Artykuł metodologiczny

Multimodalna bioluminescencyjna i pozytroniczna tomografia emisyjna/tomografia obliczeniowa ksenoprzeszczepów szpiczaka mnogiego szpiku kostnego u myszy NOG

DOI:

10.3791/58056

⸱

7 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Greater Los Angeles Veteran Administration Healthcare System, 2San Diego Veterans Administration Healthcare System, 3University of California, Los Angeles, 4Perkin Elmer

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj używamy obrazowania bioluminescencyjnego, rentgenowskiego i pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej, aby zbadać, jak hamowanie aktywności mTOR wpływa na guzy szpiczaka kostnego przeszczepionego szpiczakiem kostnym w modelu ksenoprzeszczepu. Pozwala to na fizjologicznie istotne, nieinwazyjne i multimodalne analizy działania przeciwszpiczaka mózgu terapii ukierunkowanych na guzy szpiczaka kostnego przeszczepione szpiczakiem kostnym in vivo.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Guzy szpiczaka mnogiego (MM) wszczepiają się do szpiku kostnego (BM), a ich przeżycie i progresja zależą od złożonych interakcji molekularnych i komórkowych, które istnieją w tym mikrośrodowisku. Jednak mikrośrodowisko BM nie może być łatwo odtworzone in vitro, co potencjalnie ogranicza fizjologiczne znaczenie wielu modeli eksperymentalnych in vitro i ex vivo. Problemy te można przezwyciężyć, wykorzystując model ksenoprzeszczepu, w którym transfekowane lucyferazy (LUC) komórki 8226 MM zostaną specyficznie wszczepione w szkielet myszy. Gdy myszom tym podaje się odpowiedni substrat, D-lucyferynę, wpływ terapii na wzrost guza i przeżycie można przeanalizować, mierząc zmiany w obrazach bioluminescencyjnych (BLI) wytwarzanych przez guzy in vivo. Te dane BLI w połączeniu z analizą pozytronicznej tomografii emisyjnej/tomografii obliczeniowej (PET/CT) przy użyciu markera metabolicznego 2-deoksy-2-(18F)fluoro-D-glukozy (18F-FDG) służą do monitorowania zmian w metabolizmie guza w czasie. Te platformy obrazowania pozwalają na wiele nieinwazyjnych pomiarów w mikrośrodowisku guza/BM.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MM to nieuleczalna choroba składająca się ze złośliwych komórek B osocza, które infiltrują BM i powodują zniszczenie kości, anemię, zaburzenia czynności nerek i infekcje. Mnogi szpikowe stanowią 10% - 15% wszystkich nowotworów hematologicznych1 i jest najczęstszym nowotworem obejmującym szkielet2. Rozwój MM wynika z onkogennej transformacji długożyciowych komórek plazmatycznych, które są zakładane w centrach rozrodczych tkanek limfatycznych, zanim ostatecznie trafią do klasy BM3. BM charakteryzuje się wysoce niejednorodnymi niszami; w tym różnorodne i krytyczne składniki komórkowe, regiony o niskim pO2 (niedotlenienie), rozległe unaczynienie, złożone matryce zewnątrzkomórkowe oraz sieci cytokin i czynników wzrostu, z których wszystkie przyczyniają się do nowotworu MM 4. W związku z tym opracowanie rozproszonego modelu ksenoprzeszczepu szpiczaka szpiczałkowego charakteryzującego się guzami, które są ściśle wszczepione w BM, byłoby bardzo potężnym i klinicznie istotnym narzędziem do badania patologii szpiczaka szpiczakanego mnogiego in vivo5,6. Jednak liczne przeszkody techniczne mogą ograniczać skuteczność większości modeli ksenoprzeszczepów, co sprawia, że są one kosztowne i trudne do zastosowania. Obejmuje to problemy związane ze spójnym i powtarzalnym wszczepianiem guza w niszy BM, wydłużony czas do rozwoju guza oraz ograniczenia w możliwości bezpośredniego obserwowania i mierzenia zmian wzrostu/przeżycia guza bez konieczności poświęcania myszy w trakcie eksperymentu7,8.

