zawierających tylko formę WT. Dlatego ten test wymaga, aby większość kropel zawierała nie więcej niż jedną kopię docelowego genu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Przedstawiony tutaj protokół jest zgodny z wytycznymi etycznymi Instytutu Curie. Wszystkie próbki od ludzi pobrano od pacjentów włączonych, po uzyskaniu świadomej zgody, do badań zatwierdzonych przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Instytutu Curie.

1. Pobieranie krwi, przechowywanie osocza i ekstrakcja DNA bez komórek

UWAGA: DNA wyekstrahowane z dowolnego rodzaju "tkanki" może być użyte (np. świeże lub zatopione w formaldehydzie tkanki parafinowe (FFPE), komórki w hodowli lub próbki krwi). Tutaj podajemy szczegółowe instrukcje dotyczące pobierania krwi, izolacji i przechowywania osocza oraz ekstrakcji bezkomórkowego DNA (cfDNA).

  1. Pobieranie krwi i przechowywanie osocza (Rysunek 2B)
    1. Próbki krwi należy pobrać do probówek EDTA o pojemności 7 ml. Do pobrania około 4 ml osocza zaleca się użycie dwóch probówek.
    2. Wirować probówki przez 10 minut przy stężeniu 820 x g w ciągu 3 godzin od pobrania krwi w celu oddzielenia czerwonych krwinek (RBC), białych krwinek (WBC) i osocza. Czas między pobraniem próbki a odwirowaniem ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości cfDNA (tj. cfDNA niezanieczyszczonego DNA uwolnionym z WBC).
    3. Ostrożnie odpipetować supernatant (osocze) za pomocą pipety o pojemności 1 ml, nie dotykając warstwy WBC; zwykle odzyskuje się około 2 ml osocza na probówkę EDTA.
    4. Przenieść osocze do probówek o pojemności 2 ml i odwirować podwielokrotności przy 16 000 x g przez 10 minut w temperaturze 15 °C w celu usunięcia resztek komórek.
    5. Ostrożnie odpipetować supernatant (osocze), nie naruszając osadu. Rozprowadzić osocze w probówkach kriogenicznych o pojemności 2 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będzie potrzebne.
  2. Ekstrakcja cfDNA (Rysunek 2B)
    UWAGA: Tutaj przedstawiamy procedurę przy użyciu zestawu do ekstrakcji ręcznej. Zautomatyzowana wersja zgodna z instrukcjami producenta może być również wykonana w celu izolacji cfDNA.
    1. Wlej 400 μl proteinazy K do probówki o pojemności 50 ml. Dodać 4 ml osocza (objętość rutynowo używana) i 3,2 ml buforu do lizy ACL (zawierającego 1,0 μg nośnego RNA) z zestawu. Zamknij probówkę i mieszaj przez wirowanie przez 30 s, aby uzyskać jednorodny roztwór. Inkubować w temperaturze 60 °C przez 30 minut.
    2. Dodaj 7,2 ml buforu ACB (z zestawu) do lizatu, aby zoptymalizować wiązanie krążących kwasów nukleinowych z membraną krzemionkową i mieszaj przez wirowanie przez 15–30 s. Inkubuj probówkę przez 5 minut na lodzie.
    3. Umieść kolumnę i przedłużacz o pojemności 20 ml w pompie próżniowej. Zamknij nieużywane pozycje, aby umożliwić zasysanie próżniowe.
    4. Ostrożnie nanieść mieszaninę ACB lizatu i buforu do przedłużacza probówki (na krótko odwirować probówkę, aby zebrać maksimum mieszaniny ACB z buforem lizatowym), włączyć pompę próżniową i pozwolić, aby lizat został całkowicie wciągnięty przez kolumny. Wyjmij i wyrzuć przedłużacz rurki.
    5. Nanieść 600 μl buforu ACW1 na kolumnę. Gdy bufor ACW1 zostanie przeciągnięty przez kolumnę, dodaj 750 μl buforu ACW2 i na koniec dodaj 750 μl etanolu (96–100%). Następnie umieść kolumnę w czystej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml i odwiruj z pełną prędkością (20 000 x g) przez 3 minuty, aby wyeliminować etanol.
    6. Umieścić kolumnę w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Otworzyć pokrywkę i inkubować w temperaturze 56 °C przez 10 minut, aby całkowicie wysuszyć membranę.
    7. Umieść kolumnę w czystej probówce o niskim poziomie wiązania DNA o pojemności 1,5 ml. Ostrożnie nałóż 36 μl wody wolnej od RNaz z 0,04% azydkiem sodu (bufor AVE). Zamknij pokrywkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
    8. Wirować z pełną prędkością (20 000 x g) przez 1 minutę w celu wymycia kwasów nukleinowych i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu, gdy będą potrzebne.
  3. Kwantyfikacja cfDNA
    UWAGA: Kwantyfikacja cfDNA jest przeprowadzana za pomocą fluorometru przy użyciu protokołu producenta natychmiast po ekstrakcji lub rozmrożeniu próbek w temperaturze pokojowej (RT), przed użyciem. Unikaj wielokrotnych cykli zamrażania/rozmrażania.
    1. Użyj testu o wysokiej czułości zgodnie z oczekiwaną ilością cfDNA, która zwykle jest mniejsza niż 100 ng/ml osocza. Stężenia cfDNA wahają się od 2-10 ng/ml dla zdrowych dawców, ale mogą sięgać nawet 100 ng/ml u pacjentów z chorobą przerzutową.
    2. Upewnij się, że wszystkie odczynniki mają temperaturę RT i zmieszaj 199 μl buforu rozcieńczającego fluorometr z 1 μl barwnika (200x) na reakcję (liczba N próbek + 2 wzorce do kalibracji fluorometru) w celu uzyskania roztworu roboczego.
    3. Dokładnie zwirować roztwór cfDNA, aby zapewnić jednorodność i krótko odwirować, aby zebrać zawartość na dnie probówki.
    4. Zmieszać 5 μl każdej próbki cfDNA ze 195 μl roztworu roboczego.
    5. Zmieszać 10 μl każdego wzorca ze 190 μl roztworu roboczego.
    6. Dokładnie wirować wszystkie probówki przez 2-3 sekundy, aby zapewnić jednorodność i krótko odwirować, aby zebrać zawartość na dnie probówek.
    7. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty w ciemności.
    8. Odczytaj probówki we fluorometrze, używając trybu wyjściowego "ng/μL"
    9. Obliczyć końcowe stężenie w ng/ml osocza w następujący sposób: ng/μL x 36 (objętość eluatu cfDNA) / 4 (objętość wyekstrahowanego osocza).

