Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Małoinwazyjny transfer zarodków i witryfikacja zarodków w optymalnym stadium zarodka w modelu królika

13K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58055

⸱

16 maja 2019

 ,  ,  , 
1Departament of Animal Science, Institute for Animal Science and Technology (ICTA), Universitat Politècnica de València (UPV), 2Animal Technology and Research Center (CITA), Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA)

W tym artykule

Podsumowanie

Techniki wspomaganego rozrodu (ARTs) są w ciągłym emulucie ocenianym w celu poprawy wyników i zmniejszenia związanego z tym ryzyka. Manuskrypt ten opisuje minimalnie inwazyjną procedurę transferu zarodków z skutecznym protokołem kriokonserwacji, który pozwala na wykorzystanie królików jako idealnego zwierzęcego modelu rozrodu człowieka.

Streszczenie

Techniki wspomaganego rozrodu (ARTs), takie jak hodowla zarodków in vitro czy kriokonserwacja zarodków, wpływają na naturalne wzorce rozwoju, co prowadzi do skutków okołoporodowych i pourodzeniowych. Aby zapewnić nieszkodliwość aplikacji ART, konieczne są badania na modelach zwierzęcych. Ponadto, jako ostatni krok, badania nad rozwojem zarodków wymagają oceny ich zdolności do rozwoju donoszonego, zdrowego potomstwa. W tym przypadku transfer zarodka do macicy jest niezbędny do przeprowadzenia każdego eksperymentu związanego z ARTs.

Królik był używany jako organizm modelowy do badania rozmnażania ssaków przez ponad sto lat. Oprócz filogenetycznej bliskości gatunku ludzkiego oraz niewielkich rozmiarów i niskich kosztów utrzymania, ma ważne cechy reprodukcyjne, takie jak indukowana owulacja, chronologia wczesnego rozwoju embrionalnego podobna do ludzkiej i krótka ciąża, które pozwalają nam łatwo badać konsekwencje stosowania ART. Co więcej, ART (takie jak docytoplazmatyczne wstrzyknięcie plemnika, hodowla zarodków lub kriokonserwacja) są stosowane z odpowiednią skutecznością u tego gatunku.

Korzystając z techniki laparoskopowego transferu zarodków i protokołu kriokonserwacji przedstawionego w tym artykule, opisujemy 1) jak przenieść zarodki za pomocą łatwej, minimalnie inwazyjnej techniki oraz 2) skuteczny protokół długoterminowego przechowywania zarodków królika, aby zapewnić elastyczne czasowo możliwości logistyczne i możliwość transportu próbki. Wyniki uzyskane po transferze zarodków królików na różnych etapach rozwoju wskazują, że morula jest idealnym etapem do regeneracji i transferu zarodków królików. W związku z tym wymagany jest transfer zarodków do jajowodów, co uzasadnia zabieg chirurgiczny. Ponadto morule królicze są z powodzeniem witryfikowane i przenoszone laparoskopowo, co dowodzi skuteczności opisanych technik.

Wprowadzenie

W celu uniknięcia ludzkiej bezpłodności lub poprawy rozpowszechniania zwierząt gospodarskich o wysokiej wartości genetycznej i zachowania zasobów genetycznych zwierząt, opracowano zestaw technik zbiorczo określanych jako technologie wspomaganego rozrodu, takich jak superowulacja, zapłodnienie in vitro, hodowla zarodków lub kriokonserwacja1,2. Obecnie stosuje się leczenie hormonalne w celu stymulacji jajników i wytworzenia dużej liczby pęcherzyków jajnikowych antralnych1. Oocyty pobrane z tych pęcherzyków mogą być dojrzałe, zapłodnione i rozwijane in vitro, dopóki nie zostaną albo kriokonserwowane, albo przeniesione do matek zastępczych3. Jednak podczas tych zabiegów gamety i zygoty są narażone na szereg procesów niefizjologicznych, które mogą wymagać adaptacji zarodka do przetrwania w tych warunkach4,5. Ta adaptacja jest możliwa dzięki wczesnej plastyczności zarodka, która umożliwia zarodkowi zmiany w ekspresji genów i programowaniu rozwojowym6. Jednak modyfikacje te mogą wpływać na kolejne etapy rozwoju zarodka aż do dorosłości, a obecnie powszechnie przyjmuje się, że metody, czas, procedura kriokonserwacji lub warunki hodowli wykazują różne wyniki dotyczące losu zarodka7,8. Dlatego, aby wyjaśnić specyficzne efekty indukowane ART, nieuniknione jest użycie dobrze scharakteryzowanych modeli zwierzęcych.