Ten protokół wykorzystuje zmodyfikowany model ksenoprzeszczepu, który został początkowo opracowany przez Miyakawę i wsp.9, w którym dożylne (IV) prowokowanie komórkami szpiczaka skutkuje "rozsianymi" nowotworami, które konsekwentnie i powtarzalnie wszczepiają się w BM myszy NOD/SCID/IL-2γ(null) (NOG)10. Wizualizacja tych guzów in situ jest osiągana poprzez stabilną transfekcję ludzkiej linii komórkowej 8226 MM z allelem LUC i seryjny pomiar zmian w BLI wytwarzanym przez te wszczepione komórki nowotworowe6. Co ważne, model ten można rozszerzyć w celu wykorzystania różnych innych linii ludzkich komórek MM wykazujących ekspresję LUC (np. U266 i OPM2) o podobnej skłonności do specyficznego wszczepiania się w szkielecie myszy NOG. Po identyfikacji nowotworów za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego myszy następuje pomiar wychwytu sond radiofarmaceutycznych (takich jak 18F-FDG) za pomocą PET/CT. Razem pozwala to na dodatkową charakterystykę krytycznych szlaków biochemicznych (tj. zmian w metabolizmie, zmian w hipoksji i indukcji apoptozy) w mikrośrodowisku guza/BM. Główne zalety tego modelu można podkreślić poprzez dostępność szerokiej gamy znakowanych radioizotopowo, bioluminescencyjnych i fluorescencyjnych sond i markerów, które można wykorzystać do badania progresji i patologii MM in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury opisane poniżej na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) systemu opieki zdrowotnej VA w Los Angeles i były wykonywane w sterylnych i wolnych od patogenów warunkach.

1. Przygotowanie komórek 8226 wykazujących ekspresję lucyferazy (8226-LUC)

  1. Utrzymuj ludzką linię komórkową MM, 8226, w pożywce RPMI-1640 uzupełnionej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 95% powietrza i 5% dwutlenku węgla (CO2).
  2. Wygeneruj stabilne komórki reporterowe 8226 z ekspresją LUC przez transfekcję 1 x 106 komórek 8226 wektorem reporterowym lucyferazy, a następnie selekcją za pomocą higromycyny (100 - 350 mg / ml), jak opisano wcześniej6.
  3. Utrzymuj komórki w standardowych sterylnych warunkach hodowli przez 2 - 3 tygodnie, zmieniając pożywkę co drugi dzień, aż do wytworzenia stabilnie transfekowanej linii komórkowej 8226.
  4. Potwierdź aktywność lucyferazy in vitro w 1 x 106 transfekowanych komórkach / 100 μL soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), dodając substrat lucyferazy, D-lucyferynę (150 μg / ml roztworu roboczego we wstępnie podgrzanej pożywce hodowlanej) i mierząc bioluminescencję komórek w probówce lub 96-dołkowej płytce za pomocą luminometru6.

2. Ortotopowy model ksenoprzeszczepu

  1. Trzymaj myszy NOG (w wieku 4-6 tygodni, samce lub samice) w sterylnych/wolnych od patogenów warunkach w odpowiedniej placówce opieki nad zwierzętami.
  2. Przygotuj 8226 komórek transfekowanych LUC do wstrzyknięcia dożylnego myszom NOG (~5 x 106 komórek / mysz) w dniu eksperymentu. Umyj komórki 3x w lodowatym PBS, policz je i ponownie zawieś w lodowatym PBS (bez antybiotyków i FBS) w końcowym stężeniu 5 x 106 komórek/200 μL PBS) w sterylnej probówce. Trzymaj komórki na lodzie i rzuć wyzwanie myszom tak szybko, jak to możliwe (w ciągu 30 - 120 minut).
  3. Znieczulić mysz (izofluranem, 1% - 3% w powietrzu w tempie 0,5 - 1 l/min) i ułożyć zwierzę w pozycji leżącej na poduszce grzewczej z głową skierowaną na zewnątrz. Sprawdź poziom znieczulenia, szczypiąc palec u nogi. Nałóż maść okulistyczną na oczy.
  4. Wstrzyknąć komórki 8226-LUC myszom przez żyłę ogonową (200 μl/wstrzyknięcie) za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml i igły 26-G.
    Uwaga: Lampa grzewcza może być używana do ogrzewania ogona, rozszerzając w ten sposób żyłę i zwiększając skuteczność zastrzyków.
  5. Zwróć zwierzę do jego klatki domowej i monitoruj je, aż w pełni wyzdrowieją.
  6. Potwierdź wszczepienie komórek 8226-LUC do szkieletu myszy, mierząc BLI u znieczulonych myszy (opisanych poniżej i pokazanych w Rysunek 1A).
    Uwaga: Wysięki BM mogą być również barwione pod kątem ekspresji ludzkiego CD45 za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 1B) lub za pomocą immunohistochemii pobranej kości (Figura 1C).