2. Sonda ddPCR i projekt podkładu (Rysunek 2A)

UWAGA: Amplifikacja docelowych cząsteczek w teście ddPCR przebiega według podobnych zasad jak qPCR. Każdy starter i sonda są projektowane przy użyciu konwencjonalnego dedykowanego oprogramowania Primer37 (http://primer3.ut.ee/).

  1. Wzór podkładu
    1. W oknie ustawień ogólnych zmień "stężenie kationów dwuwartościowych" na 3,8, "stężenie dNTP" na 0,8 i "bibliotekę mispriming/repeat" na właściwy organizm.
    2. W oknie ustawień zaawansowanych zmień zarówno "Tabelę parametrów termodynamicznych", jak i "Wzór na stężenie soli" na Santa Lucia 1998.
    3. Wybierz Tm między 55 a 70 °C (z 50 mM dla stężenia soli i 300 nM dla stężenia oligonukleotydów).
    4. Sprawdź specyfikę podkładów za pomocą narzędzi takich jak PrimerBlast.
    5. Unikaj regionów, które mają struktury pomocnicze.
    6. Wybierz sekwencję, która ma zawartość GC 50–60%.
    7. Unikaj powtórzeń G i C dłuższych niż 3 zasady.
    8. Jeśli to możliwe, wybieraj podkłady z Gs i C na końcu 3'.
    9. Upewnij się, że końce 3' sparowanych starterów nie mają znaczącej komplementarności, aby uniknąć dimerów starterów. Amplikony powinny być mniejsze niż 150 pz, aby skutecznie amplifikować cfDNA (średnia wielkość to 170 bp8) oraz DNA wyekstrahowane z FFPE, które często jest fragmentowane.
  2. Konstrukcja sondy
    UWAGA: Sondy hydrolizy są oznaczone fluorescencyjnym reporterem na końcu 5' i wygaszaczem na końcu 3'. Zapewniają wysoką specyficzność, wysoki stosunek sygnału do szumu i umożliwiają multipleksowanie w razie potrzeby. Dwukanałowe czytniki kropel są kompatybilne z barwnikami FAM i HEX lub VIC, a także z analizą sond sprzężonych FAM/HEX lub FAM/VIC.
    1. Zaprojektuj sondy hydrolizy komplementarne do sekwencji WT obszaru docelowego i sąsiedniego obszaru niezmiennego.
    2. Wybierz sondy znajdujące się w obrębie amplikonu zdefiniowanego przez wcześniej zaprojektowaną parę starterów. Sekwencje starterów nie mogą nakładać się na sekwencje sondy, chociaż mogą znajdować się obok siebie.
    3. Wybierz pasmo, które ma więcej C niż Gs. Sondy muszą mieć zawartość GC 30-80%.
    4. Wybierz sondy o długości od 13 do 30 nukleotydów. Dłuższe sondy mają tendencję do wykazywania wyższej fluorescencji tła, ponieważ odległość między fluoroforem a wygaszaczem wpływa na wygaszanie reportera fluoroforu.
    5. Wybierz Tm sond tak, aby była o 3 do 10 °C wyższa niż Tm starterów, aby zapewnić hydrolizę sondy podczas wyżarzania i rozciągania startera. WzmacniaczeTM są zalecane, aby osiągnąć wymaganąTM przy zachowaniu krótkiej sondy, ponieważ krótsze sondy skuteczniej rozróżniają warianty pojedynczych nukleotydów. Sondy nie powinny mieć G na końcu 5', ponieważ tłumi to sygnał fluorescencji nawet po hydrolizie.