Pierwsze udokumentowane żywe narodziny wynikające z transferu zarodków ssaków miały miejsce w 1890 roku9. Obecnie transfer zarodka (ET) do surogatki jest kluczowym krokiem w badaniu efektów wywołanych przez ART podczas preimplantacji na kolejne etapy rozwoju zarodka10. Techniki ET zależą od wielkości i budowy anatomicznej każdego zwierzęcia. W przypadku dużych modeli zwierzęcych możliwe było wykonanie ET za pomocą przezszyjkowych niechirurgicznych technik ET, ale u mniejszych gatunków cewnikowanie szyjki macicy jest bardziej skomplikowane i często stosuje się techniki chirurgiczne11. Jednak chirurgiczne ET może powodować krwotok, który może upośledzać implantację i rozwój zarodka, ponieważ krew może zaatakować światło macicy, powodując śmierć zarodka10. Niechirurgiczne techniki transszyjkowe ET są nadal stosowane u ludzi, pawianów, bydła, świń i myszy12,13,14,15,16,17, ale chirurgiczne ET są nadal stosowane u gatunków takich jak kozy, owce lub inne zwierzęta, które stwarzają dodatkowe trudności10,18,19,20,21, takie jak króliki (dwie niezależne szyjki macicy) lub myszy (mały rozmiar). Niemniej jednak metody transferu chirurgicznego są stopniowo zastępowane mniej inwazyjnymi metodami. Endoskopia była używana do transferu zarodków, na przykład u królików, świń i małych przeżuwaczy18,19,20. Te minimalnie inwazyjne metody endoskopowe mogą być stosowane do przenoszenia zarodków do bańki za pośrednictwem lejka, co jest niezbędne u królików i wykazało korzystne działanie u niektórych gatunków20. Opiera się to na znaczeniu prawidłowego dialogu między zarodkiem a matką we wczesnych stadiach zarodka w jajowodzie. Jak wspomniano powyżej, przebudowa zarodka, która ma miejsce u królików podczas migracji zarodka przez jajowód, jest niezbędna do uzyskania zarodków zdolnych do zagnieżdżenia się22,23.

Większe modele zwierzęce, takie jak bydło, są interesujące, ponieważ cechy biochemiczne i preimplantacyjne są podobne do tych u gatunków ludzkich24. Jednak duże zwierzęta są zbyt drogie, aby wykorzystać je we wstępnych próbach, a gryzonie są uważane za idealny model (76% organizmów modelowych to gryzonie) do badań laboratoryjnych25. Niemniej jednak model królika zapewnia pewne przewagi nad gryzoniami w badaniach reprodukcyjnych, ponieważ niektóre procesy biologiczne reprodukcyjne wykazywane przez ludzi są bardziej podobne u królików niż u myszy. U ludzi i królików występuje podobna chronologiczna aktywacja genomu embrionalnego, gastrulacja i struktura łożyska krwiochorowego. Ponadto, korzystając z królików, można poznać dokładny czas zapłodnienia i etapów ciąży ze względu na ich indukowaną owulację25. Cykle życiowe królika są krótkie, ciąża kończy się w 31 dni i osiąga dojrzałość płciową po około 4-5 miesiącach; Zwierzę jest łatwe w obsłudze ze względu na potulne i nieagresywne zachowanie, a jego utrzymanie jest bardzo ekonomiczne w porównaniu z wydatkami na większe zwierzęta. Ponadto należy wspomnieć, że króliki mają dupleksową macicę z dwiema niezależnymi szyjkami macicy11,25. Stawia to królika w uprzywilejowanej pozycji, ponieważ zarodki z różnych grup doświadczalnych mogą zostać przeniesione do tego samego zwierzęcia, ale do innego rogu macicy. Pozwala nam to porównać oba efekty eksperymentalne, redukując czynnik matczyny do wyników.

Dzisiaj, niechirurgiczne metody ET nie są stosowane u królików. Niektóre badania przeprowadzone pod koniec lat 90. przy użyciu techniki przezszyjkowej ET skutkowały niskimi wskaźnikami porodów od 5,5% do 20,0%11,26 w porównaniu z 50-65% metodami chirurgicznymi, w tym procedura laparoskopii opisana przez Besenfeldera i Brem18. Niskie wskaźniki powodzenia tych niechirurgicznych metod ET u królików zbiegają się z brakiem niezbędnej przebudowy zarodka w jajowodzie, której unika się w przezszyjkowym ET. W tym miejscu opisujemy skuteczną małoinwazyjną laparoskopową procedurę ET z wykorzystaniem królików jako organizmu modelowego. Technika ta stanowi model dla dalszych badań reprodukcyjnych na dużych zwierzętach i ludziach.

