Artykuł metodologiczny

Identyfikacja feromonów minoga morskiego za pomocą frakcjonowania pod kontrolą testów biologicznych

8.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58059

⸱

17 lipca 2018

 ,  , 
1Department of Fisheries and Wildlife, Michigan State University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do izolacji i charakterystyki struktury, siły węchowej i reakcji behawioralnej domniemanych związków feromonów minogów morskich.

Streszczenie

Frakcjonowanie sterowane testami biologicznymi to iteracyjne podejście, które wykorzystuje wyniki fizjologicznych i behawioralnych testów biologicznych do kierowania izolacją i identyfikacją aktywnego związku feromonowego. Metoda ta doprowadziła do pomyślnego scharakteryzowania sygnałów chemicznych, które funkcjonują jako feromony u wielu gatunków zwierząt. Minogi morskie polegają na węchu do wykrywania feromonów, które pośredniczą w reakcjach behawioralnych lub fizjologicznych. Wykorzystujemy tę wiedzę z zakresu biologii ryb, aby określić funkcje przypuszczalnych feromonów oraz pokierować izolacją i identyfikacją aktywnych składników feromonów. Chromatografia służy do ekstrakcji, zagęszczania i oddzielania związków od kondycjonowanej wody. Zapisy elektroolfaktogramu (EOG) są przeprowadzane w celu określenia, które frakcje wywołują reakcje węchowe. Następnie stosuje się testy behawioralne labiryntu dwuwyboru, aby określić, czy którakolwiek z frakcji zapachowych jest również aktywna behawioralnie i wywołuje preferencje. Metody spektrometryczne i spektroskopowe dostarczają informacji o masie cząsteczkowej i strukturze, które pomagają w wyjaśnieniu struktury. Bioaktywność czystych związków jest potwierdzona za pomocą EOG i testów behawioralnych. Reakcje behawioralne zaobserwowane w labiryncie powinny ostatecznie zostać zweryfikowane w warunkach terenowych, aby potwierdzić ich funkcję w naturalnym otoczeniu strumienia. Te testy biologiczne odgrywają podwójną rolę: 1) kierują procesem frakcjonowania oraz 2) potwierdzają i dalej definiują bioaktywność wyizolowanych składników. W tym miejscu przedstawiamy reprezentatywne wyniki identyfikacji feromonów minoga morskiego, które ilustrują użyteczność podejścia do frakcjonowania sterowanego testami biologicznymi. Identyfikacja feromonów minoga morskiego jest szczególnie ważna, ponieważ modulacja systemu komunikacji feromonów jest jedną z rozważanych opcji zwalczania inwazyjnego minoga morskiego w Wielkich Jeziorach Laurentyńskich. Metodę tę można łatwo zaadaptować do scharakteryzowania komunikacji chemicznej w szerokim zakresie taksonów i rzucić światło na chemiczną ekologię przenoszoną przez wodę.

Wprowadzenie

Feromony to specyficzne sygnały chemiczne uwalniane przez jednostki, które pomagają im w lokalizowaniu źródeł pożywienia, wykrywaniu drapieżników i pośredniczeniu w interakcjach społecznych przedstawicieli tego samego gatunku1. Komunikacja feromonów u owadów została dobrze zbadana2; Jednak identyfikacja chemiczna i funkcja biologiczna feromonów kręgowców wodnych nie zostały tak szeroko zbadane. Wiedza na temat tożsamości i funkcji uwolnionych feromonów może być wykorzystana do ułatwienia odbudowy zagrożonych gatunków3,4 lub zwalczać gatunki szkodników5,6. Zastosowanie tych technik wymaga wyizolowania i scharakteryzowania bioaktywnych składników feromonów.

Identyfikacja feromonów to dziedzina chemii produktów naturalnych. Postęp w badaniach nad feromonami został częściowo ograniczony ze względu na charakter samych cząsteczek feromonów. Feromony są często niestabilne i uwalniane w małych ilościach, a istnieje tylko kilka technik pobierania próbek, które pozwalają wykryć niewielkie ilości substancji lotnych7,8 lub związków rozpuszczalnych w wodzie9. Podejścia do identyfikacji feromonów obejmują: 1) ukierunkowane badania przesiewowe znanych związków, 2) metabolomikę oraz 3) frakcjonowanie sterowane testami biologicznymi. Ukierunkowane badania przesiewowe znanych związków testują dostępne na rynku metaboliczne produkty uboczne procesów fizjologicznych, co do których przypuszcza się, że działają jako feromony. Takie podejście jest ograniczające, ponieważ naukowcy mogą testować tylko znane i dostępne związki. Udało się jednak zidentyfikować hormony płciowe u złotych rybek, które działają jak feromony10,11,12. Metabolomika to drugie podejście do identyfikacji feromonów, które rozróżnia potencjalne małocząsteczkowe produkty przemiany materii w systemie biologicznym13. Porównanie profili metabolicznych dwóch grup (tj. ekstraktu aktywnego i nieaktywnego) umożliwia identyfikację potencjalnego profilu metabolicznego, z którego metabolit jest oczyszczany, struktura jest wyjaśniana, a bioaktywność potwierdzana14. Addytywne lub synergistyczne efekty złożonych preparatów określonych mieszanin są bardziej prawdopodobne do wykrycia za pomocą metabolomiki, ponieważ metabolity są rozpatrywane razem, a nie jako seria frakcji13. Implementacja metabolomiki opiera się jednak na dostępności syntetycznych odniesień, ponieważ uzyskane dane nie ułatwiają wyjaśnienia nowych struktur.