3. Pomiar BLI In Vivo

Uwaga: Zazwyczaj, mierzalne BLI z wszczepionych guzów u myszy można zaobserwować po raz pierwszy między 10 - 20 dniem po prowokacji, ale może to wymagać eksperymentalnego ustalenia.

  1. Znieczulić mysz (izofluranem, 1% - 3% w powietrzu w tempie 0,5 - 1 l/min) i sprawdzić poziom znieczulenia, szczypiąc palec u nogi. Nałóż maść okulistyczną na oczy.
  2. Podać zwierzęciu wstrzyknięcie IP (200 μl/wstrzyknięcie) substratu D-lucyferyny "in vivo" (30 mg/ml rozcieńczonego w sterylnym roztworze soli fizjologicznej).
  3. Zmierz BLI w ciągu 5 - 10 minut, po wstrzyknięciu substratu lucyferyny (chociaż aktywność BLI można obserwować u myszy do 45 - 60 minut), umieszczając znieczulone zwierzę w pozycji leżącej w systemie obrazowania małych zwierząt (Rysunek 2). Wybierz analizę luminescencyjną i rentgenowską i uzyskaj obrazy (Rysunek 3).
    1. Zmierz średnie promieniowanie (fotony/s/cm2/steradian) w wybranych obszarach zainteresowania (ROI) za pomocą oprogramowania do obrazowania (Rysunek 4).
    2. Umieść zwierzę z powrotem w klatce domowej i monitoruj je, aż w pełni wyzdrowieje (około 15 - 20 minut).

4. Leczenie myszy terapią celowaną

  1. Zmierz wyjściowy BLI i losowo podziel zwierzęta na grupy poddane działaniu substancji (4 - 8 myszy/grupę).
  2. Leczenie myszy polegało na wstrzyknięciu IP (200 μl/wstrzyknięcie) temsyrolimusu (0,2 - 40 mg/kg myszy), stosując schemat pięciu codziennych wstrzyknięć IP, po których następują 2 dni odpoczynku i dodatkowe pięć codziennych wstrzyknięć11.
  3. Zmierz aktywność lucyferazy (fotony/s/cm2/steradian) 2 razy w tygodniu, jak opisano w sekcji 3 i wykreśl zmianę BLI w czasie. Zmiany w BLI guza można przedstawić jako seryjne obrazy myszy (Ryc. 5B).
    Uwaga: Zaleca się codzienne monitorowanie zwierząt do momentu, gdy wystąpią u nich następujące objawy (zazwyczaj w ciągu 45 - 60 dni od początkowego wyzwania): utrata masy ciała (utrata masy ciała o więcej niż 10% w stosunku do masy ciała przed implantacją) i/lub paraliż kończyn tylnych, w którym to czasie powinny zostać poddane eutanazji przy użyciu komory CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy.