Ponieważ króliki mają szczególnie wąskie okno czasowe na implantację zarodka, ET u tego gatunku wymaga wysokiego stopnia synchronizacji między etapem rozwoju zarodka w ET a fizjologicznym statusem biorcy27. W niektórych przypadkach po leczeniu reprodukcyjnym, które spowalnia rozwój zarodka (takie jak hodowla in vitro) lub zmienia receptywność endometrium (takie jak leczenie superowulacyjne), nie ma synchronizacji między zarodkiem a macicą matki. Takie sytuacje mogą negatywnie wpłynąć na wynik. Aby odpowiedzieć w tych kontekstach, opisujemy skuteczny protokół witryfikacji moruli króliczej, który pozwala nam wstrzymać, uporządkować i wznowić eksperymenty. Proces ten jest logistycznie pożądany w badaniach reprodukcyjnych i daje nam możliwość długoterminowego przechowywania zarodków, umożliwiając ich transport. Procedura laparoskopowa i strategie kriokonserwacji pozwalają na lepsze planowanie badań z mniejszą liczbą zwierząt. W związku z tym nasza metodologia oferuje korzyści higieniczne i ekonomiczne oraz jest zgodna z koncepcją 3R (zastępstwo, redukcja i udoskonalenie) badań na zwierzętach z określonym celem, jakim jest poprawa traktowania zwierząt doświadczalnych przez ludzi. Tak więc, dzięki tym metodom, króliki stanowią idealny organizm modelowy do testów reprodukcyjnych in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne zastosowane w niniejszym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z dyrektywą 2010/63/UE EEC dotyczącą eksperymentów na zwierzętach oraz zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez Komitet Etyki ds. Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Politècnica de València w Hiszpanii (kod badawczy: 2015/VSC/PEA/00170). XGD, FMJ, MPVC oraz JSV posiadają certyfikaty autoryzacyjne wydane przez administrację rządową Walencji uprawniające do przeprowadzania eksperymentów na zwierzętach. XGD jest upoważniony do nadzoru in situ nad dobrostanem i opieką nad zwierzętami podczas eksperymentu.