Frakcjonowanie sterowane testami biologicznymi to zintegrowane, iteracyjne podejście, które obejmuje dwie dziedziny: chemię i biologię. Podejście to wykorzystuje wyniki fizjologicznych i behawioralnych testów biologicznych do kierowania izolacją i identyfikacją aktywnego związku feromonowego. Surowy ekstrakt jest frakcjonowany pod względem właściwości chemicznych (tj. wielkości cząsteczki, polarności itp.) i badany za pomocą zapisów elektroolfaktogramu (EOG) i/lub w teście biologicznym. Składniki bioaktywne są odsiewane poprzez powtórzenie tych etapów frakcjonowania i EOG i/lub testów biologicznych. Struktury czystych związków aktywnych są wyjaśniane metodami spektrometrycznymi i spektroskopowymi, które dostarczają informacji o masie cząsteczkowej i strukturze w celu wytworzenia matrycy związku, który ma być zsyntetyzowany. Frakcjonowanie sterowane testami biologicznymi może dać różnorodne metabolity i potencjalnie nowe feromony o unikalnych szkieletach chemicznych, których prawdopodobnie nie można przewidzieć na podstawie szlaków biosyntezy.

Tutaj opisujemy protokół frakcjonowania sterowany testami biologicznymi, używany do izolowania i charakteryzowania bioaktywności związków feromonów płciowych samca minoga morskiego. Minóg morski (Petromyzon marinus) jest idealnym modelem kręgowców do badania komunikacji feromonów, ponieważ ryby te w dużym stopniu polegają na wykrywaniu węchowym sygnałów chemicznych, które pośredniczą w ich anadromicznej historii życia składającej się z trzech odrębnych etapów: larw, młodocianych i dorosłych. Larwy minoga morskiego zakopują się w osadach strumieni słodkowodnych, przechodzą drastyczną metamorfozę i przekształcają się w młode osobniki, które migrują do jeziora lub oceanu, gdzie pasożytują na dużych rybach żywicielskich. Po odłączeniu się od ryby-żywiciela dorosłe osobniki migrują z powrotem do strumieni tarłowych, kierując się feromonami wędrownymi uwalnianymi przez larwy zamieszkujące strumienie15,16,17,18,19. Dojrzałe samce wznoszą się na tarliska, uwalniają wieloskładnikowy feromon płciowy, aby zwabić partnerów, z przerwami odbywają tarło przez około tydzień, a następnie umierają15,20. Identyfikacja feromonów minoga morskiego jest ważna, ponieważ modulacja systemu komunikacji feromonów jest jedną z rozważanych opcji kontroli inwazyjnych minogów morskich w Wielkich Jeziorach Laurentyńskich21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Instytucji Uniwersytetu Stanowego Michigan (AUF# 03/14-054-00 i 02/17-031-00).

1. Zbieranie i ekstrakcja wody kondycjonowanej przez minoga morskiego

  1. Umieść dojrzałe płciowo samce minoga piżmowego (15–30 osobników) w zbiorniku z 250 L natlenionej wody z jeziora Huron utrzymywanej w temperaturze 16–18 °C °C.
  2. Zbieraj wodę nasycaną feromonami samców każdej nocy od czerwca do lipca.
    Uwaga: Minogi morskie naturalnie giną po tarle. Jeśli ryba zbliża się do tego etapu życia, zastąp ją świeżym dojrzałym samcem.
  3. Wyizoluj wodę układową metodą ekstrakcji do fazy stałej.
    1. Namocz żywicę w metanolu przez 4 h przed załadowaniem na kolumnę. Załaduj żywicę na kolumnę, a następnie przepompuj 10 L wody przez kolumnę, aby usunąć rozpuszczalnik organiczny.
    2. Przepuść przetworzoną wodę z zbiornika z rybami poprzez układ pompowy do góry kolumny. Woda przepływa przez warstwę 2 kg umiarkowanie polarnego polimerowego żywicy jonowymiennej (np.., żywica Amberlite XAD-7 HP), zawartej w serii czterech szklanych kolumn o pojemności 2,5 L. Utrzymuj prędkość ładowania w zakresie od 400 do 600 mL/6 min. Wyeluj metabolity za pomocą 10 L metanolu, a następnie bezpośrednio 5 L acetonu.
      UWAGA: W tym kroku stosowane są metanol i aceton. Oba związki są łatwopalne i toksyczne.
      Uwaga: Zebrany pozostały materiał można przechowywać w temperaturze -80 °C do dalszego przetwarzania.
  4. Odtwórz kolumnę po 1 tygodniu wzbogacania, przemywając ją wodą (około 10 L).
  5. Usuń rozpuszczalnik organiczny (mieszaninę metanolu i wody) i pozyskaj ekstrakt poprzez odparowanie obrotowe przez 5 godzin w zmniejszonym ciśnieniu (poniżej 300 mbar) przy 40 °C. Skoncentrować pozostałość wodną metodą liofilizacji w suszarce zamrażalniczej przez 48 h w temperaturze -20 °C aż do wyschnięcia.

2. Izolacja frakcji metodą chromatograficzną

  1. Zalej żel krzemionkowy (230–400 mesh) początkowym fazą ruchomą i pozostaw na 30 minut. Przenieś żel wraz z rozpuszczalnikiem (zawiesinę) na kolumnę szklaną. Otwórz zawór kolumny, aby umożliwić przepływ fazy ruchomej. Pozwól, aby żel krzemionkowy osiadł i utworzył warstwę żelu.
  2. Gruntownie wymieszaj ekstrakty z żelem krzemionkowym (70–230 mesh) i załaduj je na kolumnę chromatografii cieczowej nad warstwę żelu krzemionkowego. Eluuj za pomocą gradientu od 95% CHCl3 (chloroform)/MeOH (metanol) do 100% MeOH, łącznie 2,5 L. Zbieraj eluat w oddzielne fiolki (po 10 ml każda).
    OSTRZEŻENIE: Chloroform używany w tym kroku jest trucizną.
  3. Przeprowadź łączenie eluatów w 20 frakcji na podstawie analizy chromatografii cienstwarstwowej (TLC).
    1. Wykonaj badanie TLC na płytach pokrytych warstwą żelu krzemionkowego, nanosząc próbkę na linię startową i zanurzając ją w rozwijających rozpuszczalnikach (dobierz polarność, dobierając stosunek CHCl3 do metanolu od 100–0%) w zamkniętym szklanym zbiorniku.
    2. Dobierz stosunek rozpuszczalnika rozwijającego tak, aby wszystkie plamki na TLC miały współczynnik retencji (Rf) w zakresie 0,3–0,8.
    3. Po osiągnięciu przez rozpuszczalnik linii końcowej wyjmij płytę z zbiornika i pozostaw na 10 minut, aby rozpuszczalnik odparował.
    4. Wykryj plamki najpierw pod światłem UV o długości fali 254 nm, a następnie wybarwiaj przez opryskanie kwasowym roztworem metanolowym 5% anizaldehydu (20 μL) za pomocą opryskiwacza chromatograficznego i ogrzewaj przez 3 minuty w temperaturze 85 °C.
      Uwaga: Kolorowe plamki na płytce TLC wskazują główny składnik frakcji.
    5. Połącz eluaty w 20 frakcji na podstawie koloru plamek oraz podobieństwa wartości Rf głównego składnika.
  4. Skoncentruj frakcję do sucha za pomocą odparowania obrotowego pod zmniejszonym ciśnieniem (300 mbar, zgodnie z właściwościami rozpuszczalników) w temperaturze 40 °C przez około 30 minut.