    6. Zaprojektuj sondy zrzutowe w następujący sposób: 5'-(VIC)-komplementarna sekwencja WT zmutowanego regionu-(MGB NFQ)-3' i sonda referencyjna jako: 5'-(6-FAM)-komplementarna sekwencja niezmiennego regionu-(MGB NFQ)-3'. Możliwe są również inne kombinacje reportera/wygaszacza.

3. Optymalizacja reakcji ddPCR (Rysunek 2A)

UWAGA: Na przykład kontrola DNA typu dzikiego i zmutowanego może być uzyskana z linii komórkowych, próbek nowotworów lub dostępnych na rynku wzorców referencyjnych DNA.

  1. Wykonaj konwencjonalny PCR na termocyklerze, korzystając z funkcji gradientu termicznego, aby zweryfikować specyficzność produktu PCR amplifikowanego przez zaprojektowane startery.
    1. Przygotuj unikalną mieszaninę reakcyjną PCR, jak opisano poniżej w kroku 4.1 (bez sond) na matrycy kontrolnej DNA typu dzikiego dla co najmniej 8 reakcji, aby uzyskać co najmniej jedną reakcję na temperaturę.
    2. Uruchom wzmocnienie za pomocą programu opisanego w kroku 4.3.2 i zakresu temperatur wyżarzania wokół teoretycznej temperatury wyżarzania starterów.
    3. Załaduj produkty PCR na 3% żel agarozowy, aby wybrać temperatury wyżarzania, zapewniając określone produkty.
  2. Wykonaj serię ddPCR drop-off, używając parametrów opisanych powyżej, ale tym razem z uwzględnieniem obu sond.
    1. Użyj 100% WT DNA, 100% MUT DNA i mieszaniny WT i MUT DNA (np. 50% MUT/50% WT), aby określić najlepsze warunki do wyraźnego oddzielenia chmur kropel WT i MUT.
    2. Wybierz zakres temperatur wyżarzania powyżej temperatury wybranej w kroku 4.1.
    3. Wybierz temperaturę wyżarzania, która pozwala na specyficzne wykrywanie sygnałów WT lub MUT przy użyciu 100% WT DNA lub 100% MUT DNA i najlepszej separacji chmur kropel WT i MUT.
    4. Czas wyżarzania i stężenia startera/sondy można również dostosować, aby poprawić separację chmur i zmniejszyć liczbę kropel o pośredniej fluorescencji (efekt deszczu).
  3. Oceń tło lub limit ślepej próby (LOB) testu.
    1. Przeprowadzić co najmniej 48 indywidualnych reakcji ddPCR drop-off z kontrolnym DNA WT, stosując parametry wyżarzania i stężenia starterów/sond wybrane w ppkt 3.2.
    2. Dla każdej reakcji obliczyć częstość występowania zmutowanego allelu (MAF) w następujący sposób: (liczba zmutowanych kropel/liczba wypełnionych kropel) x 100,
      UWAGA: LOB definiuje się jako fałszywie dodatnią średnią MAF i powiązaną SD, na podstawie której oblicza się 95% przedział ufności (95% CI). LOB = (średnia wyników fałszywie dodatnich MAF) + 95% CI.
  4. Ocenić granicę wykrywalności (LOD) testu.
    1. Wykonaj reakcje ddPCR z użyciem seryjnych rozcieńczeń DNA MUT w DNA WT, z MAF w zakresie od 5% do 0,01% (≥ 8 powtórzeń na warunek). Stosować parametry wyżarzania i stężenia starterów/sond wybrane w ppkt 3.2.
      UWAGA: LOD definiuje się jako najmniejsze wartości MAF, dla których powtórzenia prezentują wartości średnie i SD powyżej LOB (zob. Decraene i wsp.6 po więcej szczegółów).