1. Transfer embrionów

  1. Przygotowanie samic biorców
    1. Należy używać wyłącznie samic dojrzałych płciowo (> 4,5 miesiąca).
    2. Na tydzień przed ET należy przystosować samice do reżimu 16 h światła/8 h ciemności, aby zainicjować wzrost mieszków płciowych i zwiększyć receptywność samic.
    3. Należy wybrać samice biorców, obserwując turgor i kolor sromu. Jeśli srom jest turgidny i zaczerwieniony, samica jest receptywna.
    4. Pseudociążę (owulację) indukuje się pojedynczym wtryśnięciem domięśniowym 1 µg octanu busereliny (syntetycznego analogu hormonu uwalniającego gonadotropiny), niezależnie od masy ciała.
      UWAGA: Zazwyczaj dawka 0,8 µg jest odpowiednia do indukcji owulacji u królików średniej wielkości (4-5 kg), zatem 1 µg zazwyczaj gwarantuje wystąpienie owulacji.
    5. Owulację indukuje się z wyprzedzeniem odpowiadającym wiekowi embrionów przeznaczonych do transferu (na przykład 70-72 h przed ET świeżych morul).
  2. Znieczulenie i analgezja
    1. Należy zważyć królika i nabrać następujące środki znieczulające i przeciwbólowe.
      1. Do strzykawki 1 mL z igłą 30G: nabrać ksylazynę (5mg/kg) i chlorowodorek buprenorfiny (0,03 mg/kg). Do drugiej strzykawki 1 mL z igłą pericranialis 23G nabrać chlorowodorek ketaminy (35 mg/kg).
    2. Należy unieruchomić królika i wstrzyknąć domięśniowo mieszaninę ksylazyny i buprenorfiny.
    3. Należy wprowadzić igłę pericranialis z ketaminą do marginalnej żyły usznej, powoli wprowadzając całą zawartość strzykawki dożylnie.
    4. Należy przymocować igłę i pozostawić ją w miejscu wkłucia podczas pozostałych etapów, aby w razie potrzeby podać dodatkową dawkę znieczulenia.
    5. Królika należy pozostawić w klatce (czystej i bez innych zwierząt) na ogrzewanej platformie.
    6. Po utracie przytomności należy zastosować maść do oczu, aby zapobiec ich wysychaniu, i sprawdzić brak odruchu powiekowego.
      UWAGA: Protokół ten zapewnia płaszczyznę znieczulenia chirurgicznego przez minimum 30 min. Jeśli wymagany jest dłuższy czas, po 30 min należy wstrzyknąć dodatkowe dawki, stosując połowę ilości chlorowodorku ketaminy opisanej w punkcie 1.2.1.
    7. Głębokość znieczulenia należy monitorować, sprawdzając odruch stóp oraz ruchy oddechowe. Zmiana wzorca oddychania na nieregularny i przyspieszony wskazuje na utratę właściwej płaszczyzny znieczulenia.
    8. Należy monitorować kolor błon śluzowych (oczy, wargi itp.), częstość oddechów (30-60 oddechów na minutę), częstość akcji serca (120-325 uderzeń na minutę) oraz temperaturę rektalną (38-39,6 °C).
    9. Na osiem godzin przed transferem należy odstawić pokarm, aby uniknąć zwiększenia rozmiaru i aktywności jelit aż do zakończenia procesu ET. Należy zapewnić swobodny dostęp do wody.
  3. Przygotowanie embrionów
    1. Podłoża do manipulacji embrionami należy ogrzać do 25 °C: Podłoże Bazowe (BM), składające się z soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS) uzupełnionej o 0,2% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej.
    2. Pracując pod stereomikroskopem, należy przepłukać świeże lub rozmrożone (Krok 2) embriony podłożem BM.
    3. Używając sterylnych rękawiczek, należy przymocować odpowiednio skonfigurowany cewnik epiduralny 17G do strzykawki 1 mL.
    4. Do cewnika należy zassać 1 cm BM, a następnie mały pęcherzyk powietrza.
    5. Należy zassać 5-7 embrionów w objętości 10 µL BM, a następnie kolejny mały pęcherzyk powietrza.
    6. Napełnianie cewnika należy zakończyć poprzez zassanie 1 cm BM.
  4. Transfer embrionów
    1. W celu zapewnienia środowiska aseptycznego należy rozważyć użycie sterylnych rękawiczek, fartucha i maski.
    2. Należy wysterylizować instrumenty chirurgiczne, oczyścić powierzchnie, na których będzie wykonywana operacja, i przetrzeć je 70% etanolem.
    3. Znieczulenie należy przeprowadzić zgodnie z wcześniejszym opisem (krok 1.2), sprawdzając zanik odruchów.
    4. Sierść z brzusznej części brzucha należy usunąć za pomocą maszynki elektrycznej.
    5. Brzuszną część brzucha należy przygotować aseptycznie.
      1. Oczyścić pole operacyjne i usunąć pozostałe włosy. Umyć pole operacyjne mydłem z glukonianem chlorheksydyny. Zdezynfekować obszar roztworem chlorheksydyny i etanolem 96º (3 razy).
    6. Zwierzę należy umieścić na ogrzewanym stole chirurgicznym w pozycji Trendelenburga (głowa obniżona o 45°), aby zapewnić przesunięcie żołądka i jelit w kierunku kranialnym. Należy rozważyć opróżnienie pęcherza moczowego, jeśli jest turgidny. Uszkodzenie jakichkolwiek trzewi w tym procesie może doprowadzić do śmierci zwierzęcia. Dlatego ważne jest ich prawidłowe zlokalizowanie (Rycina 1).
    7. Obszar należy przykryć sterylnym ręcznikiem z otworem (fenestracją) odsłaniającym ogoloną skórę, aby oddzielić miejsce operacyjne od potencjalnych obszarów zanieczyszczonych.
    8. Wprowadzić trokar endoskopowy na 5 cm do jamy brzusznej, 2 cm caudalnie od wyrostka miecza, i przeprowadzić przez niego insuflację jamy otrzewnej za pomocą mechanicznego insuflatora z regulacją ciśnienia.
      UWAGA: Ciśnienie wewnątrzbrzuszne powinno wynosić 8-12 mmHg przy użyciu CO2 (Rycina 1A).
    9. Przez trokar endoskopowy wprowadzić kamerę endoskopową (Rycina 1B).
      UWAGA: Należy zidentyfikować drogi rodne, określając stan i pozycję infundibulum oraz ampuły przed ET, aby ułatwić kolejne kroki.
    10. Wprowadzić igłę epiduralną 17-G w okolice pachwinowe w odległości 2-3 cm od infundibulum (Rycina 1B).
    11. Zidentyfikować wejście do infundibulum (Rycina 2A, 2B).
    12. Wprowadzić napełniony cewnik (krok 1.3) przez igłę epiduralną do jamy brzusznej (Rycina 1C).
    13. Zlokalizować jajowód i wprowadzić 1-2 cm cewnika epiduralnego przez infundibulum do ampuły (Rycina 2A-2C). Nie należy wprowadzać cewnika zbyt głęboko do jajowodu, aby zapobiec uszkodzeniom i krwawieniu.
    14. Uwolnić embriony do jajowodu, delikatnie naciskając tłok strzykawki połączonej z cewnikiem (Rycina 2D-2F). Oba pęcherzyki powietrza muszą opuścić cewnik.
    15. Cewnik należy usunąć bezpośrednio po uwolnieniu embrionów.
    16. Przepłukać cewnik, zasysając i wypuszczając podłoże manipulacyjne, aby sprawdzić brak embrionów i potwierdzić ich pomyślny transfer.
    17. W razie potrzeby powtórzyć kroki 1.4.11 do 1.4.16 po drugiej stronie macicy.
    18. Usunąć igłę epiduralną i kamerę endoskopową.
    19. Usunąć CO2 przez trokar endoskopowy. Jeśli w brzuchu zwierzęcia pozostanie nadmiar gazu, spowoduje to ból i dyskomfort.
    20. Usunąć trokar endoskopowy z jamy brzusznej. Zdjąć ręcznik chirurgiczny.
    21. Przerwać znieczulenie.
    22. Oczyścić nacięcie wykonane trokarem roztworem chlorheksydyny. Zamknąć nacięcie wykonane trokarem za pomocą zmikronizowanego aluminium i opatrunku plastikowego.
  5. Opieka pooperacyjna
    1. Leczyć zwierzęta antybiotykami: enrofloksacyna 10 mg/kg, podskórnie, co 24 h przez 5 dni.
    2. Podawać leki przeciwbólowe: chlorowodorek buprenorfiny (0,03 mg/kg) domięśniowo co 12 godzin przez 3 dni; meloksykam (0,2 mg/kg) podskórnie co 24 h przez 3 dni.
    3. Monitorować zwierzęta przez co najmniej 30 min po operacji (zależnie od zwierzęcia i zastosowanej dawki znieczulenia), upewniając się, że odzyskały stan fizjologiczny.
    4. Zidentyfikować biorcę (np. tatuaż w uchu) i umieścić zwierzęta indywidualnie w czystej klatce w odpowiednich warunkach środowiskowych.