3. Rejestracja elektro-olfaktogramu (EOG) w celu identyfikacji frakcji/zwiazków zapachowych

  1. Wyciągnij kapilary ze szkła borokrzemowego (średnica zewnętrzna: 1,5 mm; średnica wewnętrzna: 0,86 mm; długość: 100 mm) za pomocą wyciągarki mikropipet z ustawieniem grzałki na poziomie 65.
  2. Naciśnij i przetnij otwór na końcówce kapilary za pomocą szklanego nożyka z diamentowym ostrzem i wypełnij ją stopionym 0,4% agarem w 0,9% roztworze soli fizjologicznej. Otwór na końcówce kapilary powinien mieć średnicę około 10 µm w średnicy.
  3. Wypełnij pociągnięte elektrody kapilarne z kroków 3.1–3.2 oraz uchwyty do elektrod stałofazowych wstępnie wyprodukowane z peletami Ag/AgCl (zobacz Spis materiałów) za pomocą pipety mikrolitrowej z 3 M KCl.
    Uwaga: Usuń wszelkie pęcherzyki powietrza z kapilary lub uchwytu elektrody.
  4. Włóż pobrane elektrody do uchwytów na elektrody.
  5. Przygotuj 100 mL roztworu 10-5 M L-argininy w wodzie odfiltrowanej przez węgiel aktywny z 10-2 Roztwór zapasowy L-argininy o stężeniu M w wodzie dejonizowanej (przechowywać w temperaturze 4 °C) w kolbie miarowej. Przenieś 20 mL roztworu 10-5 M L-argininy do fiolki szklanej.
  6. W celu uzyskania krzywej zależności stężenie-odpowiedź, przygotuj 10 mL 10-krotnych rozcieńczeń pul frakcji z kroku 2.3 w fiolkach szklanych. Przygotowuj świeże rozcieńczenia codziennie przed rozpoczęciem eksperymentów i używaj ich w ciągu jednego dnia. Umieść fiolki szklane zawierające roztwory robocze L-argininy oraz rozcieńczone pule frakcji w łaźni wodnej z cyrkulacją, aby umożliwić wyrównanie temperatury 8 °C.
  7. Znieczul lamparta za pomocą estru etylowego kwasu 3-aminobenzoesowego (MS222; 100 mg/L) i unieruchomij poprzez wstrzyknięcie wewnątrzmięśniowe galaminu trietylodku (3 mg/kg masy ciała, w roztworze soli fizjologicznej 0,9%) przy użyciu sterylnego strzykawki.
    Uwaga: O odpowiedniej głębokości narkozy świadczy brak ruchu skrzelnego, niemożność utrzymania pionowej postawy oraz brak przyssania się do ścian zbiornika za pomocą dysku ustnego. Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia mikrobiologicznego przed i podczas zabiegu chirurgicznego, należy nosić sterylną rękawiczkę i zanurzyć narzędzia do sekcji w 70% etanolu (v:v) w wodzie dejonizowanej na co najmniej 10 minut przed użyciem.
  8. Ułóż uśpionego minoga na stojaku w kształcie litery V i owiń wilgotną ściereczką papierową, aby zapobiec wysychaniu.
    Uwaga: Nie zatykaj otworów skrzelowych.
  9. Wprowadź rurkę z cyrkulującą, natlenioną wodą zawierającą 50 mg/L MS222 do jamy bukalnej, dostosuj przepływ i upewnij się, że woda wypływa poprzez otwory skrzelowe w celu ciągłego nawadniania skrzeli.
  10. Użyj sterylnej skalpelki i pęsety [pod mikroskopem stereoskopowym w powiększeniu 1,25X (zobacz Spis materiałów)] w celu usunięcia 5 mm2 przekrój skóry na powierzchni torebki węchowej w celu odsłonięcia nabłonka węchowego.
  11. Wypłucz rurkę do podawania substancji zapachowych wodą filtrowaną i podłącz ją do zaworu zamocowanego na mikromanipulatorze. Umieść kapilarę do podawania substancji zapachowych w jamie nabłonka węchowego za pomocą mikromanipulatora, aby dostarczać wodę filtrowaną do nabłonka węchowego i zapobiegać jego wysychaniu w czasie, gdy nie są podawane substancje zapachowe.
  12. Umieść elektrody rejestracyjną i odniesienia na mikromanipulatorach. Opuść elektrodę odniesienia na zewnętrzną skórę w pobliżu nozdrza. Przy użyciu mikroskopu stereoskopowego (1,25X) opuść elektrodę rejestracyjną tak, aby ledwo dotykała powierzchni nabłonka węchowego.
  13. Przenieś wlot rury dostarczającej substancję zapachową z filtrowanej wody tła do 10-5 roztwór L-argininy o stężeniu M
  14. Włącz komputer, wzmacniacz (ustawiony w tryb DC), filtr i cyfrowy rejestrator. Za pomocą oprogramowania sterownika zaworu zaprogramuj procedurę podawania jednopulsowego sygnału zapachowego o czasie trwania 4 s, zaznaczając pole T1, ustawiając T na 4 s oraz zaznaczając pole T2.
  15. W oprogramowaniu do pozyskiwania danych (patrz Spis materiałów), ustaw tryb akwizycji na szybki oscyloskop, kliknij ikonę odtwarzania, a następnie kliknij Rozpocznij w sterowniku zaworu, aby wyzwolić impuls zapachu.
    Uwaga: Oprogramowanie do akwizycji danych automatycznie rejestruje amplitudę różnicowej odpowiedzi EOG przez 20 s (3 s przed, 4 s podczas impulsu czynnika zapachowego i 13 s po nim). Użyj mikromanipulatora, aby dostosować położenia elektrody rejestrującej, elektrody odniesienia lub rurki do podawania czynnika zapachowego w celu zwiększenia stosunku sygnału do szumu, uzyskując maksymalną odpowiedź na standard L-argininy i minimalną odpowiedź na blank (wodę filtrowaną). Uziemij wzmacniacz, przełączając przełącznik wzmacniacza prądu przemiennego/stałą na GND podczas przesuwania elektrod.
  16. Rozpocznij rejestrowanie próby kontrolnej (blank), L-argininy, a następnie substancji zapachowych przygotowanych w kroku 3.6, w kolejności od niskich do wysokich stężeń, z przepłukaniem wodą filtrowaną co 2 minuty między aplikacjami.
  17. Po zarejestrowaniu odpowiedzi na wszystkie testowane substancje zapachowe, uziemić wzmacniacz i ostrożnie wycofać elektrody oraz kapilarę do podawania substancji zapachowych. Zgodnie z zatwierdzonymi metodami Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania w Instytucji (IACUC), na zakończenie eksperymentu EOG, uśmiercić uśpionego minoga nadmiarem MS222 (1 g/L).
    Uwaga: Potwierdź skuteczne eutanazję poprzez stwierdzenie braku ruchów skrzelowych i akcji serca przez co najmniej 5 minut, a następnie przeprowadź punkcję mózgu.
  18. Przeanalizuj i sporządź wykres danych za pomocą oprogramowania analitycznego. Określ próg wykrywalności odorantów22 aby zidentyfikować frakcje zapachowe, które wywołują odpowiedzi większe niż pusta kontrola wodą. Frakcje, które wywołują zależne od stężenia odpowiedzi węchowe różniące się od pustej kontroli wodą, są następnie testowane w badaniu behawioralnym (krok 4).