5. Analiza PET/CT z użyciem 18F-FDG do pomiaru zmian w metabolizmie guza

  1. Pościć zwierzęta w ich klatce domowej, usuwając im pokarm na 24 godziny przed eksperymentem, aby uniknąć nadmiernego nieswoistego wychwytu 18F-FDG.
  2. Przygotować 18sond PET FDG znakowanych radioizotopem F (50 - 100 μCi/wstrzyknięcie w sterylnym roztworze soli fizjologicznej) w dniu eksperymentu. Rejestruj czas i aktywność sondy 18F-FDG za pomocą kalibratora dawki.
    Uwaga: Ponieważ 18F ma stosunkowo krótki okres półtrwania (~2 h), należy starannie przygotować i zaplanować użycie tych sond.
  3. Znieczulić zwierzę (izofluranem, 1% - 3% w powietrzu w tempie 0,5 - 1 l/min) i umieścić je w pozycji leżącej na poduszce grzewczej z głową skierowaną na zewnątrz. Sprawdź poziom znieczulenia, szczypiąc palec u nogi. Nałóż maść okulistyczną na oczy.
  4. Wstrzyknąć sondę przez żyłę ogonową (100 μl/wstrzyknięcie) za pomocą osłoniętej strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml i igły 26 G.
    Uwaga: Lampa grzewcza może być używana do ogrzewania ogona, rozszerzając w ten sposób żyłę i zwiększając skuteczność zastrzyków.
  5. Zmierzyć radioaktywność resztkową w igle/strzykawce w kalibratorze dawki i zanotować aktywność oraz czas.
    Uwaga: Standaryzacja inkubacji, dawkowania i czasu inkubacji myszy jest niezbędna do zapewnienia odtwarzalności i porównywalności danych.
  6. Utrzymuj myszy w znieczuleniu i w temperaturze 37 °C za pomocą poduszki grzewczej przez cały okres pobierania sondy (~ 45 - 90 min).
    Uwaga: Ważne jest, aby myszy pozostawały w stanie spoczynku i w temperaturze 37 °C, aby uniknąć niespecyficznego pobrania sondy.
  7. Wstrzykiwanie sondy 18F-FDG należy rozłożyć w czasie w odstępach około 20 do 30 minut, aby zapewnić podobny czas znakowania u myszy.
    Uwaga: Prawidłowy przebieg pracy i czas wstrzykiwania sondy spowodują optymalne i powtarzalne warunki obrazowania.
  8. Zmierz aktywność 18F-FDG w systemie obrazowania małych zwierząt PET/CT w wybranych regionach zainteresowania, które odpowiadają wszczepionym guzom (Rysunek 6).
    Uwaga: Początkowo zalecana jest 10-minutowa statyczna ekspozycja PET i 2-minutowa ekspozycja na CT, ale dokładne czasy ekspozycji mogą wymagać eksperymentalnego określenia.
  9. Zwróć zwierzęta do ich domowych klatek i monitoruj je, aż w pełni wyzdrowieją. Umieść myszy w dedykowanym pomieszczeniu zwrotnym przez 24 godziny, podczas gdy sonda rozpada się do poziomu tła.
    Uwaga: Ze względu na krótki okres półtrwania wynoszący 18F, wielokrotne pomiary przy użyciu nowej sondy można wykonywać nawet 2 razy w tygodniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W początkowych badaniach pilotażowych, dożylne wstrzyknięcia komórek 8226-LUC myszom NOD/SCID nie przyniosły guzów MM wszczepionych BM, chociaż płaskonabłonkowe guzy MM łatwo się tworzyły (100% skuteczności). W przeciwieństwie do tego, prowokacje dożylne z 8226 komórkami u myszy NOG generowały (w ciągu 15 - 25 dni) guzy w szkielecie (i tylko rzadko tworzyły guzy w tkance nieszkieletowej, takiej jak wątroba lub śledziona). Ponieważ guzy w szkielecie nie mogły być wizualnie potwierdzone prz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo różnorodności przedklinicznych modeli ksenoprzeszczepów MM 6,9,11,12,13, możliwość badania interakcji guza/BM w mikrośrodowisku BM pozostaje trudna14. Opisane tutaj techniki pozwalają na szybkie i powtarzalne wszczepienie komórek nowotworowych 8226-LUC w szkielecie myszy NOG.

Kluczowe kroki w tym proto...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor Kevin Francis jest pracownikiem firmy Perkin-Elmer.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wsparta grantem VA MERIT1I01BX001532 od Departamentu Stanów Zjednoczonych ds. Weteranów Biomedical Laboratory Research and Development Service (BLRDS) dla P.F., a E.C. dziękuje za wsparcie od VA Clinical Science R&D Service (Merit Award I01CX001388) oraz VA Rehabilitation R&D Service (Merit Award I01RX002604). Dalsze wsparcie pochodziło z grantu zalążkowego UCLA dla J.K. Treści te niekoniecznie reprezentują poglądy Departamentu ds. Weteranów Stanów Zjednoczonych lub rządu Stanów Zjednoczonych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
8226 ludzka linia komórkowa szpiczakaATCCCCL-155
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Myszy (NOG)Jackson Labs5557
VivoGlo Substrate LucyferinPromegaP1041
Hypoxyprobe-1KitHPLHP1-100
PE-CD45 (klon H130)BD Biosciences555483Używany do cytometrii przepływowej w celu identyfikacji ludzkich komórek nowotworowych CD45 + w wysięku królika BM
anty-ludzkiego CD45 (klon D3F8Q)Sygnalizacja komórkowa Technologia70527Przeciwciało pierwszorzędowe stosowane w immunohistochemii wyciętej kości
Kozia IgG anty-królicza (sprzężona HRP)ABCAMab205718Przeciwciało seconday stosowane do immunohistochemii wyciętej kości
System testów reporterowych z podwójną lucyferazyąPromegaE1910
pGL4.5 Lucyferazy Reporter VectorPromegaE1310
IVIS Lumina XRMS In System obrazowania VivoPerkin Elmer
System obrazowania PET/CT Sofie G8Perkin Elmer