Chirurgiczny zabieg endoskopowy u królika; sekwencja znieczulenia, wprowadzenia narzędzi i iniekcji próbki.
Rysunek 1: Laparoskopowy transfer embrionów wspomagany laparoskopią (widok zewnętrzny). A) Wprowadzenie trokaru endoskopowego (jeden port). B) Wprowadzenie kamery endoskopowej i igły do znieczulenia zewnątrzoponowego (czarna strzałka). C) Wprowadzenie cewnika do transferu embrionów (biała strzałka) przez igłę do znieczulenia zewnątrzoponowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Seria obrazów laparoskopowych przedstawiająca cewniki jajnikowe i jajowód w badaniu rozrodczym.
Rysunek 2: Transfer embrionów wspomagany laparoskopią (widok wewnętrzny). A: Wprowadzenie cewnika przez igłę do znieczulenia zewnątrzoponowego do obszaru brzusznego. Gwiazdka wskazuje lejek jajowodu. B, C, D: Cewnik z załadowanymi embrionami jest wprowadzany do części rozpierastej jajowodu przez lejek. E, F: Uwolnienie embrionów, potwierdzone wizualizacją obrzękniętego jajowodu. Rysunek został opracowany na podstawie pracy Marco-Jiménez et al.38. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Witryfikacja i rozmrażanie zarodków

  1. Wszystkie manipulacje należy przeprowadzać w temperaturze pokojowej (około 22 °C), aby zmniejszyć toksyczność roztworu witryfikacyjnego w wyższych temperaturach.
    UWAGA: W tym protokole do przenoszenia embrionów można używać automatycznej pipety 0,1-2 µL, ale odpowiednie mogą być również inne podobne urządzenia do przenoszenia embrionów z minimalną objętością cieczy.
  2. Przeprowadź witryfikację embrionów w dwuetapowej procedurze dodawania:
    1. Umieść embriony na 2 minuty w roztworze równoważącym składającym się z 10% (v/v) glikolu etylenowego i 10% (v/v) dimetylosulfotlenku rozpuszczonych w BM.
    2. Przenieś embriony (z kroku 2.2.1) na 1 minutę do roztworu witryfikacyjnego składającego się z 20% (v/v) glikolu etylenowego i 20% (v/v) dimetylosulfotlenku rozpuszczonych w BM.
  3. Załaduj embriony do plastikowego ministraw o pojemności 125 µL (który posiada jeden zamknięty koniec z bawełnianym czopkiem i jeden otwarty koniec). Proces ten przedstawiono schematycznie na Rysunku 3.
    1. Połącz zamknięty koniec ministraw 0,125 μL z odpowiednim mikrodozownikiem (np. Captroll III®).
    2. Zaspiruj BM do 1/3 długości słomki, a następnie mały pęcherzyk powietrza.
    3. Zaspiruj embriony w objętości 40 µL roztworu witryfikacyjnego, a następnie kolejny mały pęcherzyk powietrza.
    4. Zaspiruj BM, aż pierwsza frakcja cieczy (krok 2.3.2) dotrze do bawełny.
    5. Zamknij otwarty koniec korkiem do słomek.
  4. Krok 2.2.2 należy wykonać równolegle z krokiem 2.3, aby upewnić się, że nie upłynęła więcej niż jedna minuta, co byłoby toksyczne dla embrionów.
  5. Zanurz ministraw bezpośrednio w ciekłym azocie, aby przeprowadzić witryfikację.
  6. Przechowuj ministraw w naczyniu Dewar z azotem przez wymagany czas.
  7. Odmroź embriony w jednym etapie.
    1. Umieść ministraw poziomo w odległości 10 cm od oparów ciekłego azotu na 20-30 s.
    2. Gdy wewnątrz ministraw rozpocznie się proces krystalizacji, zanurz ministraw w kąpieli wodnej o temperaturze 25 °C na 10-15 s.
    3. Usuń korek z ministraw i odetnij bawełniany czopek.
    4. Za pomocą podłączonego mikrodozownika wypchnij całą zawartość ministraw na płytkę zawierającą 0,33 M roztwór sacharozy w BM o temperaturze 25 °C na 5 minut.
      UWAGA: Ten krok musi zostać wykonany szybko, aby ograniczyć ekspozycję embrionów na roztwór witryfikacyjny.
    5. Przenieś embriony na nową płytkę zawierającą roztwór BM na kolejne 5 min.
    6. Do dalszego procesu ET należy wybrać wyłącznie embriony nieuszkodzone (z nienaruszoną warstwą mucyny i strefą przejrzystą).
      UWAGA: Należy wziąć pod uwagę, że w przypadku embrionów rozmrożonych, transfery asynchroniczne (np. 60-62 h w transferach morul) mogą poprawić wyniki, umożliwiając resynchronizację między embrionem a błoną śluzową macicy matki.