4. Dwuwyborowy test behawioralny w labiryncie do identyfikacji frakcji lub związków o aktywności behawioralnej

  1. Przyzwyczaj dojrzałą płciowo samicę minoga morskiego w klatce wyzwalającej umieszczonej w labiryncie (zobacz Rysunek uzupełniający 1) przez 5 min. Utrzymuj stałe natężenie przepływu wody rzecznej w labiryncie.
    Uwaga: Labirynt wykonany jest z politurowanego drewna morskiego i ma 6,5 m długości oraz 1,2 m szerokości, z przegrodą o długości 2,7 m oddzielającą górną część labiryntu na dwa kanały. Wodę tymczasowo odprowadza się do labiryntu. Głębokość wody należy utrzymywać na poziomie 0,19 m, a prędkość przepływu na poziomie 0,07 m/s ± 0,01.
  2. Wypuść minoga morskiego i rejestruj łączny czas spędzony przez niego w kanale doświadczalnym i kontrolnym, obu zawierających wodę rzeczną, przez 10 min.
    Uwaga: Jeśli minóg morski nie wejdzie do kanału doświadczalnego i kontrolnego przez co najmniej 10 s w tym 10-minutowym okresie, zakończ próbę, ponieważ jest to oznaka braku aktywności lub silnego偏u do jednej strony.
  3. Podaj bodziec testowy (tj. przypuszczalny feromon o stężeniu 10-12 M rozpuszczony w 50% metanolu/wodzie dejonizowanej) do losowo wybranego kanału doświadczalnego oraz środek rozpuszczający (50% metanol/woda dejonizowana) do kanału kontrolnego za pomocą pomp perystaltycznych w stałym tempie 200 mL/min przez 5 min.
    Uwaga: Jako początkowe stężenie w teście behawioralnym należy użyć stężenia progowego detekcji bodźca testowego wyznaczonego na podstawie rejestracji elektro-olfaktogramu.
  4. Podawaj bodziec testowy i środek rozpuszczający przez dodatkowe 10 min i rejestruj łączny czas spędzony przez minoga w kanale doświadczalnym i kontrolnym.
  5. Przepłucz labirynt wodą przez 10 min przed rozpoczęciem kolejnej próby. Powtórz kroki 4.1–4.4 z co najmniej 7 minogami, o ile dostępny jest wystarczający zapas bodźca testowego.
  6. Oblicz wskaźnik preferencji22 dla każdej próby i oszacuj istotność statystyczną za pomocą testu Wilcoxona dla rang znakowanych.
    Uwaga: Wskaźnik daje pojedynczą liczbę, która może być dodatnia lub ujemna. Dodatnia wartość wskaźnika preferencji wskazuje na przyciąganie, natomiast ujemna wartość wskazuje na odpychanie. Jeśli wskaźnik preferencji różni się istotnie od zera, frakcja jest uznawana za aktywną.
    figure-protocol-1
    Gdzie:
    Bc = czas spędzony przez testowanego minoga w kanale kontrolnym przed aplikacją zapachu,
    Be = czas spędzony w kanale doświadczalnym przed aplikacją zapachu,
    Ac = czas spędzony w kanale kontrolnym po aplikacji zapachu,
    Ae = czas spędzony w kanale doświadczalnym po aplikacji zapachu.