4. Protokół ddPCR (Rysunek 2B)

UWAGA: Podobnie jak w przypadku konwencjonalnego ddPCR, protokół drop-off ddPCR składa się z 4 etapów: (i) przygotowania mieszanki PCR, (ii) generowania kropel, (iii) amplifikacji PCR i (iv) akwizycji danych.

  1. Przygotowanie mieszanki PCR
    1. Postępuj zgodnie ze standardowymi środkami ostrożności, takimi jak noszenie rękawiczek, używanie czystego kaptura do PCR, czystych pipet i RNazy, wody destylowanej wolnej od DNaz, aby uniknąć zanieczyszczenia.
    2. Rozmrozić i zrównoważyć składniki reakcji w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotuj 20 razy startery/sondy wymieszać w wodzie destylowanej, ze starterami po 18 μM i sondami po 5 μM każda.
    4. Dla wszystkich indywidualnych reakcji PCR należy przygotować mieszaninę próbek, łącząc 2x ddPCR supermix (10 μL), 1 μL 20x mieszanki starterów/sond i do 10 ng próbki DNA qsp 20 μL wody destylowanej.
    5. Dokładnie wymieszać mieszaninę reakcyjną, aby zapewnić jednorodność i krótko odwirować, aby zebrać zawartość na dnie probówki przed dozowaniem. Nie wahaj się powtórzyć tego kroku dla każdej mieszanki reakcyjnej przed użyciem.
  2. Generowanie kropel
    1. Włóż wkład ddPCR do uchwytu i załaduj 20 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej próbki do środkowych dołków wkładu w celu wytworzenia kropelek (zielone pozycje w Rysunek 2B) za pomocą 8-kanałowej pipety.
    2. Dodać 70 μl oleju z generatora kropel do studzienek dennych (żółte pozycje).
    3. Włóż wkład z uszczelką do generatora kropel; kropelki będą wytwarzane w górnych dołkach naboju (niebieskie pozycje).
    4. Powoli i delikatnie (aby uniknąć ścinania) odsysać i dozować 40 μl kropelek z wkładów do 96-dołkowej płytki PCR. Użyj pipety wielokanałowej, aby zoptymalizować przenoszenie kropel.
  3. Amplifikacja PCR
    1. Uszczelnij końcową płytkę PCR folią aluminiową za pomocą uszczelniacza do płytek natychmiast po przeniesieniu kropel, aby uniknąć parowania. Krótko odwirować płytkę, aby zebrać zawartość na dnie studzienek.
    2. Uruchom konwencjonalną amplifikację PCR na termocyklerze za pomocą następującego programu: 95 °C 10 min, 40 cykli [94 °C 30 s, zwalidowane wyżarzanie T° przez 60 s], 98 °C 10 min (rampa 2.5°C/s). Uwzględnij kontrole bez wejściowego DNA i DNA typu dzikiego (≥3 kontrpróby) w każdym przebiegu.
    3. Po zakończeniu cyklu należy na krótko odwirować płytkę, aby zebrać zawartość na dnie studzienek.
  4. Akwizycja danych
    1. Po amplifikacji PCR należy użyć czytnika kropel, aby policzyć kropelki PCR-dodatnie i PCR-ujemne, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
      UWAGA: Czytnik kropel zwykle oferuje dwukolorowy optyczny system detekcji kompatybilny z fluoroforami FAM, VIC lub HEX.