Układ identyfikacji próbek embrionów; schemat i zbliżenie procesu przygotowania słomki z przerwami powietrznymi i zatyczkami.
Rycina 3: Schemat prawidłowo załadowanej słomki. A) BM odnosi się do pożywki do manipulacji embrionami stosowanej podczas witryfikacji. Embriony muszą być załadowane w roztworze do witryfikacji. B) Wygląd makroskopowy załadowanej słomki z powiększeniem szczegółu pozycji embrionu. To urządzenie o dużej objętości pozwala na witryfikację dużej liczby embrionów, w przeciwieństwie do urządzeń o minimalnej objętości. Ponadto obsługa tego urządzenia jest łatwiejsza w porównaniu z urządzeniami o minimalnej objętości, podczas gdy wyniki u królików są podobne41. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Mało inwazyjny laparoskopowy transfer świeżych lub witryfikowanych zarodków sprawia, że królik jest jednym z najlepszych zwierząt modelowych do badań nad rozrodczością. Tabela 1 przedstawia wyniki transferu zarodków (ET) w różnych stadiach rozwoju (Rysunek 4). Współczynnik przeżywalności przy urodzeniu (procent zarodków, z których rozwinęły się młode) potwierdził skuteczność opisanej w niniejszej pracy techniki laparoskopowej. Wyższe wartości...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Od czasu pierwszego udokumentowanego przypadku urodzenia żywego z przeniesionych zarodków9 technika ta i gatunki królików stały się kluczowe w badaniach nad reprodukcją. Poza tym badania nad embrionami obejmujące manipulację, produkcję, krioprezerwację itp. wymagają jako ostatniego kroku oceny zdolności zarodka do uzyskania zdrowego, donoszonego potomstwa. W związku z tym niezbędna jest technika transferu zarodków13,28. Z biegiem ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez fundusze z Ministerstwa Gospodarki i Konkurencyjności Hiszpanii (AGL2017-85162-C2-1-R) oraz Programu Badawczego Generalitat Valenciana (PrometeoII 2014/036). Angielska wersja tekstu poprawiona przez N. Macowan English Language Service

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)VWR332
Chlorowodorek buprenorfinyAlvet Escartí626Na zlecenie licencjonowanego lekarza weterynarii.
Buserelin AcetateSigma AldrichB3303
Mydło diglukonianu klorheksydynyAlvet Escartí0265DCCJ500B
Diglukonian klorheksydyny, roztwór AlvetEscartí0265DCCA500B
CO2Air Liquide99921CO2 N48.
Inkubator CO2Fisher15385194
naukowy DimetylosulfotlenekSigma AldrichW387509
Dulbecco" s sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS)Sigma AldrichD5773Bez chlorku wapnia.
Elektryczna maszynka do goleniaOster Golden A5078005-140-002
Kamera endoskopowaOptomic Spain S.AOP-714
Trokar endoskopowy z silikonowym zaworem ulotkowymKarl Storz Endoscopia Ibé rica S.A.30114GKLekki model trokara.
EnrofloksacynaAlvet Escartí9993046Na zamówienie licencjonowanego lekarza weterynarii.
Igła epicranealna 23GAlvet Escartí514056353Można również używać mniejszych igieł.
Cewnik zewnątrzoponowyVygon corporate187.10
Igła zewnątrzoponowaVygon corporate187.10
Glikol etylenowySigma Aldrich102466-M
Maść do oczuAlvet Escartí5273
Chlorowodorek ketaminyAlvet Escartí184Na zlecenie licencjonowanego lekarza weterynarii.
Aparatura laparoskopowaKarl Storz Endoscopia Ibé rica S.A.26003 AAHopkins® Laparoskop, laparoskop prosty 0º-mm, długość 30 cm, kanał roboczy 5 mm.
Źródło światłaOptomic Spain S.AFibrolux 250
Liquid AzotAir LiquideP1505XXX
Mechaniczny infiltrator CO2Karl Storz, Endoscopia Ibé rica S.A.Endoflator®
MeloxicamAlvet Escartí9993501Na zamówienie licencjonowanego lekarza weterynarii.
szalki Petriego, 35 mmSigma AldrichCLS430165-500EA
Opatrunek plastikowy (Nobecutan)IBOR medica7140028
Słomka plastikowa 0,25 mlIMV - technologie6431
Roztwór jodku powidonuAlvet Escartí02656DPYS500S
NożyczkiROBOZRS-5880Sprawdzi się każde zwykłe małe proste nożyczki ze stali chirurgicznej.
Rurka silikonowa do insulatoraKarl Storz Endoscopia Ibé rica S.A.
Mikroskop stereoskopowyLeicaMZ16FIstnieją tańsze opcje, takie jak Leica MZ8 lub Nikon SMZ-10 lub SMZ-2B, żeby wymienić tylko kilka.
Sterylne rękawiceAlvet Escartí087GL010075
Sterylny fartuchAlvet Escartí
Sterylna maskaAlvet Escartí058B15924B
SłomkaIMV - technologie6431
SacharozaSigma AldrichS7903
Strzykawka, 1 mlFisher scientific11750425
Cewnik moczowyIMV - technologie17722
Kąpiel wodnaRAYPABAE-4
KsylazynaAlvet Escartí525225Na zamówienie licencjonowanego lekarza weterynarii.
KrólikiUniversitat Politè cnica de Valè ncia Linia AMożna stosować inne linie matczyne, takie jak linia V lub linia HP.
: , , , , 2040004012261501 Strzykawka, 5 ml Fisher scientific 11773313