5. Chromatograficzne wyodrębnienie czystych związków z aktywnych frakcji

  1. Powtórz kroki 2.1–2.4 z frakcjami, które wywołują reakcje węchowe (krok 3) i wywołują reakcje behawioralne (krok 4).
  2. Dalej oczyszczaj aktywne frakcje na związki metodą chromatografii żelowo-permeacyjnej, używając kolumny Sephadex LH-20.
    1. Przygotuj próbkę w 0,5 mL wstępnej fazy ruchomej [CHCl3-MeOH (1:1) lub MeOH 100%], załaduj na odpowiednią kolumnę kolumnę CHCl3-MeOH (1:1), a następnie kolumnę MeOH (100%) i eluuj, aby uzyskać związki.

6. Ustalenie struktury związku czystego za pomocą spektrometrii mas (MS) i rezonansu magnetycznego jądra (NMR)

  1. Rozpuść i rozcieńcz oczyszczoną substancję w początkowej fazie ruchomej (zazwyczaj metanol:woda, 1:1, v:v) chromatografii cieczowej wysokiej wydajności (HPLC), aby otrzymać 10 μL roztworu o stężeniu około 1 μg/mL.
    1. Przenieś roztwór próbki do fiol do HPLC i umieść je w autodolewaczu HPLC. Wstrzyknij próbkę (10 μL) do spektrometrii mas z jonizacją przez rozpylenie elektrostatyczne (ESIMS) i zarejestruj widma wysokorozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją przez rozpylenie elektrostatyczne (HRESIMS) za pomocą chromatografu cieczowego sprzężonego ze spektrometrem mas23.
  2. Przewidziany wzór cząsteczkowy ustal na podstawie bazy danych oprogramowania spektrometru masowego (zobacz Tabelę materiałów)24.
    1. Otwórz chromatogram wstrzykniętej próbki i uzyskaj jej widmo masowe, wybierając szczyt chromatograficzny.
    2. Wprowadź zmierzoną wartość masy na ładunek (m/z) (4 miejsca po przecinku) w sekcji Skład elementarny w module Narzędzia. Ustaw parametr tolerancji na PPM < 5.
    3. Dostosuj parametry symboli, aby odpowiadały składowi elementarnemu badanej cząsteczki. Oprogramowanie generuje przewidywany wzór cząsteczkowy na podstawie analizy pojedynczej masy.
  3. Wybierz rozpuszczalniki deuterowane (600 μL, CH3OH-d4 lub DMSO-d6) zgodnie z protokołem25, aby rozpuścić próbki.
    1. Całkowicie rozpuść próbkę w wybranych rozpuszczalnikach deuterowanych, aby uzyskać roztwór o stężeniu w przybliżeniu od 0,1 do 10 mg/mL. Przenieś roztwór próbki do probówki NMR, aby zarejestrować widma 1D (1H, 13C) i 2D NMR [1H-1H korelacyjna spektroskopia (COSY), heterojądrowa koherentność pojedynczego kwantu (HSQC), heterojądrowa korelacja wielokrotnych wiązań (HMBC)] na spektrometrze NMR o częstotliwości 900 MHz26.
  4. Umieść probówkę NMR z próbką w turbinie wirnika. Użyj miarki głębokości, aby upewnić się, że wysokość próbki znajduje się w środku okna pomiarowego. Otwórz oprogramowanie NMR (zobacz Tabelę materiałów) i kliknij przycisk Podnieś, aby zmienić próbkę w magnesie.
    Uwaga: Przyłóż rękę do góry magnesu, aby poczuć strumień gazu wychodzący z wierzchu magnesu. W tym samym czasie powinien być słyszalny dźwięk gwizdania.
  5. Delikatnie umieść próbkę na poduszce powietrznej na szczycie magnesu i ponownie naciśnij przycisk Podnieś, aby opuścić próbkę do wnętrza magnesu NMR.
    Uwaga: Nasłuchuj charakterystycznego „kliknięcia”, które wskazuje, że próbka znajduje się w odpowiedniej pozycji.
  6. Utwórz nowy zestaw danych i załaduj domyślne parametry zalecane przez instrument NMR (zobacz Tabelę materiałów).
    1. Wpisz „lock”, aby uruchomić automatyczną procedurę blokowania, i wybierz rozpuszczalnik na stronie z monitem.
    2. Aby wykonać dokładne strojenie, w panelu Manipulacja ustaw przycisk w trybie Unlock, dostosuj kursor na panelu manipulacyjnym i ponownie zablokuj magnes.
    3. Na monitującej stronie Atma dostosuj parametr na panelu manipulacyjnym do procedury strojenia, która może potrwać kilka minut. Poczekaj, aż strojenie zostanie zakończone, zanim przejdziesz dalej.
    4. Uruchom automatyczną procedurę wyrównywania pola magnetycznego, wpisując „topshim” w wierszu poleceń. Poczekaj na zakończenie wyrównywania, zanim przejdziesz dalej.
    5. Wpisz „rga”, aby ustawić automatyczne dopasowanie wzmocnienia odbiorczego, następnie wpisz „d1”, aby ustawić opóźnienie między impulsami, a następnie wpisz „zg”, aby rozpocząć akwizycję, i poczekaj, aż zostanie zakończona.
    6. Wpisz „ef” lub „efp”, aby przetworzyć dane, a następnie wpisz „apk” w celu automatycznego fazowania. Przetwórz dane w oprogramowaniu do przetwarzania NMR.
  7. Wyznacz strukturę chemiczną na podstawie interpretacji analizy danych NMR.
  8. Policz sygnały węglowe w widmie 13C NMR. Wybierz pasujący wzór cząsteczkowy z przewidywanego wyniku uzyskanego metodą wysokorozdzielczej spektrometrii mas (HR-MS).
  9. Przeanalizuj całkowanie sygnałów protonowych w widmie 1H NMR i przypisz łączność węgla i protonu na podstawie sygnałów w widmie HSQC.
  10. Przypisz łączność szkieletu węglowego na podstawie korelacji w widmie 1H-1H COSY i HMBC.
  11. Wstępnie przypisz strukturę chemiczną na podstawie uzasadnienia strukturalnego27. Przeszukaj wstępną strukturę w bazach danych struktur chemicznych. Porównaj wstępną strukturę z analogami opisanymi w literaturze.
  12. Przypisz konfigurację względną za pomocą widma spektroskopii efektu Overhausera jądrowego (NOESY).
    Uwaga: Ponieważ właściwości identyfikacyjne enancjomerów w metodach spektrometrycznych i spektroskopowych są identyczne, konfigurację absolutną niektórych związków, szczególnie tych z grupą 2’-OH i 2’-NH2, należy określić za pomocą reakcji pochodzenia. Po reakcji pochodzenia różnice widoczne w widmach ułatwiają jednoznaczne przypisanie konfiguracji absolutnych większości związków28.