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raab, M. S., Podar, K., Breitkreutz, I., Richardson, P. G., Anderson, K. C. Multiple Myeloma. The Lancet. 374 (9686), 324-339 (2009).
  2. Galson, D. L., Silbermann, R., Roodman, G. D. Mechanisms of Multiple Myeloma Bone Disease. BoneKEy Reports. 1, 135(2012).
  3. Anderson, K. C., Carrasco, R. D. Pathogenesis of Myeloma. Annual Review of Pathology. 6, 249-274 (2011).
  4. Reagan, M. R., Rosen, C. J. Navigating the Bone Marrow Niche: Translational Insights and Cancer-Driven Dysfunction. Nature Reviews Rheumatology. 12 (3), 154-168 (2016).
  5. Frost, P., et al. Mammalian Target of Rapamycin Inhibitors Induce Tumor Cell Apoptosis in Vivo Primarily by Inhibiting Vegf Expression and Angiogenesis. Journal of Oncology. 2013, 897025(2013).
  6. Mysore, V. S., Szablowski, J., Dervan, P. B., Frost, P. J. A DNA-Binding Molecule Targeting the Adaptive Hypoxic Response in Multiple Myeloma Has Potent Antitumor Activity. Molecular Cancer Research. 14 (3), 253-266 (2016).
  7. Podar, K., Chauhan, D., Anderson, K. C. Bone Marrow Microenvironment and the Identification of New Targets for Myeloma Therapy. Leukemia. 23 (1), 10-24 (2009).
  8. Campbell, R. A., et al. Laglambda-1: A Clinically Relevant Drug Resistant Human Multiple Myeloma Tumor Murine Model That Enables Rapid Evaluation of Treatments for Multiple Myeloma. International Journal of Oncology. 28 (6), 1409-1417 (2006).
  9. Miyakawa, Y., et al. Establishment of a New Model of Human Multiple Myeloma Using Nod/Scid/Gammac(Null) (Nog) Mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (2), 258-262 (2004).
  10. Ito, M., et al. Nod/Scid/Gamma(C)(Null) Mouse: An Excellent Recipient Mouse Model for Engraftment of Human Cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  11. Frost, P., et al. In Vivo Antitumor Effects of the Mtor Inhibitor Cci-779 against Human Multiple Myeloma Cells in a Xenograft Model. Blood. 104 (13), 4181-4187 (2004).
  12. Asosingh, K., et al. Role of the Hypoxic Bone Marrow Microenvironment in 5t2mm Murine Myeloma Tumor Progression. Haematologica. 90 (6), 810-817 (2005).
  13. Storti, P., et al. Hypoxia-Inducible Factor (Hif)-1alpha Suppression in Myeloma Cells Blocks Tumoral Growth in Vivo Inhibiting Angiogenesis and Bone Destruction. Leukemia. 27 (8), 1697-1706 (2013).
  14. Fryer, R. A., et al. Characterization of a Novel Mouse Model of Multiple Myeloma and Its Use in Preclinical Therapeutic Assessment. PLoS One. 8 (2), e57641(2013).
  15. Gould, S. J., Subramani, S. Firefly Luciferase as a Tool in Molecular and Cell Biology. Analytical Biochemistry. 175 (1), 5-13 (1988).
  16. Czernin, J., Phelps, M. E. Positron Emission Tomography Scanning: Current and Future Applications. Annual Review Medicine. 53, 89-112 (2002).
  17. Pandey, M. K., Bhattacharyya, F., Belanger, A. P., Wang, S. Y., DeGrado, T. R. Pet Imaging of Fatty Acid Oxidation and Glucose Uptake in Heart and Skeletal Muscle of Rats: Effects of Cpt-1 Inhibition. Circulation. 122 (21), (2010).
  18. Wang, M. W., et al. An in Vivo Molecular Imaging Probe (18)F-Annexin B1 for Apoptosis Detection by Pet/Ct: Preparation and Preliminary Evaluation. Apoptosis. 18 (2), 238-247 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

obrazowanie bioluminescencyjneobrazowanie PET CTmodel ksenoprzeszczepuleczenie temsirolimusemsubstrat D lucyferynasonda 18F FDGobrazowanie ma ych zwierz t

Powiązane artykuły