Bibliografia

  1. Chen, M., Heilbronn, L. K. The health outcomes of human offspring conceived by assisted reproductive technologies (ART). Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 388-402 (2017).
  2. Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo vitrification in rabbits: Consequences for progeny growth. Theriogenology. 84 (5), 674-680 (2015).
  3. Sirard, M. A. The influence of in vitro. fertilization and embryo culture on the embryo epigenetic constituents and the possible consequences in the bovine model. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 411-417 (2017).
  4. Feuer, S. K., Rinaudo, P. F. Physiological, metabolic and transcriptional postnatal phenotypes of in vitro. fertilization (IVF) in the mouse. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 8 (4), 403-410 (2017).
  5. Jiang, Z., et al. Genetic and epigenetic risks of assisted reproduction. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 44, 90-104 (2017).
  6. Fleming, T. P., Velazquez, M. A., Eckert, J. J. Embryos, DOHaD and David Barker. Journal of Developmental Origins of Health and Disease. 6 (5), 377-383 (2015).
  7. Sparks, A. E. Human embryo cryopreservation-methods, timing, and other considerations for optimizing an embryo cryopreservation program. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (2), 128-144 (2015).
  8. Swain, J. E. Optimal human embryo culture. Seminars in Reproductive Medicine. 33 (2), 103-117 (2015).
  9. Heape, W. Preliminary note on the transplantation and growth of mammalian ova within a uterine foster-mother. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 48, 457-459 (1890).
  10. Bermejo-Alvarez, P., Park, K. E., Telugu, B. P. Utero-tubal embryo transfer and vasectomy in the mouse model. Journal of Visualized Experiments. (84), e51214(2014).
  11. Kidder, J. D., Roberts, P. J., Simkin, M. E., Foote, R. H., Richmond, M. E. Nonsurgical collection and nonsurgical transfer of preimplantation embryos in the domestic rabbit (Oryctolagus cuniculus) and domestic ferret (Mustela putorius furo). Journal of Reproduction and Fertility. 116 (2), 235-242 (1999).
  12. Tıras, B., Cenksoy, P. O. Practice of embryo transfer: recommendations during and after. Seminars in Reproductive Medicine. 32 (4), 291-296 (2014).
  13. Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).
  14. Moreno-Moya, J. M., et al. Complete method to obtain, culture, and transfer mouse blastocysts nonsurgically to study implantation and development. Fertility and Sterility. 101 (3), e13(2014).
  15. Hasler, J. F. Forty years of embryo transfer in cattle: a review focusing on the journal Theriogenology, the growth of the industry in North America, and personal reminisces. Theriogenology. 81 (1), 152-169 (2014).
  16. Bauer, C. The baboon (Papio sp.) as a model for female reproduction studies. Contraception. 92 (2), 120-123 (2015).
  17. Martinez, E. A., et al. Nonsurgical deep uterine transfer of vitrified, in vivo-derived, porcine embryos is as effective as the default surgical approach. Science Reports. 5, 10587(2015).
  18. Besenfelder, U., Brem, G. Laparoscopic embryo transfer in rabbits. Journal of Reproduction and Fertility. 99, 53-56 (1993).
  19. Besenfelder, U., Mödl, J., Müller, M., Brem, G. Endoscopic embryo collection and embryo transfer into the oviduct and the uterus of pigs. Theriogenology. 47 (5), 1051-1060 (1997).
  20. Besenfelder, U., Havlicek, V., Kuzmany, A., Brem, G. Endoscopic approaches to manage in vitro and in vivo embryo development: use of the bovine oviduct. Theriogenology. 73 (6), 768-776 (2010).
  21. Fonseca, J. F., et al. Nonsurgical embryo recovery and transfer in sheep and goats. Theriogenology. 86 (1), 144-151 (2016).
  22. Denker, H. W. Structural dynamics and function of early embryonic coats. Cells Tissues Organs. 166, 180-207 (2000).
  23. Marco-Jiménez, F., López-Bejar, M. Detection of glycosylated proteins in rabbit oviductal isthmus and uterine endometrium during early embryo development. Reproduction in Domestic Animals. 48 (6), 967-973 (2013).
  24. Ménézo, Y. J., Hérubel, F. Mouse and bovine models for human IVF. Reproductive BioMedicine Online. 4 (2), 170-175 (2002).
  25. Fischer, B., Chavatte-Palmer, P., Viebahn, C., Navarrete Santos, A., Duranthon, V. Rabbit as a reproductive model for human health. Reproduction. 144 (1), 1-10 (2012).
  26. Besenfelder, U., Strouhal, C., Brem, G. A method for endoscopic embryo collection and transfer in the rabbit. Zentralbl Veterinarmed A. 45 (9), 577-579 (1998).
  27. Daniel, N., Renard, J. P. Embryo transfer in rabbits. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (1), (2010).
  28. Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters rabbit foetal placenta at transcriptomic and proteomic level. Reproduction. 147 (6), 789-801 (2014).
