Techniki wspomaganego rozrodu (ARTs) są w ciągłym emulucie ocenianym w celu poprawy wyników i zmniejszenia związanego z tym ryzyka. Manuskrypt ten opisuje minimalnie inwazyjną procedurę transferu zarodków z skutecznym protokołem kriokonserwacji, który pozwala na wykorzystanie królików jako idealnego zwierzęcego modelu rozrodu człowieka.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Małoinwazyjny transfer zarodków i witryfikacja zarodków w optymalnym stadium zarodka w modelu królika
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Techniki wspomaganego rozrodu (ARTs), takie jak hodowla zarodków in vitro czy kriokonserwacja zarodków, wpływają na naturalne wzorce rozwoju, co prowadzi do skutków okołoporodowych i pourodzeniowych. Aby zapewnić nieszkodliwość aplikacji ART, konieczne są badania na modelach zwierzęcych. Ponadto, jako ostatni krok, badania nad rozwojem zarodków wymagają oceny ich zdolności do rozwoju donoszonego, zdrowego potomstwa. W tym przypadku transfer zarodka do macicy jest niezbędny do przeprowadzenia każdego eksperymentu związanego z ARTs.
Królik był używany jako organizm modelowy do badania rozmnażania ssaków przez ponad sto lat. Oprócz filogenetycznej bliskości gatunku ludzkiego oraz niewielkich rozmiarów i niskich kosztów utrzymania, ma ważne cechy reprodukcyjne, takie jak indukowana owulacja, chronologia wczesnego rozwoju embrionalnego podobna do ludzkiej i krótka ciąża, które pozwalają nam łatwo badać konsekwencje stosowania ART. Co więcej, ART (takie jak docytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika, hodowla zarodków lub kriokonserwacja) są stosowane z odpowiednią skutecznością u tego gatunku.
Korzystając z techniki laparoskopowego transferu zarodków i protokołu kriokonserwacji przedstawionego w tym artykule, opisujemy 1) jak przenieść zarodki za pomocą łatwej, minimalnie inwazyjnej techniki oraz 2) skuteczny protokół długoterminowego przechowywania zarodków królika, aby zapewnić elastyczne czasowo możliwości logistyczne i możliwość transportu próbki. Wyniki uzyskane po transferze zarodków królików na różnych etapach rozwoju wskazują, że morula jest idealnym etapem do regeneracji i transferu zarodków królików. W związku z tym wymagany jest transfer zarodków do jajowodów, co uzasadnia zabieg chirurgiczny. Ponadto morule królicze są z powodzeniem witryfikowane i przenoszone laparoskopowo, co dowodzi skuteczności opisanych technik.
Wprowadzenie
W celu uniknięcia ludzkiej bezpłodności lub poprawy rozpowszechniania zwierząt gospodarskich o wysokiej wartości genetycznej i zachowania zasobów genetycznych zwierząt, opracowano zestaw technik zbiorczo określanych jako technologie wspomaganego rozrodu, takich jak superowulacja, zapłodnienie in vitro, hodowla zarodków lub kriokonserwacja1,2. Obecnie stosuje się leczenie hormonalne w celu stymulacji jajników i wytworzenia dużej liczby pęcherzyków jajnikowych antralnych1. Oocyty pobrane z tych pęcherzyków mogą być dojrzałe, zapłodnione i rozwijane in vitro, dopóki nie z....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury eksperymentalne zastosowane w niniejszym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z dyrektywą 2010/63/UE EEC dotyczącą eksperymentów na zwierzętach oraz zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Politècnica de València w Hiszpanii (kod badawczy: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC oraz JSV posiadają certyfikaty autoryzacyjne wydane przez administrację rządową Walencji uprawniające do przeprowadzania eksperymentów na zwierzętach. XGD jest upoważniony do nadzoru in situ nad dobrostanem i opieką nad zwierzętami podczas eksperymentu.