7. EOG i testy biologiczne w celu potwierdzenia, że czyste związki są wonne i aktywne behawioralnie

  1. Powtórz kroki 3.1 – 3.5.
  2. Aby przygotować krzywą stężenie-odpowiedź, sporządź 10 mL 10-krotnych rozcieńczeń czystych związków w zakresie stężeń od 10-6 M do 10-13 M z 10-3 M zapasowego roztworu feromonu w 50% metanolu/wodzie przechowywanego w temperaturze -20 °C, na podstawie masy cząsteczkowej ustalonej w kroku 6.2. Umieść szklane fiolki z roboczymi roztworami L-argininy i czystymi związkami w wannie z cyrkulującą wodą, aby temperatura wyrównała się do 8 °C.
  3. Powtórz kroki 3.7 – 3.18.
  4. Powtórz kroki 4.1 – 4.2.
  5. Podaj czysty związek w stężeniu progowym wykrywalności w EOG do losowo wybranego kanału eksperymentalnego, a środek rozpuszczający (50% metanol/woda zdejonizowana) do kanału kontrolnego za pomocą pompy perystaltycznej przy stałym przepływie 200 mL/min przez 5 min.
  6. Powtórz kroki 4.4 – 4.6.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat podsumowujący kroki opisane w protokole frakcjonowania sterowanego bioesejami przedstawiono na Rysunku 1. Protokół obejmuje etapy izolacji oraz charakterystyki struktury, potencjału węchowego i aktywności behawioralnej 5 domniemanych feromonów minogi morskiej (Rysunek 2). Wykorzystując dane z spektrometrii mas oraz NMR (Rysunek 3 oraz Rysunek 4), ustalono struktu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ryby żyją w chemicznym świecie pełnym związków, które nie zostały jeszcze zidentyfikowane. Frakcjonowanie sterowane testami biologicznymi okazało się niezbędne do identyfikacji i scharakteryzowania bioaktywnych cząsteczek, które pośredniczą w wielu interakcjach chemicznych, takich jak te obserwowane u łososia masu31, słoni azjatyckich32 i minogów morskich 33,34,35. Frakcjonowanie s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Stacji Biologicznej Hammond Bay U.S. Geological Survey za korzystanie z ich obiektów badawczych oraz personelowi U.S. Fish and Wildlife Service oraz Fisheries and Oceans Canada za dostarczenie minogów morskich. Badania te były wspierane przez granty Komisji Rybołówstwa Wielkich Jezior dla Weiming Li i Ke Li.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Standardowe kapilary borokrzemianowe Premium o standardowych ściankach z filamentem Warner InstrumentsG150F-4(OD 1,5 mm, ID 0,86 mm)
Przyrząd do ściągania pipetNarishigePC-10wyciąga elektrody do EOG
Nóż do szkła z diamentową końcówkąOgólnakońcówka elektrod do EOG
Kapilary ze szkła borokrzemianowegoWorld Precision Instruments1B150-4rurka doprowadzająca nawaniacz do EOG
Uchwyt elektrody rejestrującej serii E prosty korpus z granulką Ag/AgCl do szklanej kapilary OD 1,5 mmWarner InstrumentsESP-M15Nuchwyt elektrody nagrywającej
Uchwyt elektrody referencyjnej Seria E z uchwytem z  Granulat Ag/AgCl  do kapilary szklanej OD 1,5 mmWarnerInstruments E45P-F15NHuchwyt elektrody referencyjnej
1 mm pinWarner InstrumentsWC1-10do mostkowania uchwytów elektrod referencyjnych i rejestrujących
Pin 2 mmWarner InstrumentsWC2-5do mostkowania uchwytów elektrod referencyjnych i rejestrujących
AgarSigmaA1296stopiony agar do napełniania elektrod
Chlorek potasu (KCl)SigmaP93333M KCl do napełniania elektrod i uchwytów elektrod
Micropipette microfilWorld Precision InstrumentsMF28G-5do napełniania elektrod i uchwytów elektrod
L-argininaSigmaA5006środek nawaniający do kontroli pozytywnej EOG
MetanolSigma34860
Łaźnia wodnaWykonane na zamówienieNie dotyczyposiada substancje zapachowe do EOG
Ester etylowy kwasu 3-aminobenzoesowego (MS222)Syndel USATricaine1GEOG znieczulenie
Trietiodek gallaminySigmaG8134-5GEOG paralityczna
strzykawka 1 mlBD Biosciences301025do podawania paraliżu
Igła podskórna 26G 5/8BD Biosciences305115do podawania paraliżu
Zacisk rolkowyWorld Precyzja Instrumenty14043-20regulują szybkość przepływu środka znieczulającego do ust minoga