  29. Green, M., Bass, S., Spear, B. A device for the simple and rapid transcervical transfer of mouse embryos eliminates the need for surgery and potential post-operative complications. Biotechniques. 47 (5), 919-924 (2009).
  30. Duan, X., Li, Y., Di, K., Huang, Y., Li, X. A nonsurgical embryo transfer technique in mice. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 32 (4), 440-446 (2016).
  31. Denker, H. W., Gerdes, H. J. The dynamic structure of rabbit blastocyst coverings. I. Transformation during regular preimplantation development. Anatomy and Embryology. 157, 15-34 (1979).
  32. Seidel, G. E., Bowen, R. A., Kane, M. T. In vitro fertilization, culture and transfer of rabbit ova. Fertility and Sterility. 27, 861-870 (1976).
  33. Binkerd, P. E., Anderson, G. B. Transfer of cultured rabbit embryos. Gamete Research. 2, 65-73 (1979).
  34. Murakami, H., Imai, H. Successful implantation of in vitro cultured rabbit embryos after uterine transfer: a role for mucin. Molecular Reproduction and Development. 43, 167-170 (1996).
  35. Techakumphu, M., Wintenberger-Torrèsa, S., Sevelleca, C., Ménézo, Y. Survival of rabbit embryos after culture or culture/freezing. Animal Reproduction Science. 13 (3), 221-228 (1987).
  36. Gitzelmann, C. A., et al. Cell-mediated immune response is better preserved by laparoscopy than laparotomy. Surgery. 127 (1), 65-71 (2000).
  37. Huang, S. G., Li, Y. P., Zhang, Q., Redmond, H. P., Wang, J. H., Wang, J. Laparotomy and laparoscopy diversely affect macrophage-associated antimicrobial activity in a murine model. BMC Immunology. 14, 27(2013).
  38. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Almela-Miralles, V., Vicente, J. S. Development of Cheaper Embryo Vitrification Device Using the Minimum Volume Method. Public Library of Science One. 11 (2), e0148661(2016).
  39. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Generation of live offspring from vitrified embryos with synthetic polymers supercool X-1000 and Supercool Z-1000. CryoLetters. 35, 286-292 (2014).
  40. Marco-Jiménez, F., Jiménez-Trigos, E., Lavara, R., Vicente, J. S. Use of cyclodextrins to increase cytoplasmic cholesterol in rabbit embryos and their impact on live KITs derived from vitrified embryos. Cryoletters. 35, 320-326 (2014).
  41. Marco-Jiménez, F., Lavara, R., Jiménez-Trigos, E., Vicente, J. S. In vivo development of vitrified rabbit embryos: Effects of vitrification device, recipient genotype, and asynchrony. Theriogenology. 79 (7), 1124-1129 (2013).
  42. Vicente, J. S., et al. Rabbit morula vitrification reduces early foetal growth and increases losses throughout gestation. Cryobiology. 67, 321-326 (2013).
  43. Viudes-de-Castro, M. P., Marco-Jiménez, F., Cedano-Castro, J. I., Vicente, J. S. Effect of corifollitropin alfa supplemented with or without Lh on ovarian stimulation and embryo viability in rabbit. Theriogenology. 98, 68-74 (2017).
  44. Saenz-de-Juano, M. D., et al. Vitrification alters at transcriptomic and proteomic level rabbit foetal placenta. Reproduction. 147, 789-801 (2014).
  45. Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jimenez, F., Viudes-de-Castro, M. P., Lavara, R., Vicente, J. S. Direct comparison of the effects of slow freezing and vitrification on late blastocyst gene expression, development, implantation and offspring of rabbit morulae. Reproduction in Domestic Animals. 49, 505-511 (2014).
  46. Lavara, R., Baselga, M., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Long-term and transgenerational effects of cryopreservation on rabbit embryos. Theriogenology. 81, 988-992 (2014).
  47. Saenz-de-Juano, M. D., Marco-Jiménez, F., Vicente, J. S. Embryo transfer manipulation cause gene expression variation in blastocysts that disrupt implantation and offspring rates at birth in rabbit. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. 207, 50-55 (2016).
  48. Roque, M., Valle, M., Kostolias, A., Sampaio, M., Geber, S. Freeze-all cycle in reproductive medicine: current perspectives. JBRA Assisted Reproduction. 21 (1), 49-53 (2017).
  49. Tsunoda, Y., Soma, T., Sugie, T. Effect of post-ovulatory age of recipient on survival of frozen-thawed rabbit morulae. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 483-487 (1982).
  50. Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
  51. Lavara, R., Baselga, M., Vicente, J. S. Does storage time in LN2 influence survival and pregnancy outcome of vitrified rabbit embryos? Theriogenology. 76 (4), 652-657 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Laparoskopowy transfer embrion wtransfer w stadium moruliprzesy embrion w do jajowodukriokonserwacja embrion wtechnika ma oinwazyjnawspomagane technologie prokreacjipobieranie embrion wrozmra anie embrion w
Małoinwazyjny transfer zarodków i witryfikacja zarodków w optymalnym stadium zarodka w modelu królika
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.