5. Analiza danych (Rysunek 2C i Rysunek 3)

UWAGA: Kropelki PCR-dodatnie i PCR-ujemne są liczone w celu zapewnienia bezwzględnej kwantyfikacji alleli MUT i WT w docelowym regionie. Przypisane kropelki są używane do obliczenia MAF w każdym dołku. Kwantyfikacja kropel i analiza testów drop-off może być przeprowadzona przy użyciu pakietu ddPCR R (https://github.com/daattali/ddpcr) opracowanego przez Attali i współpracowników9,10. Ten pakiet R automatycznie klasyfikuje kropelki jako puste, będące częścią "deszczu" (z powodu nieefektywnego wzmocnienia) lub jako wypełnione prawdziwym sygnałem dodatnim (Rysunek 3). Poniższa sekcja prezentująca poszczególne etapy analizy jest skróconą wersją opisowej winiety algorytmu napisanej przez jej autorów (zob. https://github.com/daattali/ddpcr/blob/master/vignettes/ algorytm. Rmd, aby uzyskać więcej informacji). Dane są eksportowane do plików z wartościami rozdzielanymi przecinkami (FileName_Amplitude.csv) i przesyłane w pakiecie ddPCR w celu analizy bezpośrednio w R lub poprzez dedykowany interfejs internetowy.

  1. Regulacja parametrów
    UWAGA: Należy się spodziewać, że każdy projekt testu drop-off skutkuje określonym końcowym rozkładem kropli i zmianami w kształcie chmury, separacjach lub pozycjach. Aby zapewnić wydajną automatyczną analizę, należy dostosować zestaw parametrów. Jeśli odwiert ma nieoczekiwany profil, może to spowodować niepowodzenie analizy całej płyty, co spowoduje wyświetlenie komunikatu o błędzie. Problematyczna studnia będzie musiała zostać zidentyfikowana i usunięta z automatycznej analizy.
    1. Zidentyfikuj uszkodzone studnie za pomocą (REMOVE_FAILURES). Użyj TOTAL_DROPS_T (wartość domyślna to 5 000), aby dostosować minimalną liczbę kropel w każdym dołku. Użyj EMPTY_LAMBDA_LOW_T (wartość domyślna to 0,3) i EMPTY_LAMBDA_HIGH_T (wartość domyślna to 0,99), aby dostosować metryki, które oceniają oczekiwane chmury kropel (puste, MUT, WT) i ich jakość.
      Uwaga: Zbyt wiele pustych kropel jest znakiem, że w reakcji nie było wystarczającej ilości amplifikowanej matrycy.
    2. Zidentyfikuj krople odstające za pomocą (REMOVE_OUTLIERS). Użyj TOP_PERCENT (domyślnie p = 1%), aby dostosować górny procent p kropel o najwyższej wartości sygnału w każdym wymiarze sygnału (FAM, VIC/HEX) spośród kropel na całej płycie. Użyj CUTOFF_IQR (wartość domyślna to 5), aby dostosować próg wartości odstającej najwyższego procentu p. najwyższego sygnału.
    3. Zidentyfikuj puste kropelki za pomocą (REMOVE_EMPTY). Użyj CUTOFF_SD (domyślnie 7), aby dostosować odchylenie standardowe dolnego (pustego kropelki) rozkładu Gaussa wartości sondy 1.
    4. Kropelki bramki za pomocą (CLASSIFY). Użyj CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD (domyślnie 3), aby dostosować odchylenie standardowe wyższego (wypełnionego kropel) rozkładu Gaussa wartości sondy 1. Użyj ADJUST_BW_MIN (domyślnie 4) i ADJUST_BW_MAX (domyślnie 20), aby dostosować parametry k_min i k_max, aby oszacować gęstość jądra wartości sondy 2 i rozróżnić MUT i chmurę kropel WT.
      1. Użyj SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ (domyślnie p=1%) i SIGNIFICANT_P_VALUE (domyślnie poziom istotności s=0,01%), aby sklasyfikować studnie jako zmutowane lub dzikie.