Chlorek sodu (NaCl)J.T. Baker3624-05do przygotowania 0,9% soli fizjologicznej
Plastikowy stojak w kształcie litery V jako stolik na próbkiWykonane na zamówienieNietrzyma minoga podczas EOG
Plastikowe korytoWykonane na zamówienieNie dotyczytrzyma plastikowy stojak w kształcie litery V podczas EOG
Ostrza skalpela - #11Fine Science Tools10011-00do preparacji EOG
Rękojeść skalpela - #3Fine Science Tools10003-12do sekcji EOG
Proste ultra cienkie kleszczeFine Science Tools11252-00do sekcji EOG, kleszcze Dumont #5SF
Zakrzywione ultra cienkie kleszczeNarzędzia do nauki11370-42do preparacji EOG, Moria MC40B
NożyczkiprosteFine Science Tools15003-08do preparacji EOG
Mikroskop stereoskopowyZeissDiscovery V8do preparacji EOG
Światło oświetlaczaZeissCL 1500 ECOdo rozwarstwiania EOG
Rurki z tworzywa sztucznegoOgólnedo podłączenia układu recyrkulacyjnego EOG i kąpieli wodnych
Rurki doprowadzające nawaniaczWykonane na zamówienieNie dotyczy
In Zestaw filtrów liniowych i uszczelekFirma Lee TCFA1201035A
MikromanipulatoryNarishigeMM-3do pozycjonowania elektrod i kapilarnej rurki doprowadzającej nawaniacz Magnetyczne
urządzenia przytrzymująceKanetecMB-K
Sterownik zaworuArduinowykonany na zamówieniedo sterowania otwieraniem zaworu w celu stymulacji zapachu
Zawór elektromagnetycznyLee FirmaLFAA1201618Hzawór do stymulacji zapachów
NeuroLog wzmacniacz AC/DCDigitimer Sp. z o.o.NL106do zwiększenia amplitudy sygnału elektrycznego
NeuroLog DC przedwzmacniacz z głowicąDigitimer Ltd.NL102Gw celu zwiększenia amplitudy sygnału eliktrycznego
Filtr dolnoprzepustowy 60 HzDigitimer Sp. z o.o.NL125
DigitizerMolecular Devices LLCAxon Digidata 1440A
Komputer Dell (OptiPlex 745) z oprogramowaniem do pozyskiwania danych AxoscopeMolecular Devices LLCAxoScope wersja 10.4
Klatka FaradayaWykonane na zamówienieNie dotyczyEkranowanie szumów elektromagnetycznych
Labiryntwyboru Wykonane na zamówienieNie dotyczywodoodporna sklejka morska pokryta plastikową wkładką
Pompa do śmieciHondaWT30XK4Anapełnia labirynt wodą z pobliskiej rzeki
Pompa perystaltyczna z rurkąCole ParmerMasterflex 07557-00do usuwania nawaniaczy w labiryncie
Generator inwerterowyHondaEU1000izasila pompę perstaltyczną
Klatka zwalniającaWykonane na zamówienieNie dotyczysłuży do aklimatyzacji minoga w labiryncie
SiatkaOgólnasłuży do przechowywania wymiarów labiryntu i minimalizowania turbulencji wody za pomocą rolek siatkowych
Wiadra (5 galonów)Ogólnydo mieszania substancji zapachowych
PrzepływomierzMarsh-McBirneyFlo-Mate 2000do pomiaru wyładowania
Żywica XAD 7 HP ChemicznaDow37380-43-1do ekstrakcji wody kondycjonowanej 
MetanolSigma34860do ekstrakcji wody kondycjonowanej 
Łaźnia wodnaYamatoBM 200do ekstrakcji wody kondycjonowanej 
LiofilizatorLabconcoCentriVap Koncentratordo ekstrakcji kondycjonowanego chloroformu
wodnego SigmaCX1050do izolacji basenów frakcji
Żel krzemionkowy 70-230 meshSigma112926-00-8do izolacji basenów frakcji
Żel krzemionkowy 230-400 meshSigma112926-00-8do izolacji basenów frakcji
Krzemionka wstępnie powlekana żelowe płytki TLCSigma99571do izolacji basenów frakcji
aldehyd anżylowySigmaA88107do izolacji pul frakcji
Sephadex LH-20GE Healthcare17-0090-01do izolacji basenów frakcji
Żywica Amberlite XAD 7 HPSigmaXAD7HPdo ekstrakcji wody kondycjonowanej 
4, 2,5 l pojemności szklanych kolumnAce Glass Inc.5820do ekstrakcji wody kondycjonowanej 
AcetonSigma650501do ekstrakcji wody kondycjonowanej 
Spektrometr masowy TQ-S TOF LC (lub równoważny)Waters Co.Nie dotyczydla wyjaśnienia struktury
Binarna pompa HPLCWaters Co.1525do izolacji pul/związków frakcji
Spektrometr Agilent NMR, 900MHz (lub równoważny)AgilentN/Ado wyjaśnienia struktury
System suszenia RotovapBuchiRIIdo ekstrakcji wody kondycjonowanej 
Lampa UV (254 nm)Spectronics Co.ENF-240Cdo chromatografii cienkowarstwowej 
Elektroda rejestrująca i referencyjna dotyczy o nauce do