1. Transfer embrionów
-
<....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Mało inwazyjny laparoskopowy transfer świeżych lub witryfikowanych zarodków sprawia, że królik jest jednym z najlepszych zwierząt modelowych do badań nad rozrodczością. Tabela 1 przedstawia wyniki transferu zarodków (ET) w różnych stadiach rozwoju (Rysunek 4). Współczynnik przeżywalności przy urodzeniu (procent zarodków, z których rozwinęły się młode) potwierdził skuteczność opisanej w niniejszej pracy techniki laparoskopowej. Wyższe wartości.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Od czasu pierwszego udokumentowanego przypadku urodzenia żywego z przeniesionych zarodków9 technika ta i gatunki królików stały się kluczowe w badaniach nad reprodukcją. Poza tym badania nad embrionami obejmujące manipulację, produkcję, krioprezerwację itp. wymagają jako ostatniego kroku oceny zdolności zarodka do uzyskania zdrowego, donoszonego potomstwa. W związku z tym niezbędna jest technika transferu zarodków13,28. Z biegiem .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez fundusze z Ministerstwa Gospodarki i Konkurencyjności Hiszpanii (AGL2017-85162-C2-1-R) oraz Programu Badawczego Generalitat Valenciana (PrometeoII 2014/036). Angielska wersja tekstu poprawiona przez N. Macowan English Language Service
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Albumina surowicy bydlęcej (BSA) | VWR | 332 | |
| Chlorowodorek buprenorfiny | Alvet Escartí | 626 | Na zlecenie licencjonowanego lekarza weterynarii. |
| Buserelin Acetate | Sigma Aldrich | B3303 | |
| Mydło diglukonianu klorheksydyny | Alvet Escartí | 0265DCCJ500B | |
| Diglukonian klorheksydyny, roztwór Alvet | Escartí | 0265DCCA500B | |
| CO2 | Air Liquide | 99921 | CO2 N48. |
| Inkubator CO2 | Fisher | 15385194 | |
| naukowy Dimetylosulfotlenek | Sigma Aldrich | W387509 | |
| Dulbecco" s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) | Sigma Aldrich | D5773 | Bez chlorku wapnia. |
| Elektryczna maszynka do golenia | Oster Golden A5 | 078005-140-002 | |
| Kamera endoskopowa | Optomic Spain S.A | OP-714 | |
| Trokar endoskopowy z silikonowym zaworem ulotkowym | Karl Storz Endoscopia Ibé rica S.A. | 30114GK | Lekki model trokara. |
| Enrofloksacyna | Alvet Escartí | 9993046 | Na zamówienie licencjonowanego lekarza weterynarii. |
| Igła epicranealna 23G | Alvet Escartí | 514056353 | Można również używać mniejszych igieł. |
| Cewnik zewnątrzoponowy | Vygon corporate | 187.10 | |
| Igła zewnątrzoponowa | Vygon corporate | 187.10 | |
| Glikol etylenowy | Sigma Aldrich | 102466-M | |
| Maść do oczu | Alvet Escartí | 5273 | |
| Chlorowodorek ketaminy | Alvet Escartí | 184 | Na zlecenie licencjonowanego lekarza weterynarii. |
| Aparatura laparoskopowa | Karl Storz Endoscopia Ibé rica S.A. | 26003 AA | Hopkins® Laparoskop, laparoskop prosty 0º-mm, długość 30 cm, kanał roboczy 5 mm. |
| Źródło światła | Optomic Spain S.A | Fibrolux 250 | |
| Liquid Azot | Air Liquide | P1505XXX | |
| Mechaniczny infiltrator CO2 | Karl Storz, Endoscopia Ibé rica S.A. | Endoflator® | |
| Meloxicam | Alvet Escartí | 9993501 | Na zamówienie licencjonowanego lekarza weterynarii. |
| szalki Petriego, 35 mm | Sigma Aldrich | CLS430165-500EA | |
| Opatrunek plastikowy (Nobecutan) | IBOR medica | 7140028 | |
| Słomka plastikowa 0,25 ml | IMV - technologie | 6431 | |
| Roztwór jodku powidonu | Alvet Escartí | 02656DPYS500S | |
| Nożyczki | ROBOZ | RS-5880 | Sprawdzi się każde zwykłe małe proste nożyczki ze stali chirurgicznej. |
| Rurka silikonowa do insulatora | Karl Storz Endoscopia Ibé rica S.A. | ||
| Mikroskop stereoskopowy | Leica | MZ16F | Istnieją tańsze opcje, takie jak Leica MZ8 lub Nikon SMZ-10 lub SMZ-2B, żeby wymienić tylko kilka. |
| Sterylne rękawice | Alvet Escartí | 087GL010075 | |
| Sterylny fartuch | Alvet Escartí | ||
| Sterylna maska | Alvet Escartí | 058B15924B | |
| Słomka | IMV - technologie | 6431 | |
| Sacharoza | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Strzykawka, 1 ml | Fisher scientific | 11750425 | |
| Cewnik moczowy | IMV - technologie | 17722 | |
| Kąpiel wodna | RAYPA | BAE-4 | |
| Ksylazyna | Alvet Escartí | 525225 | Na zamówienie licencjonowanego lekarza weterynarii. |
| Króliki | Universitat Politè cnica de Valè | ncia Linia A | Można stosować inne linie matczyne, takie jak linia V lub linia HP. |
Bibliografia
- Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (ART). Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 388-402 (2017).
- Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