        Uwaga: W tym algorytmie zmutowana studzienka jest definiowana jako mająca MAF, który jest statystycznie znacznie wyższy niż p%.
  2. Zautomatyzowana analiza
    UWAGA: Dla każdego parametru przedstawionego w tej sekcji autorzy pakietu ddPCR R zaproponowali wartości domyślne w oparciu o swoją wiedzę specjalistyczną i dane. Jednak wszystkie parametry mogą być modyfikowane w celu zwiększenia jakości analizy (Rysunek 3).
    1. Zidentyfikuj uszkodzone studnie.
      1. Użyj czterech wskaźników kontroli jakości (ustawienia: REMOVE_FAILURES) do identyfikacji uszkodzonych odwiertów; pierwsza z nich to minimalna liczba kropel, które powinna zawierać studnia. Pozostałe trzy koncentrują się na identyfikacji ważnych populacji kandydujących dla pustych, prawdopodobnie FAM+ i HEX+/VIC+. Odwierty, które nie spełniają tych kryteriów, należy usunąć z dalszej analizy.
    2. Zidentyfikuj krople odstające.
      1. Aby uniknąć przekrzywienia bramkowania kropel, należy usunąć wartości odstające (tj. kropelki o nienormalnie wysokiej wartości HEX/VIC lub FAM) z dalszej analizy, ustawiając górny próg graniczny (ustawienia: REMOVE_OUTLIERS).
    3. Zidentyfikuj puste kropelki.
      1. Zidentyfikuj puste kropelki, aby zmniejszyć rozmiar danych (w typowej studni będą one odpowiadać za większość kropel) i wyeliminuj błąd statystyczny spowodowany obecnością dużej części bezużytecznych informacji, ponieważ pozostają tylko krople zawierające szablony (ustawienia: REMOVE_EMPTY).
    4. Wykonaj bramkowanie kropelkowe.
      1. Sklasyfikuj pozostałe kropelki jako zmutowane, dzikie lub deszczowe (ustawienia: KLASYFIKUJ).
    5. Zidentyfikuj kropelki deszczu.
      1. Ponieważ kropelki deszczu powstają w wyniku nieefektywnego wzmocnienia, należy wykluczyć chmury FAM+ lub HEX+/VIC+. Określ granice ich klastrów, korzystając z wartości sondy 1 (ustawienie: CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD).
    6. Zidentyfikuj kropelki zmutowane i dzikie.
      1. Ponieważ głównym punktem analizy jest rozróżnienie między szablonami zmutowanymi i dzikimi, zidentyfikuj wszystkie pozostałe kropelki na tym etapie jako jedną lub drugą. Ponieważ powinny mieć podobne wartości sondy 1, użyj wartości sondy 2, aby jak najlepiej przewidzieć ich naturę (ustawienia: ADJUST_BW_MIN i ADJUST_BW_MAX).
    7. Klasyfikuj studnie jako zmutowane i dzikie.
      1. Po ustaleniu, które kropelki to MUT i WT, oblicz MAF. Korzystając z częstości mutacji i związanej z nią wartości p każdej studzienki, można je sklasyfikować (ustawienia: SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ, SIGNIFICANT_P_VALUE) jako studzienki WT (zawierające głównie kropelki WT) lub studzienki MUT (zawierające statystycznie istotną liczbę kropel MUT).
  3. Eksplorowanie i eksportowanie danych
    1. Eksploruj i eksportuj dane jako liczbę kropel, wartości odstających, puste krople, stężenia lub wykresy, które można dodatkowo dostosować w celu uzyskania optymalnej reprezentacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W badaniu koncepcyjnym, z wykorzystaniem strategii drop-off ddPCR, zbadano mutacje w eksonie 2 genu KRAS (kodony 12 i 13) oraz delecje w eksonie 19 genu EGFR w tkankach FFPE oraz próbkach osocza pobranych od pacjentów z nowotworami6.