Bibliografia

  1. Wyatt, T. D. Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).
  2. El-Sayed, A. M. The pherobase: database of insect pheromones and semiochemicals. , Available from: http://www.pherobase.com (2009).
  3. Zhu, J., et al. Reverse chemical ecology: Olfactory proteins from the giant panda and their interactions with putative pheromones and bamboo volatiles. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), E9802-E9810 (2017).
  4. Leal, W. S. Reverse chemical ecology at the service of conservation biology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 12094-12096 (2017).
  5. Carde, R. T., Minks, A. K. Control of moth pests by mating disruption: successes and constraints. Annual Review of Entomology. 40 (1), 559-585 (1995).
  6. Witzgall, P., Kirsch, P., Cork, A. Sex pheromones and their impact on pest management. Journal of chemical ecology. 36, (2010).
  7. Cheng, Y. -n, Wen, P., Dong, S. -h, Tan, K., Nieh, J. C. Poison and alarm: the Asian hornet Vespa velutina uses sting venom volatiles as an alarm pheromone. Journal of Experimental Biology. 220 (4), 645-651 (2017).
  8. Howse, P., Stevens, J., Jones, O. T. Insect Pheromones and Their Use in Pest Management. , Springer Science & Business Media. (2013).
  9. Pizzolon, M., et al. When fathers make the difference: efficacy of male sexually selected antimicrobial glands in enhancing fish hatching success. Functional Ecology. 24 (1), 141-148 (2010).
  10. Stacey, N., Sorensen, P. Hormones in communication | Hormonal Pheromones Encyclopedia of Fish Physiology. , Elsevier Inc. (2011).
  11. Kobayashi, M., Sorensen, P. W., Stacey, N. E. Hormonal and pheromonal control of spawning behavior in the goldfish. Fish Physiology and Biochemistry. 26 (1), 71-84 (2002).
  12. Stacey, N. Hormonally-derived pheromones in teleost fishes. Fish Pheromones and Related Cues. , 33-88 (2015).
  13. Kuhlisch, C., Pohnert, G. Metabolomics in chemical ecology. Natural Product Reports. 32 (7), 937-955 (2015).
  14. Prince, E. K., Pohnert, G. Searching for signals in the noise: metabolomics in chemical ecology. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 396 (1), 193-197 (2010).
  15. Teeter, J. Pheromone communication in sea lampreys (Petromyzon marinus): implications for population management. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 2123-2132 (1980).
  16. Moore, H., Schleen, L. Changes in spawning runs of sea lamprey (Petromyzon marinus) in selected streams of Lake Superior after chemical control. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 37 (11), 1851-1860 (1980).
  17. Vrieze, L. A., Bergstedt, R. A., Sorensen, P. W. Olfactory-mediated stream-finding behavior of migratory adult sea lamprey (Petromyzon marinus). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 68, (2011).
  18. Wagner, C. M., Jones, M. L., Twohey, M. B., Sorensen, P. W. A field test verifies that pheromones can be useful for sea lamprey (Petromyzon marinus) control in the Great Lakes. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 63 (3), 475-479 (2006).
  19. Wagner, C. M., Twohey, M. B., Fine, J. M. Conspecific cueing in the sea lamprey: do reproductive migrations consistently follow the most intense larval odour? Animal Behaviour. 78, (2009).
  20. Siefkes, M. J., Winterstein, S. R., Li, W. Evidence that 3-keto petromyzonol sulphate specifically attracts ovulating female sea lamprey Petromyzon marinus. Animal Behaviour. 70, (2005).
  21. Siefkes, M. J., Steeves, T. B., Sullivan, W. P., Twohey, M. B., Li, W. Sea lamprey control: past, present, and future. Great Lakes Fisheries Policy and Management. , Michigan State University Press. East Lansing, MI. 651-704 (2013).
  22. Li, K., et al. Three Novel Bile Alcohols of Mature Male Sea Lamprey (Petromyzon marinus) Act as Chemical Cues for Conspecifics. Journal of Chemical Ecology. 43 (6), 543-549 (2017).
  23. Hird, S. J., Lau, B. P. -Y., Schuhmacher, R., Krska, R. Liquid chromatography-mass spectrometry for the determination of chemical contaminants in food. TRAC Trends in Analytical Chemistry. 59, 59-72 (2014).
  24. Little, J. L., Williams, A. J., Pshenichnov, A., Tkachenko, V. Identification of "known unknowns" utilizing accurate mass data and ChemSpider. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (1), 179-185 (2012).
  25. Beckonert, O., et al. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nature Protocols. 2 (11), 2692(2007).
  26. Kaiser, B., Wright, A. Draft Bruker XRF Spectroscopy User Guide: Spectral Interpretation and Sources of Interference. , BRUKER. Madison, WI. (2008).
  27. Breitmaier, E., Sinnema, A. Structure Elucidation by NMR in Organic Chemistry: A Practical Guide. , Wiley. Chichester, New York, Brisbane, Toronto, Singapore. (1993).
  28. Seco, J. M., Quinoá, E., Riguera, R. The assignment of absolute configuration by NMR. Chemical Reviews. 104 (1), 17-118 (2004).
  29. Li, K., et al. Bile Salt-like Dienones Having a Novel Skeleton or a Rare Substitution Pattern Function as Chemical Cues in Adult Sea Lamprey. Organic Letters. , (2017).
  30. Li, K., Buchinger, T. J., Li, W. Discovery and characterization of natural products that act as pheromones in fish. Natural Product Reports. , In press (2018).
  31. Yambe, H., et al. L-Kynurenine, an amino acid identified as a sex pheromone in the urine of ovulated female masu salmon. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15370-15374 (2006).
  32. Rasmussen, L., Lee, T. D., Zhang, A., Roelofs, W. L., Daves, G. D. Jr Purification, identification, concentration and bioactivity of (Z)-7-dodecen-1-yl acetate: sex pheromone of the female Asian elephant, Elephas maximus. Chemical Senses. 22 (4), 417-437 (1997).
  33. Sorensen, P. W., et al. Mixture of new sulfated steroids functions as a migratory pheromone in the sea lamprey. Nature Chemical Biology. 1 (6), 324-328 (2005).
  34. Hoye, T. R., et al. Details of the structure determination of the sulfated steroids PSDS and PADS: New components of the sea lamprey (Petromyzon marinus) migratory pheromone. The Journal of organic chemistry. 72 (20), 7544-7550 (2007).
  35. Fine, J. M., Sorensen, P. W. Isolation and biological activity of the multi-component sea lamprey migratory pheromone. Journal of Chemical Ecology. 34 (10), 1259-1267 (2008).
  36. De Buchinger, T. J., Wang, H., Li, W., Johnson, N. S. Evidence for a receiver bias underlying female preference for a male mating pheromone in sea lamprey. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 280, (2013).
  37. De Bruyne, M., Baker, T. Odor detection in insects: volatile codes. Journal of Chemical Ecology. 34 (7), 882-897 (2008).
  38. Bradshaw, J., Baker, R., Lisk, J. Separate orientation and releaser components in a sex pheromone. Nature. 304 (5923), 265-267 (1983).
  39. Linn, C., Campbell, M., Roelofs, W. Pheromone components and active spaces: what do moths smell and where do they smell it. Science. 237 (4815), 650-652 (1987).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakcja do fazy sta ejchromatografia cieczowarejestracja elektroolfaktogram wtest labiryntu z dwoma wyboramichromatografia wykluczania cz steczkowegospektrometria masspektroskopia NMRekologia chemiczna

Powiązane artykuły