Sonda typu drop-off dla KRAS badała region o długości 16 bp obejmujący liczne mutacje w eksonie 2 genu KRAS , w którym znajduje się ponad...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby zaprojektować skuteczny test ddPCR typu drop-off, optymalizacja ma kluczowe znaczenie i należy uważnie przestrzegać protokołu. Każda kombinacja starterów i sond ma unikalną skuteczność reakcji PCR. W związku z tym indywidualny test musi zostać dokładnie zwalidowany na próbkach kontrolnych, zanim zostanie użyty na cennych próbkach testowych. Optymalizacja i walidacja są ważne dla certyfikacji wykrywania sygnału szczytowego oraz oceny swoistości i czułości. Jak opisano w protokole, wszystkie mutacje zlokalizowane w reg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Kilku autorów jest nazwanych wynalazcami dwóch zgłoszeń patentowych (EP17305920.5, EP18305277.8) związanych z wykrywaniem ctDNA.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Institut Curie SiRIC (grant INCa- DGOS-4654). Autorzy pragną również podziękować Caroline Hego za jej wkład w powstanie filmu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka K2EDTA (kod koloru: lawenda)Probówki BD367863EDTA służą do uzyskania próbki krwi pełnej lub osocza EDTA
Zestaw krążących kwasów nukleinowych QIAamp (protokół ręczny)Qiagen55114Do izolacji swobodnie krążącego DNA z ludzkiego osocza
QIAsymphony DSP Krążące DNA (protokół automatyczny)Qiagen937556Do izolacji swobodnie krążącego DNA z ludzkiego osocza
System QIAsymphony SPQiagen9001297w pełni zintegrowany i zautomatyzowany system do oczyszczania cfDNA, DNA lub RNA
QIAvac 24 PlusQiagen19413Do jednoczesnego oczyszczania do 24 cfDNA
Fluorometr kubitowyInvitrogenQ33226Fluorometr kubitowy to fluorometr stacjonarny do ilościowego oznaczania DNA
QX100 lub czytnik QX200Bio-Rad186-3003 lub 186-4003, odpowiednio:Czytnik mierzy intensywność fluorescencji każdej kropli i wykrywa rozmiar i kształt, gdy kropelki przechodzą przez detektor
Generator kropel QX100 lub QX200Bio-Rad186-3002 lub 186-4002, odpowiednio,Przyrząd używany do generowania kropel
Termocykler C1000Bio-Rad1851196Modułowa platforma termocyklera, zawiera obudowę termocyklera C1000 Touch, 96-dołkowy moduł szybkiej reakcji
Zgrzewarka do płytBio-Rad181-4000PX1&handel; Zgrzewarka do płytek
PCR Uchwyt na kartridże DG8Bio-Rad186-3051Ustawia i utrzymuje wkład DG8 w przyrządzie do wytwarzania kropel
Wkłady i uszczelki generatora kropelBio-Rad186-4007Wkład mikroprzepływowy DG8 służy do mieszania próbki i oleju w celu wytworzenia kropel; Uszczelki DG8 uszczelniają wkład, aby zapobiec parowaniu i wywierają ciśnienie wymagane do tworzenia kropel
PCR supermixBio-Rad186-3010ddPCR supermix do sond (bez dUTP)
96-dołkowe płytki PCREppendorf95102036296-dołkowe płytki półspódniczkowe
Uszczelka foliowaBio-Rad181-4040Folia przebijalna zgrzewana
ddPCR Czytnik kropel OilBio-RadOlej 186-3004używany w odczyt
Olej do generowania kropel do sondBio-Rad186-3005olej do generowania kropelek
Probówka DNA loBind 1,5 mlEppendorf0030 108.051Probówki Eppendorf LoBind maksymalizują odzysk próbki poprzez znaczne ograniczenie wiązania próbki z powierzchnią
Zestaw wzorcowy Multiplex I cfDNAHORIZONHD780Wzorce referencyjne cfDNA Multiplex I są wysoce scharakteryzowanymi, biologicznie istotnymi materiałami referencyjnymi używanymi do oceny wydajności testów cfDNA, które wykrywają mutacje somatyczne
ZESTAW TESTOWY QUBIT DSDNA HS, 500Life TechnologiesQ32854Test HS jest wysoce selektywny dla dwuniciowego DNA (dsDNA) nad RNA i został zaprojektowany tak, aby był dokładny dla początkowych stężeń próbki od 10 pg / µ L do 100 ng/&mikro; L
Probówki do testów kubitowychLife TechnologiesQ32856Probówki do testów kubitowych mają 500 i mikro; L cienkościenne rurki polipropylenowe do użytku z fluorometrem Qubit

Bibliografia

  1. Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
  2. Amado, R. G., Wolf, M., et al. Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).
  3. Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer. New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).
  4. Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -F. Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective. Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).
  5. Saliou, A., Bidard, F. -C., et al. Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions. Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).
  6. Decraene, C., Silveira, A. B., et al. Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR. Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).
  7. Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), e115(2012).
  8. Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin. Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).
  9. Bidshahri, R., Attali, D., et al. Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).
  10. Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data. F1000Research. 5, (2016).
  11. Forbes, S. A., Beare, D., et al. COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution. Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kropelkowa cyfrowa PCRkr ce DNA nowotworowedetekcja mutacjimetoda drop off ddPCRp ynna biopsjaekstrakcja DNA z osoczaanaliza mutacji nowotworowychsubstytucja pojedynczego nukleotyduamplifikacja PCRgenerowanie kropelek

Powiązane artykuły